Wykrywanie rzadkich wariantów genomicznych z sekwencjonowania pulującego przy użyciu SPLINTER

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja genów w populacji osobników wykazujących przewagę rzadkich wariacji funkcjonalnych. Jest to realizowane poprzez wstępne łączenie próbek DNA z danej populacji. Drugim krokiem jest przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji.

Następnie przeprowadza się dopasowanie odczytów do sekwencji referencyjnej oraz tworzy model błędów. Ostatnim krokiem jest analiza obliczeniowa z wykorzystaniem algorytmu splinter. W końcowym etapie analiza splinter sekwencjonowania nowej generacji (NGS) z próbek pulowanych służy do wskazania genów w populacjach wykazujących przewagę rzadkiej wariancji funkcjonalnej. Prezentacja procedury.

Dzisiaj wystąpi Francesco Vilania, doktorant w laboratorium mojego mentora i naszego współpracownika, Roba Mitry, a towarzyszyć mu będzie Enrique Ramos, doktorant w moim laboratorium. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak genotypowanie pojedynczych osobników, jest to, że pozwala ona na bardzo precyzyjne wykrywanie rzadkich wariantów sekwencji w mieszanej populacji cząsteczek DNA bez konieczności posiadania jakichkolwiek wcześniejszych informacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie genetyki i genomiki, takie jak określenie częstości występowania nowych rzadkich wariantów wywołujących choroby w dużych badaniach kohortowych.

Każdy eksperyment typu splinter wymaga zastosowania kontroli negatywnej i pozytywnej w celu uzyskania optymalnej dokładności; przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR, używając polimerazy DNA PFU ultra high fidelity. Kontrolą negatywną jest produkt PCR z dowolnej sekwencji DNA, o której wiadomo, że nie wykazuje zmienności genetycznej, takiej jak klonowany szkielet wektora.

W tym przypadku wykorzystano amplikon o długości 1 934 par zasad z wektora M 13 MP 18. Kontrola pozytywna może stanowić dowolny zestaw wcześniej zwalidowanych wariantów sekwencji występujących w całej populacji. Jeśli dane te nie są dostępne, laboratorium to opracowało sztuczną kontrolę pozytywną składającą się z produktu PCR o długości 331 par zasad, otrzymanego z mieszaniny zmodyfikowanych sekwencji sklonowanych do wektora PGMT easy, zgodnie z listą w tej tabeli.

Sekwencje te łączy się, aby naśladować różne częstotliwości występowania rzadkich alleli rzeczywistych wariantów w populacji pacjentów. Po amplifikacji PCR próbek, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi, każdy produkt PCR należy oczyścić z nadmiaru starterów, wykorzystując zestaw do szybkiej puryfikacji kolumnowej Kyogen Kayak lub płyty filtrujące z 96 dołkami z manifoldem próżniowym w przypadku oczyszczania na dużą skalę. Po puryfikacji należy określić ilość każdego produktu PCR przy użyciu standardowych technik.

Przygotuj wszystkie produkty PCR oraz kontrole do połączenia w pulę znormalizowaną według liczby cząsteczek. Łączenie według stężenia spowoduje nadreprezentację krótkich amplikonów względem dłuższych produktów. Zamiast tego, połącz znormalizowaną liczbę cząsteczek na każdy amplikon.

Wybierz dowolne liczby, które są wystarczająco duże, aby zachować dokładność podczas pipetowania. Pobierz produkty PCR oraz kontrole. Ligacja produktów PCR jest konieczna, ponieważ fragmentacja krótkich amplikonów PCR prawdopodobnie spowodowałaby błąd reprezentacji w kierunku ich końców.

Z tego powodu produkty PCR podlegają ligacji do dużych wektorów przed ich fragmentacją. Przygotować mieszaninę do ligacji tępych końców, używając ligazy T4, T4 PNK oraz PEG, zgodnie z listą w protokole. Inkubować reakcję w temperaturze 22 °C przez 17 godzin.

Następnie inkubować w temperaturze 65°C przez 20 minut, a potem przechowywać w temperaturze 4°C. Po tym czasie sprawdzić ligację, nakładając 50 ng próbki na żel agarozowy. Prawidłowa ligacja objawi się obecnością prążka o wysokiej masie cząsteczkowej w odpowiedniej ścieżce.

Przygotuj próbkę do fragmentacji DNA za pomocą strategii sonikacji losowej, rozcieńczając ją w stosunku 10:1 w buforze Qiagen PB w celu zmniejszenia lepkości. Następnie przeprowadź fragmentację dużych ilości produktów PCR, korzystając z urządzenia Diagenode Bioruptor (24 próbki), sonikując z dużą mocą przez 25 minut, stosując cykle 40 sekund pracy i 20 sekund przerwy w każdej minucie. Sprawdź wyniki fragmentacji DNA na żelu agarozowym i przystąp do sekwencjonowania Illumina zgodnie z opisem w tekście.

