Rozwój zarostowego zapalenia oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepu płuc
10 lipca 2012
Zacierające zapalenie oskrzelików jest kluczową przeszkodą dla długoterminowego przeżycia biorców przeszczepu płuc, a brak solidnego modelu przedklinicznego uniemożliwia zbadanie immunopatogenezy zacierającego zapalenia oskrzelików. W przeciwieństwie do innych przeszczepów narządów litych, unaczyniony przeszczep płuc myszy został opracowany dopiero niedawno. Tutaj pokazujemy nasz niezależnie opracowany model zarostowego zapalenia oskrzelików po mysim ortotopowym przeszczepie jednego płuca.
Ogólnym celem tej procedury jest ustanowienie literackiego modelu zapalenia oskrzelików w odzwierciedleniu ortotopowego przeszczepu płuc. Osiąga się to poprzez uprzednie pobranie płuca dawcy od myszy C 57 BL 10. Drugim krokiem jest przygotowanie mankietu do oskrzela, tętnicy płucnej i żyły do zespolenia.
Następnie przygotowane płuco dawcy jest przeszczepiane do myszy biorcy C pięć siedem BL sześć. Ostatnim krokiem jest obserwacja przeszczepionej myszy przez 21 lub 28 dni po przeszczepie. Ostatecznie analiza histologiczna służy do wykazania literackich zmian w zapaleniu oskrzelików w przeszczepionym płucu.
Główną zaletą tego modelu w porównaniu z lustrzanym heterotopowym modelem przeszczepu dróg oddechowych jest to, że obecny model naśladuje stan człowieka. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą walczyć, ponieważ wyższe struktury u myszy są bardzo delikatne i bardziej podatne na urazy, ponieważ masa tylko 10 masy szczura Umieść mysz dawcy w szczelnej komorze trzymania i wywołaj znieczulenie 5% izofu fluoru. Następnie użyj cewnika dożylnego o rozmiarze 20, aby zaintubować mysz lub Trae, a następnie umieść go na respiratorze dla gryzoni
.Utrzymuj znieczulenie za pomocą jednego do 2% izofluoru. Po upewnieniu się, że mysz jest w pełni znieczulona przez brak reakcji na machanie ogonem i szczypanie palców, umieść ją w pozycji leżącej i przygotuj brzuch 70% alkoholem. Teraz odetnij nożyczkami skórę pokrywającą brzuch i odsłoń mięśnie brzucha.
Następnie wykonaj sternnotomię lapar wykonując najpierw nacięcie w linii środkowej przez ścianę brzucha, a następnie przecinając poprzecznie w poprzek mostka, odsuń jelita i zlokalizuj żyłę główną dolną, która znajduje się tuż pod wątrobą. Wstrzyknąć heparynę w ilości 100 mikrolitrów na kilogram do IVC. Następnie pociągnij w dół więzadło sierpowe wątroby i przetnij przeponę wzdłuż brzusznego przyczepu przyczynowego w kierunku kręgosłupa.
Przetnij obie strony ściany klatki piersiowej do szyi, aby odsłonić klatkę piersiową. Przetnij klatkę piersiową obustronnie, chroniąc płuco i usuń grasicę. Następnie przeciąć IVC w klatce piersiowej na poziomie przepony.
Teraz zlokalizuj serce i wytnij prawy uszek przedsionkowy. Następnie wykonaj poprzeczne nacięcie u nasady pnia tętnicy płucnej i użyj nacięcia, aby przepłukać płuca dwoma mililitrami schłodzonych pierścieni z mleczanami i 0,1 mililitra heparyny. Odsłoń tchawicę, a następnie odetnij ją wraz z przełykiem.
Teraz zatrzymaj wentylację na dwóch trzecich końcowej inflacji pływowej. Wytnij długi blok serca i przechowuj go na lodzie. Umieść gazę na wyciętym płucu, aby chronić je przed światłem.
Naciąć więzadło płucne aż do żyły płucnej lub pv. Usuń przełyk i aortę, aby zlokalizować wnękę. Znajdź tętnicę płucną lub pa, która znajduje się w najbardziej czaszkowym aspekcie wnęki i przyczepionym oskrzelu głównym.
Ostrożnie wypreparuj tętnicę płucną z dala od oskrzeli. Teraz wykonaj mankiet PA z cewnika dożylnego o rozmiarze 24, przycinając go do 0,5 milimetra długości z przedłużeniem 0,7 milimetra. Powierzchnia mankietu jest pleciona AB.
