Name: Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Poznaj model eksterioryzacji krezki szczura do badania dynamiki komórkowej w angiogenezie. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci naczyniowej na poziomie pojedynczych komórek i identyfikację nowych fenotypów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Board of Regents of the State of Louisiana LEQSF(2009-12)-RD-A-19 (PI: W.L. Murfee) oraz Tulane Hypertension and Renal Center of Excellence finansowane z grantu NIH P20RR017659-08 (PI: L. Gabriel Navar).

1. Uwagi dotyczące przygotowania procedury chirurgicznej
<ol>
	<li>Przed operacją należy wysterylizować przybory i instrumenty chirurgiczne. Przybory wykorzystywane podczas sterylnego zabiegu chirurgicznego dla każdego szczura obejmują: 1 obrus chirurgiczny, który posłuży jako sterylna powierzchnia do rozmieszczenia instrumentów, jeden obrus z fabrycznie wyciętym otworem o wymiarach ok. 0,5 in x 1,5 in w centrum, który zostanie umieszczony na szczurze, oraz gazę. Wycięty otwór w obrusie zostanie dopasowany do nacięcia wykonanego u szczura. Instrumenty niezbędne do operacji obejmują: 1 standardową parę nożyczek do przecinania nici chirurgicznych, dwie pęsety oraz precyzyjny uchwyt do igieł do manipulowania i chwytania nici, a także skalpel z ostrzem. Powszechnie stosowane w naszym laboratorium narzędzia zostały wymienione w Tabeli specyficznych materiałów i narzędzi chirurgicznych. Ostateczny wybór narzędzi zależy jednak od preferencji eksperymentatora.</li>
	<li>Przygotuj przestrzeń operacyjną. Umieść worek z 100 mL 0,9% sterylnej soli fizjologicznej pod podkładką grzewczą, aby zapewnić, że sól fizjologiczna mająca kontakt z tkanką krezki była wstępnie ogrzana do temperatury około 37 °C. Jako alternatywę dla soli fizjologicznej można zastosować roztwór Ringera lub inny bufor fizjologiczny. Rozłóż wysterylizowane instrumenty i przybory chirurgiczne na sterylnym obrusie, aby zapewnić do nich łatwy dostęp podczas procedury eksterioryzacji. Będą również potrzebne sterylne aplikatory z bawełnianą końcówką oraz odpowiednie 3 rodzaje nici chirurgicznych (4-0, 5-0 i 7-0). Upewnij się, że opakowania są wcześniej otwarte, aby materiały można było pobrać przy zachowaniu sterylności. Na koniec zdezynfekuj zmodyfikowany plastikowy stolik, zanurzając go w 100% etanolu na co najmniej 5 minut. Stolik jest to szalka Petriego o średnicy 100 mm z wyciętym w centrum eliptycznym otworem (Rycina 1). Do początkowego wykonania i, jeśli to konieczne, poszerzenia otworu można użyć narzędzia Dremel. Po wykonaniu otworu krawędzie wyciętego plastiku należy wygładzić za pomocą papieru ściernego o różnej ziarnistości. Następnie stolik należy umyć, a na koniec do krawędzi otworu dodać obojętną glinkę modelarską (kupioną w lokalnym sklepie plastycznym) lub klej silikonowy, aby uzyskać wypukłą, gładką powierzchnię. Przed kontaktem z tkanką stolik musi zostać odpowiednio przepłukany sterylną solą fizjologiczną.</li>
	<li>W tym modelu angiogenezy zazwyczaj stosujemy dorosłe samce szczurów Wistar (350 ± 25 g). Można stosować inne szczepy i wiek szczurów. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg b.w.), ksylazyny (8 mg/kg b.w.) i atropiny (0,08 mg/kg b.w.). Po około 5 min potwierdza się efekt znieczulenia i ogala skórę brzucha szczura.</li>
</ol>
2. Model eksterioryzacji krezki szczura
<ol>
	<li>Umieść znieczulonego szczura na plecach na podkładce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Podczas procedury chirurgicznej stosuje się techniki aseptyczne. Należy nosić sterylne rękawiczki i nie dopuszczać do kontaktu instrumentów oraz materiałów z powierzchniami niesterylnymi, z wyjątkiem tkanek szczura.</li>
	<li>Oczyść obszar brzucha, przecierając go naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem oraz jodyną.</li>
	<li>Za pomocą ostrza skalpela wykonaj niewielkie (około 0,75 cala) nacięcie podłużne wzdłuż skóry, a następnie wzdłuż linea alba, około 1 cala poniżej mostka.</li>
	<li>Załóż wcześniej docięty obłożnik na obszar brzucha tak, aby otwór pokrywał się z nacięciem.</li>
