Test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej przy użyciu kulek magnetycznych do badania interakcji białko-białko: przykład wirusa polio-nanoma

Protokół ten wykorzystuje interakcję między wirusem polio a wirusem polio, rozpoznając nanociała w celu zademonstrowania prostego ilościowego testu wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej. Głównie kulki magnetyczne powlekane kobaltem są używane do ściągania oznakowanych białek, a także wszelkich oddziałujących białek znakowanych radiowo. Najpierw wymieszaj znakowane i oznakowane białka i inkubuj w temperaturze pokojowej.

Następnie dodaj kulki magnetyczne, które rozpoznają znacznik, oddziel związaną frakcję znakowanego białka od frakcji niezwiązanej za pomocą magnesów. Następnie zmierz sygnał znakowanego białka znajdującego się we frakcji niezwiązanej i określ ilość znakowanego białka znajdującego się we frakcji niezwiązanej. Wyniki tego testu powinowactwa do fazy ciekłej są niezwykle przydatne, gdy testowane są białka wrażliwe na konwersję potwierdzoną.

Ten test wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej może dostarczyć informacji na temat interakcji między wirusem polio, rozpoznając nano boies i różne antygeny wirusa polio. Metoda ta może być również stosowana do innych interakcji białek białkowych, pod warunkiem, że jedno białko można znakować, a drugie można wykryć. Po raz pierwszy otrzymaliśmy identyfikator dla tej metody, gdy byliśmy zainteresowani badaniem interakcji między wirusem polio, rozpoznawaniem nanociał i różnych antygenów wirusa polio.

Ponieważ wirus polio jest wrażliwy na konwersję konfirmacyjną, po przyczepieniu do twardej powierzchni, stosowanie e LSA jest ograniczone. Dlatego należy preferować system oparty na fazie ciekłej. Przykładem takiego systemu opartego na fazie ciekłej, często wykorzystywanego w badaniach nad wirusem polio, jest mikrobiałko.

Test immunoprecypitacyjny. Mimo że test ten udowodnił swoją przydatność, wymaga skrystalizowanej struktury konwencjonalnego przeciwciała, której nie ma w nanociałach. Te nanociała, które są interesującymi i bardzo stabilnymi przeciwciałami jednodomenowymi, można łatwo zaprojektować za pomocą różnego tekstu.

Szeroko stosowany. Stos wykazuje powinowactwo do jonów dwuwartościowych, takich jak nikiel i kobalt, które z kolei mogą być łatwo pokryte kulkami magnetycznymi. W związku z tym opracowaliśmy prosty ilościowy test wychwytywania powinowactwa oparty na kulkach magnetycznych pokrytych kobaltem.

Reese ma zapas kulek magnetycznych za pomocą wiru i przenosi 10 mikrolitrów na każdą próbkę do probówki, granuluje kulki za pomocą magnesu. Usuń przezroczysty supinat, aby umyć koraliki. Dodaj 150 mikrolitrów buforu wiążącego.

Zbierz koraliki za pomocą magnesu i usuń supinat po drugim praniu. Ponownie zawiesić kulki w 40 mikrolitrach buforu wiążącego dla każdej próbki do kontroli. Jako tło w próbce pierwszej, należy przygotować studzienkę bez znakowanego radioaktywnie wirusa, ale z równą objętością buforu wiążącego do kontroli.

Próbka dwie ze 100% aktywności radiowej. Dodaj wszystkie składniki do studzienki, z wyjątkiem zastąpienia nano ciała buforem wiążącym. Teraz dodaj 2000 zliczeń na minutę znakowanego S 35 siedmioszczepu wirusa polio typu 1 w łącznej objętości 80 mikrolitrów buforu wiążącego do wszystkich próbek.

Zaakceptuj kontrolę. Próbka pierwsza. Do każdej próbki dodać 10 mikrolitrów rozcieńczenia nano ciała.

