Name: Rozwój zarostowego zapalenia oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepu płuc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj model zarostowego zapalenia oskrzelików po ortotopowym przeszczepie płuca u myszy. Ta metoda umożliwia badanie immunopatogenezy transplantacji płuc i mechanizmów powikłań pooperacyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Źródła finansowania: Praca ta była finansowana z grantów National Institutes of Health HL067177, HL096845 oraz P01AI084853 przyznanych D.S.W.

1. Procedura dawcy
<ol>
 <li>Wszystkie procedury chirurgiczne przeprowadzono z zachowaniem techniki sterylnej. Ani myszy dawcy, ani myszy biorcy nie podawano antybiotyków.</li>
 <li>Indukcję znieczulenia myszy dawcy rozpoczęto przy użyciu 5% izofluranu.</li>
 <li>U myszy wykonano intubację przez otwór ustno-gardłowy przy użyciu cewnika dożylnego 20G, a następnie podłączono ją do respiratora dla gryzoni, stosując 100% tlenu z częstotliwością 125 oddechów/minutę i objętością oddechową około 0,5 ml (2% masy ciała).</li>
 <li>Znieczulenie podtrzymywano za pomocą inhalacji 1-2% izofluranu.</li>
 <li>Myszą dawcę ułożono w pozycji na plecach i przygotowano skórę za pomocą 70% alkoholu.</li>
 <li>Laparosternotomię wykonano jako połączone cięcie w linii środkowej i poprzeczne.</li>
 <li>Heparynę w dawce 100 u/kg wstrzyknięto do żyły głównej dolnej (IVC), tuż poniżej wątroby.</li>
 <li>Przeponę przecięto wzdłuż brzusznego przyczepu żebrowego w kierunku kręgosłupa, a jamę klatki piersiowej odsłonięto, przecinając obie strony ściany klatki piersiowej aż do szyi.</li>
 <li>Po przecięciu IVC na poziomie przepony, wycięto wyrostek prawego przedsionka i przepłukano płuca 2 ml schłodzonego (4 °C) roztworu Ringera z mleczanem oraz 0,1 ml heparyny poprzez cięcie poprzeczne u nasady pnia tętnicy płucnej (PA).</li>
 <li>Zatrzymując wentylację w dwóch trzecich fazy końca wdechu, wycięto blok serce-płuca i przechowywano go w lodzie (4 °C).</li>
 <li>Lewe płuco dawcy przygotowano dla biorcy poprzez zamocowanie mankietów. Przecięto więzadło płucne aż do żyły płucnej (PV). Wylot płuca odsłonięto poprzez usunięcie przełyku i aorty.</li>
 <li>Zidentyfikowano PA, znajdującą się w najbardziej kranialnej części wylotu, a także dołączony do niej oskrzela główne (Br). Ostrożnie odseparowano PA od oskrzela.</li>
 <li>Mankiet PA wykonano z cewnika dożylnego (I.V.) 24G i przycięto do długości 0,5 mm z przedłużeniem 0,7 mm.</li>
 <li>Całą powierzchnię mankietu zatarto, aby ułatwić anastomozę.</li>
 <li>Mankiet dla oskrzela wykonano z cewnika IV 20G i przycięto do długości 1,0 mm z przedłużeniem 0,7 mm.</li>
 <li>Przy użyciu tych samych materiałów, rozmiar mankietu PV zależał od masy myszy dawcy. Konkretnie, dla myszy o masie 24-27 g rozmiar mankietu wynosił 22G, długość 0,7 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Dla myszy o masie 27-32 g w badaniach wykorzystano cewnik 20G o długości 0,7 mm z przedłużeniem 0,7 mm.</li>
 <li>Mankiet wprowadzono do końców dystalnych PA, PV oraz Br i zabezpieczono szwem 9-0.</li>
 <li>Płuco dawcy przepłukano i przemyto sterylną solą fizjologiczną z dodatkiem sterylnej heparyny przed przechowywaniem. Następnie płuco dawcy owinięto sterylną gazą nasączoną sterylną solą fizjologiczną w lodzie (4 °C), co pozwoliło zachować czystość i sterylność płuca.</li>
 <li>Na oskrzela nałożono zacisk do mikro naczyń, aby zapobiec przedostaniu się roztworu Ringera z mleczanem do dróg oddechowych.</li>
</ol>
2. Procedura biorcy
<ol>
 <li>Indukcja znieczulenia i wentylacja mechaniczna przebiegają tak samo, jak opisano powyżej dla dawcy.</li>
 <li>Lewą ścianę klatki piersiowej ogalono i przygotowano za pomocą 70% alkoholu, a następnie pole operacyjne odizolowano sterylnymi obłożeniami.</li>
 <li>Wykonuje się nacięcie torakotomiczne w lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej, prowadząc nacięcie grzbietowo w pobliżu kręgosłupa, a następnie umieszcza się zacisk naczyniowy na lewych naczyniach płucnych i oskrzeli w sąsiedztwie serca. W górnej części widoczna jest PA, w końcowym odcinku wnęki PV, a pomiędzy nimi Br.</li>
 <li>Stosując delikatną trakcję hemostatyka, aby wywołać lekki naciąg PA, Br i PV, lewe płuco zostaje wyciągnięte z jamy klatki piersiowej, pozostawiając zaklemowane centralne struktury wnęki.</li>
 <li>PA, PV i Br izoluje się poprzez tępą dyssekcję, a następnie umieszcza się luźną sztywą 9-0 wokół PA, PV i Br.</li>
 <li>Po całkowitym oddzieleniu PA od jej osłonki zewnętrznej, w ścianie przedniej wykonuje się niewielkie nacięcie poprzeczne obejmujące około jednej czwartej obwodu naczynia, pozostawiając nienaruszoną kontynuację tylnej części tętnicy.</li>
 <li>Płuco dawcy, owinięte w zimną, nasączoną roztworem Lactated Ringer gazą bawełnianą i przygotowane zgodnie z powyższym opisem, zostaje umieszczone w jamie klatki piersiowej, a mankiety wprowadzone do PA, PV i Br biorcy oraz zabezpieczone szwem 9-0.</li>
 <li>Zdejmuje się zacisk poprzeczny wnęki, umożliwiając reperfuzję i wentylację.</li>