	<li>Delikatnie wywrzyj nacisk wokół nacięcia. Zazwyczaj doprowadzi to do wystawienia jelita cienkiego w stopniu umożliwiającym jego łatwą identyfikację.</li>
	<li>Za pomocą aplikatorów z watowanym końcem delikatnie wyciągnij fragment jelita cienkiego i zlokalizuj jelito kręte. W miarę wyciągania krezki, należy ją delikatnie rozłożyć na plastikowej podstawce (Rycina 2).</li>
	<li>Zidentyfikuj 6–8 unaczynionych okien krezkowych. Okno krezkowe definiuje się jako cienką, półprzezroczystą błonę znajdującą się pomiędzy parami tętnic i żył zasilających jelito cienkie (Rycina 2).</li>
	<li>Zapisz czas rozpoczęcia eksterioryzacji. Pozostaw fragment krezki na zewnątrz przez 20 minut. W czasie eksterioryzacji używaj sterylnej strzykawki (5 mL), aby okresowo uzupełniać sól fizjologiczną w szalce Petriego, zapewniając zanurzenie tkanki i zapobiegając jej wysychaniu.</li>
	<li>Podczas 20-minutowego czasu ekspozycji oznacz 2 centralnie położone okna krezkowe sterylną nicią chirurgiczną 7-0. Oznaczenia należy wykonać w obszarze tłuszczowym w pobliżu jelita.</li>
	<li>Wprowadź eksterioryzowany fragment krezki z powrotem do jamy brzusznej.</li>
	<li>Zamknij mięśnie brzucha szwem monofilamentowym 5-0 w sposób przerywany.</li>
	<li>Zamknij skórę szwem monofilamentowym 4-0 w sposób przerywany.</li>
	<li>Przetrzyj miejsce zszycia, używając naprzemiennie sterylnej gazy nasączonej 70% izopropanolem oraz jodyną.</li>
	<li>Nałóż żel smarujący do oczu na oba oczy szczura. Celem smarowania oczu jest zapobieganie wysychaniu rogówki podczas procedury chirurgicznej i rekonwalescencji. Żel smarujący należy nałożyć przed rozpoczęciem interwencji chirurgicznej. W razie potrzeby ponownie nałóż żel przed powrotem szczura do klatki na czas rekonwalescencji.</li>
</ol>
3. Pobieranie i utrwalanie tkanek
<ol>
	<li>W wyznaczonym dniu po stymulacji znieczul i uśmierć szczura. W naszym laboratorium szczury są znieczulane poprzez wstrzyknięcie domięśniowe ketaminy (80 mg/kg b.w.), ksylazyny (8 mg/kg b.w.) oraz atropiny (0.8 mg/kg b.w.), a następnie uśmiercane poprzez wstrzyknięcie wewnątrzsercowe beuthanasii. Beuthanasia jest roztworem pentobarbitalu sodu i fenytoiny, który może być stosowany do szybkiej i bezbolesnej eutanazji. W naszym laboratorium zazwyczaj wstrzykuje się 0.1 - 0.2 ml na szczura.</li>
	<li>Ponownie otwórz jamę brzuszną, delikatnie wyjmij jelito cienkie i zlokalizuj dwa zaznaczone okna.</li>
	<li>Wytnij każde z wyewagowanych okien krezkowych, używając pęsety i mikronożyczek. Pozostawienie brzegu tkanki tłuszczowej wokół każdego okna jest korzystne dla późniejszego rozłożenia tkanki na szkiełkach mikroskopowych. Natychmiast zanurz każde okno w PBS. Podczas wycinania staraj się nie przecinać par tętnic i żył w obrębie tłuszczowego brzegu okien, aby zminimalizować ryzyko wypełnienia okien krwią. Unikaj również przecinania jelit, co mogłoby doprowadzić do kontaktu treści jelitowej z oknami.</li>
	<li>Użyj pęsety, aby rozłożyć tkanki na dodatnio naładowanych szkiełkach mikroskopowych. Na jednym szkiełku można zamocować dwie tkanki.</li>
	<li>Pozostaw tkanki do częściowego wyschnięcia, a następnie za pomocą ostrza skalpela usuń nadmiar tłuszczu.</li>
	<li>Tkanki są teraz gotowe do utrwalenia. Można zastosować typowe metody utrwalania. W naszym laboratorium zazwyczaj utrwalamy preparaty na szkiełkach w metanolu (-20 °C) przez 30 min. Pomyślne znakowanie przeprowadzono również na tkankach nieutrwalonych. Metody utrwalania mogą zależeć od preferowanego przeciwciała.</li>
</ol>
4. Immunoznakowanie tkanek
<ol>
	<li>Tkanki można teraz zazwyczaj znakować zgodnie z instrukcjami dla danego przeciwciała do immunohistochemii. Ze względu na nasze zainteresowanie identyfikacją roli perycytów naczyniowych podczas angiogenezy, w naszym laboratorium powszechnie znakuje się komórki śródbłonka i komórki okołonaczyniowe10, 12, 13. Przydatnymi znacznikami do identyfikacji komórek śródbłonka w obrębie hierarchii sieci mikronaczyniowych są przeciwciało przeciwko PECAM lub lektyna BSI. Markery komórek okołonaczyniowych stosowane w tej tkance obejmują NG2, desminę, SM-α aktynę, PDFGRβ oraz β-tubulinę klasy III. Poniżej, w sekcji 3.3, przedstawiliśmy protokoły kolorymetrycznego i fluorescencyjnego znakowania immunochemicznego PECAM.</li>