Aby zapewnić powierzchnię do zespolenia, należy wykonać mankiet na oskrzela z materiału podobnego do mankietu PA tylko za pomocą cewnika o rozmiarze 20 przyciętego na długość jednego milimetra z przedłużeniem 0,7 milimetra. Rozmiar mankietu PV różni się w zależności od wagi myszy dawcy. Dla myszy o wadze od 24 do 27 gramów.
Rozmiar mankietu to 22 gauge z długością 0,7 milimetra i przedłużeniem 0,7 milimetra dla myszy o wadze od 27 do 32 gramów. Długości są takie same, ale używany jest cewnik o rozmiarze 20. Teraz włóż mankiety do dystalnej soczewki tętnicy płucnej, żyły płucnej i oskrzeli, zabezpieczając każdy z dziewięcioma jedwabnymi szwami.
Po prawidłowym założeniu wszystkich mankietów. Przygotowane płuco dawcy owinąć gazą nasączoną laktami, obrączkarką, i umieścić na lodzie do czasu przeszczepienia. Aby przygotować biorcę, mysz indukuje znieczulenie i umieszcza na wentylacji mechanicznej w taki sam sposób, jaki zastosowano w przypadku dawcy.
Ogol lewą ścianę klatki piersiowej i przygotuj z 70% alkoholem. Zacznij od wykonania nacięcia torakotomii w lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. Przedłuż nacięcie grzbietowo blisko kręgosłupa.
Upewnij się, że pole operacyjne jest ułożone w sterylny sposób i umieść zacisk mikronaczyń na lewych naczyniach płucnych i oskrzelach przylegających do serca. Tętnicę płucną można uwidocznić w aspekcie czaszkowym, żyłę płucną na rozpieszczonym końcu wnęki i oskrzela między nimi. Następnie użyj delikatnej trakcji na hemostacie, aby wywołać łagodne napięcie na pa, pv i oskrzelach.
Pozostaw struktury wnękowe zaciśnięte i ostrożnie wytnij lewe płuco. Odizoluj tętnicę płucną, żyłę płucną i oskrzela, a następnie luźno umieść szew wokół każdej struktury. Całkowicie odciąć PA od pochewki przybyszowej, a następnie wykonać małe poprzeczne nacięcie około jednej czwartej obwodu naczynia w przedniej ścianie.
Pozostawiając kontynuację grzbietowej części tętnicy nienaruszoną, należy pobrać płuco dawcy, które jest owinięte w zimną gazę bawełnianą nasączoną laktami, i umieścić ją w jamie klatki piersiowej. Następnie włóż mankiety do biorcy pa, PV i oskrzeli, aby utworzyć zespolenie i podwiązać je za pomocą nanoszwu. Następnie usuń płuco biorcy.
Następnie zdejmij zacisk krzyżowy wnękowy, który pozwala na reperfuzję i wentylację. Umieść przeszczepione płuco z powrotem w klatce piersiowej biorcy i zamknij nacięcie torakotomii Używając pięciu szwów, mysz powinna teraz dojść do siebie po znieczuleniu. Buprenorfina może być podawana w celu złagodzenia bólu po odzyskaniu przytomności przez mysz.
Poniższa tabela przedstawia wyniki histologiczne ostrego odrzucenia i częstości występowania piśmiennego zapalenia oskrzelików lub OB. Ocena ostrego odrzucenia po przeszczepie jest określana jako ocena A. Kombinacje przeszczepów allogenicznych wykazują znacznie bardziej ostrą lub przewlekłą patologię odrzucenia w porównaniu z przeszczepem ISO. Ponadto częstość występowania piśmiennego zapalenia oskrzelików była znacznie wyższa w kombinacjach przeszczepów allogenicznych niż w przeszczepie ISO w 21. i 28. dniu po przeszczepie.
Wyniki makro i histopatologia po 28 dniach od przeszczepu płuc przedstawiono tutaj. Obrazy te reprezentują wyniki makro oraz płuco przeszczepu ISO barwione H i E oraz prawe płuco naiwne. Obrazy te reprezentują alloprzeszczep płuc BL 10 barwiony triremą h i masen przeszczepiony biorcy myszy BL six, u którego rozwinęły się odpowiednio OB i non OB.
