Name: Wykrywanie rzadkich wariantów genomowych z sekwencjonowania zbiorczego za pomocą SPLINTER (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 6 s
Description: Poznaj analizę sekwencjonowania zbiorczego DNA przy użyciu algorytmu SPLINTER. Ta metoda obliczeniowa umożliwia precyzyjne wykrywanie rzadkich wariantów genetycznych w dużych populacjach, co jest kluczowe dla badań nad genetyką złożonych cech i chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez grant Children's Discovery Institute MC-II-2006-1 (RDM i TED), grant NIH Epigenetics Roadmap [1R01DA025744-01 oraz 3R01DA025744-02S1] (RDM i FLMV), U01AG023746 (SC), fundację Saigh Foundation (FLMV i TED), grant 1K08CA140720-01A1 oraz wsparcie z nagrody Alex's Lemonade Stand „A” (TED). Dziękujemy Genome Technology Access Center w Departamencie Genetyki na Washington University School of Medicine za pomoc w analizie genomowej. Centrum jest częściowo wspierane przez grant NCI Cancer Center Support #P30 CA91842 dla Siteman Cancer Center oraz grant ICTS/CTSA #UL1RR024992 z National Center for Research Resources (NCRR), komponentu National Institutes of Health (NIH), a także NIH Roadmap for Medical Research. Niniejsza publikacja jest wyłączną odpowiedzialnością autorów i nie musi reprezentować oficjalnego stanowiska NCRR lub NIH.