Aby rozpocząć sekwencjonowanie, wykonaj dopasowanie odczytów. Przekonwertuj surowe pliki z odczytami z sekwencjonowania do formatu scarf lub je skompresuj. Kompresja jest opcjonalna.

Pozwala to zaoszczędzić czas i miejsce w kolejnych etapach analizy bez utraty istotnych informacji. Używając dołączonego narzędzia do dopasowania, dopasuj surowe odczyty do adnotowanej, szybszej sekwencji referencyjnej. Do obszarów docelowych należy włączyć reakcje PCR, a także kontrole pozytywne i negatywne.

Format wejściowy musi być zgodny z formatem scarf lub skompresowany. Następnie należy przeprowadzić tagowanie plików zgodnie z opisem w tekście. Każdy przebieg generuje unikalny profil błędów sekwencjonowania, który należy scharakteryzować w celu dokładnego wywoływania wariantów (variant calling), aby zamodelować błędy dla każdego przebiegu.

W każdej bibliotece próbek z puli, pochodzącej z wyrównanego pliku z tagami, zawarto kontrolę wewnętrzną o znanej zmienności sekwencji. Należy wygenerować plik modelu błędów za pomocą dołączonego narzędzia, wykorzystując sekwencję referencyjną kontroli negatywnej; można użyć całej sekwencji kontroli negatywnej lub alternatywnie tylko jej podzbioru, określonego przez końce 5' i 3'. Należy zawsze stosować unikalne odczyty oraz pseudo-liczniki.

Narzędzie wygeneruje trzy pliki, których nazwy będą odpowiadać parametrowi nazwy pliku wyjściowego z końcówką zero, jeden lub dwa. Pliki te odpowiadają odpowiednio modelom błędów rzędu zero, pierwszego i drugiego dla wywołania wariantów (variant calling) przy użyciu programu splinter. W celu wizualizacji profilu współczynnika błędów przebiegu należy zawsze używać modelu błędów drugiego rzędu.

Skrypt Perl użyty do wykreślenia wykresu modelu błędów może zostać wykorzystany do wygenerowania w formacie PDF wykresu błędów dla pliku modelu błędów zerowego rzędu. Plik wykresu ujawni trendy błędów specyficzne dla danego przebiegu i może zostać wykorzystany do określenia maksymalnej liczby baz odczytanych do analizy. W następnej sekcji zostanie zademonstrowane, jak uruchomić program splinter na pliku wyrównanym, wykorzystując model błędów do wykrywania rzadkich wariantów sekwencji.

Pierwszym krokiem analizy jest uruchomienie programu splinter na wyrównanym pliku, przy użyciu sekwencji referencyjnej oraz modelu błędów. Pojedyncze zasady odczytów mogą zostać wykluczone z analizy, jeśli zostaną uznane za wadliwe. Próg wartości p określa rygorystyczność analizy wykrywania wariantów.

Dobrym punktem wyjścia jest minimalna wartość odcięcia wynosząca -1,301. Opcja wielkości puli (pool size) optymalizuje dyskryminację sygnału od szumu w algorytmie poprzez eliminację potencjalnej wariancji przy częstościach mniejszych alleli niższych niż częstość pojedynczego allela w rzeczywistej puli. Opcję wielkości puli należy ustawić na najbliższą wartość, która jest większa niż rzeczywista liczba alleli analizowanych w eksperymencie.

Warianty wykryte przy niższych częstotliwościach zostaną zignorowane jako szum. Po wprowadzeniu wszystkich parametrów i nazw plików uruchom program splinter. Plik ten zwraca wszystkie statystycznie istotne trafienia w całej próbce wraz z opisem pozycji oraz typu wariantu.

Wartość p na częstotliwość występowania wariantu na nić DNA oraz całkowite pokrycie na nić DNA. Plik listy jest wykorzystywany przez program splinter do normalizacji pokrycia w całej próbce. Pierwsze pole wskazuje interesujący nas amplikon, natomiast drugie pole wskazuje pozycję, w której występuje mutacja.

N oznacza, że reszta sekwencji nie zawiera żadnej mutacji. Po normalizacji kluczowa jest analiza kontroli pozytywnej, aby zmaksymalizować czułość i swoistość dla danego przebiegu. Jest to istotne, ponieważ najprawdopodobniej początkowy punkt odcięcia wynoszący -1,301 nie będzie wystarczający do wyeliminowania wszystkich wyników fałszywie dodatnich.

