Name: Test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej przy użyciu kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko: przykład wirusa polio-nanoma (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Poznaj ilościowy test wychwytywania powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko. Metoda ta jest szczególnie przydatna przy analizie białek wrażliwych na zmiany konformacyjne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pracownikom wydziału Biotechnologii Farmaceutycznej i Biologii Molekularnej, a w szczególności Monique De Pelsmacker za przygotowanie wirusa znakowanego radioaktywnie. Jesteśmy wdzięczni Ellen Merckx i Hadewych Halewyck za interesujące uwagi i dyskusje oraz Gerrit De Bleeser za pomoc w laboratorium. Praca ta była wspierana finansowo z grantu OZR Vrije Universiteit Brussel (OZR1807), Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (G.0168.10N) oraz Światowej Organizacji Zdrowia (TSA 200410791). Lise Schotte jest stypendystką przeddoktorancką Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO).

Zasada (A) oraz ogólny opis metody (B) przedstawione są na Rysunku 1.
1. Przygotowanie buforu
<ol>
	<li>Przygotować bufor wiążący/płuczący, rozpuszczając w wodzie wodorofosforan sodu (50 mM) oraz chlorek sodu (300 mM), a następnie dostosować pH do wartości 8,0. Dodatkowo dodać Tween 20 (stężenie końcowe 0,01% (m/v)), metioninę (stężenie końcowe 2% (m/v)) oraz albuminę (stężenie końcowe 0,1% (m/v)) i doprowadzić do wymaganej objętości.</li>
</ol>
2. Przygotowanie kulek magnetycznych
Przygotować kulki magnetyczne zgodnie z instrukcją obsługi. W skrócie:
<ol>
	<li>Resuspenduj kulki magnetyczne za pomocą wortexa.</li>
	<li>Przenieś dla każdej próbki 10 μl resuspendowanych kulek magnetycznych (40 mg/ml) do probówki.</li>
	<li>Zgromadź kulki magnetyczne za pomocą magnesu, aż naddatek stanie się przejrzysty (+/- 30 sec), a następnie ostrożnie usuń naddatek.</li>
	<li>Umyj kulki magnetyczne dwukrotnie: resuspenduj kulki w 150 μl buforu Binding/Wash. Przesuń kulki magnetyczne na jedną stronę probówki za pomocą magnesu, aż naddatek stanie się przejrzysty, i ostrożnie usuń naddatek.</li>
	<li>Użyj 40 μl buforu Binding/Wash dla każdej próbki, aby resuspendować kulki (10 mg/ml).</li>
</ol>
3. Analiza wychwytu powinowactwem
Uwaga: Aby zmierzyć (kosmiczną) radioaktywność tła (0% radioaktywności), do próbki kontrolnej 1 nie dodaje się wirusa znakowanego radioaktywnie. Zamiast tego dodaje się taką samą objętość buforu do wiązania/płukania (Binding/Wash buffer).
Uwaga: 100% radioaktywności jest definiowane przez próbkę kontrolną 2, do której dodano wszystkie składniki z wyjątkiem nanociała. Zamiast niego dodano taką samą objętość buforu do wiązania/płukania (Binding/Wash buffer).
<ol>
	<li>Nanieś 2000 cpm poliwirusa szczepu Sabina typu 19 znakowanego 35S (promieniowanie β), rozcieńczonego buforem do wiązania i płukania (Binding/Wash buffer) do objętości 80 μl, do płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami.</li>
	<li>Dodaj 10 μl rozcieńczenia nanociała do poszczególnych dołków.</li>
	<li>Mieszaj przez około 10 sekund za pomocą wytrząsarki.</li>
	<li>Inkubuj próbki przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodaj 40 μl zawiesiny przemytych kulek magnetycznych i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym mieszaniu.</li>
	<li>Oddziel kulki od nadfiltratu za pomocą magnesu i przelej oczyszczony nadfiltr do probówki.</li>
</ol>
4. Pomiar promieniotwórczości
<ol>
	<li>Przenieś 50 μl supernatantu z kroku 3.6 do kolby do liczenia.</li>
	<li>Dodaj 3 ml płynu scyntylacyjnego i wymieszaj. Zmierz radioaktywność w liczniku scyntylacyjnym β.</li>
