Wykrywanie rzadkich wariantów genomowych z sekwencjonowania zbiorczego za pomocą SPLINTER
June 23rd, 2012
Sekwencjonowanie DNA w puli to szybka i opłacalna strategia wykrywania rzadkich wariantów związanych ze złożonymi fenotypami w dużych kohortach. W tym miejscu opisujemy analizę obliczeniową zbiorczego sekwencjonowania nowej generacji 32 genów związanych z rakiem przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER. Ta metoda jest skalowalna i ma zastosowanie do każdego fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania.
Ogólnym celem tej procedury jest identyfikacja genów w populacji osób wykazujących przewagę rzadkiej zmienności funkcjonalnej. Osiąga się to poprzez najpierw zebranie populacji próbek DNA. Drugim krokiem jest utworzenie i sekwencjonowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.
Następnie następuje wyrównanie odczytów do sekwencji referencyjnej i utworzenie modelu błędów. Ostatnim krokiem jest analiza obliczeniowa z wykorzystaniem algorytmu odłamkowego. Ostatecznie analiza odłamkowa zbiorczego sekwencjonowania nowej generacji służy do pokazania genów w populacjach z przewagą rzadkiej wariancji funkcjonalnej Demonstrując procedurę.
Dzisiaj będzie Francesco Vilania, który jest doktorantem w laboratorium mojego mentora i naszego współpracownika, Roba Mitry, a dołączy do niego Enrique Ramos, doktorant w moim laboratorium. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pojedyncze pojedyncze genotypy, jest to, że pozwala ona na bardzo precyzyjne wykrycie rzadkich wariantów sekwencji w mieszanej populacji cząsteczki DNA bez konieczności uzyskiwania jakichkolwiek wcześniejszych informacji. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki i genomiki, takie jak sposób określenia częstości występowania nowych chorób powodujących rzadkie warianty w dużych badaniach kohortowych.
Każdy eksperyment z odłamkami wymaga obecności kontroli ujemnej i dodatniej, aby uzyskać optymalną dokładność, przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR przy użyciu PFU ultra wysokiej wierności. Polimeraza DNA. Kontrola ujemna to produkt PCR z dowolnej sekwencji DNA, o której wiadomo, że nie ma zmienności genetycznej, takiej jak sklonowany szkielet wektora.
W tym przypadku używany jest amplikon 1 934 par zasad z wektora M 13 MP 18. Kontrolą dodatnią może być dowolny zestaw wcześniej zwalidowanych wariantów sekwencji obecnych w całej populacji. Jeśli te dane nie są dostępne, laboratorium to zaprojektowało sztuczną kontrolę pozytywną składającą się z 331 zasad na produkt PCR z mieszanki zmodyfikowanych sekwencji sklonowanych do łatwego wektora PGMT, jak podano w tej tabeli.
Sekwencje te są łączone w celu naśladowania różnych częstości występowania mniejszych alleli prawdziwych wariantów w puli pacjentów. Po amplifikacji próbek metodą PCR, jak omówiono w pisemnym protokole dołączonym do tego filmu, oczyść każdy produkt PCR z nadmiaru starterów za pomocą szybkiego oczyszczania kolumny kajakowej kyogen lub 96-dołkowych płytek filtracyjnych z kolektorem próżniowym w celu czyszczenia na dużą skalę. Po oczyszczeniu należy określić ilościowo każdy produkt PCR przy użyciu standardowych technik.
Przygotuj się do połączenia wszystkich produktów PCR i kontroli w pulę znormalizowaną przez liczbę cząsteczek. Łączenie według koncentracji spowoduje nadreprezentację małych amplikonów w stosunku do większych produktów. Zamiast tego zbierz znormalizowaną liczbę cząsteczek na amplikony.
Wybierz dowolne liczby, które są wystarczająco duże, aby zachować dokładność podczas pipetowania. Wyciągnij produkty i elementy sterujące PCR. Podwiązanie produktów PCR jest konieczne, ponieważ rozdrobnienie małych kandydatów do PCR prawdopodobnie skłania reprezentację do ich celów.
Z tego powodu podwiązujemy produkty pull PCR do dużych konwencji przed ich fragmentacją. Przygotuj mieszankę do podwiązania przy użyciu T four Ligase, T four PNK i PEG zgodnie z podaniem w protokole. Inkubować reakcję w temperaturze 22 stopni Celsjusza przez 17 godzin.
Następnie inkubować w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 20 minut i utrzymywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sprawdź ligację, ładując 50 nanogramów próbki do powstałego żelu. Udana ligacja spowoduje, że w pasie pojawi się pasmo o dużej masie cząsteczkowej.