 <li>Po umieszczeniu przeszczepionego płuca z powrotem w klatce piersiowej biorcy, nacięcie torakotomiczne zamyka się szwem 5-0.</li>
 <li>Mysz zostaje pozostawiona do wybudzenia z narkozy. Bezpośrednio po operacji oraz co 8 godzin przez 2-3 dni po zabiegu podaje się buprenorfinę (0,05-0,15 mg/kg).</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Nasze doświadczenie wykazało, że biegłość w modelu transplantacji płuc u myszy wymaga kilku miesięcy powtarzalnej praktyki. Po osiągnięciu biegłości uzyskaliśmy 96% przeżywalności okołooperacyjnej (96/100 kolejnych zabiegów), przy czym zgony nastąpiły w ciągu siedmiu dni po operacji. Dwa zgony były wynikiem krwawienia, które rozpoczęło się w trakcie operacji, a przyczyną śmierci pozostałych dwóch myszy był odma opłucnowa. We wszystkich procedurach czas ciepłego niedokrwienia wynosił 14,32 ± 3,14 minuty, a czas zimnego niedokrwienia 58,51 ± 18,06 minuty. Badano trzy grupy ortotopowej transplantacji płuc: izograft: C57BL/6→C57BL/6, allograft: C57BL/10→C57BL/6 oraz C57BL/6→C57BL/10. Wykorzystaliśmy wyłącznie samce myszy, jednak nasza technika może być stosowana również u samic, ponieważ nie występują istotne różnice anatomiczne między płciami.
Ocena stopnia patologii odrzucenia została przeprowadzona w sposób zaślepiony, przy wykorzystaniu standardowych kryteriów dla klinicznych transplantacji płuc7(Tabela 1). Podczas gdy w przypadku izoszczepów (C57BL/6→C57BL/6) zaobserwowano łagodne odrzucenie lub jego brak, obie kombinacje alloszczepów rozwinęły porównywalne odrzucenie ostre lub przewlekłe (Rysunek 1). Z kolei OB występował znacznie częściej w grupie C57BL/10→C57BL/6 niż w grupie C57BL/6→C57BL/10 do 28. dnia (Tabela 1).
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td> </td>
 <td>C57BL/6→ 
 C57BL/6</td>
 <td>C57BL/10→ 
 C57BL/6</td>
 <td>C57BL/6→ 
 C57BL/10</td>
 <td>Wartość P</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Patologia odrzucenia 
 Wyniki „A” w dniu 28</td>
 <td>0.67±0.89</td>
 <td>*3.33±0.82</td>
 <td>*3.29±0.76</td>
 <td>*P&gt;0.05</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>OB/Całkowita liczba myszy w dniu 21 i 28</td>
 <td>0/24 (0%)</td>
 <td>**14/34 (42.1%)</td>
 <td>**2/16 (12.5%)</td>
 <td>**P&lt;0.05</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Wyniki histologiczne odrzutania ostrego oraz rozpowszechnienie zapalenia oskrzelików z obliteracją po transplantacji. Ocena odrzutania ostrego (wyniki „A”) według standardowych kryteriów opisanych w reprezentatywnych wynikach. Dane przedstawiają średnią ± SD wyników „A” w 28. dniu po transplantacji. Dane przedstawiają liczbę i procent myszy w każdej grupie, u których rozwinęła się OB w 21. i 28. dniu po transplantacji.
<img alt="Analiza histologiczna, barwienia trichromowe i H&amp;E, porównanie tkanki płuc, oznaczone A-D, badanie eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3947/3947fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Wyniki makroskopowe i histopatologia w 28. dniu po transplantacji płuc. Panel 1A przedstawia wyniki makroskopowe oraz barwienie H&amp;E izoszczepu płuca i prawego płuca naiwnego. Panele 1B i 1C przedstawiają barwienie H&amp;E oraz trichromem Massona alloszczepu płuca BL/10 przeszczepionego myszy biorcy BL/6, w których odpowiednio rozwinął się OB i brak OB. Biała strzałka w 1B wskazuje zmiany OB. Panel 1D przedstawia alloszczep płuca BL/6 przeszczepiony myszy biorcy BL/10.
Główne problemy rozwiązane w trakcie procedury były następujące.
<ol>
 <li>Zaburzenia przepływu krwi: Płukanie płuca dawcy do momentu, aż nabierze ono białego koloru. Zastosowanie nadmiernego ciśnienia może doprowadzić do obrzęku płuc. Należy jednak unikać zbyt intensywnego płukania, aby zapobiec obrzękowi po przeszczepie.</li>
 <li>Trudności z wprowadzeniem mankietu do dawcy: Należy upewnić się, że naczynia krwionośne mają odpowiednią długość i są wolne od przylegającego tłuszczu oraz tkanek łącznych.</li>
 <li>Krwawienie w miejscu anastomozy: Należy użyć patyczków higienicznych, aby wywrzeć ucisk w dotkniętym miejscu przez około 5 minut.</li>
 <li>Zator przepływu krwi w tętnicy płucnej (PA) biorcy: Spowodowany głównie skręceniem naczynia podczas wprowadzania mankietu. Jeśli w PA zostanie zaobserwowane powietrze, konieczne jest ponowne wykonanie anastomozy.</li>
 <li>Trudna anastomoza żyły płucnej (PV): Błona PV jest bardzo cienka i łatwo ulega rozerwaniu. Należy dobrać odpowiedni rozmiar mankietu i wprowadzić go prosto do PV biorcy, czyniąc to bardzo delikatnie.</li>
 <li>Zator przepływu krwi w żyle płucnej (PV) biorcy: Należy sprawdzić położenie i kierunek mankietu. Należy zwolnić ucisk mankietu oskrzelowego.</li>
 <li>Odma opłucnowa: Może być spowodowana albo perforacją oskrzeli wskutek manipulacji w drogach oddechowych, albo perforacją powierzchni płuca na skutek urazu związanego z procedurą przeszczepu. W pierwszym przypadku stosuje się chirurgiczne zamknięcie otworu w ścianie dróg oddechowych, a w drugim – zaszycie przecieku na powierzchni płuca przy użyciu nici nylonowej 10-0.</li>
</ol>

