Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Celem następnego eksperymentu jest zidentyfikowanie przestrzennej i czasowej dynamiki komórkowej biorącej udział w angiogenezie, definiowanej jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. Wykorzystując prosty, powtarzalny model, należy najpierw stymulować angiogenezę poprzez krótkotrwałe wyeksponowanie krezki szczura, a następnie pobrać tkanki krezki w różnych punktach czasowych po stymulacji. Następnie należy przeprowadzić immunoznakowanie przekrojów tkankowych.

Na przykład, należy użyć markera komórek śródbłonka, aby zwizualizować całą przebudowującą się strukturę naczyniową w obrębie tkanki i stworzyć kluczową dwuwymiarową wizualizację rozrastających się sieci mikro naczyniowych. Model ten jest atrakcyjny, ponieważ powoduje gwałtowny wzrost wielu parametrów angiogennych w stosunkowo krótkim czasie. Wizualizacja sieci na poziomie pojedynczych komórek oraz korelacja tych parametrów z etykietowaniem wielokomórkowym okazały się niezwykle użyteczne w identyfikacji nowych fenotypów komórek biorących udział w pączkowaniu naczyń kapilarnych.

Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące dynamiki komórkowej uczestniczącej we wzroście sieci mikro naczyniowej. Obejmuje to określenie czasu i miejsca obecności konkretnych komórek podczas procesu kiełkowania naczyń włosowatych. Głównymi zaletami tej metody są prostota, wymaganie minimalnej interwencji chirurgicznej oraz wywoływanie silnej odpowiedzi angiogennej w stosunkowo krótkim czasie.

Ponadto wykorzystuje ona krezkę (rap mesentery), która jest tkanką umożliwiającą obserwację nienaruszonej sieci aż do poziomu pojedynczej komórki. W naszym doświadczeniu metoda ta jest bardzo łatwa do opanowania i w konsekwencji powtarzalna między różnymi badaczami po zaprezentowaniu procedury. Dziś Peter Stapler, doktorant w naszym laboratorium, przygotuje się do operacji zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym tekście.

Po zgoleniu brzucha szczura należy ułożyć zanarkowanego zwierzęcia na plecach na podkładce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała. Obszar brzucha należy oczyścić, naprzemiennie przecierając go sterylnymi gazikami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym oraz jodyną. Około 2,5 cm poniżej mostka należy wykonać niewielkie cięcie podłużne wzdłuż skóry, a następnie wzdłuż białej linii brzucha. Na sekcję brzuszną należy nałożyć docięty wcześniej obłożnik tak, aby otwór pokrywał się z nacięciem. Delikatnie uciskając obszar wokół nacięcia, należy odsłonić jelito cienkie. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką należy ostrożnie wyciągnąć fragment jelita cienkiego, kładąc krezkę na plastikowej podstawce z jałową solą fizjologiczną, a następnie zlokalizować jelito kręte.

Zidentyfikuj od sześciu do ośmiu unaczynionych okien krezowych – cienkich, półprzezroczystych błon znajdujących się pomiędzy parami tętnic i żył odżywiającymi jelito cienkie. Zapisz czas rozpoczęcia procedury i uruchom minutnik na 20 minut. Zaznacz dwa centralnie położone okna krezowe za pomocą sterylnej nici chirurgicznej 7/0 w obszarze tłuszczowym w pobliżu jelita.

Okresowo uzupełniaj sól fizjologiczną w szalce Petriego za pomocą sterylnej strzykawki 5 ml, aby zapewnić, że tkanka pozostanie zanurzona i wilgotna. Po upływie czasu ekspozycji wprowadź krezkę z powrotem do jamy brzusznej. Zamknij mięśnie brzucha szwem przerwanym, używając mononici 5-0.

Następnie zamknij skórę szwem monofilamentowym 4-0 w sposób przerywany, przemyj obszar szwu naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem, alkoholem i jodyną, nałóż żel nawilżający na oba oczy szczura i przenieś go z powrotem do klatki w celu rekonwalescencji. W wyznaczonym dniu, po stymulacji, znieczul i uśmierć szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Następnie ponownie otwórz jamę brzuszną i przykryj obszar brzucha kawałkiem folii spożywczej. Teraz ostrożnie wyciągnij jelito cienkie i zlokalizuj dwa zaznaczone okna, używając pincety i mikronożyczek.

Wyciąć każde z wyeksponowanych okien krezowych wraz z marginesem tłuszczu. Należy starać się nie przecinać par tętnic i żył w obrębie tłuszczowego marginesu okien, aby zminimalizować ryzyko ich wypełnienia krwią. Należy również ograniczyć przecinanie jelit, co zapobiegnie wydostaniu się ich zawartości.

Po kontakcie z oknami natychmiast zanurz każde okno w PBS. Następnie za pomocą pęsety rozłóż tkanki na pozytywnie naładowanych szkiełkach mikroskopowych, montując dwie tkanki na jednym szkiełku. Po częściowym wyschnięciu tkanek usuń nadmiar tłuszczu za pomocą ostrza skalpela.

Utrwal próbki w metanolu przez 30 min w temperaturze -20 °C, umieszczając je w zamrażarce. Osusz preparaty w próżni, aby usunąć nadmiar roztworu buforu. Ponadto obrysuj tkanki pisakiem woskowym, aby zapobiec niekontrolowanemu wypływowi roztworów przeciwciał poza obszar tkanki.