Przygotuj się do fragmentacji DNA za pomocą losowej strategii sonikacji, rozcieńczając próbkę 10 do jednego w buforze Qiagen PB, aby była mniej lepka. Następnie rozdrobnić duży stożek produktów PCR za pomocą biopęknięcia węzła dwubiegunowego 24 próbek, sonikować z dużą mocą w ciągu 25 minut z 40 sekundami włączenia i 20 sekundami przerwy na minutę. Sprawdź wyniki fragmentacji DNA na agrożelu i przystąp do sekwencjonowania świetlnego zgodnie z opisem w tekście.
Aby rozpocząć sekwencjonowanie, odczytaj wyrównanie. Konwertuj surowe sekwencjonowanie, czytaj pliki do formatu szalika lub kompresuj je. Kompresja jest opcjonalna.
Oszczędza to czas i miejsce na kolejne etapy analizy, nie tracąc przy tym żadnych istotnych informacji. Korzystając z dołączonego narzędzia do wyrównywania, wyrównaj nieprzetworzone odczyty do szybszej sekwencji referencyjnej z adnotacjami. Specyficzne dla regionów docelowych obejmują reakcje PCR, a także kontrole pozytywne i ujemne.
Format wejściowy musi być w formacie szalika lub skompresowany. Następnie wykonaj tagowanie plików zgodnie z opisem w tekście. Każdy przebieg generuje unikatowy profil błędu sekwencjonowania, który należy scharakteryzować pod kątem dokładnego wywoływania wariantu w celu modelowania błędów dla każdego przebiegu.
Wewnętrzna kontrola, o której wiadomo, że jest wdrażana w odniesieniu do zmienności sekwencji, jest zawarta w każdej bibliotece próbek puli Z wyrównanego oznaczonego pliku. Wygeneruj plik modelu błędu za pomocą dołączonego narzędzia z sekwencją odniesienia kontroli ujemnej, można użyć całej sekwencji kontroli ujemnej lub alternatywnie tylko podzbioru, gdy jest określony przez pięć końców pierwszych i trzy końce pierwsze. Zawsze należy stosować unikatowe odczyty i pseudoliczby.
Narzędzie wygeneruje trzy pliki nazwane jako parametr nazwy pliku wyjściowego kończący się na zero, jeden lub dwa. Pliki te odpowiadają zerowemu modelowi błędów pierwszego i drugiego rzędu odpowiednio dla wywołania wariantu z odłamkiem. Model błędów drugiego rzędu powinien być zawsze używany do wizualizacji profilu współczynnika błędów uruchamiania.
Skrypt Pearl używany do wykreślania wykresu modelu błędu może być wykorzystany do wygenerowania wykresu błędu PDF w pliku modelu błędu zerowego rzędu. Plik wykresu ujawni trendy błędów specyficznych dla przebiegu i może być wykorzystany do wywnioskowania maksymalnej liczby baz odczytu dla analizy. W poniższej sekcji pokazano, jak uruchomić odłamek na wyrównanym pliku przy użyciu modelu błędów w celu wykrycia rzadkich wariantów sekwencji.
Pierwszym krokiem analizy jest uruchomienie drzazgi na wyrównanym pliku przy użyciu sekwencji referencyjnej i modelu błędów. Pojedyncze bazy odczytu mogą zostać wyłączone z analizy, jeśli okaże się, że są wadliwe. Wartość odcięcia wartości P określa, jak rygorystyczna będzie analiza wywołań wariantów.
Minimalny punkt odcięcia na poziomie minus 1,301 to dobry początek. Opcja rozmiaru puli optymalizuje dyskryminację sygnału algorytmu do szumu, eliminując potencjalną wariancję przy mniejszych częstotliwościach alleli mniejszych niż w przypadku pojedynczego allelu w rzeczywistej puli. Opcja rozmiaru puli powinna być ustawiona na najbliższą wartość, która jest większa niż rzeczywista liczba alleli analizowanych w eksperymencie.
Wariancja wywoływana przy niższych częstotliwościach będzie ignorowana jako szum. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów i nazw plików uruchamiamy splinter. Ten plik zwraca wszystkie działania, które są statystycznie istotne w całej próbce, wraz z opisem pozycji typu wariantu wariantu.
Wartość P na nić DNA, częstość wariantu i całkowite pokrycie na nić DNA. Fiolka z listą jest używana przez odłamek do normalizacji pokrycia w próbce. Pierwsze pole wskazuje interesujący nas amplikon, podczas gdy drugie pole wskazuje pozycję, w której mutacja jest obecna.
N wskazuje, że reszta sekwencji nie zawiera żadnej mutacji. Normalizacja, analiza kontroli pozytywnej jest kluczem do maksymalizacji czułości i swoistości dla konkretnej serii. Jest to ważne, ponieważ najprawdopodobniej początkowy punkt odcięcia minus 1,301 nie wystarczy, aby wyeliminować wszystkie fałszywe alarmy.