<ol><li>Asimacopoulos, P. J., Molokhia, F. A., Pegg, C. A., Norman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Lung transplantation in the rat.</a> Transplant Proc. 3, 583-585 (1971).</li>
<li>Yoshida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+technique+of+experimental+lung+transplantation+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Surgical technique of experimental lung transplantation in rabbits.</a> Ann. Thorac. Cardiovasc. Surg. 11, 7-11 (2005).</li>
<li>McDyer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+murine+obliterative+bronchiolitis+in+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Human and murine obliterative bronchiolitis in transplant.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 4, 37-43 (2007).</li>
<li>Sato, M., Keshavjee, S., Liu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+research%3A+animal+models+of+obliterative+bronchiolitis+after+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Translational research: animal models of obliterative bronchiolitis after lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 9, 1981-1987 (2009).</li>
<li>Okazaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+orthotopic+vascularized+aerated+lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation.</a> Am. J. Transplant. 7, 1672-1679 (2007).</li>
<li>Fan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutralizing+IL-17+Prevents+Obliterative+Bronchiolitis+in+Murine+Orthotopic+Lung+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Transplant%22%5BJournal%5D)">Neutralizing IL-17 Prevents Obliterative Bronchiolitis in Murine Orthotopic Lung Transplantation.</a> Am. J. Transplant. 11, 911-922 (2011).</li>
<li>Stewart, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revision+of+the+1996+working+formulation+for+the+standardization+of+nomenclature+in+the+diagnosis+of+lung+rejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Heart+Lung+Transplant%22%5BJournal%5D)">Revision of the 1996 working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of lung rejection.</a> J. Heart Lung Transplant. 26, 1229-1242 (2007).</li>
<li>Mizuta, T., Kawaguchi, A., Nakahara, K., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+rat+lung+transplantation+using+a+cuff+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Simplified rat lung transplantation using a cuff technique.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 97, 578-581 (1989).</li>
<li>Jungraithmayr, W. M., Korom, S., Hillinger, S., Weder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+orthotopic%2C+single-lung+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">A mouse model of orthotopic, single-lung transplantation.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 137, 486-491 (2009).</li>
<li>Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+vascularized+right+lung+transplantation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Orthotopic vascularized right lung transplantation in the mouse.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ortotopowy przeszczep płuc u myszy jest trudny ze względu na wymagania mikrochirurgiczne oraz ekstremalną kruchość tkanek. Wprowadzenie techniki mankietowej umożliwiło powszechne stosowanie ortotopowego przeszczepu płuc u szczurów8. Stało się to podstawą do opracowania w naszym laboratorium modelu ortotopowego przeszczepu płuc u myszy. U myszy i szczurów, w przeciwieństwie do ludzi, lewe płuco składa się tylko z jednego płata i stanowi jedynie 25% całkowitej masy płuc. Dzięki temu jednopłatowy przeszczep lewego płuca jest możliwy do wykonania w modelu mysim bez konieczności stosowania systemu wspomagania krążenia.
Nasze wstępne operacje wykazały, że wentylacja i perfuzja przeszczepionego płuca były w dużym stopniu zależne od rozmiaru anastomozy żyły płucnej (PV). Aby dopasować dawcę do biorcy, zastosowano konkretne rozmiary mankietów anastomozy PV, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami9. Niewłaściwy dobór rozmiaru mankietu prowadził albo do niedodmy przeszczepionego płuca, albo do rozejścia się anastomozy PV. Okazaki et al opisali zastosowanie połączonego podwiązania naczyń i zaciskania oskrzela5. W niniejszym badaniu we wszystkich strukturach wnęki zastosowaliśmy zacisk naczyniowy (do tętniaków), co w naszej ocenie może skrócić czas ciepłego niedokrwienia. Jednym z ograniczeń ortotopowego przeszczepu lewego płuca w modelu mysim jest fakt, że zwierzęta biorcy mogą przeżyć po nekrozie allograftów indukowanej odpowiedzią alloimmunologiczną5. W związku z tym badania przeżywalności nie są wykonalne, a ocena przeszczepu opiera się na badaniu histologicznym przeszczepionego płuca10.
Wykorzystując tę technikę opracowaliśmy przedkliniczny model zapalenia bronchiolów z obowiązującym zwłóknieniem (obliteracyjnego zapalenia bronchiolów) u myszy. W szczególności mysz dawca to szczep C57BL/10, a biorca to C57BL/6. Sugeruje to rolę mniejszych, a nie głównych antygenów zgodności tkankowej w patogenezie obliteracyjnego zapalenia bronchiolów6. Ponadto wykazaliśmy, że neutralizacja IL-17 zapobiega obliteracyjnemu zapaleniu bronchiolów w modelu mysim. Model ten stanowi nowe narzędzie badawcze do analizy transplantacji płuc oraz rozwoju klinicznych przeszczepów płuc.