</ol>
5. Regeneracja kulek
<ol>
	<li>Zebrać zużyte kuleczki magnetyczne do probówki i odwirować przy 500 x g przez 2 minuty lub do momentu uzyskania klarownego supernatantu.</li>
	<li>Usunąć supernatant i resuspender kuleczki w 6 ml 0.5 M NaOH.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę do kilku probówek i inkubować w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut.</li>
	<li>Użyć magnesów do zebrania kuleczek magnetycznych i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml 2% roztworu SDS do każdej probówki i resuspender za pomocą wortexa. Gotować przez 5 minut.</li>
	<li>Zebrać kuleczki i usunąć supernatant. Resuspender kuleczki w 1 ml 0.2 M EDTA (pH=7).</li>
	<li>Inkubować probówki w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut, a następnie ponownie usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml wody do każdej probówki i resuspender kuleczki. Zebrać kuleczki i usunąć supernatant. Powtórzyć ten etap płukania dwukrotnie.</li>
	<li>Usunąć supernatant i resuspender kuleczki w 1 ml roztworu 10 mM CoCl2. Inkubować na wytrząsarce przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant, używając magnesu do zebrania kuleczek, i resuspender w 1 ml buforu wiążącego/płuczącego (Binding/Wash buffer).</li>
	<li>Usunąć supernatant i przemyć kuleczki dwukrotnie, używając 1 ml 20% (v/v) etanolu.</li>
	<li>Resuspender kuleczki w ich pierwotnej objętości 20% (v/v) etanolu, aby uzyskać zregenerowane kuleczki o stężeniu 40 mg/ml.</li>
</ol>
6. Interpretacja wyników
<ol>
	<li>Próbka kontrolna 1, do której nie dodano wirusa znakowanego izotopowo, służy do korekty tła radioaktywnego oraz wyznaczenia wartości 0% radioaktywności. Próbka kontrolna 2, która nie zawiera nanociała i w której konsekwentnie cały znakowany izotopowo wirus pozostaje w supernatancie, jest przyjęta jako wartość 100% radioaktywności.</li>
	<li>Procent radioaktywności w supernatancie (= a %) jest miarą całkowitego wytrącenia (= 100 - a %) wirusa znakowanego izotopowo przez nanociało.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne wyniki dla tego testu wychwytu powinowactwa przedstawiono na Rysunkach 2, 3 i 4. Na Rysunku 2 pokazano powinowactwo PVSS38C, nanoprzeciwciała specyficznego dla poliovirusa. Powinowactwo PVSS38C badano dla trzech różnych antygenów poliovirusa: antygenu natywnego (antygen N), antygenu podgrzanego (antygen H) oraz podjednostek 14S. Antygen N to nienaruszony, zakaźny wirus. Podczas podgrzewania wirusa (20 minut w 56 °C) lub jego przytwierdzenia do stałej powierzchni (wyniki nieopublikowane) zmienia się konformacja kapsydu, co prowadzi do (częściowej) utraty wirusowego RNA oraz białka kapsydu VP4, w wyniku czego powstają puste kapsydy nazywane antygenami H. Podjednostki 14S są produktami pośrednimi składania. Antygeny te są rozpoznawane przez różne zestawy przeciwciał po immunizacji10 i posiadają zatem różne epitopy oraz miejsca antygenowe. Na rysunku procent radioaktywności w supernatancie przedstawiono jako funkcję stężenia nanoprzeciwciała. Widać, że radioaktywność w supernatancie próbek zawierających znakowane radioaktywnie podjednostki 14S maleje wraz ze wzrostem stężenia nanoprzeciwciała PVSS38C. Można to interpretować jako zwiększenie ilości podjednostek 14S poliovirusa związanych z nanoprzeciwciałem PVSS38C, a pośrednio z kulkami magnetycznymi. Miano wychwytu (= stężenie nanoprzeciwciała niezbędne do wychwycenia 50% znakowanego radioaktywnie wirusa) można obliczyć graficznie jako 0,099 nM. Nie zaobserwowano powinowactwa PVSS38C do formy antygenu N i antygenu H poliovirusa. Na podstawie tych danych wyinterpretowano, że PVSS38C oddziałuje z epitopem, który występuje wyłącznie na podjednostce 14S, a nie na dwóch pozostałych formach antygenowych poliovirusa.