Biała strzałka w jednym B identyfikuje zmiany OB. Ten panel pokazuje alloprzeszczep płuc BL six przeszczepiony biorcy myszy BL 10 po opanowaniu. Tę technikę można wykonać w prawie pół godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Użyteczność tej techniki polega na tym, że można ją wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na mechanistyczne pytania dotyczące pierwotnej dysfunkcji przeszczepu, ostrego odrzucenia i ablacyjnego zapalenia oskrzelików po przeszczepie płuc.
Przegląd
To badanie przedstawia model obliterującego zapalenia oskrzeliczek po pojedynczej ortotopicznej transplantacji płuca u myszy. Model ma na celu naśladowanie warunków ludzkich, rozwiązując wyzwania związane z immunopatogenezą przeszczepów płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Immunologia przeszczepów
- Patologia zapalenia oskrzeliczek
- Modele mysie w badaniach biomedycznych
Tło
- Obliterujące zapalenie oskrzeliczek jest główną przeszkodą dla sukcesu przeszczepów płuc.
- Istniejące modele nie adekwatnie naśladują ludzkie warunki przeszczepu płuc.
- Ostatnie osiągnięcia umożliwiły przeszczepianie unaczynnionej mysiej płuca.
- To badanie wprowadza nowy model do badania obliterującego zapalenia oskrzeliczek.
Cel badania
- Ustawienie wiarygodnego modelu do badania obliterującego zapalenia oskrzeliczek.
- Ułatwienie badania immunopatogenezy w przeszczepach płuc.
- Poprawa zrozumienia powikłań po przeszczepie.
Stosowane metody
- Pobieranie płuc od dawcy od myszy C57BL/10.
- Przygotowanie mankietów do anastomoz tchawicy, tętnicy płucnej i żyły.
- Przeszczepianie płuca dawcy do odbiorcy C57BL/6.
- Przeprowadzanie analizy histologicznej po przeszczepie w celu oceny zmian związanych z zapaleniem oskrzeliczek.
Główne wyniki
- Model skutecznie naśladuje ludzkie obliterujące zapalenie oskrzeliczek.
- Analiza histologiczna ujawniła znaczące zmiany w przeszczepionych płucach.
- Wyższa patologia odrzucenia została zaobserwowana w kombinacjach allogennych w porównaniu z izogennymi.
- Model zapewnia platformę dla przyszłych badań nad immunologią przeszczepów płuc.
Wnioski
- Ten nowy model jest cennym narzędziem do badania powikłań przeszczepów płuc.
- Poprawia zrozumienie mechanizmów obliterującego zapalenia oskrzeliczek.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać ten model do postępów terapeutycznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Establishing a murine model of obliterative bronchiolitis addresses a critical unmet need in lung transplant research by replicating human pathophysiology. This model enables mechanistic interrogation of immunopathogenic processes driving chronic allograft dysfunction. It supports preclinical de-risking of therapeutic strategies targeting fibroproliferative airway lesions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of alloimmune mechanisms underlying fibroproliferative bronchiolar lesions.
- Operational Value: Provides a vascularized, orthotopic system for functional target validation in transplant immunology.
- Scientific Value: Supports hypothesis testing of pathways involved in epithelial-mesenchymal transition and fibrosis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable histopathological endpoints for assessing lesion burden and progression.
- Operational Value: Standardized surgical procedure enables reproducible model generation across laboratories.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery through longitudinal analysis of allograft tissue.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Mirrors human obliterative bronchiolitis pathology, enhancing translational relevance of preclinical findings.
- Operational Value: Allows evaluation of candidate therapeutics in a clinically relevant microenvironment.
- Scientific Value: Enables mechanistic de-risking by isolating variables in alloimmune versus ischemia-reperfusion injury.
Pipeline & Workflow Integration
The model integrates into discovery workflows by providing a disease-relevant system for target validation prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of immunomodulatory targets.
- Screening: Delivers quantitative histological readouts for compound effect assessment.
- Analytics: Enables statistical comparison of lesion prevalence across experimental groups.
- Translational Research: Connects immunological mechanisms to histopathological outcomes in a preclinical setting.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for chronic rejection studies across therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by modeling human-like fibro-obliterative lesions.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized cuff-based anastomosis and postoperative monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in chronic rejection pathways.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of interventions based on histopathological efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques and murine anesthesia management.
- Dependent on specialized instrumentation for vascular and airway cuff preparation.
- Necessitates standardized histological scoring protocols for cross-functional consistency.
- Involves adaptation considerations for different murine genetic backgrounds.
- Limited by the technical complexity of orthotopic lung transplantation in small mammals.