<table><tbody><tr><td>Zeiss Opmi 6SFC-1880</td><td>Prescott&amp;#8217;s Inc</td><td>PMZ014</td><td></td></tr><tr><td>Respirator dla gryzoni Harvard</td><td>Harvard Apparatus</td><td>55-7058</td><td></td></tr><tr><td>kaniula do dożylnego podawania leków (I.V.) o rozmiarze 20G</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>100510D</td><td></td></tr><tr><td>kaniula dożylna 22G</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>081015S</td><td></td></tr><tr><td>kaniula dożylna 24G</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>100522A</td><td></td></tr><tr><td>9/0 Methylenowe Błękitne Jedwabne Nieskażone</td><td>Ashaway Line Twine Mfg. CO</td><td>MBVS-90</td><td></td></tr><tr><td>Szew chirurgiczny Alcon 10-0</td><td>Alcon Laboratories, Inc.</td><td>8065-192101</td><td></td></tr><tr><td>Czarny pleciony jedwab 5-0/18 cali</td><td>Henry Schein</td><td>M652630</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa 1000 j./ml</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>407156</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Betadine</td><td>Produkt Purdue</td><td>67618-150</td><td></td></tr><tr><td>roztwór Laktatu Ringera do zastrzyków</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-7953-03</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/10</td><td>Harlan Sprague-Dawley</td><td>8–12 tygodni, 25–30 g</td><td>Mężczyzna, dawca</td></tr><tr><td>C57BL/6</td><td>Harlan Sprague-Dawley</td><td>8–12 tygodni, 25–30 g</td><td>Mężczyzna, dawca lub biorca</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 2. Tabela myszy, specyficznych odczynników i sprzętu&lt;/strong&gt;.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