Aby wykazać, że utrata radioaktywności z supernatantu wynika wyłącznie ze specyficznego powinowactwa nanobody do jego antygenów, ten sam test przeprowadzono z użyciem Nb1 – nanobody wytworzonego przeciwko regulatorowi transkrypcyjnemu lrpB z *Sulfolobus sulfataricus*, o którym wiadomo, że nie wykazuje on żadnych interakcji z żadnym antygenem poliwirusa. Wynik tego testu przedstawiono na Rysunku 3. Cały znakowany radioaktywnie wirus pozostał w supernatantach, co dowodzi braku reaktywności Nb1 wobec trzech form antygenowych poliwirusa.
Powtarzalność wyników sprawdzono poprzez powtórzenie eksperymentu łącznie osiem razy dla jednego nanociała (tzn. PVSP29F), w różne dni i przez różne osoby. Wyniki przedstawiono na Ryc. 4. Średnią wartość procentową radioaktywności w supernatnacie obliczono dla każdego stężenia nanociała i przedstawiono wraz z odchyleniem standardowym.
<img alt="Wykrywanie poliovirusa za pomocą nanoprzeciwciał; schemat z kulkami magnetycznymi i nanoprzeciwciałami z tagiem His w układzie testowym." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Przegląd zasady (A) oraz metody (B) analizy. A. Nanoprzeciwciała z tagiem His, które specyficznie rozpoznają określony antygen poliovirusa, będą w stanie oddziaływać z kulkami magnetycznymi powlekanymi kobaltem i spowodują wytrącenie radioaktywnie znakowanego wirusa. B. Do radioaktywnie znakowanego poliovirusa dodaje się nanoprzeciwciała z tagiem His i inkubuje. Następnie dodaje się kulki magnetyczne powlekane kobaltem i przeprowadza separację magnetyczną antygenu związanego i niezwiązanego. Mierzy się radioaktywność nadkładu, na podstawie której można wyznaczyć ilość wychwyconego antygenu.
<img alt="Wykres stężenia nanociała w funkcji radioaktywności; porównanie wiązania antygenu N, antygenu H i 14S." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wychwyt powinowactwa różnych antygenów poliwirusa przez nanociało PVSS38C za pomocą kulek magnetycznych. Procent radioaktywności w nadfiltrze przedstawiono jako funkcję stężenia PVSS38C. W przypadku 14S stwierdzono zależność stężenie-odpowiedź, co wskazuje na oddziaływanie PVSS38C z epitopem obecnym wyłącznie na 14S. Nie wykryto istotnego oddziaływania z antygenem N ani antygenem H, choć przy bardzo wysokich stężeniach zauważono pomijalny wychwyt niespecyficzny.
<img alt="Wykres radioaktywności w funkcji stężenia nanociała; ocena wiązania antygenu; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Magnetyczne wychwytywanie powinowactwa różnych antygenów poliwirusa przez nanociało Nb1. Procent radioaktywności obecnej w supernatancie przedstawiono jako funkcję stężenia Nb1. Wiadomo, że Nb1 nie wchodzi w interakcje z żadnym antygenem ani podjednostką poliwirusa. Ponieważ 100 % radioaktywności znajduje się w supernatancie, żaden wirus nie został związany niespecyficznie z Nb1. Utrata radioaktywności na rysunku 2 wynika zatem wyłącznie ze specyficznego powinowactwa nanociała do jego antygenów.
<img alt="Wykres zależności radioaktywności od stężenia VHH, wykazujący spadek; analiza danych z wyników testu wiązania." src="/files/ftp_upload/3937/3937fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Powtarzalność testu. Średnią wartość procentową radioaktywności w supernatancie przedstawiono w funkcji stężenia nanoprzeciwciała. Eksperyment powtórzono ośmiokrotnie w różne dni i przez różne osoby. Odchylenie standardowe przedstawiono w postaci pionowych słupków.

