Name: Szybkie usuwanie fibroblastów z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych o dużej gęstości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-28T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: Poznaj szybką metodę aspiracji do usuwania fibroblastów mysich z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Technika zachowuje integralność kolonii i pluripotencję komórek do dalszych badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu New Faculty Award II przyznanego przez California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1) oraz National Research Award finansowanego przez NIH (F32-HL104924)

1. Przygotowanie mysich embrionalnych komórek karmicielskich
<ol>
 <li>MEF użyte do kokultury z hESC powinny zostać wcześniej poddane naświetlaniu lub traktowaniu mitomycyną C, aby zapobiec ich podziałom.</li>
 <li>Na dwie godziny przed wysianiem MEF, pokryj każdą 60 mm szalkę hodowlaną traktowaną plazmą 2 ml 0,05% żelatyny.</li>
 <li>Rozmroź fiolkę z potraktowanymi MEF i wysiej w zagęszczeniu ~20 000 komórek/cm2.</li>
 <li>Pozostaw komórki do przyczepienia na noc.</li>
</ol>
2. Współwysiew hESC na MEF
<ol>
 <li>Nowe kolonie można inicjować z kultur kriokonserwowanych lub poprzez pasażowanie bieżących kultur na nowe płytki pokryte MEF, zgodnie z poniższą procedurą.</li>
 <li>Płytkę zawierającą duże kolonie hESC przeznaczone do pasażowania przemyć 1 raz 3 ml podgrzanego 1x PBS.</li>
 <li>Dodać 3 ml roztworu kolagenazy IV/PBS (1 mg/ml) i inkubować przez 5-10 min w 37 °C. (Uwaga: Komórki nie oddzielą się od siebie ani nie zwinią w kulki, co ma miejsce w przypadku stosowania trypsyny).</li>
 <li>Gdy komórki wciąż znajdują się w kolagenazie, krawędzią końcówki pipety 5 ml narysować na koloniach wzór w kratkę, rozbijając je na małe skupiska komórek.</li>
 <li>Używając końca końcówki pipety (trzymanej prostopadle do płytki hodowlanej), zeskrobać dno płytki hodowlanej, odrywając wszystkie komórki od powierzchni.</li>
 <li>Przenieść komórki do probówki Falcon i wirować przy (1000 rpm) przez 5 min.</li>
 <li>Po wirowaniu odessać medium, pozostawiając pellet komórkowy w probówce Falcon.</li>
 <li>Odessać medium MEF z komórek MEF wysianych dzień wcześniej.</li>
 <li>Przesiać komórki w stosunku 1:3 z płytki wyjściowej i podkarmić 3 ml medium hESC.</li>
</ol>
3. Usuwanie MEF z kokultury
Uwaga: Hodowle ludzkich ESC muszą być o wysokiej gęstości, zazwyczaj między 10 a 14 dniem hodowli.
<ol>
 <li>Umieść końcówkę pipety aspiracyjnej przy krawędzi płytki i pozwól, aby siła ssania delikatnie uniosła krawędź warstwy MEF.</li>
 <li>Odsaj cały pożywkę z naczynia, pozwól końcówce uchwycić warstwę komórek i powoli przesuń ją łukowatym ruchem nad płytką. Uwaga: Warstwa komórek może zatkać końcówkę pipety, ale nie stanowi to problemu, ponieważ nie powinno to przeszkodzić w ręcznym odciągnięciu warstwy z powierzchni płytki hodowlanej. Jeśli komórki przykleją się do końcówki aspiratora, można wykorzystać krawędź naczynia hodowlanego, aby rozbić warstwę komórek w celu całkowitej aspiracji.</li>
 <li>Niezwłocznie uzupełnij pożywkę dla hESC i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Końcowym wynikiem procesu usuwania MEF są niewielkie, niezakłócone kolonie hESC (Rysunek 1D), zdolne do znacznej ekspansji w bardzo duże kolonie (Rysunek 2) przy jednoczesnym zachowaniu ekspresji markerów pluripotencji SSEA-4, Oct 4 i Tra 1-81 (Rysunek 3).
<img alt="Stem cell colony growth, microscope image, cellular differentiation analysis, biological research." src="/files/ftp_upload/3951/3951fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 Rysunek 1. Morfologia kolonii ESC przed i po usunięciu MEF. Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w A) dzień 1 i B) drugi dzień po wysianiu na naczynia hodowlane. C) Wysoka gęstość Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (H7) otoczone przez MEF. Dwie kolonie hESC zostały obrysowane czerwonymi przerywanymi liniami. D) Po usunięciu MEF za pomocą opisanego techniki aspiracji, otrzymujemy wyizolowaną kolonię hESC z bardzo niewielką liczbą MEF otaczających nienaruszoną kolonię.
<img alt="Wzrost komórek w ciągu 10 dni; obraz mikroskopowy ekspansji kolonii komórek; eksperyment time-lapse." src="/files/ftp_upload/3951/3951fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Ekspansja kolonii ESC 10 dni po usunięciu MEF. Oryginalna kolonia hESC bezpośrednio po usunięciu MEF (lewa strona) rozrasta się w bardzo dużą kolonię (prawa strona) o średnicy około 800 μm, powiększenie 10x. Należy zauważyć, że oryginalna kolonia została zobrazowana przy tym samym powiększeniu (10x), co kolonia złożona.
