Szybkie usuwanie fibroblastów z gęstych kultur ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest szybka i efektywna izolacja kolonii ludzkich komórek macierzystych. Osiąga się to poprzez hodowlę ludzkich komórek embrionalnych na gęstej warstwie embrionalnych fibroblastów mysich. Z czasem ekspansja populacji komórek macierzystych zwiększa ich liczbę, a także pozwala im na tworzenie kolonii w formie wysp w tej warstwie.

Następnie warstwa metylocelulozy jest usuwana poprzez aspirację, pozostawiając pojedyncze kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Wyniki barwienia immunohistochemicznego na markery komórek macierzystych wykazują, że jest to skuteczna metoda izolacji, która pozwala na wyeliminowanie komórek karmicielskich przy zachowaniu integralności kolonii. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas kokultywacji komórek w naszym laboratorium, kiedy chciałem uratować kultury komórek macierzystych przed systemami hodowli o zbyt wysokiej konfluencji.

Głównym problemem, z jakim większość osób spotka się przy korzystaniu z tego systemu, jest brak doświadczenia w hodowli ludzkich komórek macierzystych. Stwierdziliśmy, że technika ta jest szczególnie przydatna w sytuacjach, gdy musimy wyizolować dużą liczbę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do celów eksperymentalnych. W porównaniu z innymi metodami, takimi jak sortowanie czy ręczne wybieranie kolonii komórek macierzystych, metoda ta jest szybsza i bardziej efektywna w izolowaniu kolonii z kultur o wysokiej gęstości.

embrionalne fibroblasty mysie powinny zostać poddane działaniu mitomycyny C lub naświetlone przed współhodowlą z embrionalnymi komórkami macierzystymi, aby zapobiec ich podziałom. Na dwie godziny przed wysiewem MEF każdą 60 mm szalkę hodowlaną poddaną obróbce plazmą pokryć dwiema mililitrami 0,05% żelatyny. Rozmrozić fiolkę z przygotowanymi MEF, wirować przez pięć minut przy 1 500 RPM i wysiać kulturę o gęstości około 20 000 komórek/cm² na pokrytą żelatyną szalkę. Inkubować kulturę przez noc, aż komórki przylgną. Nowe kultury można inicjować z komórek kriokonserwowanych lub poprzez pasażowanie obecnych kultur na szalki pokryte MEF. Rozpoczynając pracę z płytką zawierającą duże kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, wypłukać je raz trzyma mililitrami ogrzanego roztworu PBS.

Dodaj 3 mL roztworu kolagenazy IV o stężeniu 1 mg/mL i inkubuj przez 5 do 10 minut w temperaturze 37 °C. Komórki nie powinny stać się wyraźnie odseparowane ani zwijać się w kule, co zdarza się w przypadku użycia trypsyny. Za pomocą krawędzi końcówki pipety o pojemności 5 mL wykonaj na koloniach nacięcia w kształcie kratki i rozbij je na małe skupiska komórek.

Trzymając koniec końcówki pipety prostopadle do płytki hodowlanej, zeskrobcie dno płytki, aby odłączyć wszystkie komórki od powierzchni. Przenieście komórki do probówki typu Falcon w celu ich zebrania, odwirujcie przy 1000 RPM przez pięć minut, a następnie odessijcie pożywkę. Następnie odessijcie pożywkę z fibroblastów embrionalnych myszy wysianych dzień wcześniej.

Następnie przesiej ludzkie embrionalne komórki macierzyste z pierwotnej płytki w stosunku jeden do trzech i zasil trzy mililitrami pożywki dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Ludzkie HECS są hodowane w wysokiej gęstości przez 10 do 14 dni. Umieść końcówkę pipety aspiracyjnej przy krawędzi płytki i za pomocą ssania delikatnie podnieś krawędź arkusza met.

Usunąć pożywkę z naczynia. Pozwolić końcówce uchwycić arkusz komórkowy, a następnie powoli przesuwać końcówkę po łuku nad płytką. Jeśli arkusz znacząco zablokuje pipetę, usunąć arkusz z hodowli.

Uderz aspiratorem w górną część naczynia hodowlanego, aby całkowicie rozbić skupiska komórek, a następnie usuń komórki poprzez pełną aspirację. Natychmiast wymień medium dla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych i przenieś hodowlę do inkubatora do hodowli komórkowych po wysianiu na naczynia hodowlane. Ten system kokultury prowadzi do powstania gęstych kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych otoczonych przez embrionalne fibroblasty mysie.

Technika aspiracji usuwa MES i pozwala na uzyskanie niewielkich, niezakłóconych kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Dzięki minimalnej ilości MES otaczającej nienaruszoną kolonię, kolonie embrionalnych komórek macierzystych mogą ulegać znaczącej ekspansji, tworząc bardzo duże struktury. Na przykład, zaprezentowana kolonia ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, widoczna bezpośrednio po usunięciu meth, przekształciła się w bardzo dużą kolonię, co potwierdzono identyfikacją immunofluorescencyjną kolonii do 10 dni po meth.

Deplecja wykazuje, że kolonie utrzymują ekspresję markerów pluripotencji i nie wykazują różnicowania w kierunku linii mezo-dermalnej. Te obrazy w świetle przechodzącym przedstawiają morfologię kolonii barwionych immunofluorescencyjnie przy różnych powiększeniach. DAPI barwi jądra komórkowe.

Co istotne, ludzkie embrionalne komórki macierzyste wykazują ekspresję ludzkich markerów komórek macierzystych SSEA-4, TTRA-1-60 i TRA-1-81. Należy zauważyć, że na obrazach przedstawiona jest kolonia o typowych, gładkich krawędziach. Komórki te nie wykazują ekspresji FLK-1, będącego wczesnym markerem różnicowania mezo-dermy, ani nie zawierają fibroblastów, o czym świadczy brak barwienia DDR2.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat izolacji kolonii ludzkich komórek macierzystych przy użyciu technik hodowli służących do manipulowania naturalnym środowiskiem. Po opanowaniu tej metody czynność ta może być wykonana w ciągu kilku sekund. Ponadto należy pamiętać, aby nie dopuścić do wyschnięcia hodowli podczas usuwania medium oraz warstw zanieczyszczeń.