Development of Obliterative Bronchiolitis in a Murine Model of Orthotopic Lung Transplantation

O ortotopowym przeszczepie płuc u szczurów po raz pierwszy wspomnieli Asimacopoulos i współpracownicy w 1971 roku 1. Obecnie metoda ta jest powszechnie akceptowana i standaryzowana nie tylko w badaniach nad odrzuceniem allogenicznym, ale także pomiędzy szczepami syngenicznymi w celu analizy mechanizmów uszkodzenia reperfuzyjnego po przeszczepie płuc. Choć zastosowanie modelu szczura oraz innych dużych zwierząt 2 znacząco przyczyniło się do wyjaśnienia tych zagadnień, zakres tych badań jest ograniczony przez niedobór szczurów z nokautem genów oraz szczurów transgenicznych. Ze względu na brak skutecznych terapii zapalenia oskrzelików z obliteracją, będącego główną przyczyną zgonów pacjentów po przeszczepie płuc, prowadzono intensywne poszukiwania modeli przedklinicznych, które odwzorowywałyby zapalenie oskrzelików z obliteracją. Model alloprzeszczepu tchawicy jest najszerzej stosowany i może odtwarzać niektóre cechy histopatologiczne zapalenia oskrzelików z obliteracją 3. Jednak brak nienaruszonego układu naczyniowego i brak połączenia z drogami oddechowymi biorcy, a także niepełne cechy patologiczne zapalenia oskrzelików z obliteracją ograniczają użyteczność tego modelu 4. W przeciwieństwie do przeszczepiania innych narządów miąższowych, unaczynione przeszczepy płuc myszy zostały opisane po raz pierwszy dopiero w 2007 roku przez Okazaki i współpracowników 5. Stosując podstawowe zasady przeszczepu płuc szczura, nasze laboratorium zainicjowało model zapalenia oskrzelików z obliteracją przy użyciu ortotopowych przeszczepów pojedynczego lewego płuca u myszy z niedopasowaniem mniejszego antygenu histokompatybilnego, co pozwala na dalsze badanie immunopatogenezy zapalenia oskrzelików z obliteracją6.

Zatarczeniowe zapalenie oskrzelików jest kluczową przeszkodą w długoterminowym przeżyciu biorców przeszczepów płuc, a brak wiarygodnego modelu przedklinicznego uniemożliwia badanie immunopatogenezy tego schorzenia. W przeciwieństwie do innych przeszczepów narządów miąższowych, transplantacja unaczynionego płuca mysiego została opracowana dopiero niedawno. W niniejszej pracy przedstawiamy opracowany przez nas model zatarczeniowego zapalenia oskrzelików po ortotopowym przeszczepieniu pojedynczego płuca myszy.

Rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

O ortotopowym przeszczepieniu płuc u szczurów po raz pierwszy wspomnieli Asimacopoulos i współpracownicy w 1971 roku 1. Obecnie metoda ta jest powszechnie akceptowana i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ustanowienie modelu iteratywnego zapalenia oskrzelików odzwierciedlającego ortotopowy przeszczep płuc. Osiąga się to poprzez pobranie płuca dawcy od myszy C 57 BL 10. Drugim krokiem jest przygotowanie mankietu oskrzela, tętnicy płucnej oraz żyły do anastomozy.Następnie przygotowane płuco dawcy zostaje przeszczepione do myszy biorcy C57BL/6. Ostatnim krokiem jest obserwacja przeszczepionej myszy przez 21 lub 28 dni po transplantacji. W końcowej fazie stosuje się analizę histologiczną, aby wykazać zmiany zapalne w obrębie oskrzelików w przeszczepionym płucu.Główną zaletą tego modelu w porównaniu z lustrzanym modelem heterotopicznego przeszczepu dróg oddechowych jest to, że obecny model naśladuje stan ludzki. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wyższe struktury u myszy są bardzo delikatne i bardziej podatne na urazy, gdyż ich masa stanowi zaledwie 1/10 masy szczura. Umieść mysz dawcę w szczelnej komorze utrzymującej i wprowadź w stan znieczulenia za pomocą 5% isofluranu. Następnie użyj cewnika dożylnego 20G, aby zaintubować tchawicę myszy, a następnie podłącz ją do respiratora dla gryzoni.Utrzymuj znieczulenie, stosując od 1 do 2% isofluoranu. Po upewnieniu się, że mysz jest w pełni znieczulona (brak reakcji na bodziec ucisku ogona i palca), ułóż ją w pozycji grzbietnej i przygotuj brzuch, przemywając go 70% alkoholem. Następnie za pomocą nożyczek wytnij skórę nadbrzusza, aby odsłonić mięśnie brzucha.Następnie wykonaj laparosternotomię, zaczynając od nacięcia w linii pośrodkowej przez ścianę brzucha, a następnie przecinając poprzecznie mostek; odsuń jelita i zlokalizuj żyłę główną dolną, która znajduje się bezpośrednio pod wątrobą. Wstrzyknij heparynę w dawce 100 µl/kg do żyły głównej dolnej. Następnie odciągnij w dół więzadło sierpowate wątroby i przetnij przeponę wzdłuż brzusznego przyczepu ogonowego w kierunku kręgosłupa.Przetnij obie strony klatki piersiowej aż do szyi, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Przetnij klatkę piersiową obustronnie, chroniąc płuca, i usuń grasicę. Następnie przetnij wewnątrzklatkową część IVC na poziomie przepony.Następnie zlokalizuj serce i wycięte przedsionkowe uszko prawe. Wykonaj nacięcie poprzeczne u nasady pnia tętnicy płucnej, a następnie wykorzystaj to nacięcie do przepłukania płuc 2 mL schłodzonego roztworu Ringera z mleczanem oraz 0,1 mL heparyny. Obnaż tchawicę, a następnie odetnij ją wraz z przełykiem.Następnie przerwij wentylację przy dwóch trzecich objętości wdechowej na końcu wydechu. Wyciąć blok serca i płuc i przechowywać go w lodzie. Na wyciętym płucu położyć gazę, aby chronić je przed światłem.Naciąć więzadło płucne aż do żyły płucnej lub pv. Usunąć przełyk i aortę, aby zlokalizować wnękę. Odnaleźć tętnicę płucną lub pa, która znajduje się w najbardziej kranialnej części wnęki, oraz przylegający do niej oskrzele główne.Ostrożnie oddziel tętnicę płucną od oskrzela. Następnie wykonaj mankiet PA z kaniuli do dożylnego podawania leków o rozmiarze 24 G, odcinając fragment o długości 0,5 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Powierzchnia mankietu jest pleciona AB.Aby zapewnić powierzchnię do anastomozy, wykonaj mankiet dla oskrzela, używając materiału analogicznego do mankietu tętnicy płucnej (PA), wykorzystując jedynie cewnik 20 G docięty do długości 1 mm z przedłużeniem 0,7 mm. Rozmiar mankietu żyły płucnej (PV) zależy od masy myszy donora. Dla myszy o masie od 24 do 27 g.Rozmiar