<img alt="Obrazy mikroskopowe komórek macierzystych wykazujące barwienie DAPI, SSEA-4, Oct3/4, Tra-1-81, Flk-1 i DDR2." src="/files/ftp_upload/3951/3951fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Immunobarwienie kolonii hESC pozbawionych MEF. Identyfikacja immunofluorescencyjna kolonii do 10 dni po usunięciu MEF wykazuje, że kolonie utrzymują ekspresję markerów pluripotencji, co potwierdzają barwienia na Oct 3/4, SSEA-4 i Tra-1-81. Ponadto kolonie hESC nie wykazują różnicowania w kierunku mezodermalnym, na co wskazuje brak ekspresji Flk-1. A, E, I i M) to obrazy w świetle przechodzącym kolonii barwionych immunofluorescencyjnie, odpowiednio przy powiększeniu 20x, 10x, 10x i 2x. B, F, J i N) pokazują jądra komórkowe – komórki barwione DAPI w koloniach barwionych immunofluorescencyjnie, odpowiednio przy powiększeniu 20x, 10x, 10x i 2x. C-D) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych SSEA-4 oraz obraz złożony, 20x. G-H) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych Oct 3/4 oraz obraz złożony, 10x. K-L) pokazują wyłącznie ekspresję markera ludzkich komórek macierzystych Tra 1-81 oraz obraz złożony, 10x. M-P) Ostatni rząd obrazów przedstawia kolonię wykazującą typowe gładkie krawędzie widoczne przy tym powiększeniu, 2x; kolonie te nie wykazywały ekspresji O) Flk-1, wczesnego markera różnicowania mezodermy, ani nie P) zawierały fibroblastów, co potwierdza brak barwienia DDR2.
Wideo uzupełniające. Usuwanie fibroblastów poprzez aspirację warstwy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3951/3951movie1.mp4" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+inner+cell+mass+cells+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts.</a> Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).</li>
<li>Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+from+human+blastocysts%3A+somatic+differentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.</a> Nat. Biotechnol. 18, 399-404 (2000).</li>
<li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scalable+culture+of+human+embryonic+stem+cells+in+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated, scalable culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions.</a> Biotechnol Bioeng. 102, 1636-1644 (2009).</li>
<li>Kolhar, P., Kotamraju, V. R., Hikita, S. T., Clegg, D. O., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+surfaces+for+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic surfaces for human embryonic stem cell culture.</a> J. Biotechnol. 146, 143-146 (2010).</li>
<li>Hovatta, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+system+using+human+foreskin+fibroblasts+as+feeder+cells+allows+production+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Reprod%22%5BJournal%5D)">A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells.</a> Hum. Reprod. 18, 1404-1409 (2003).</li>
<li>McKay, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+feeder+cell+line+for+derivation+and+culture+of+hESc%2FhiPSc%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human feeder cell line for derivation and culture of hESc/hiPSc.</a> Stem Cell Res. 7, 154-162 (2011).</li>
<li>Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder-free+growth+of+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).</li>
<li>Stein, G. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStein%2C+GS+%22Thawing%2C+Seeding%2C+and+Changing+Medium+of+Human+Embryonic+Stem+Cells%22">Thawing, Seeding, and Changing Medium of Human Embryonic Stem Cells</a>. Shi, M. J., Stencel, K., Borowski, M. , John Wiley & Sons, Inc. (2010).</li>
<li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol. Biol. 767, 107-123 Forthcoming.</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Metoda przedstawiona w niniejszym manuskrypcie oferuje szybką i mniej kosztowną alternatywę dla eliminacji komórek żerujących fibroblastów z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Skuteczne usunięcie fibroblastów zależy od powstania ściśle zlanej monowarstwy tych komórek, która rozwija się w dłuższych hodowlach komórek macierzystych. Po 7–10 dniach rosnące kolonie hESC będą wypychać fibroblasty żerujące na zewnątrz, tworząc coraz gęstszą monowarstwę fibroblastów pomiędzy koloniami. Silne połączenia międzyk...