<ol><li>Thys, B., Schotte, L., Muyldermans, S., Wernery, U., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+antiviral+activity+of+single+domain+antibody+fragments+against+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro antiviral activity of single domain antibody fragments against poliovirus.</a> Antiviral Res. 87, 257-264 (2010).</li>
<li>Meloen, R. H., Briaire, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+cross-reacting+antigens+on+the+intact+foot-and-mouth+disease+virus+and+its+12S+subunits+with+antisera+against+the+structural+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A study of the cross-reacting antigens on the intact foot-and-mouth disease virus and its 12S subunits with antisera against the structural proteins.</a> J. Gen. Virol. 51, 107-116 (1980).</li>
<li>Vrijsen, R., Rombaut, B., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+protein+A+micro-immunoprecipitation+method%3A+assay+of+antibodies+to+the+N+and+H+antigens+of+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative protein A micro-immunoprecipitation method: assay of antibodies to the N and H antigens of poliovirus.</a> J. Immunol. Methods. 59, 217-220 (1983).</li>
<li>Rombaut, B., Jore, J., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+competition+immunoprecipitation+assay+of+unlabeled+poliovirus+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A competition immunoprecipitation assay of unlabeled poliovirus antigens.</a> J. Virol. Methods. 48, 73-80 (1994).</li>
<li>Kessler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+antigens+from+cells+with+a+staphylococcal+protein+A-antibody+adsorbent%3A+parameters+of+the+interaction+of+antibody-antigen+complexes+with+protein+A%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of antigens from cells with a staphylococcal protein A-antibody adsorbent: parameters of the interaction of antibody-antigen complexes with protein A.</a> J. Immunol. 115, 1617-1624 (1975).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hamers, C., Songa, B. ajyana, Bendahman, E., N,, Hamers, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Arbabi Ghahroudi, M., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+and+identification+of+single+domain+antibody+fragments+from+camel+heavy-chain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies.</a> FEBS Lett. 414, 521-526 (1997).</li>
<li>Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+domain+camel+antibodies%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single domain camel antibodies: current status.</a> Rev. Mol. Biotechnol. 74, 277-302 (2001).</li>
<li>Rombaut, B., Vrijsen, R., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+evolution+in+poliovirus+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epitope evolution in poliovirus maturation.</a> Arch. Virol. 76, 289-298 (1983).</li>
<li>Brioen, P., Sijens, R. J., Vrijsen, R., Rombaut, B., Thomas, A. A., Jackers, A., Boeye, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridoma+antibodies+to+poliovirus+N+and+H+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hybridoma antibodies to poliovirus N and H antigen.</a> Arch. Virol. 74, 325-330 (1982).</li>
<li>Thys, B., Saerens, D., Schotte, L., De Bleeser, G., Muyldermans, S., Hassanzadeh-Ghassabeh, G., Rombaut, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+quantitative+affinity+capturing+assay+of+poliovirus+antigens+and+subviral+particles+by+single-domain+antibodies+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple quantitative affinity capturing assay of poliovirus antigens and subviral particles by single-domain antibodies using magnetic beads.</a> J. Virol. Methods. 173, 300-305 (2011).</li>
<li>Wild, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWild%2C+D+%22The+Immunoassay+Handbook%22">The Immunoassay Handbook</a>. , Third edition, Elsevier. (2005).</li>
<li>Kremser, L., Konecsni, T., Blaas, D., Kenndler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+labeling+of+human+rhinovirus+capsid+and+analysis+by+capillary+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescence labeling of human rhinovirus capsid and analysis by capillary electrophoresis.</a> Anal. Chem. 76, 4175-4181 (2004).</li>
<li>Pelkmans, L., Kartenbeck, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caveolar+endocytosis+of+simian+virus+40+reveals+a+new+two-step+vesicular-transport+pathway+to+the+ER%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular-transport pathway to the ER.</a> Nat. Cell Biol. 3, 473-483 (2001).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