Każda analiza odłamków pokaże rzeczywistą wartość P dla każdego wywołanego wariantu, którego nie można było przewidzieć jako priorytetu. Jednak całą analizę można powtórzyć, stosując najmniej rygorystyczną wartość P wyświetlaną na początkowym wyjściu dla znanych prawdziwie dodatnich pozycji bazowych. Będzie to służyć do zachowania wszystkich wyników prawdziwie dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu większości, jeśli nie wszystkich, wyników fałszywie dodatnich, które zazwyczaj mają znacznie mniej znaczące wartości P w porównaniu z wartościami prawdziwie dodatnimi.
Aby zautomatyzować ten proces, można użyć skryptu testera odcięcia. Skrypt testera odcięcia wymaga pliku wyjściowego odłamka i listy pozytywnych trafień kontrolnych w postaci pliku rozdzielanego tabulatorami, takiego jak ten używany do normalizacji. Wynikowym wynikiem będzie lista punktów odcięcia, które stopniowo osiągają optymalny.
Ostatni wiersz reprezentuje najbardziej optymalną wartość odcięcia dla przebiegu i dlatego może być używany do analizy danych. Optymalnym wynikiem jest osiągnięcie czułości i swoistości jednego z nich. Jeśli jednak nie zostanie osiągnięta, analizę odłamków można zoptymalizować, zmieniając liczbę włączonych baz odczytu.
Końcowe odcięcie można zastosować do danych za pomocą skryptu cutoff cut, który przefiltruje plik wyjściowy odłamka z trafień poniżej optymalnego odcięcia. Ten krok spowoduje wygenerowanie końcowego pliku wyjściowego odłamka, który będzie zawierał wycinki i indele obecne w próbce. Należy pamiętać, że dane wyjściowe dla wstawień są nieco inne niż dla podstawień lub usunięć.
Dokładność jako funkcja pokrycia pojedynczego allelu w próbce zbiorczej jest wizualizowana na tym typie wykresu. Dokładność jest szacowana jako obszar pod krzywą w skrócie UC krzywej operatora odbiornika i waha się od losowej dokładności 0,5 do doskonałej dokładności 1,0. W tym przykładzie UC jest wykreślany jako funkcja pokrycia na allel w celu wykrycia pojedynczych zmutowanych alleli w pulach 200 501 000 alleli.
W tym miejscu UC jest wykreślana jako funkcja sumy dla wstawień, delecji i podstawień. Ten wykres błędu pokazuje prawdopodobieństwo uwzględnienia błędnej podstawy w danej pozycji. Profil błędu pokazuje niskie wskaźniki błędów z rosnącym trendem w kierunku trzech głównych końców odczytu sekwencjonowania.
Warto zauważyć, że różne nukleotydy referencyjne wykazują różne prawdopodobieństwa błędu. Ten wykres ujawnia dokładność drzazgi w szacowaniu częstości alleli dla pozycji, które miały więcej niż 25-krotne pokrycie na allel. Porównanie łącznych częstości występowania alleli DNA oszacowanych za pomocą odłamka z liczbą alleli mierzoną za pomocą badań asocjacyjnych całego genomu lub wyników GWAS.
W bardzo wysokiej korelacji pobrano populację 974 osobników, które skierowano do sekwencjonowania ponad 20 kilozasad. Drzazga została zastosowana do wykrywania rzadkich wariantów. Zgodnie ze standardowym protokołem, każda osoba została wcześniej poddana genotypowaniu za pomocą zgodności gwas między genotypowaniem oznaczonych i nowych wariantów.
Wywołane w próbie zbiorczej były doskonałe. Trzy warianty, z których dwa były rzadkie w populacji, nazwano denovo na podstawie wyników sekwencjonowania i zostały potwierdzone przez indywidualne sekwencjonowanie pirotechniczne, częstości występowania mniejszych alleli lub zgodność matematyczna między sekwencjonowaniem pirotechnicznym a sekwencjonowaniem ciągniętym była doskonała. Po zakończeniu znajdowania rzadkiej wariancji w próbie zbiorczej wiele osób chce wiedzieć, jakie są funkcjonalne konsekwencje zidentyfikowanej wariancji.
Tak więc adnotacja Twojej wariancji staje się kolejnym krokiem w procesie po rozwoju. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się sekwencjonowaniem DNA do badania rzadkich wariantów w szybki i opłacalny sposób w celu scharakteryzowania rzadkich wariantów w badaniach na dużej populacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykrywać rzadkie warianty sekwencji w puli, próbce DNA za pomocą drzazgi.