	<li>Przed pierwszą inkubacją z przeciwciałem pierwotnym preparaty są suszone próżniowo w celu usunięcia nadmiaru roztworu buforowego. Ponadto tkanki są wstępnie obrysowywane woskowym pisakiem, aby zapobiec niekontrolowanemu odpływowi roztworów przeciwciał z obszaru tkanki. Na koniec każdy etap znakowania kończy się etapami płukania. Podczas płukania preparaty umieszcza się w naczyniach do barwienia. Roztwór buforowy jest wymieniany 3 razy w trakcie czasu trwania płukania.</li>
	<li>Procedury znakowania przeciwciałami komórek śródbłonka:
		 Kolorymetryczne znakowanie PECAM
		<ol>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nanieść kroplowo około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; należy upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.</li>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nanieść kroplowo roztwór przeciwciała wtórnego (roztwór VECTASTAIN Elite ABC z Vector Laboratories; roztwór wtórnego przeciwciała streptawidyna-peroksydaza) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
			<li>Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.</li>
			<li>Inkubować tkanki z Vector Nova Red przez 15 minut. Następnie opłukać tkanki wodą.</li>
			<li>Montowanie preparatów: Zanurzyć preparaty w 95% etanolu 10 razy. Zanurzyć preparaty w 100% etanolu na 2 min. Zanurzyć preparaty w kolejnym roztworze 100% etanolu na 2 min. Następnie zanurzać preparaty w kolejnych roztworach 100% ksylenu przez 2 minuty każdy. Pozostawić do wyschnięcia, a tkanki przykryć cienką warstwą VectaMount i szkiełkiem podstawowym.</li>
		</ol>
		 Fluorescencyjne znakowanie PECAM
		<ol>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym: Nanieść kroplowo około 100-200 µL roztworu przeciwciała pierwotnego (mysie monoklonalne biotynilowane przeciwciało CD31 w rozcieńczeniu 1:200 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na każdą tkankę; należy upewnić się, że cała tkanka jest pokryta roztworem przeciwciała. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
			<li>Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.</li>
			<li>Inkubacja z przeciwciałem wtórnym: Nanieść kroplowo roztwór przeciwciała wtórnego (Streptawidyna-CY3 w rozcieńczeniu 1:100 w buforze do przeciwciał (0,1% saponiny w PBS + 2% BSA)) na tkanki. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
			<li>Płukać tkanki w PBS + 0,1% saponiny przez 30 minut.</li>
			<li>Montowanie preparatów: Nanieść kroplowo mieszaninę PBS z glicerolem w stosunku 50:50 na tkanki. Przykryć szkiełkiem podstawowym. Następnie użyć lakieru do paznokci, aby uszczelnić szczelinę między szkiełkiem podstawowym a preparatem.</li>
		</ol>
	</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Reprezentatywne obrazy tkanek krezki szczura oznakowanych immunohistochemicznie pod kątem PECAM przedstawiono na Rysunku 3. Oznakowanie PECAM pozwala na identyfikację wszystkich typów naczyń w hierarchii przebudowywanych sieci mikro naczyniowych i może być wykorzystane do ilościowego określenia parametrów angiogennych w określonych punktach czasowych po stymulacji. Oznakowanie PECAM umożliwia również rozróżnienie tętniczek od żyłek. Tętniczki doprowadzające charakteryzują się zazwyczaj mniejszą średnicą i wydłużoną morfologią komórek śródbłonka w porównaniu z odpowiadającymi im żyłkami (Rysunek 4). Kapilary oraz pąki kapilarne można zidentyfikować na podstawie średnicy naczynia i jego względnego położenia w sieci. Typowe cechy przebudowywanych sieci obejmują zwiększone pączkowanie kapilar, gęstość naczyń, obszar unaczyniony oraz krętość żyłek. Ilościowe oznaczenie różnych parametrów angiogennych pozwala określić przebieg czasowy wzrostu sieci (Rysunek 5). Pączkowanie kapilar z istniejących naczyń osiąga szczyt między 3. a 5. dniem i powraca do poziomu niestymulowanego do 10. dnia. Po tym przejściowym wzroście pączkowania następują wzrosty gęstości naczyniowej i obszaru unaczynionego. Jako dowód na przebudowę większych naczyń w tym modelu, liczba segmentów tętniczek i żyłek również wzrasta w czasie trwania procesu.