<table><tbody><tr><td>DDR2</td><td>Santa Curz</td><td>7555</td><td>Marker fibroblastów</td></tr><tr><td>Dapi</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td>Marker jąder komórkowych</td></tr><tr><td>SSEA-4</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Marker ludzkich hESC</td></tr><tr><td>Oct 3/4 </td><td>Santa Cruz</td><td>9081</td><td>Marker ludzkich hESC</td></tr><tr><td>Flk-1 </td><td>BD Pharma</td><td>555307</td><td>Marker wczesnego różnicowania</td></tr><tr><td>Tra-1-81</td><td>Acris</td><td>AM20377AF4-S</td><td>Marker ludzkich hESC</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1.&lt;/strong&gt; Tabela specyficznych odczynników użytych do immunobarwienia hESC.</td></tr></tbody></table>

szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Rapid Fibroblast Removal from High Density Human Embryonic Stem Cell Cultures

Do ustanowienia kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) po izolacji blastocysty wykorzystano embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)1. Ten system komórek zasilających (feeder system) zapobiega spontanicznej różnicowaniu się hESCs podczas ekspansji komórkowej. Jednak ta metoda kokultury jest pracochłonna, wymaga wysoko wykwalifikowanego personelu i skutkuje niską czystością hESC4. Wiele laboratoriów próbowało zminimalizować liczbę komórek zasilających w kulturach hESC (np. poprzez zastosowanie naczyń powlekanych macierzą lub innych typów komórek zasilających5-8). Te zmodyfikowane systemy hodowli wykazały pewien potencjał, ale nie zastąpiły standardowej metody hodowli hESCs z wykorzystaniem embrionalnych fibroblastów mysich traktowanych mitycyną C w celu opóźnienia niepożądanej spontanicznej różnicowania kultur hESC. W związku z tym komórki zasilające użyte podczas ekspansji hESC powinny zostać usunięte podczas eksperymentów nad różnicowaniem. Chociaż dostępnych jest kilka technik oczyszczania kolonii hESC z komórek zasilających (FACS, MACS lub zastosowanie wektorów opornych na leki), techniki te są pracochłonne, kosztowne i/lub niszczące dla hESC. Celem niniejszego projektu było opracowanie metody oczyszczania umożliwiającej pozyskanie czystszej populacji hESCs. Zaobserwowaliśmy, że w konfluencyjnej kulturze hESC populację MEF można usunąć za pomocą prostego i szybkiego odessania warstwy MEF. Usunięcie to zależy od kilku czynników, w tym od bocznego wiązania komórka-komórka MEF, które wykazują mniejsze powinowactwo wiązania do styrenowego naczynia hodowlanego, oraz od zdolności kolonii komórek macierzystych do wypierania fibroblastów na zewnątrz podczas tworzenia własnej „niszy”. Następnie badano ekspresję SSEA-4, Oct3/4 oraz Tra 1-81 w hESC do 10 dni po usunięciu MEF, aby zapewnić utrzymanie pluripotencji. Co więcej, kolonie hESC były w stanie nadal rosnąć, tworząc większe formacje po usunięciu MEF, co zapewniło dodatkowy etap ekspansji hESC.