W protokole radioaktywność antygenu oddziałującego z nanociałem definiuje się jako utratę radioznaczonego wirusa z supernatantu. Zatem ilość wytrąconej radioaktywności (=100 - a %) (związanej z koralikami magnetycznymi) może być oszacowana w sposób pośredni na podstawie radioaktywności w supernatancie (= a %). Z drugiej strony możliwe jest również bezpośrednie pomiar radioaktywności wytrąconej frakcji związanej antygenu poprzez elucję immunokompleksów z koralików magnetycznych za pomocą 500 mM imidazolu. Wcześniej wykaza...

<table><tbody><tr><td>Izolacja i pulldown białek z tagiem His za pomocą Dynabeads </td><td>Invitrogen</td><td>101.03D</td><td>Kuleczki magnetyczne</td></tr><tr><td>Optiphase &amp;rsquo;HiSafe&amp;rsquo; 2</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>1200 - 436</td><td>Płyn scyntylacyjny</td></tr></tbody></table>

analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

W niniejszym artykule przedstawiono prosty, ilościowy test powinowactwa w fazie ciekłej. Pod warunkiem, że jedno białko może zostać oznakowane tagiem, a drugie białko znacznikiem, metodę tę można zastosować do badania oddziaływań białko-białko. Opiera się ona z jednej strony na rozpoznawaniu białka z tagiem przez magnetyczne kulki powlekane kobaltem, a z drugiej na oddziaływaniu między białkiem z tagiem a drugim, specyficznym białkiem znakowanym. W pierwszej kolejności białka znakowane i z tagiem są mieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej. Następnie dodaje się kulki magnetyczne rozpoznające tag, a związaną frakcję białka znakowanego oddziela się od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Ilość wychwyconego białka znakowanego można określić pośrednio, mierząc sygnał białka znakowanego pozostałego w frakcji niezwiązanej. Opisany test powinowactwa w fazie ciekłej jest niezwykle użyteczny podczas analizy białek wrażliwych na zmiany konformacyjne. Opracowanie i zastosowanie testu zademonstrowano na przykładzie oddziaływania między poliovirusem a nanobody rozpoznającymi poliovirusa1. Ponieważ poliovirus jest wrażliwy na zmiany konformacyjne2 po przytwierdzeniu do powierzchni stałej (wyniki nieopublikowane), zastosowanie metody ELISA jest ograniczone, w związku z czym preferowany powinien być system oparty na fazie ciekłej. Przykładem systemu opartego na fazie ciekłej, często stosowanego w badaniach nad polio3,4, jest test mikroimmunoprecypitacji białkiem A5. Mimo że test ten potwierdził swoją przydatność, wymaga on obecności struktury Fc, której brakuje w nanobody6,7. Jednakże te interesujące i stabilne przeciwciała jednodomenowe8 mogą zostać łatwo zmodyfikowane w celu wprowadzenia różnych tagów. Powszechnie stosowany tag (His)6 wykazuje powinowactwo do jonów bidentatnych, takich jak nikiel lub kobalt, które z kolei mogą być łatwo naniesione na kulki magnetyczne. Opracowaliśmy zatem ten prosty, ilościowy test powinowactwa oparty na magnetycznych kulkach powlekanych kobaltem. Poliovirus został znakowany 35S, aby umożliwić niezakłócone oddziaływanie z nanobody oraz umożliwić detekcję ilościową. Metoda ta jest łatwa w wykonaniu i może zostać wdrożona niskim kosztem, co dodatkowo wspiera możliwość efektywnej regeneracji kulek magnetycznych.

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

W niniejszym artykule przedstawiono prosty, ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Przy założeniu, że jedno białko może zostać znakowane, a drugie białko ...