W naszym laboratorium model ten był wykorzystywany do identyfikacji komórkowych zmian fenotypowych w określonych punktach czasowych podczas tego procesu przebudowy10, 11. Na przykład β-tubulina klasy III pozwala zidentyfikować perycyty wzdłuż naczyń angiogennych (Rycina 6). W tkankach niepobudzonych ekspresja β-tubuliny klasy III jest specyficzna dla nerwów. W przeciwieństwie do tego, podczas szczytu kiełkowania kapilar, β-tubulina klasy III jest eksprymowana przez komórki okołonaczyniowe. Tego rodzaju wynik podkreśla użyteczność tego prostego i solidnego modelu angiogennego w identyfikacji nowych typów komórek zaangażowanych w proces angiogenezy.
<img alt="Eksperyment w szalce Petriego; modyfikacja z plasteliny; przed i po modyfikacji; eliptyczny otwór." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
	Rycina 1. Zdjęcia plastikowej podstawy przed i po modyfikacji. Podstawa przed modyfikacją to szalka Petriego o średnicy 100 mm. Modyfikacje obejmują wycięcie eliptycznego otworu w centrum oraz późniejsze nałożenie plasteliny lub silikonowego kleju na krawędź otworu w celu utworzenia podniesionej, gładkiej powierzchni. Powierzchnia ta stanowi wewnętrzną granicę, która ułatwia superfuzję zewnętrznych okien krezkowych. Pasek skali wynosi 1 cm.
<img alt="Schemat okna krezkowego; badanie anatomiczne struktury jelita w szalce Petriego." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
	Rycina 2. Obraz zewnętrznionego obszaru krezkowego. Okna krezkowe definiuje się jako cienkie, półprzezroczyste błony znajdujące się pomiędzy parami tętnic i żył odżywiających jelito cienkie. Podczas czasu zewnętrznienia obszar krezkowy jest rozłożony i zanurzony w soli fizjologicznej w zmodyfikowanej szalce Petriego. Obojętna żółta glina modelarska zapewnia gładką powierzchnię, przez którą krezka jest przeciągana przez wcześniej wycięty otwór. Pasek skali wynosi 1 cm.
<img alt="Schemat wzrostu naczyń krwionośnych, niepobudzone w porównaniu z dniem 3. i dniem 10., zmiany naczyniowe w czasie." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
	Rycina 3. Reprezentatywne obrazy sieci mikronaczyniowych krezki z tkanek niepobudzonych oraz tkanek w 3. i 10. dniu po eksterioryzacji krezki. Marker PECAM pozwolił zidentyfikować hierarchię sieci mikronaczyniowych, w tym arteriole (A), wenule (V) i kapilary (C). Po stymulacji w sieciach mikronaczyniowych zaobserwowano zwiększenie wypustkowania kapilar (groty strzałek) oraz gęstości naczyń. Pasek skali oznacza 100 μm.
<img alt="Schemat histologiczny przedstawiający struktury tętnicze (A) i żylne (V) w analizie próbki tkanki." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
	Rycina 4. Reprezentatywne obrazy par tętniczek/żyłek w sieciach mikronaczyniowych krezki dorosłego szczura. Na obu obrazach tętniczki (A) można odróżnić od żyłek (V) na podstawie mniejszej średnicy względnej oraz wydłużonej morfologii komórek śródbłonka. Paski skali wynoszą 20 μm.