<ol><li>Vallania, F. L. M., Druley, T. E., Ramos, E., Wang, J., Borecki, I., Province, M., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+discovery+of+rare+insertions+and+deletions+in+large+cohorts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">High-throughput discovery of rare insertions and deletions in large cohorts.</a> Genome Research. 20, 1391-1397 (2010).</li>
<li>Shendure, J., Mitra, R., Varma, C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+Sequencing+Technologies%3A+Methods+and+Goals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Advanced Sequencing Technologies: Methods and Goals.</a> Nature Reviews of Genetics. 5, 335-344 (2004).</li>
<li>The 1000 Genomes Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+human+genome+variation+from+population-scale+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of human genome variation from population-scale sequencing.</a> Nature. 467, 1061-1073 (2010).</li>
<li>Manolio, T. A., Collins, F. S., Cox, N. J., Goldstein, D. B., Hindorff, L. A., Hunter, D. J., McCarthy, M. I., Ramos, E. M., Cardon, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+missing+heritability+of+complex+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the missing heritability of complex diseases.</a> Nature. 461, 747-753 (2009).</li>
<li>Reich, D. E., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+allelic+spectrum+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">On the allelic spectrum of human disease.</a> Trends Genet. 17, 502-510 (2001).</li>
<li>Cohen, J. C., Kiss, R. S., Pertsemlidis, A., Marcel, Y. L., McPherson, R., Hobbs, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+rare+alleles+contribute+to+low+plasma+levels+of+HDL+cholesterol%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiple rare alleles contribute to low plasma levels of HDL cholesterol.</a> Science. 305, 869-872 (2004).</li>
<li>Ji, W., Foo, J. N., O'Roak, B. J., Zhao, H., Larson, M. G., Simon, D. B., Newton-Cheh, C., State, M. W., Levy, D., Lifton, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+independent+mutations+in+renal+salt+handling+genes+contribute+to+blood+pressure+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Rare independent mutations in renal salt handling genes contribute to blood pressure variation.</a> Nat. Genet. 40, 592-599 (2008).</li>
<li>Ahituv, N., Kavaslar, N., Schackwitz, W., Ustaszewska, A., Martin, J., Hebert, S., Doelle, H., Ersoy, B., Kryukov, G., Schmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+sequencing+at+the+extremes+of+human+body+mass%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Medical sequencing at the extremes of human body mass.</a> Am. J. Hum. Genet. 80, 779-791 (2007).</li>
<li>Druley, T. E., Vallania, F. L., Wegner, D. J., Varley, K. E., Knowles, O. L., Bonds, J. A., Robison, S. W., Doniger, S. W., Hamvas, A., Cole, F. S., Fay, J. C., Mitra, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+rare+allelic+variants+from+pooled+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of rare allelic variants from pooled genomic DNA.</a> Nat. Methods. 6, 263-265 (2009).</li>
<li>Mitra, R. D., Butty, V., Shendure, J., Housman, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Genotyping+and+Haplotyping+with+Polymerase+Colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Digital Genotyping and Haplotyping with Polymerase Colonies.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 5926-5931 (2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że częstość występowania i odpowiedź terapeutyczna w przypadku powszechnych, złożonych fenotypów i chorób, takich jak otyłość8, hipercholesterolemia4, nadciśnienie tętnicze7 i inne, mogą być modyfikowane przez osobiste profile rzadkich wariantów. Identyfikacja genów i szlaków, w których warianty te gromadzą się w populacjach dotkniętych tymi schorzeniami, będzie miała istotne znaczenie diagnostyczne i terapeutyczne, jednak osobna analiza chorych osób może być zbyt czasochłonna i kosztowna. Analiza oparta na populacji oferuje bardziej efektywną metodę badania zmienności genetycznej w wielu loci.
Przedstawiamy nowatorski protokół sekwencjonowania zpulowanych próbek DNA w połączeniu z pakietem oprogramowania SPLINTER, zaprojektowany do identyfikacji tego typu wariancji genetycznej w populacjach. Demonstrujemy dokładność tej metody w identyfikacji i kwantyfikacji rzadkich alleli w dużej zpulowanej populacji 947 osobników, w tym wariantów rzadkich, które zostały zidentyfikowane de novo z sekwencjonowania puli i zwalidowane za pomocą indywidualnego pirosekwencjonowania. Nasza strategia różni się od innych protokołów głównie włączeniem kontroli pozytywnej i negatywnej do każdego eksperymentu. Pozwala to programowi SPLINTER osiągnąć znacznie wyższą dokładność i moc w porównaniu do innych podejść1. Optymalne pokrycie 25-krotne na allel jest stałe, niezależnie od wielkości puli, co sprawia, że analiza dużych pul jest wykonalna, ponieważ wymóg ten skaluje się liniowo wraz z wielkością puli. Nasze podejście jest bardzo elastyczne i może być stosowane do każdego interesującego fenotypu, a także do próbek naturalnie heterogennych, takich jak mieszane populacje komórek i biopsje guzów. Biorąc pod uwagę rosnące zainteresowanie sekwencjonowaniem pul z dużych regionów docelowych, takich jak eksom lub genom, nasze przygotowanie bibliotek i analiza SPLINTER są kompatybilne z sekwencjonowaniem typu custom-capture oraz sekwencjonowaniem całego eksomu, jednak narzędzie do dopasowywania w pakiecie SPLINTER nie zostało zaprojektowane dla dużych sekwencji referencyjnych. W związku z tym z powodzeniem wykorzystaliśmy program do dopasowywania oparty na programowaniu dynamicznym, Novoalign, do dopasowań w całym genomie, a następnie do identyfikacji wariantów z zpulowanej próbki (Ramos et al., w trakcie recenzji). Zatem nasza strategia sekwencjonowania pul może być z powodzeniem skalowana do większych pul z coraz większą ilością sekwencji docelowej.

<table><tbody><tr><td>PfuUltra High-Fidelity</td><td>Agilent</td><td>600384</td><td>1.4</td></tr><tr><td>Betaina</td><td>SIGMA</td><td>B2629</td><td>1.4</td></tr><tr><td>Wektor ssDNA M13mp18</td><td>NEB</td><td>N4040S</td><td>1.5</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>1.5</td></tr><tr><td>Polinukleotydowa kinaza T4</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Ligaza T4</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy 8000 MW</td><td>SIGMA</td><td>P5413</td><td>2.2</td></tr><tr><td>Sonikator Bioruptor</td><td>Diagenode</td><td>UCD-200-TS</td><td>2.3</td></tr></tbody></table>

wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu splinter

Detection of Rare Genomic Variants from Pooled Sequencing Using SPLINTER

Wraz z gwałtownym postępem technologii sekwencjonowania DNA w ostatnich latach2, staje się coraz bardziej oczywiste, że stopień zmienności genetycznej między dowolnymi dwiema osobnikami jest większy, niż wcześniej sądzono3. Z kolei genotypowanie oparte na mikromacierzach nie pozwoliło na zidentyfikowanie istotnego wpływu powszechnych wariantów sekwencji na zmienność fenotypową powszechnych chorób4,5. Wspólnie obserwacje te doprowadziły do sformułowania hipotezy powszechnych chorób i rzadkich wariantów (Common Disease / Rare Variant), sugerującej, że większość „brakującej dziedziczności” w powszechnych i złożonych fenotypach wynika zamiast tego z indywidualnego profilu rzadkich lub prywatnych wariantów DNA danej osoby6-8. Jednakże charakterystyka wpływu rzadkiej zmienności na złożone fenotypy wymaga analizy wielu dotkniętych osobników w wielu locusach genomowych, a w idealnym przypadku powinna być porównana z podobnym badaniem w kohorcie osób zdrowych. Pomimo mocy sekwencjonowania oferowanej przez dzisiejsze platformy, przeprowadzenie badania populacyjnego wielu locusów genomowych oraz późniejsza analiza obliczeniowa pozostają dla wielu badaczy barierą nie do przejścia.
Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy podejście oparte na sekwencjonowaniu puli1,9 oraz nowy pakiet oprogramowania1 do bardzo dokładnego wykrywania rzadkich wariantów z uzyskanych danych. Możliwość łączenia genomów z całych populacji dotkniętych osób oraz badania stopnia zmienności genetycznej w wielu celowanych regionach w ramach jednej biblioteki sekwencjonowania zapewnia doskonałe oszczędności kosztów i czasu w porównaniu z tradycyjną metodologią sekwencjonowania pojedynczych próbek. Przy średnim pokryciu sekwencjonowania na allel wynoszącym 25-krotność, nasz autorski algorytm, SPLINTER, wykorzystuje wewnętrzną strategię kontroli wywoływania wariantów do identyfikacji insercji, delecji i substytucji o długości do czterech par zasad z wysoką czułością i swoistością w pulach zawierających do 1 allelu mutanty na 500 osobników. W niniejszej pracy opisujemy metodę przygotowania biblioteki do sekwencjonowania puli, a następnie przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące korzystania z pakietu SPLINTER do analizy sekwencjonowania puli (<a href="http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter" target="_blank">http://www.ibridgenetwork.org/wustl/splinter</a>). Przedstawiamy porównanie sekwencjonowania puli 947 osób, z których każda przeszła również badanie macierzowe całego genomu, przy sekwencjonowaniu ponad 20kb na osobę. Zgodność między genotypowaniem wariantów oznaczonych i nowych wariantów wykrytych w próbce pulowanej była doskonała. Metodę tę można łatwo skalować do dowolnej liczby loci genomowych i dowolnej liczby osobników. Poprzez wprowadzenie wewnętrznych pozytywnych i negatywnych kontroli amplikonów w proporcjach naśladujących badaną populację, algorytm może zostać skalibrowany dla optymalnej wydajności. Strategię tę można również zmodyfikować do zastosowania w przechwytywaniu przez hybrydyzację lub z wykorzystaniem kodów kreskowych specyficznych dla danej osoby, a także zastosować do sekwencjonowania naturalnie heterogenicznych próbek, takich jak DNA nowotworu.

Sekwencjonowanie puli DNA jest szybką i kosztowo efektywną strategią wykrywania rzadkich wariantów związanych ze złożonymi fenotypami w dużych kohortach. W niniejszym materiale opisujemy analizę obliczeniową sekwencjonowania nowej generacji pul 32 genów związanych z nowotworami przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER. Metoda ta jest skalowalna i może być zastosowana do dowolnego analizowanego fenotypu.

Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

W związku z tym, że technologia sekwencjonowania DNA znacząco rozwinęła się w ostatnich latach2, staje się coraz bardziej oczywiste, że poziom zmienności genetycznej pomiędzy dowolnymi ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja genów w populacji osobników wykazujących przewagę rzadkich wariacji funkcjonalnych. Jest to realizowane poprzez wstępne łączenie próbek DNA z danej populacji. Drugim krokiem jest przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.Następnie przeprowadza się dopasowanie odczytów do sekwencji referencyjnej oraz tworzy model błędów. Ostatnim krokiem jest analiza obliczeniowa z wykorzystaniem algorytmu splinter. W końcowym etapie analiza splinter sekwencjonowania nowej generacji (NGS) z próbek pulowanych służy do wskazania genów w populacjach wykazujących przewagę rzadkiej wariancji funkcjonalnej. Prezentacja procedury.Dzisiaj wystąpi Francesco Vilania, doktorant w laboratorium mojego mentora i naszego współpracownika, Roba Mitry, a towarzyszyć mu będzie Enrique Ramos, doktorant w moim laboratorium. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak genotypowanie pojedynczych osobników, jest to, że pozwala ona na bardzo precyzyjne wykrywanie rzadkich wariantów sekwencji w mieszanej populacji cząsteczek DNA bez konieczności posiadania jakichkolwiek wcześniejszych informacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki i genomiki, takie jak określenie częstości występowania nowych rzadkich wariantów wywołujących choroby w dużych badaniach kohortowych.Każdy eksperyment typu splinter wymaga zastosowania kontroli negatywnej i pozytywnej w celu uzyskania optymalnej dokładności; przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, używając polimerazy DNA PFU ultra high fidelity. Kontrolą negatywną jest produkt PCR z dowolnej sekwencji DNA, o której wiadomo, że nie wykazuje zmienności genetycznej, takiej jak klonowany szkielet wektora.W tym przypadku wykorzystano amplikon o długości 1 934 par zasad z wektora M 13 MP 18. Kontrola pozytywna może stanowić dowolny zestaw wcześniej zwalidowanych wariantów sekwencji występujących w całej populacji. Jeśli dane te nie są dostępne, laboratorium to opracowało sztuczną kontrolę pozytywną składającą się z produktu PCR o długości 331 par zasad, otrzymanego z mieszaniny zmodyfikowanych sekwencji sklonowanych do wektora PGMT easy, zgodnie z listą w tej tabeli.Sekwencje te łączy się, aby naśladować różne częstotliwości występowania rzadkich alleli rzeczywistych wariantów w populacji pacjentów. Po amplifikacji PCR próbek, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi, każdy produkt PCR należy oczyścić z nadmiaru starterów, wykorzystując zestaw do szybkiej puryfikacji kolumnowej Kyogen Kayak lub płyty filtrujące z 96 dołkami z manifoldem próżniowym w przypadku oczyszczania na dużą skalę. Po puryfikacji należy określić ilość każdego produktu PCR przy użyciu standardowych technik.Przygotuj wszystkie produkty PCR oraz kontrole do połączenia w pulę znormalizowaną według liczby cząsteczek. Łączenie według stężenia spowoduje nadreprezentację krótkich amplikonów względem dłuższych produktów. Zamiast tego, połącz znormalizowaną liczbę cząsteczek na każdy amplikon.Wybierz dowolne liczby, które są wystarczająco duże, aby zachować dokładność podczas pipetowania. Pobierz produkty PCR oraz kontrole. Ligacja produktów PCR jest konieczna, ponieważ fragmentacja krótkich amplikonów PCR prawdopodobnie spowodowałaby błąd reprezentacji w kierunku ich końców.Z tego powodu produkty PCR podlegają ligacji do dużych wektorów przed ich fragmentacją. Przygotować mieszaninę do ligacji tępych końców, używając ligazy T4, T4 PNK oraz PEG, zgodnie z listą w protokole. Inkubować reakcję w temperaturze 22 °C przez 17 godzin.Następnie inkubować w temperaturze 65°C przez 20 minut, a potem przechowywać w temperaturze 4°C. Po tym czasie sprawdzić ligację, nakładając 50 ng próbki na żel agarozowy. Prawidłowa ligacja objawi się obecnością prążka o wysokiej masie cząsteczkowej w odpowiedniej ścieżce.Przygotuj próbkę do fragmentacji DNA za pomocą strategii sonikacji losowej, rozcieńczając ją w stosunku 10:1 w buforze Qiagen PB w celu zmniejszenia lepkości. Następnie