Niniejszy protokół wykorzystuje oddziaływanie między poliovirusem a nanociałami rozpoznającymi poliovirusa w celu zademonstrowania prostego ilościowego testu wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. W zasadzie zastosowano kuleczki magnetyczne powlekane kobaltem do wyciszania białek z etykietą oraz wszelkich oddziałujących z nimi białek znakowanych promieniotwórczo. Najpierw wymieszaj białka znakowane i etykietowane, a następnie inkubuj je w temperaturze pokojowej.Następnie dodaje się kuleczki magnetyczne rozpoznające znacznik, a następnie oddziela frakcję związanego białka znakowanego od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Następnie mierzy się sygnał białka znakowanego obecnego w frakcji niezwiązanej i określa jego ilość w tej frakcji. Wyniki z tego analizy powinowactwa w fazie ciekłej są niezwykle użyteczne podczas badania białek wrażliwych na konwersję konformacyjną.Ten test powinowactwa w fazie ciekłej pozwala na analizę oddziaływań między nanociałami rozpoznającymi poliwirusa a różnymi antygenami poliwirusa. Metodę tę można zastosować również do innych oddziaływań białko-białko, pod warunkiem że jedno z białek może zostać znakowane, a drugie wykryte. Pierwsze doświadczenia z tą metodą zdobyliśmy podczas badań nad oddziaływaniami między nanociałami rozpoznającymi poliwirusa a różnymi antygenami poliwirusa.Ponieważ poliovirus jest wrażliwy na zmiany konformacyjne podczas wiązania z powierzchnią stałą, zastosowanie e LSA jest ograniczone. Dlatego preferowany powinien być system oparty na fazie ciekłej. Przykładem takiego systemu wykorzystywanego często w badaniach nad poliovirusem jest micro protein.Analiza immunoprecypitacji. Mimo że test ten udowodnił swoją przydatność, wymaga on skrystalizowanej struktury konwencjonalnego przeciwciała, której nanociała nie posiadają. Nanociała, będące interesującymi i bardzo stabilnymi przeciwciałami jednodomenowymi, mogą być łatwo modyfikowane pod kątem różnych sekwencji.Szeroko stosowany stos białek wykazuje powinowactwo do jonów dwuwartościowych, takich jak nikiel i kobalt, które z kolei mogą być łatwo naniesione na kuleczki magnetyczne. Opracowaliśmy zatem prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa oparty na kuleczkach magnetycznych powlekanych kobaltem.Wymieszaj zapas kulek magnetycznych w wortexie i przenieś 10 µL dla każdej próbki do probówki, a następnie osadź kulki za pomocą magnesu. Usuń przezroczysty nadosad, aby wypłukać kulki. Dodaj 150 µL buforu wiążącego.Zebrać kuleczki za pomocą magnesu i usunąć nadsącz po drugim przemyciu. Zawiesić kuleczki ponownie w 40 µL buforu wiążącego dla każdej próbki i kontroli. W celu wyznaczenia tła dla próbki pierwszej, przygotować dołek bez wirusa znakowanego radioaktywnie, ale z taką samą objętością buforu wiążącego dla kontroli.Przygotuj próbkę o 100% radioaktywności. Dodaj wszystkie składniki do dołka, zastępując nanociało buforem wiążącym. Następnie dodaj 2000 zliczeń na minutę poliovirusa szczepu 7 typ 1 znakowanego S 35 do wszystkich próbek, tak aby całkowita objętość bufora wiążącego wynosiła 80 µL.Przyjąć kontrolę. Próbka pierwsza. Dodać 10 µL rozcieńczenia nanociała do każdej próbki.Mieszaj dokładnie przez 10 sekund na wytrząsarce i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 40 µL zawiesiny