<img alt="Analiza wzrostu naczyniowego, wykresy słupkowe przedstawiające powierzchnię tkanki, pąki kapilarne i długość w czasie." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
	Rycina 5. Reprezentatywna kwantyfikacja parametrów angiogennych w czasie wzrostu mikronaczyniowego po eksterioryzacji krezki. A) Powierzchnia naczyniowa w przeliczeniu na powierzchnię tkanki. B) Liczba pąków kapilarnych w przeliczeniu na powierzchnię naczyniową. C) Całkowita długość naczyniowa w przeliczeniu na powierzchnię naczyniową. *oznacza istotną różnicę w porównaniu z grupą niepobudzoną. Porównania statystyczne wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (One-Way ANOVA) z następującym po niej testem Dunna. (p &lt; 0.05). UN oznacza grupę niepobudzoną.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna wzrostu komórek w czasie; wzrost neurytów pokazany w stanie niepobudzonym oraz w 3. i 10. dniu." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
	Rycina 6. Reprezentatywne obrazy fluorescencyjne mikrokrążenia krezkowego z tkanek niepobudzonych oraz tkanek 3 i 10 dni po eksterioryzacji krezki. Immunofluorescencyjne znakowanie PECAM (czerwone) identyfikuje komórki śródbłonka, a znakowanie β-tubuliną klasy III (zielone) identyfikuje nerwy (groty strzałek) i komórki okołonaczyniowe (strzałki). Komórki okołonaczyniowe przejściowo zwiększają ekspresję β-tubuliny klasy III podczas kiełkowania naczyń włosowatych. W niepobudzonych sieciach mikrokrążenia β-tubulina klasy III jest specyficzna dla nerwów i nie identyfikuje komórek okołonaczyniowych. 3 dni po stymulacji β-tubulina klasy III pozytywnie znakuje komórki okołonaczyniowe wzdłuż mikronaczyń. Do 10. dnia wzorzec ekspresji β-tubuliny klasy III zaczyna powracać do stanu niepobudzonego. Pasek skali to 50 μm.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej sieci neuronalnych, z zaznaczonymi na czerwono i zielono połączeniami synaptycznymi." src="/files/ftp_upload/3954/3954fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
	Rysunek 7. Obrazy potwierdzające możliwość śledzenia uprzednio znakowanych komórek aplikowanych miejscowo podczas wzrostu sieci mikronaczyniowej stymulowanej przez eksterioryzację krezki. Komórki podawano metodą superfuzji przez okna krezkowe podczas 20-minutowego okresu eksterioryzacji. 1 dzień po operacji zaobserwowano komórki znakowane DiI (czerwone) w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co mikronaczynia dodatnie pod kątem PECAM (zielone). A, B) Przykłady komórek szpiku kostnego znakowanych DiI wykazujących morfologię obłą i wydłużoną. W niektórych przypadkach (strzałki) komórki były wydłużone wzdłuż mikronaczyni. C) Przykład skupiska mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych DiI w pobliżu wierzchołka pąka kapilarnego (strzałka). Paski skali wynoszą 50 μm (A) oraz 20 μm (B, C).

<ol><li>Carmeliet, P., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer and other diseases.</a> Nature. 407, 249-257 (2000).</li>
<li>le Noble, F. A., Stassen, F. R., Hacking, W. J., Struijker Boudier, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hypertens%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and hypertension.</a> J. Hypertens. 16, 1563-1572 (1998).</li>
<li>Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+remodeling%3A+a+complex+continuum+spanning+angiogenesis+to+arteriogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Microvascular remodeling: a complex continuum spanning angiogenesis to arteriogenesis.</a> Microcirculation. 10, 99-111 (2003).</li>
<li>Anderson, C. R., Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+identification+of+an+extracellular+matrix+scaffold+that+microguides+capillary+sprouting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical identification of an extracellular matrix scaffold that microguides capillary sprouting in vivo.</a> J. Histochem. Cytochem. 52, 1063-1072 (2004).</li>
<li>Ponce, A. M., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+stimulus+determines+the+positioning+of+pericytes+within+capillary+sprouts+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Angiogenic stimulus determines the positioning of pericytes within capillary sprouts in vivo.</a> Microvasc. Res. 65, 45-48 (2003).</li>
<li>Franzen, L., Ghassemifar, R., Malcherek, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mast+cell+activation+improves+connective+tissue+repair+in+the+perforated+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Agents+Actions%22%5BJournal%5D)">Experimental mast cell activation improves connective tissue repair in the perforated rat mesentery.</a> Agents Actions. 33, 371-377 (1991).</li>
<li>Anderson, C. R., Hastings, N. E., Blackman, B. R., Price, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+sprout+endothelial+cells+exhibit+a+CD36+low+phenotype%3A+regulation+by+shear+stress+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+mechanism+for+attenuating+anti-proliferative+thrombospondin-1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Capillary sprout endothelial cells exhibit a CD36 low phenotype: regulation by shear stress and vascular endothelial growth factor-induced mechanism for attenuating anti-proliferative thrombospondin-1 signaling.</a> Am. J. Pathol. 173, 1220-1228 (2008).</li>
<li>Norrby, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+models+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo models of angiogenesis.</a> J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).</li>