Dobrze mieszaj przez 10 sekund na shakerze i inkubuj przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 40 mikrolitrów przemytej zawiesiny kulek magnetycznych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej pod ciągłym wytrząsaniem, granulować kulki magnesem i przenieść oczyszczony natant SUP do probówki w celu zmierzenia radioaktywności każdej próbki, przenieść 50 mikrolitrów supinatu do kolby liczącej. Dodaj trzy mililitry mieszanki płynu scyntylacyjnego i przeczytaj tę izolację.

Przeciwstaw się wyciągnięciu zużytych kulek magnetycznych do probówki za pomocą wody i odwiruj 500 razy G przez dwie minuty. Wyrzuć supinat i ponownie zawieś kulki w sześciu mililitrach 0,5 molowego wodorotlenku sodu. Następnie podzielić zawiesinę na kilka probówek i inkubować w łaźni ultradźwiękowej przez pięć minut.

Po granulowaniu kulek magnesem i usunięciu supinatu, dodaj jeden mililitr 2% roztworu SDS do każdej probówki, a następnie wymieszaj przez wirowanie i foliowanie przez pięć minut. Teraz zbierz koraliki. Dodaj jeden mililitr 0,2 molowego EDTA pH siedem do każdej probówki i inkubuj probówki w łaźni ultradźwiękowej przez pięć minut.

Następnie zbierz koraliki, umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem wody, a następnie jednym mililitrem 10-milimolowego roztworu chlorku kobaltu. Umieść probówki na shakerze na 10 minut. Przystąp do zbierania koralików na magnesie i ponownie zawieś w jednym mililitrze bufora wiążącego.

Umyj dwukrotnie w jednym mililitrze 20% etanolu, na koniec ponownie zawieś kulki w ich pierwotnej objętości 20% etanolu, aby uzyskać zregenerowane kulki w stężeniu 40 miligramów na mililitr. Skorygowano radioaktywność tła poprzez ustawienie sterowania. Próbka pierwsza jako wartość promieniotwórczości 0%, a próbka kontrolna druga jako wartość 100% radioaktywności.

Teraz dla każdej próbki oblicz procentową zawartość radioaktywności w stanie jako miarę całkowitego wytrącania się wirusa znakowanego radiowo przez nanociało. Eksperyment ten ocenia powinowactwo PVSS 38 C i przeciwciała specyficznego dla wirusa polio przy użyciu trzech różnych antygenów wirusa polio, antygenu natywnego, podgrzanego antygenu i podjednostek 14 s. Co ciekawe, radioaktywność w stanie próbek zawierających znakowane radioaktywnie podjednostki 14 s zmniejsza się wraz ze wzrostem stężenia nanociała PVSS 38 C. Wskazuje to na wzrost ilości podjednostek s wirusa polio 14 związanych z nanociałem P pvs, S 38 C, a pośrednio z kulkami magnetycznymi.

Ponieważ nie obserwuje się powinowactwa pvs S 38 C do antygenowej i antygenowej formy H wirusa polio, nanociało wydaje się specyficzne dla podjednostki 14 s wirusa polio. Powinowactwo nanociała do jego antygenów, mierzone tą metodą, jest specyficzne jak niepowiązane nanociało. Uwaga: jeden nie wykazuje reaktywności wobec trzech form antygenowych wirusa polio.

System ten zapewnia wysoką odtwarzalność, jak wskazano w tej krzywej odpowiedzi na dawkę wygenerowanej przez różnych badaczy w różnych dniach. Po opanowaniu tej niezawodnej fazy ciekłej, test wychwytywania powinowactwa można prawidłowo przeprowadzić w ciągu dwóch godzin, recykling dołączonych bitów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak korzystać z tego testu wychwytywania powinowactwa do fazy ciekłej opartego na uderzeniach magnetycznych podczas badania interakcji między różnymi białkami, zwłaszcza gdy nie można zastosować układów opartych na fazie stałej.