przemytych kulek magnetycznych i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej przy ciągłym wytrząsaniu, odwiruj kulki za pomocą magnesu i przenieś klarowny supernatant do probówki w celu pomiaru radioaktywności każdej próbki, przenosząc 50 µL supernatantu do kolby liczącej. Dodaj trzy mililitry mieszaniny płynu scyntylacyjnego i odczytaj wynik na liczniku.Wypłucz użyte kuleczki magnetyczne w probówce za pomocą wody i odwiruj przy 500 ×g przez dwie minuty. Odlej nadsącz i ponownie zawieś kuleczki w sześciu mililitrach 0,5 molarnego wodorotlenku sodu. Następnie podziel zawiesinę do kilku probówek i inkubuj w kąpieli ultradźwiękowej przez pięć minut.Po zebraniu kulek za pomocą magnesu i usunięciu naddatku, do każdej probówki należy dodać jeden mililitr 2% roztworu SDS, a następnie wymieszać za pomocą wortexa i folgować przez pięć minut. Następnie należy odzyskać kulek. Do każdej probówki należy dodać jeden mililitr 0,2 M EDTA o pH 7 i inkubować probówki w kąpieli ultradźwiękowej przez pięć minut.Następnie zebrać kuleczki, przemyć je trzy razy jednym mililitrem wody, a następnie jednym mililitrem 10 milimolowego roztworu chlorku kobaltu. Umieścić probówki na wytrząsarce na 10 minut. Przejść do zbierania kuleczek za pomocą magnesu i resuspenderować je w jednym mililitrze buforu wiążącego.Przemyj dwukrotnie w jednym mililitrze 20% etanolu, a następnie resuspenduj kuleczki w ich pierwotnej objętości 20% etanolu, aby uzyskać zregenerowane kuleczki o stężeniu 40 mg/mL. Skoryguj tło radioaktywności, przyjmując próbkę kontrolną jeden jako wartość 0% radioaktywności, a próbkę kontrolną dwa jako wartość 100% radioaktywności.Następnie dla każdej próbki oblicz procent radioaktywności w nadsączu jako miarę całkowitego wytrącania radioznakowanego wirusa przez nanociało. Niniejszy eksperyment ocenia powinowactwo PVSS 38 C oraz przeciwciała specyficznego dla poliwirusa przy użyciu trzech różnych antygenów poliwirusa: antygenu natywnego, antygenu podgrzanego oraz podjednostek 14 s. Co ciekawe, radioaktywność w nadsączu próbek zawierających radioznakowane podjednostki 14 s maleje wraz ze wzrostem stężenia nanociała PVSS 38 C. Wskazuje to na wzrost ilości podjednostek 14 s poliwirusa związanych z nanociałem PVSS 38 C, a pośrednio z kuleczkami magnetycznymi.Ponieważ nie zaobserwowano powinowactwa pvs S 38 C do formy N antygenowej oraz H antygenowej poliovirusa, nanociało wydaje się być specyficzne dla podjednostki 14 s poliovirusa. Powinowactwo nanociała do jego antygenów mierzone tą metodą jest specyficzne, w przeciwieństwie do niepowiązanego nanociała NB one, które nie wykazuje reaktywności wobec trzech form antygenowych poliovirusa.System ten wykazuje wysoką powtarzalność, co potwierdza przedstawiona krzywa dawka-odpowiedź, wygenerowana przez różnych badaczy w różne dni. Po opanowaniu metody ten niezawodny test powinowactwa w fazie ciekłej może zostać prawidłowo przeprowadzony w ciągu dwóch godzin, wliczając w to recykling kulek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś posiadać gruntowną wiedzę na temat stosowania tego testu powinowactwa w fazie ciekłej opartego na kuleczkach magnetycznych podczas badania oddziaływań między różnymi białkami, szczególnie w sytuacjach, gdy nie można zastosować systemów opartych na fazie stałej.