Pomimo podejmowanych wysiłków w celu przejścia na warunki hodowli bez komórek podporowych, izolacja i hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pozostają w dużej mierze zależne od kokultur z embrionalnymi fibroblastami mysimi (MEFs). W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodologię szybkiego usuwania komórek podporowych z kultur hESC przed przystąpieniem do eksperymentów.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Do ustanowienia kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) po izolacji blastocysty wykorzystano embrionalne fibroblasty mysie (MEFs)1. Ten system komórek zasilających...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest szybka i efektywna izolacja kolonii ludzkich komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez hodowlę ludzkich komórek embrionalnych na gęstej warstwie embrionalnych fibroblastów mysich. Z czasem ekspansja populacji komórek macierzystych zwiększa ich liczbę, a także pozwala im na tworzenie kolonii w formie wysp w tej warstwie.Następnie warstwa metylocelulozy jest usuwana poprzez aspirację, pozostawiając pojedyncze kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Wyniki barwienia immunohistochemicznego na markery komórek macierzystych wykazują, że jest to skuteczna metoda izolacji, która pozwala na wyeliminowanie komórek karmicielskich przy zachowaniu integralności kolonii. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas kokultywacji komórek w naszym laboratorium, kiedy chciałem uratować kultury komórek macierzystych przed systemami hodowli o zbyt wysokiej konfluencji.Głównym problemem, z jakim większość osób spotka się przy korzystaniu z tego systemu, jest brak doświadczenia w hodowli ludzkich komórek macierzystych. Stwierdziliśmy, że technika ta jest szczególnie przydatna w sytuacjach, gdy musimy wyizolować dużą liczbę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do celów eksperymentalnych. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak sortowanie czy ręczne wybieranie kolonii komórek macierzystych, metoda ta jest szybsza i bardziej efektywna w izolowaniu kolonii z kultur o wysokiej gęstości.embrionalne fibroblasty mysie powinny zostać poddane działaniu mitomycyny C lub naświetlone przed współhodowlą z embrionalnymi komórkami macierzystymi, aby zapobiec ich podziałom. Na dwie godziny przed wysiewem MEF każdą 60 mm szalkę hodowlaną poddaną obróbce plazmą pokryć dwiema mililitrami 0,05% żelatyny. Rozmrozić fiolkę z przygotowanymi MEF, wirować przez pięć minut przy 1 500 RPM i wysiać kulturę o gęstości około 20 000 komórek/cm² na pokrytą żelatyną szalkę. Inkubować kulturę przez noc, aż komórki przylgną. Nowe kultury można inicjować z komórek kriokonserwowanych lub poprzez pasażowanie obecnych kultur na szalki pokryte MEF. Rozpoczynając pracę z płytką zawierającą duże kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, wypłukać je raz trzyma mililitrami ogrzanego roztworu PBS.Dodaj 3 mL roztworu kolagenazy IV o stężeniu 1 mg/mL i inkubuj przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Komórki nie powinny stać się wyraźnie odseparowane ani zwijać się w kule, co zdarza się w przypadku użycia trypsyny. Za pomocą krawędzi końcówki pipety o pojemności 5 mL wykonaj na koloniach nacięcia w kształcie kratki i rozbij je na małe skupiska komórek.Trzymając koniec końcówki pipety prostopadle do płytki hodowlanej, zeskrobcie dno płytki, aby odłączyć wszystkie komórki od powierzchni. Przenieście komórki do probówki typu Falcon w celu ich zebrania, odwirujcie przy 1000 RPM przez pięć minut, a następnie odessijcie pożywkę. Następnie odessijcie pożywkę z fibroblastów embrionalnych myszy wysianych dzień wcześniej.Następnie przesiej ludzkie embrionalne komórki macierzyste z pierwotnej płytki w stosunku jeden do trzech i zasil trzy mililitrami pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ludzkie HECS są hodowane w wysokiej gęstości przez 10 do 14 dni. Umieść końcówkę pipety aspiracyjnej przy krawędzi płytki i za pomocą ssania delikatnie podnieś krawędź arkusza met.Usunąć pożywkę z naczynia. Pozwolić końcówce uchwycić arkusz komórkowy, a następnie powoli przesuwać końcówkę po łuku nad płytką. Jeśli arkusz znacząco zablokuje pipetę, usunąć arkusz z hodowli.Uderz aspiratorem w górną część naczynia hodowlanego, aby całkowicie rozbić skupiska komórek, a następnie usuń komórki poprzez pełną aspirację. Natychmiast wymień medium dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i przenieś hodowlę do inkubatora do hodowli komórkowych po wysianiu na naczynia hodowlane. Ten system kokultury prowadzi do powstania gęstych kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych otoczonych przez embrionalne fibroblasty mysie.Technika aspiracji usuwa MES i pozwala na uzyskanie niewielkich, niezakłóconych kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Dzięki minimalnej ilości MES otaczającej nienaruszoną kolonię, kolonie embrionalnych komórek macierzystych mogą ulegać znaczącej ekspansji, tworząc bardzo duże struktury. Na przykład, zaprezentowana kolonia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, widoczna bezpośrednio po usunięciu meth, przekształciła się w bardzo dużą kolonię, co potwierdzono identyfikacją immunofluorescencyjną kolonii do 10 dni po meth.Deplecja wykazuje, że kolonie utrzymują ekspresję markerów pluripotencji i nie wykazują różnicowania w kierunku linii mezo-dermalnej. Te obrazy w świetle przechodzącym przedstawiają morfologię kolonii barwionych immunofluorescencyjnie przy różnych powiększeniach. DAPI barwi jądra komórkowe.Co istotne, ludzkie embrionalne komórki macierzyste wykazują ekspresję ludzkich markerów komórek macierzystych SSEA-4, TTRA-1-60 i TRA-1-81. Należy zauważyć, że na obrazach przedstawiona jest kolonia o typowych, gładkich krawędziach. Komórki te nie wykazują ekspresji FLK-1, będącego wczesnym markerem różnicowania mezo-dermy, ani nie zawierają fibroblastów, o czym świadczy brak barwienia DDR2.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji kolonii ludzkich komórek macierzystych przy użyciu technik hodowli służących do manipulowania naturalnym środowiskiem. Po opanowaniu tej metody czynność ta może być wykonana w ciągu kilku sekund. Ponadto należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia hodowli podczas usuwania medium oraz warstw zanieczyszczeń.