Przegląd
Pooled DNA sequencing to wydajna metoda identyfikacji rzadkich wariantów genetycznych związanych ze złożonymi cechami w dużych populacjach. Ten artykuł szczegółowo opisuje analizę obliczeniową danych sekwencjonowania pul DNA z 32 genów związanych z rakiem przy użyciu pakietu oprogramowania SPLINTER.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Genomika
- Badania nad rakiem
Tło
- Pooled DNA sequencing pozwala na wykrywanie rzadkich funkcjonalnych wariantów w populacji.
- Metoda jest skalowalna i może być stosowana do różnych fenotypów.
- Zapewnia opłacalną alternatywę dla tradycyjnego genotypowania pojedynczych osobników.
- Wykorzystuje technologie sekwencjonowania nowej generacji.
Cel badania
- Zidentyfikować geny z rzadkimi funkcjonalnymi wariantami w mieszanych populacjach.
- Wykazać skuteczność algorytmu SPLINTER w analizie danych sekwencjonowania pul.
- Ustanowić protokół dla dokładnego wykrywania wariantów w dużych badaniach kohorowych.
Zastosowanie metod
- Skupianie próbek DNA z populacji.
- Tworzenie i sekwencjonowanie biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.
- Dopasowywanie odczytów sekwencjonowania do sekwencji referencyjnej.
- Analiza obliczeniowa przy użyciu algorytmu SPLINTER.
Główne wyniki
- Udane zidentyfikowanie rzadkich wariantów sekwencji w pulach próbek.
- Demonstracja zdolności algorytmu SPLINTER do modelowania błędów sekwencjonowania.
- Walidacja metody przy użyciu zarówno kontroli pozytywnych, jak i negatywnych.
- Generowanie modeli błędów dla dokładnego wykrywania wariantów.
Wnioski
- Pooled DNA sequencing jest potężnym narzędziem do badania zmienności genetycznej.
- Oprogramowanie SPLINTER poprawia dokładność wykrywania wariantów.
- Ta metoda może znacząco przyczynić się do zrozumienia złożonych cech genetycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Detecting rare genomic variants in large populations is critical for target validation in complex disease research, where common variants fail to explain phenotypic variability. The SPLINTER-enabled pooled sequencing approach provides a cost-effective, scalable method to interrogate therapeutic hypotheses by identifying low-frequency functional variants without prior variant knowledge. This supports early discovery de-risking by enabling allele frequency estimation and variant confirmation in disease-relevant cohorts, directly informing portfolio prioritization and mechanistic follow-up.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting rare functional variants in pooled populations, clarifying disease-associated genetic architecture.
- Operational Value: Reduces need for individual genotyping, lowering cost and increasing throughput for large-cohort variant screening.
- Predictive Value: Supports allele frequency quantification and variant validation, improving confidence in target-disease associations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative variant calls from pooled data, enabling standardized assessment of variant prevalence across genomic loci.
- Operational Value: Produces reproducible error models and normalization controls, ensuring consistent variant detection across sequencing runs.
- Scalability: Compatible with hybridization capture and barcoding, allowing adaptation to diverse sample types including tumor DNA.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates progression from variant discovery to functional follow-up by providing validated rare variants for phenotypic analysis.
- Mechanistic De-risking: Enables comparison of variant frequencies between affected and unaffected cohorts, supporting causal inference in complex traits.
- Preclinical Model Relevance: Identifies variants suitable for editing in model systems to assess functional impact and pathway involvement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis generation to lead identification, providing variant detection outputs that inform target selection and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by identifying genes enriched for rare functional variation in disease cohorts.
- Screening: Enables assay-ready variant detection through standardized library preparation and computational analysis using SPLINTER.
- Analytics: Generates error models, P-value cutoffs, and allele frequency estimates that allow quantitative comparison of variant calls across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation by supplying validated variants for functional annotation and model system testing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable pooled sequencing and analysis pipeline applicable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing false positives through internal controls and iterative cutoff optimization.
- Operational Value: Standardizes library preparation, error modeling, and variant calling, enhancing reproducibility across sites and studies.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling large-cohort rare variant screening at reduced cost per sample.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted target prioritization by providing allele frequency data and variant confirmation for go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology for pooled library preparation and next-generation sequencing.
- Dependent on instrumentation for PCR, ligation, fragmentation, and sequencing, along with computational infrastructure for SPLINTER execution.
- Necessitates cross-team standardization of control design, pooling strategies, and cutoff determination for consistent results.
- Adaptation considerations include adjusting amplicon size, control ratios, and pooling depth for different genomic regions and sample types.
- Practical limitations include the need for sufficient coverage per allele and accurate quantification of input molecules to avoid amplification bias.