a-liquid-phase-affinity-capture-assay-using-magnetic-beads-to-study

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test oparty na metodzie uwięzienia w fazie ciekłej z wykorzystaniem magnesowych kulek do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliowirusa-nanociała

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Niedawno opracowany nowoczesny test aglutynacji cząsteczek (PA) z wykorzystaniem cząsteczki receptora wirusowego umożliwił szybką i łatwą identyfikację poliwirusa (PV). W niniejszym artykule przedstawimy procedurę testu PA służącą do identyfikacji PV.

Metoda aglutynacji cząsteczek w identyfikacji poliwirusa

Tandemowa puryfikacja powinowactwa (TAP) jest skuteczną metodą identyfikacji białek wiążących. W ramach dowodu koncepcji metodologię tę zastosowano do dobrze scharakteryzowanego czynnika inicjacji translacji eIF4E w celu koprecypitacji czynników komórkowych gospodarza zaangażowanych w inicjację translacji. Metoda ta może być łatwo zaadaptowana do dowolnego białka komórkowego lub wirusowego.

Identyfikacja partnerów oddziaływań białkowych z wykorzystaniem tandemowej oczyszczania powinowactwa

W tym filmie pokazujemy test immunoprecypitacyjny, zwany testem wychwytywania VLP, w celu wyizolowania z próbki cząstek wirusopodobnych wyświetlających antygen lub VLP. Antygen wiąże się ze specyficznymi przeciwciałami związanymi z kulkami magnetycznymi, tworząc unieruchomiony kompleks antygen-przeciwciało, który jest następnie oddzielany i przechowywany do dalszej analizy.

Test wychwytywania cząstek wirusopodobnych: metoda izolowania VLP wyświetlających antygen z próbki przy użyciu neutralizujących kulek magnetycznych sprzężonych z przeciwciałami

Tutaj opisujemy protokoły rozbijania komórek ssaków poprzez mielenie w stanie stałym w temperaturze kriogenicznej, wytwarzanie ekstraktu komórkowego z powstałego proszku komórkowego i izolowanie interesujących kompleksów białkowych poprzez wychwytywanie powinowactwa na paramagnetycznych kulkach w skali mikronowej sprzężonych z przeciwciałami.

Wychwytywanie powinowactwa do kompleksu białkowego z komórek ssaków poddanych mieleniu w kriomerze

Wirusy lub pęcherzyki zewnątrzkomórkowe były wychwytywane immunologicznie za pomocą nanocząsteczek magnetycznych 15 nm sprzężonych z przeciwciałami rozpoznającymi antygeny powierzchniowe. Uchwycone wiriony lub pęcherzyki znakowano fluorescencyjnymi przeciwciałami przeciwko innym antygenom powierzchniowym. Powstałe kompleksy rozdzielono w silnym polu magnetycznym i przeanalizowano za pomocą konwencjonalnych cytometrów przepływowych wyzwalanych fluorescencją.

Wirometria przepływowa do analizy widm antygenowych wirionów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Interakcje białko-białko mogą zachodzić zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie komórki. Aby zbadać te interakcje, stosuje się tradycyjną koimmunoprecypitację i nowoczesny test ligacji zbliżeniowej. W tym badaniu porównujemy te dwie metody wizualizacji rozkładu oddziaływań NF90-RBM3 w jądrze i cytoplazmie.

Wizualizacja interakcji białko-białko we frakcjach jądrowych i cytoplazmatycznych za pomocą koimmunoprecypitacji i testu ligacji zbliżeniowej in situ

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania epitopów neutralizacji na cząsteczkach wirusopodobnych wyświetlających antygen (VLP). Immunoprecypitację VLP pochodzących z ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV) przeprowadza się przy użyciu przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla glikoprotein otoczkowych sprzężonych z kulkami magnetycznymi sprzężonymi z białkiem G. Przechwycone VLP są następnie poddawane analizie SDS-PAGE i Western blot przy użyciu przeciwciał specyficznych dla białka rdzenia...

Wykrywanie epitopów wrażliwych na neutralizację w antygenach wyświetlanych na szczepionkach opartych na cząsteczkach wirusopodobnych (VLP) za pomocą testu wychwytywania

Tutaj opisujemy nowo opracowany multipleksowy fluorescencyjny test immunologiczny, który wykorzystuje system cytometrii z podwójnym przepływem reporterowym do jednoczesnego wykrywania dwóch unikalnych epitopów białka kolca na nienaruszonych cząsteczkach wirusa SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2) zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej, które zostały wychwycone przez mikrosfery magnetyczne sprzężone z enzymem konwertującym angiotensynę.

Profilowanie epitopów białek powierzchniowych na cząsteczkach wirusa za pomocą strategii multipleksu dual-reporter

Poznaj ilościowy test wychwytywania powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko. Metoda ta jest szczególnie przydatna przy analizie białek wrażliwych na zmiany konformacyjne.

Test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej przy użyciu kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko: przykład wirusa polio-nanoma (Wideo) | JoVE Journal

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Przeglądaj więcej filmów