przeprowadź fragmentację dużych ilości produktów PCR, korzystając z urządzenia Diagenode Bioruptor (24 próbki), sonikując z dużą mocą przez 25 minut, stosując cykle 40 sekund pracy i 20 sekund przerwy w każdej minucie. Sprawdź wyniki fragmentacji DNA na żelu agarozowym i przystąp do sekwencjonowania Illumina zgodnie z opisem w tekście.Aby rozpocząć sekwencjonowanie, wykonaj dopasowanie odczytów. Przekonwertuj surowe pliki z odczytami z sekwencjonowania do formatu scarf lub je skompresuj. Kompresja jest opcjonalna.Pozwala to zaoszczędzić czas i miejsce w kolejnych etapach analizy bez utraty istotnych informacji. Używając dołączonego narzędzia do dopasowania, dopasuj surowe odczyty do adnotowanej, szybszej sekwencji referencyjnej. Do obszarów docelowych należy włączyć reakcje PCR, a także kontrole pozytywne i negatywne.Format wejściowy musi być zgodny z formatem scarf lub skompresowany. Następnie należy przeprowadzić tagowanie plików zgodnie z opisem w tekście. Każdy przebieg generuje unikalny profil błędów sekwencjonowania, który należy scharakteryzować w celu dokładnego wywoływania wariantów (variant calling), aby zamodelować błędy dla każdego przebiegu.W każdej bibliotece próbek z puli, pochodzącej z wyrównanego pliku z tagami, zawarto kontrolę wewnętrzną o znanej zmienności sekwencji. Należy wygenerować plik modelu błędów za pomocą dołączonego narzędzia, wykorzystując sekwencję referencyjną kontroli negatywnej; można użyć całej sekwencji kontroli negatywnej lub alternatywnie tylko jej podzbioru, określonego przez końce 5' i 3'. Należy zawsze stosować unikalne odczyty oraz pseudo-liczniki.Narzędzie wygeneruje trzy pliki, których nazwy będą odpowiadać parametrowi nazwy pliku wyjściowego z końcówką zero, jeden lub dwa. Pliki te odpowiadają odpowiednio modelom błędów rzędu zero, pierwszego i drugiego dla wywołania wariantów (variant calling) przy użyciu programu splinter. W celu wizualizacji profilu współczynnika błędów przebiegu należy zawsze używać modelu błędów drugiego rzędu.Skrypt Perl użyty do wykreślenia wykresu modelu błędów może zostać wykorzystany do wygenerowania w formacie PDF wykresu błędów dla pliku modelu błędów zerowego rzędu. Plik wykresu ujawni trendy błędów specyficzne dla danego przebiegu i może zostać wykorzystany do określenia maksymalnej liczby baz odczytanych do analizy. W następnej sekcji zostanie zademonstrowane, jak uruchomić program splinter na pliku wyrównanym, wykorzystując model błędów do wykrywania rzadkich wariantów sekwencji.Pierwszym krokiem analizy jest uruchomienie programu splinter na wyrównanym pliku, przy użyciu sekwencji referencyjnej oraz modelu błędów. Pojedyncze zasady odczytów mogą zostać wykluczone z analizy, jeśli zostaną uznane za wadliwe. Próg wartości p określa rygorystyczność analizy wykrywania wariantów.Dobrym punktem wyjścia jest minimalna wartość odcięcia wynosząca -1,301. Opcja wielkości puli (pool size) optymalizuje dyskryminację sygnału od szumu w algorytmie poprzez eliminację potencjalnej wariancji przy częstościach mniejszych alleli niższych niż częstość pojedynczego allela w rzeczywistej puli. Opcję wielkości puli należy ustawić na najbliższą wartość, która jest większa niż rzeczywista liczba alleli analizowanych w eksperymencie.Warianty wykryte przy niższych częstotliwościach zostaną zignorowane jako szum. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów i nazw plików uruchom program splinter. Plik ten zwraca wszystkie statystycznie istotne trafienia w całej próbce wraz z opisem pozycji oraz typu wariantu.Wartość p na częstotliwość występowania wariantu na nić DNA oraz całkowite pokrycie na nić DNA. Plik listy jest wykorzystywany przez program splinter do normalizacji pokrycia w całej próbce. Pierwsze pole wskazuje interesujący nas amplikon, natomiast drugie pole wskazuje pozycję, w której występuje mutacja.N oznacza, że reszta sekwencji nie zawiera żadnej mutacji. Po normalizacji kluczowa jest analiza kontroli pozytywnej, aby zmaksymalizować czułość i swoistość dla danego przebiegu. Jest to istotne, ponieważ najprawdopodobniej początkowy punkt odcięcia wynoszący -1,301 nie będzie wystarczający do wyeliminowania wszystkich wyników fałszywie dodatnich.Każda analiza splinter wykaże rzeczywistą