<li>Norrby, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+Mesentery+Angiogenesis+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Rat Mesentery Angiogenesis Assay.</a> J. Vis. Exp. (52), e3078(2011).</li>
<li>Murfee, W. L., Rehorn, M. R., Peirce, S. M., Skalak, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+cells+along+venules+upregulate+NG2+expression+during+microvascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Perivascular cells along venules upregulate NG2 expression during microvascular remodeling.</a> Microcirculation. 13, 261-273 (2006).</li>
<li>Stapor, C. P., Murfee, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+class+III+%CE%B2-tubulin+as+a+marker+of+angiogenic+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of class III β-tubulin as a marker of angiogenic perivascular cells.</a> Microvascular Research. , Forthcoming (2011).</li>
<li>Yang, M., Aragon, M., Murfee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+Mesenteric+Microvascular+Networks+from+Spontaneously+Hypertensive+Versus+Normotensive+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in Mesenteric Microvascular Networks from Spontaneously Hypertensive Versus Normotensive Rats.</a> Microcirculation. , (2011).</li>
<li>Robichaux, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic%2FBlood+endothelial+cell+connections+at+the+capillary+level+in+adult+rat+mesentery%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Lymphatic/Blood endothelial cell connections at the capillary level in adult rat mesentery.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 293, 1629-1638 (2010).</li>
<li>Amos, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFATS+collection%3A+The+role+of+human+adipose-derived+stromal+cells+in+inflammatory+microvascular+remodeling+and+evidence+of+a+perivascular+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">IFATS collection: The role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype.</a> Stem Cells. 26, 2682-2690 (2008).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Model eksterioryzacji został opisany w 2006 roku i jest adaptacją wcześniejszych modeli angiogenezy w krezce szczura opartych na urazie mechanicznym4-7; daje on wyniki podobne do dobrze ugruntowanych modeli z iniekcją do. (i.p.), które wykorzystują krezkę szczura9. Wykazano eksperymentalnie, że 20-minutowy czas eksterioryzacji wywołuje silną odpowiedź angiogenną. Choć okres ten można modyfikować, pozwala on na miejscowe stosowanie inhibitorów angiogenezy4 w badaniach mechanistycznych oraz bezpośrednie wprowadzanie egzogennych komórek w celu badania linii komórkowych. Wykonalność inkorporacji komórek do przebudowującej się tkanki krezki została potwierdzona w wstępnych badaniach przeprowadzonych w naszym laboratorium z użyciem uprzednio znakowanych komórek szpiku kostnego oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (Rycina 7), a także poprzez sukcesy w badaniu losów ludzkich komórek stropowych pochodzenia tłuszczowego po iniekcji do.14. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy ten model do identyfikacji zmian fenotypowych perycytów w czasie trwania odpowiedzi angiogennej10 oraz do oceny potencjału angiogennego w warunkach patologicznych, takich jak nadciśnienie tętnicze12. Odpowiedź angiogenną oraz zmiany fenotypu komórek związane z tym modelem można zaobserwować również w innych modelach angiogenezy w krezce szczura, w tym podczas przewlekłej ekspozycji na hipoksję10, 11.
Ograniczeniem modelu eksterioryzacji jest fakt, że dokładne mechanizmy wyzwalające angiogenezę nie są znane. Eksterioryzacja krezki została powiązana z degranulacją komórek tucznych i zwiększonym poziomem histaminy6, jednak wymagane są dalsze badania, aby uzyskać więcej informacji. Bodziec angiogenny jest bez wątpienia wieloczynnikowy, wywołując silną odpowiedź przebudowy w całej hierarchii sieci mikronaczyniowej. Choć nieznane mechanizmy pozostają głównym punktem krytyki tego modelu, jego powtarzalność i prostota czynią go atrakcyjnym do identyfikacji dynamiki komórkowej zaangażowanej w naturalnie złożony proces kiełkowania naczyń włosowatych. Powtarzalność modelu została potwierdzona poprzez porównywalne parametry angiogenne w czasie wzrostu sieci mikronaczyniowej u wielu szczepów szczurów (samców Wistar i samic Sprague-Dawley) w wcześniej opublikowanych badaniach z naszego laboratorium10, 12. Ponieważ większość tkanek krezki dorosłych szczurów jest unaczyniona, model ten pozwala również na zbadanie wielu tkanek u jednego zwierzęcia. Niestety, model ten nie znajduje oczywistego zastosowania w genetycznych modelach mysich, ponieważ okna krezkowe u myszy wykazują mniejsze naturalne unaczynienie i, w naszym doświadczeniu, zazwyczaj brakuje w nich obserwowalnych sieci rozgałęzień. Przyszłe zastosowania obejmują badanie funkcjonalności naczyń podczas angiogenezy przy użyciu mikroskopii intravitalnej w określonych punktach czasowych oraz badanie związanej z tym dynamiki komórkowej uczestniczącej w limfangiogenezie i neurogenezie. Chociaż stopień naturalnego unaczynienia w obrębie okna krezkowego wydaje się być w przybliżeniu proporcjonalny do wieku, obserwowaliśmy rozgałęzione sieci mikronaczyniowe u samców szczurów Wistar w wieku zaledwie 4-5 tygodni. Obserwacje te sugerują, że model eksterioryzacji mógłby zostać zastosowany również do porównywania różnic angiogennych w zależności od wieku.