mankietu to 22G o długości 0,7 mm i przedłużeniu 0,7 mm dla myszy o masie od 27 do 32 g. Długości są takie same, lecz stosowany jest cewnik 20G. Następnie wprowadź mankiety do dystalnych odcinków tętnicy płucnej, żyły płucnej i oskrzela, mocując każdy z nich szwem jedwabnym 9-0.Po prawidłowym przymocowaniu wszystkich mankietów, owinąć przygotowaną płucno dawcy gazą nasączoną roztworem Ringera z mleczanem i umieścić na lodzie do czasu transplantacji. Aby przygotować mysz biorcę, wprowadzić znieczulenie i podłączyć do wentylacji mechanicznej w taki sam sposób, w jaki zrobiono to u dawcy.Wygolić lewą ścianę klatki piersiowej i przygotować ją za pomocą 70% alkohol. Rozpocząć od wykonania nacięcia torakotomii w lewej trzeciej przestrzeni międzyżebrowej. Przedłużyć nacięcie grzbietowo w stronę kręgosłupa.Należy upewnić się, że pole operacyjne zostało obłożone sterylnymi chustami, a następnie założyć zacisk do mikro naczyń na lewe naczynia płucne i oskrzele w sąsiedztwie serca. Tętnica płucna jest widoczna od strony głowowej, żyła płucna u dystalnego końca wnęki, a oskrzele pomiędzy nimi. Następnie, za pomocą hemostatu, należy delikatnie pociągnąć, aby wywrzeć lekki nacisk na pa, PV i oskrzele.Pozostaw struktury wnęki zaklampowane i ostrożnie przeprowadź resekcję lewego płuca. Wyizoluj tętnicę płucną, żyłę płucną oraz oskrzele, a następnie nałóż luźne szwy wokół każdej z tych struktur. Całkowicie odpreparuj tętnicę płucną z jej osłonkiy zewnętrznej, a następnie wykonaj niewielkie nacięcie poprzeczne o długości około jednej czwartej obwodu naczynia w ścianie przedniej.Pozostawiając nienaruszoną kontynuację grzbietowej części tętnicy, należy pobrać płuca dawcy, które są owinięte w nasączoną zimnym roztworem Ringera z mleczanami gazą bawełnianą, i umieścić je w jamie klatki piersiowej. Następnie należy wprowadzić mankiety do tętnicy płucnej (pa), żyły płucnej (PV) oraz oskrzela biorcy w celu wykonania anastomozy i podwiązać je nano-szwem. Na koniec należy usunąć płuco biorcy.Następnie należy zdjąć zacisk na wnęce, co umożliwi reperfuzję i wentylację. Przesunąć przeszczepione płuco z powrotem do klatki piersiowej biorcy i zamknąć nacięcie torakotomiczne, używając szwu 5-0. Mysz powinna teraz dojść do siebie po znieczuleniu. W celu uśmierzenia bólu po odzyskaniu przez mysz przytomności można podać buprenorfinę.Tabela ta przedstawia oceny histologiczne odrzucania ostrego oraz częstość występowania zapalenia bronchioli z obliteracją (OB). Ocena odrzucania ostrego po przeszczepieniu jest określana jako wynik A. Kombinacje allograftów wykazują znacznie więcej patologii odrzucania ostrego lub przewlekłego w porównaniu z graftem ISO. Ponadto częstość występowania zapalenia bronchioli z obliteracją była istotnie wyższa w kombinacjach allograftów niż w grafcie ISO w 21. i 28. dniu po przeszczepieniu.Tutaj przedstawiono wyniki makroskopowe i histopatologiczne 28 dni po transplantacji płuc. Obrazy te przedstawiają wyniki makroskopowe oraz barwienie H i E przeszczepionego płuca ISO oraz prawego płuca naiwnego. Obrazy te przedstawiają barwienie H i E oraz masen trireme allograftu płuca BL 10 przeszczepionego biorcy myszy BL six, u którego rozwinęło się odpowiednio OB i non OB.Biała strzałka w panelu B wskazuje zmiany OB. Panel ten przedstawia biorcę myszy BL 10 po przeszczepieniu allograftu płuca od myszy BL 6. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje niemal pół godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Użyteczność tej techniki polega na tym, że może ona zostać wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące mechanizmów dysfunkcji pierwotnej przeszczepu, odrzucania ostrego oraz bronchiolitis ablacyjnego po transplantacji płuc.