Każda analiza splinter wykaże rzeczywistą wartość P dla każdego zidentyfikowanego wariantu, której nie można było przewidzieć priorytetowo. Jednakże całą analizę można powtórzyć, stosując najmniej rygorystyczną wartość P wyświetloną w początkowym wyniku dla znanych pozycji bazowych będących prawdziwie dodatnimi. Pozwoli to na zachowanie wszystkich wyników prawdziwie dodatnich przy jednoczesnym wykluczeniu większości, jeśli nie wszystkich, wyników fałszywie dodatnich, które zazwyczaj mają znacznie mniej istotne wartości P w porównaniu do wyników prawdziwie dodatnich.

Aby zautomatyzować ten proces, można zastosować skrypt do wyznaczania wartości odcięcia (cutoff tester script). Skrypt ten wymaga pliku wynikowego z programu Splinter oraz listy trafień kontroli pozytywnej w formie pliku rozdzielonego tabulatorami, analogicznego do pliku użytego podczas normalizacji. Wynikiem będzie lista wartości odcięcia, które stopniowo prowadzą do wyznaczenia wartości optymalnej.

Ostatnia linia reprezentuje najbardziej optymalną wartość odcięcia dla danego przebiegu i może zatem zostać wykorzystana do analizy danych. Optymalnym wynikiem jest osiągnięcie czułości i swoistości na poziomie jeden. Jeśli jednak nie zostanie to osiągnięte, analizę splinter można zoptymalizować poprzez zmianę liczby uwzględnionych zasad odczytanych.

Ostateczny próg odcięcia można zastosować do danych za pomocą skryptu cutoff cut, który odfiltruje z pliku wyjściowego splinter wyniki poniżej optymalnego progu. Krok ten wygeneruje końcowy plik wyjściowy splinter, który będzie zawierał snipy oraz indele obecne w próbce. Należy pamiętać, że format danych wyjściowych dla insercji różni się nieco od formatu dla substytucji lub delecji.

Na tego typu wykresie przedstawiono dokładność w funkcji pokrycia dla pojedynczego allelu w próbce pulowanej. Dokładność szacowana jest jako pole pod krzywą (skrót AUC) charakterystyki pracy odbiornika i mieści się w zakresie od wartości 0,5, odpowiadającej dokładności losowej, do 1,0, oznaczającej dokładność idealną. W tym przykładzie AUC jest przedstawione jako funkcja pokrycia na allel dla detekcji pojedynczych alleli zmutowanych w pulach zawierających od 200 do 1 000 000 alleli.

Poniżej przedstawiono UC w funkcji całkowitej liczby insercji, delecji i substytucji. Ten wykres błędów obrazuje prawdopodobieństwo wbudowania błędnej zasady w danej pozycji. Profil błędów wykazuje niskie wskaźniki błędów z tendencją wzrostową w kierunku końca 3' odczytu sekwencjonowania.

Wyraźnie odmienne nukleotydy referencyjne wykazują różne prawdopodobieństwa błędów. Wykres ten przedstawia dokładność narzędzia splinter w szacowaniu częstości alleli dla pozycji, które posiadały pokrycie większe niż 25-krotne na allel. Porównanie częstości alleli w puli DNA oszacowanych przez splinter z liczbą alleli zmierzoną w badaniach asocjacyjnych całego genomu lub wynikami GWAS.

Przy bardzo wysokiej korelacji wyselekcjonowano populację 974 osobników, a do sekwencjonowania wyznaczono obszary o długości ponad 20 kb. W celu wykrycia rzadkich wariantów zastosowano narzędzie Splinter. Zgodnie ze standardowym protokołem, w przypadku każdego osobnika przeprowadzono wcześniej genotypowanie, wykorzystując zgodność GWAS pomiędzy genotypowaniem wariantów oznakowanych (tagged) i nowych.

Wyniki odczytów w próbce pulowanej były doskonałe. Na podstawie wyników sekwencjonowania zidentyfikowano de novo trzy warianty, z których dwa były rzadkie w populacji; zostały one zwalidowane za pomocą indywidualnego sekwencjonowania pirosequencingiem, a zgodność częstotliwości rzadkich alleli lub zgodność matematyczna między sekwencjonowaniem pirosequencingiem a sekwencjonowaniem pulowanym była doskonała. Po zidentyfikowaniu rzadkiego wariantu w próbce pulowanej, wielu badaczy pragnie dowiedzieć się, jakie są konsekwencje funkcjonalne zidentyfikowanego wariantu.

Kolejnym krokiem w procesie po etapie rozwoju jest adnotacja wariantów. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie sekwencjonowania DNA do szybkiego i kosztowo efektywnego badania rzadkich wariantów w celu ich charakterystyki w dużych badaniach populacyjnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat wykrywania rzadkich wariantów sekwencji w puli próbek DNA z wykorzystaniem metody splinter.