wartość P dla każdego zidentyfikowanego wariantu, której nie można było przewidzieć priorytetowo. Jednakże całą analizę można powtórzyć, stosując najmniej rygorystyczną wartość P wyświetloną w początkowym wyniku dla znanych pozycji bazowych będących prawdziwie dodatnimi. Pozwoli to na zachowanie wszystkich wyników prawdziwie dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu większości, jeśli nie wszystkich, wyników fałszywie dodatnich, które zazwyczaj mają znacznie mniej istotne wartości P w porównaniu do wyników prawdziwie dodatnich.Aby zautomatyzować ten proces, można zastosować skrypt do wyznaczania wartości odcięcia (cutoff tester script). Skrypt ten wymaga pliku wynikowego z programu Splinter oraz listy trafień kontroli pozytywnej w formie pliku rozdzielonego tabulatorami, analogicznego do pliku użytego podczas normalizacji. Wynikiem będzie lista wartości odcięcia, które stopniowo prowadzą do wyznaczenia wartości optymalnej.Ostatnia linia reprezentuje najbardziej optymalną wartość odcięcia dla danego przebiegu i może zatem zostać wykorzystana do analizy danych. Optymalnym wynikiem jest osiągnięcie czułości i swoistości na poziomie jeden. Jeśli jednak nie zostanie to osiągnięte, analizę splinter można zoptymalizować poprzez zmianę liczby uwzględnionych zasad odczytanych.Ostateczny próg odcięcia można zastosować do danych za pomocą skryptu cutoff cut, który odfiltruje z pliku wyjściowego splinter wyniki poniżej optymalnego progu. Krok ten wygeneruje końcowy plik wyjściowy splinter, który będzie zawierał snipy oraz indele obecne w próbce. Należy pamiętać, że format danych wyjściowych dla insercji różni się nieco od formatu dla substytucji lub delecji.Na tego typu wykresie przedstawiono dokładność w funkcji pokrycia dla pojedynczego allelu w próbce pulowanej. Dokładność szacowana jest jako pole pod krzywą (skrót AUC) charakterystyki pracy odbiornika i mieści się w zakresie od wartości 0,5, odpowiadającej dokładności losowej, do 1,0, oznaczającej dokładność idealną. W tym przykładzie AUC jest przedstawione jako funkcja pokrycia na allel dla detekcji pojedynczych alleli zmutowanych w pulach zawierających od 200 do 1 000 000 alleli.Poniżej przedstawiono UC w funkcji całkowitej liczby insercji, delecji i substytucji. Ten wykres błędów obrazuje prawdopodobieństwo wbudowania błędnej zasady w danej pozycji. Profil błędów wykazuje niskie wskaźniki błędów z tendencją wzrostową w kierunku końca 3' odczytu sekwencjonowania.Wyraźnie odmienne nukleotydy referencyjne wykazują różne prawdopodobieństwa błędów. Wykres ten przedstawia dokładność narzędzia splinter w szacowaniu częstości alleli dla pozycji, które posiadały pokrycie większe niż 25-krotne na allel. Porównanie częstości alleli w puli DNA oszacowanych przez splinter z liczbą alleli zmierzoną w badaniach asocjacyjnych całego genomu lub wynikami GWAS.Przy bardzo wysokiej korelacji wyselekcjonowano populację 974 osobników, a do sekwencjonowania wyznaczono obszary o długości ponad 20 kb. W celu wykrycia rzadkich wariantów zastosowano narzędzie Splinter. Zgodnie ze standardowym protokołem, w przypadku każdego osobnika przeprowadzono wcześniej genotypowanie, wykorzystując zgodność GWAS pomiędzy genotypowaniem wariantów oznakowanych (tagged) i nowych.Wyniki odczytów w próbce pulowanej były doskonałe. Na podstawie wyników sekwencjonowania zidentyfikowano de novo trzy warianty, z których dwa były rzadkie w populacji; zostały one zwalidowane za pomocą indywidualnego sekwencjonowania pirosequencingiem, a zgodność częstotliwości rzadkich alleli lub zgodność matematyczna między sekwencjonowaniem pirosequencingiem a sekwencjonowaniem pulowanym była doskonała. Po zidentyfikowaniu rzadkiego wariantu w próbce pulowanej, wielu badaczy pragnie dowiedzieć się, jakie są konsekwencje funkcjonalne zidentyfikowanego wariantu.Kolejnym krokiem w procesie po etapie rozwoju jest adnotacja wariantów. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie sekwencjonowania DNA do szybkiego i kosztowo efektywnego badania rzadkich wariantów w celu ich charakterystyki w dużych badaniach populacyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykrywania rzadkich wariantów sekwencji w puli próbek DNA z wykorzystaniem metody splinter.