rapid-fibroblast-removal-from-high-density-human-embryonic-stem-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybkie usuwanie fibroblastów z kultur ludzkich komórek macierzystych zarodkowych o wysokiej gęstości

Niniejszy artykuł opisuje protokół izolacji i hodowli pierwotnych kultur fibroblastów z tkanki skóry oraz płuc dzikich gryzoni.

Zakładanie pierwotnych kultur fibroblastów dorosłych gryzoni

Zachowanie fibroblastów leży u podstaw całego spektrum jednostek klinicznych, ale pozostają one słabo scharakteryzowane, głównie ze względu na ich wrodzoną heterogeniczność. Tradycyjne badania nad fibroblastami opierają się na manipulacji in vitro, maskowaniu zachowania fibroblastów in vivo. Opisujemy oparty na FACS protokół izolacji fibroblastów skóry myszy, który nie wymaga hodowli komórkowej.

Izolacja fibroblastów skórnych myszy metodą FACS

Opisujemy prostą i szybką eksperymentalną procedurę generowania pierwotnych fibroblastów z uszu i ogonów myszy. Procedura nie wymaga specjalnego szkolenia zwierząt i może być stosowana do generowania kultur fibroblastów z uszu przechowywanych w RT przez okres do 10 dni.

Generowanie pierwotnych kultur fibroblastów z tkanek uszu i ogona myszy

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Tutaj opisujemy klinicznie istotną, wysoce wydajną, bezkarmową metodę przeprogramowania ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste za pomocą zmodyfikowanych mRNA kodujących czynniki przeprogramowujące i dojrzałe mimiki mikroRNA-367/302. Uwzględniono również metody oceny efektywności przeprogramowania, ekspansji klonalnych kolonii iPSC i potwierdzenia ekspresji markera pluripotencji TRA-1-60.

Oparte na RNA przeprogramowanie ludzkich pierwotnych fibroblastów w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste

Ten manuskrypt opisuje oparty na FACS protokół izolacji brodawkowatych i siateczkowatych fibroblastów z ludzkiej skóry. Omija hodowlę in vitro, która była nieunikniona w przypadku powszechnie stosowanego protokołu izolacji za pomocą kultur eksplantatów. Emanujące podzbiory fibroblastów są funkcjonalnie odrębne i wykazują zróżnicowaną ekspresję i lokalizację genów w skórze właściwej.

Izolacja fibroblastów brodawkowatych i siatkowatych ze skóry ludzkiej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Ten protokół przedstawia szybką metodę jednoczesnego generowania kultur melanocytów i fibroblastów ze skóry myszy w wieku 0-4 dni. Te pierwotne kultury mogą być utrzymywane i manipulowane in vitro w celu badania różnych fizjologicznie istotnych procesów, w tym biologii komórek skóry, pigmentacji, gojenia się ran i czerniaka.

Szybkie generowanie pierwotnych mysich kultur melanocytów i fibroblastów

Przedstawiamy protokół do izolacji pierwotnych dorosłych fibroblastów w łatwy, szybki i niezawodny sposób, możliwy do wykonania przez początkujących (np. studentów). Zabieg łączy enzymatyczne trawienie tkanek i mechaniczne mieszanie z falami ultradźwiękowymi w celu uzyskania pierwotnych fibroblastów. Protokół można łatwo dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych (np. tkanki ludzkiej).

Wspomagana ultradźwiękami pierwotna izolacja fibroblastów dorosłych

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Prezentowany tutaj jest protokół generowania zmodyfikowanych tkanek łącznych do równoległej hodowli 48 tkanek na wielodołkowej płytce z podwójnymi biegunami, odpowiedni do badań mechanistycznych, modelowania chorób i badań przesiewowych. Protokół jest zgodny z fibroblastami z różnych narządów i gatunków, a jego przykładem są tutaj pierwotne fibroblasty serca ludzkiego.

Tkanka łączna pochodząca z fibroblastów pochodząca od człowieka do zastosowań przesiewowych

Poznaj szybką metodę aspiracji do usuwania fibroblastów mysich z hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Technika zachowuje integralność kolonii i pluripotencję komórek do dalszych badań.

Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Przeglądaj więcej filmów