development-obliterative-bronchiolitis-murine-model-orthotopic-lung

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Rozwój obliteracyjnego zapalenia drobnych oskrzeli w mysim modelu ortotopicznej transplantacji płuc

W niniejszym filmie przedstawiono i porównano dwa modele eksperymentalne służące do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych (OAD) u myszy: model heterotopowej oraz ortotopowej transplantacji tchawicy.

Heterotopowe i ortotopowe przeszczepy tchawicy u myszy wykorzystywane jako modele do badania rozwoju obliteracyjnej choroby dróg oddechowych

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Opisujemy metodę znacznego zwiększenia ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc do płuc myszy poprzez wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych z uszkodzeniem. Podejście to może być również stosowane do badania interakcji zrębu w mikrośrodowisku płuc, rozsiewu przerzutów, chorób współistniejących raka płuc oraz do bardziej efektywnego generowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów.

Wstępne kondycjonowanie dróg oddechowych myszy za pomocą bleomycyny zwiększa skuteczność ortotopowego wszczepienia komórek raka płuc

Tutaj prezentujemy optymalizacje modelu przeszczepu płuc szczurów, które służą poprawie wyników. Zapewniamy przewodnik po rozmiarach mankietów w oparciu o masę ciała, strategię pomiaru w celu ustalenia 4. przestrzeni międzyżebrowej oraz metody zamykania ran i pobierania płynu BAL (płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe) i tkanek.

Model przeszczepu płuc szczura uszkodzenia cieplnego niedokrwienia/reperfuzji: optymalizacje w celu poprawy wyników

Model mysiego przeszczepu wewnątrzpłucnego tchawicy (IPTT) jest cenny do badania choroby zarostowej dróg oddechowych (OAD) po przeszczepie płuc. Oferuje wgląd w specyficzne dla płuc zachowania immunologiczne i angiogenne w znoszeniu dróg oddechowych po allotransplantacji z wysoką odtwarzalnością. W tym miejscu opisujemy procedurę IPTT i jej oczekiwane efekty.

Mysi przeszczep wewnątrzpłucnej tchawicy: model do badania choroby zarostowej dróg oddechowych po przeszczepie płuc

Tutaj prezentujemy protokół do dożylnego obrazowania przeszczepionego lewego płuca myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Stanowi to cenne narzędzie do badania dynamiki i interakcji komórkowych w czasie rzeczywistym po przeszczepie płuc u myszy.

Przyżyciowa mikroskopia dwufotonowa przeszczepionego płuca myszy

Protokół ten opisuje ulepszoną technikę ortotopowego przeszczepu lewego płuca u szczurów, koncentrując się na zmniejszeniu trudności operacyjnych i poprawie wskaźników przeżycia.

Ortotopowy przeszczep lewego płuca u szczurów

W niniejszym filmie zaprezentowano model ortotopowego przeszczepu aorty jako prosty model do badania rozwoju waskulopatii przeszczepu (TVP) u szczurów. <br...

Ortotopowy przeszczep aorty: model szczurzy do badania rozwoju przewlekłej waskulopatii

Guzy pęcherza moczowego u myszy żeńskich indukuje się w sposób małoinwazyjny poprzez cewnikowanie, lokalną kauteryzację oraz następującą po niej adhezję komórek raka do miejsc oparzeń.

Ortotopowy model mysiego raka pęcherza moczowego

Przedstawiamy łatwą do wdrożenia modyfikację klasycznej techniki dwóch mankietów stosowanej w ortotopowym przeszczepieniu wątroby u szczura.

Ortotopowa transplantacja wątroby u szczurów

Poznaj model zarostowego zapalenia oskrzelików po ortotopowym przeszczepie płuca u myszy. Ta metoda umożliwia badanie immunopatogenezy transplantacji płuc i mechanizmów powikłań pooperacyjnych.

Rozwój zapalenia obliteracyjnego oskrzelików w mysim modelu ortotopowego przeszczepienia płuc

Przeglądaj więcej filmów