<table><tbody><tr><td>Obłożenie chirurgiczne</td><td>Cardinal Health</td><td>4012</td><td>12&quot;x12&quot; sterylne owijki Bio-Shield Regular</td></tr><tr><td>Mikronóżce Noyes</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5677</td><td>Mikronóżce sprężynowe do sekcji Noyes;&lt;br/&gt; proste, końcówki ostra-tępa; krawędź tnąca 13mm; szerokość końcówki 0.25mm, całkowita długość 4 1/2&quot;</td></tr><tr><td>Pinceta Graefe</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135</td><td>Mikropinceta do sekcji; ząbkowana; lekko zakrzywiona; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4&quot;</td></tr><tr><td>Pinceta Graefe</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5130</td><td>Mikropinceta do sekcji; ząbkowana, prosta; szerokość końcówki 0.8mm; długość 4&quot;</td></tr><tr><td>Sznur chirurgiczny 4-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>699G</td><td>(1.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament</td></tr><tr><td>Sznur chirurgiczny 5-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>8556</td><td>(1.0 metric) sznur polipropylenowy PROLENE, niebieski monofilament</td></tr><tr><td>Sznur chirurgiczny 7-0</td><td>Ethicon Inc.</td><td>1647G</td><td>(0.5 metric) sznur nylonowy ETHILON, czarny monofilament</td></tr><tr><td>Mikroportań Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>12060-02</td><td>Szerokość końcówki:0.6mm&lt;br/&gt; Długość zacisku:5mm&lt;br/&gt; Długość:9cm&lt;br/&gt; Końcówka prosta</td></tr><tr><td>Portań Castroviejo</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td>Kształt końcówki:prosta&lt;br/&gt; Szerokość końcówki:1.5mm&lt;br/&gt; Długość zacisku:10mm&lt;br/&gt; Nożyczki:nie&lt;br/&gt; Blokada:tak&lt;br/&gt; Długość:14cm&lt;br/&gt; Ząbkowanie:tak</td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-9843</td><td>Rękojeść skalpela, #3; pełna; długość 4&quot;</td></tr><tr><td>Sterylne ostrze chirurgiczne</td><td>Cincinnati Surgical</td><td>0110</td><td>Stal nierdzewna; rozmiar 10</td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-13</td><td>Z fazowanym brzegiem, z pokrywką</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela specyficznych materiałów i narzędzi chirurgicznych.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Beuthanasia</td><td>Merck &amp;amp; Co.</td><td>MWI #: 011168</td><td>Składnik aktywny: na 100mL, 390 mg pentobarbalsodu, 50mg fenytoiny sodowej</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Fort Dodge Animal Health</td><td>MWI #: 000680</td><td>Kateset 100 mg/ml</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Lloyd, Inc.</td><td>MWI #: 009307</td><td>Anased 100 mg/ml (zamówiono z MWI Veterinary Supply)</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>Hospira Inc.</td><td>94-217-JT</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>011M8207</td><td></td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BCBB4080</td><td></td></tr><tr><td>PECAM (CD31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553371</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna-CY3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-160-084</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>096555</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>Vector Nova Red</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>VectaMount</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela specyficznych odczynników&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Wzrost i przebudowa sieci mikro naczyniowej są krytycznymi aspektami gojenia ran, stanu zapalnego, retinopatii cukrzycowej, wzrostu guzów oraz innych stanów chorobowych1, 2. Wzrost sieci jest powszechnie przypisywany angiogenezie, definiowanej jako powstawanie nowych naczyń z naczyń istniejących. Proces angiogenezy jest również bezpośrednio powiązany z arteriogenezą, definiowaną jako nabieranie przez naczynia włosowate otoczki z komórek peryvaskularnych oraz powiększanie naczyń. Oczywiste jest, że angiogeneza jest procesem złożonym i angażuje wielu uczestników na poziomie komórkowym i molekularnym3. Zrozumienie sposobu wzrostu sieci mikro naczyniowej wymaga zidentyfikowania dynamiki przestrzennej i czasowej w obrębie hierarchii sieci w trakcie przebiegu angiogenezy. Informacje te są kluczowe dla opracowania terapii mających na celu manipulowanie wzrostem naczyń.