detection-rare-genomic-variants-from-pooled-sequencing-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie rzadkich wariantów genomowych z sekwencjonowania pulowego z wykorzystaniem SPLINTER

Strategia genetyki molekularnej w celu znalezienia mutacji de novo powodujących powszechne zaburzenia, takie jak autyzm i schizofrenia.

Strategia identyfikacji mutacji de novo w powszechnych zaburzeniach, takich jak autyzm i schizofrenia

Opisujemy przygotowanie bibliotek DNA z kodami kreskowymi i późniejsze przechwytywanie eksonów oparte na hybrydyzacji do wykrywania kluczowych mutacji związanych z rakiem w klinicznych próbkach guzów poprzez masowo równoległe sekwencjonowanie "nowej generacji". Celowane sekwencjonowanie eksonów oferuje korzyści w postaci wysokiej przepustowości, niskich kosztów i głębokiego pokrycia sekwencji, zapewniając w ten sposób wysoką czułość wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości.

Wykrywanie somatycznych zmian genetycznych w próbkach nowotworowych poprzez wychwytywanie eksonów i masowo równoległe sekwencjonowanie

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje technikę wykrywania mutacji o niskiej częstotliwości w ctDNA, ER-Seq. Metoda ta wyróżnia się unikalnym zastosowaniem dwukierunkowej korekcji błędów, specjalnego filtra tła i wydajnej akwizycji molekularnej.

Wykrywanie rzadkich mutacji w ctDNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) to potężne narzędzie do charakterystyki genomu, które jest ograniczone przez wysoki poziom błędów platformy (~0,5–2,0%). Opisujemy nasze metody sekwencjonowania z korekcją błędów, które pozwalają nam wyeliminować wskaźnik błędów NGS i wykryć mutacje przy frakcjach alleli wariantów tak rzadkich, jak 0,0001.

Wykrywanie rzadkich zdarzeń za pomocą sekwencjonowania DNA i RNA z korekcją błędów

Opracowaliśmy opłacalną metodę śledzenia dynamiki alleli polimorfizmu niepojedynczego nukleotydu, którą można łatwo dostosować do eksperymentalnej ewolucji zamrożonych archiwów. Technikę tripletowej PCR połączono z automatyczną równoległą elektroforezą kapilarną w celu ilościowego określenia względnej częstości allelu insercji w trakcie ewolucji eksperymentalnej.

Śledzenie dynamiki wariantów strukturalnych w eksperymentalnie wyewoluowanych populacjach

Opracowaliśmy międzygatunkowe porównawcze podejście onkogenomiczne, wykorzystując analizy genomiczne i funkcjonalne badania genomowe do identyfikacji i porównania celów terapeutycznych w nowotworach powstających w genetycznie modyfikowanych modelach mysich i odpowiadającym im typie nowotworu ludzkiego.

Profilowanie genetyczne i badania przesiewowe w skali genomu w celu identyfikacji celów terapeutycznych w mysich modelach złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych

Izolacja genomowego DNA z ogonów myszy

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Poznaj analizę sekwencjonowania zbiorczego DNA przy użyciu algorytmu SPLINTER. Ta metoda obliczeniowa umożliwia precyzyjne wykrywanie rzadkich wariantów genetycznych w dużych populacjach, co jest kluczowe dla badań nad genetyką złożonych cech i chorób.

Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

Przeglądaj więcej filmów