Następnie nanieś kroplami około 200 µL rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, aby pokryć całą tkankę. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj tkanki buforem PBS z dodatkiem 0,1% sapiny, stosując trzy wymiany buforu. Następnie dodaj roztwór przeciwciała wtórnego strep adin peroxidase i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; po trzech przemyciach inkubuj próbki w Vector Nova Red przez 15 minut.

Przepłukać wodą przed montowaniem preparatów. Zanurzyć 10 razy w 95% etanolu, a następnie przeprowadzić kolejne etapy odwodnienia. Pozostawić preparaty do wyschnięcia, pokryć tkanki cienką warstwą odpowiedniej ilości medium, a po suszeniu próżniowym i opisaniu, założyć szkiełka zakrywające.

Preparaty. Przykryć próbki tkanek rozcieńczonym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Przemyć trzykrotnie w PBS z dodatkiem 0,1% saponiny, wykonując każde płukanie przez 10 minut. Następnie dodać przeciwciało wtórne i inkubować przez jedną godzinę. Przepłukać w PBS z dodatkiem 0,1% saponiny, zamontować preparaty na szkiełkach w PBS z glicerolem i zabezpieczyć lakierem do paznokci.

W tym miejscu szczegółowo opisujemy modyfikację zwykłej szalki Petriego w celu wykorzystania jej jako pola operacyjnego. Do zapewnienia gładkiej powierzchni, przez którą krezka jest przeciągana przez wcześniej wycięty otwór, użyto żółtej glinki modelarskiej. Ponownie, okna krezkowe widoczne tutaj na polu operacyjnym w okresie eksternalizacji są definiowane jako cienkie, półprzezroczyste błony znajdujące się między parami tętnic i żył zasilającymi tutaj jelito.

Barwienie PCAM pozwala zidentyfikować wszystkie typy naczyń w hierarchii przebudowujących się sieci mikro naczyniowych w określonych punktach czasowych po eksternalizacji. Obrazy te mogą być wykorzystane do ilościowego określenia parametrów angiogennych w konkretnych punktach czasowych po stymulacji.

Oznakowanie PCAM pozwala na rozróżnienie tętnic od żył. Należy zauważyć, że tętnice doprowadzające zazwyczaj charakteryzują się mniejszymi średnicami i wydłużoną morfologią komórek śródbłonka w porównaniu do odpowiadających im żył. Typowe cechy przebudowy sieci obejmują obszar unaczynienia, kiełkowanie kapilar oraz gęstość naczyń.

Kwantyfikacja tych różnych wskaźników angiogennych pozwala scharakteryzować przebieg czasowy wzrostu sieci. Kiełkowanie naczyń kapilarnych z istniejących już naczyń osiąga szczyt między trzecim a piątym dniem, a do dziesiątego dnia powraca do poziomu podstawowego (niestymulowanego). W naszym laboratorium ten przejściowy wzrost kiełkowania jest następowany przez zwiększenie obszaru unaczynionego oraz gęstości naczyń.

Ten system modelowy został wykorzystany do identyfikacji nowych zmian fenotypowych w komórkach w określonych punktach czasowych podczas procesu przebudowy. Labelowanie immunofluorescencyjne PCA barwi komórki śródbłonka na czerwono, natomiast labelowanie beta-tubuliną klasy III barwi nerwy oraz pasożyty wzdłuż naczyń angiogennych na zielono. Co ciekawe, w tkankach niestymulowanych ekspresja beta-tubuliny klasy III jest specyficzna dla nerwów.

W przeciwieństwie do tego, w szczytowym okresie kiełkowania naczyń włosowatych, beta-tubulina klasy trzeciej jest ekspresowana przez komórki okołonaczyniowe. Tego rodzaju wynik podkreśla użyteczność tego prostego i solidnego modelu angiogenezy w identyfikowaniu nowych typów komórek zaangażowanych w proces angiogenezy. Do 10. dnia wzorzec ekspresji beta-tubuliny klasy trzeciej zaczyna powracać do stanu niepobudzonego.

Model ten mógłby potencjalnie zostać wykorzystany również do badań nad liniami komórkowymi. Wykonalność włączenia komórek do przebudowującej się tkanki krezkowej została potwierdzona w tych badaniach wstępnych, w których wcześniej znakowane komórki szpiku kostnego lub mezenchymalne komórki macierzyste były wprowadzane na okna krezkowe podczas 20 minutowego okresu ekspozycji zewnętrznej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać nasz model internalizacji krezki szczura do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej we wzrost sieci mikronaczyniowej.

Tę prostą technikę można przeprowadzić w czasie od około 45 minut do jednej godziny. Należy pamiętać, że po zabiegu chirurgicznym kluczowe jest delikatne obchodzenie się z krezką oraz unikanie przebicia naczyń krwionośnych. Można zastosować znakowanie immunologiczne w celu identyfikacji wielu typów komórek wzdłuż naczyń krwionośnych.

Można również przeprowadzić znakowanie naczyń limfatycznych i nerwów. Pozwala to na badanie nie tylko komórkowych zmian fenotypowych związanych z angiogenezą, ale także koordynacji między angiogenezą, neurogenezą a limfangiogenezą.