Model eksterioryzacji opisany w niniejszym artykule stanowi prosty, powtarzalny model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Został on zaadaptowany z modeli gojenia ran w krezce szczura4-7 i stanowi alternatywę dla stymulowania angiogenezy w krezce poprzez wstrzyknięcia doszpikowe (i.p.) czynników proangiogennych8, 9. Model eksterioryzacji jest atrakcyjny, ponieważ wymaga minimalnej interwencji chirurgicznej i powoduje gwałtowny, powtarzalny wzrost liczby pączków kapilarnych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyniowej w stosunkowo krótkim czasie w tkance, która umożliwia dwuwymiarową wizualizację całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczych komórek. Stymulowany wzrost odzwierciedla naturalne odpowiedzi angiogenne w środowisku fizjologicznym, bez zakłóceń wywołanych przez obce cząsteczki angiogenne. Dzięki zastosowaniu metod znakowania immunohistochemicznego model ten okazał się niezwykle użyteczny w identyfikacji nowych zdarzeń komórkowych uczestniczących w angiogenezie. Badacze mogą łatwo korelować wskaźniki angiogenne w czasie przebudowy z dynamiką specyficzną dla danego etapu, taką jak zmiany fenotypowe komórek lub interakcje komórkowe4, 5, 7, 10, 11.

Niniejszy artykuł opisuje prosty model stymulacji angiogenezy w krezce szczura. Model ten powoduje gwałtowny wzrost pączkowania naczyń włosowatych, powierzchni naczyniowej oraz gęstości naczyń w stosunkowo krótkim czasie, w tkance umożliwiającej wizualizację en face całych sieci mikronaczyniowych aż do poziomu pojedynczej komórki.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Wzrost i przebudowa sieci mikronaczyniowej są krytycznymi aspektami gojenia ran, stanu zapalnego, retinopatii cukrzycowej, wzrostu nowotworów oraz innych chorób...

Celem następnego eksperymentu jest zidentyfikowanie przestrzennej i czasowej dynamiki komórkowej biorącej udział w angiogenezie, definiowanej jako wzrost nowych naczyń krwionośnych z już istniejących. Wykorzystując prosty, powtarzalny model, należy najpierw stymulować angiogenezę poprzez krótkotrwałe wyeksponowanie krezki szczura, a następnie pobrać tkanki krezki w różnych punktach czasowych po stymulacji. Następnie należy przeprowadzić immunoznakowanie przekrojów tkankowych.Na przykład, należy użyć markera komórek śródbłonka, aby zwizualizować całą przebudowującą się strukturę naczyniową w obrębie tkanki i stworzyć kluczową dwuwymiarową wizualizację rozrastających się sieci mikro naczyniowych. Model ten jest atrakcyjny, ponieważ powoduje gwałtowny wzrost wielu parametrów angiogennych w stosunkowo krótkim czasie. Wizualizacja sieci na poziomie pojedynczych komórek oraz korelacja tych parametrów z etykietowaniem wielokomórkowym okazały się niezwykle użyteczne w identyfikacji nowych fenotypów komórek biorących udział w pączkowaniu naczyń kapilarnych.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące dynamiki komórkowej uczestniczącej we wzroście sieci mikro naczyniowej. Obejmuje to określenie czasu i miejsca obecności konkretnych komórek podczas procesu kiełkowania naczyń włosowatych. Głównymi zaletami tej metody są prostota, wymaganie minimalnej interwencji chirurgicznej oraz wywoływanie silnej odpowiedzi angiogennej w stosunkowo krótkim czasie.Ponadto wykorzystuje ona krezkę (rap mesentery), która jest tkanką umożliwiającą obserwację nienaruszonej sieci aż do poziomu pojedynczej komórki. W naszym doświadczeniu metoda ta jest bardzo łatwa do opanowania i w konsekwencji powtarzalna między różnymi badaczami po zaprezentowaniu procedury. Dziś Peter Stapler, doktorant w naszym laboratorium, przygotuje się do operacji zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym tekście.Po zgoleniu brzucha szczura należy ułożyć zanarkowanego zwierzęcia na plecach na podkładce grzewczej w celu utrzymania temperatury ciała. Obszar brzucha należy oczyścić, naprzemiennie przecierając go sterylnymi gazikami nasączonymi 70% alkoholem izopropylowym oraz jodyną. Około 2,5 cm poniżej mostka należy wykonać niewielkie cięcie podłużne wzdłuż skóry, a następnie wzdłuż białej linii brzucha. Na sekcję brzuszną należy nałożyć docięty wcześniej obłożnik tak, aby otwór pokrywał się z nacięciem. Delikatnie uciskając obszar wokół nacięcia, należy odsłonić jelito cienkie. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką należy ostrożnie wyciągnąć fragment jelita cienkiego, kładąc krezkę na plastikowej podstawce z jałową solą fizjologiczną, a następnie zlokalizować jelito kręte.Zidentyfikuj od sześciu do ośmiu unaczynionych okien krezowych – cienkich, półprzezroczystych błon znajdujących się pomiędzy parami tętnic i żył odżywiającymi jelito cienkie. Zapisz czas rozpoczęcia procedury i uruchom minutnik na 20 minut. Zaznacz dwa centralnie położone okna krezowe za pomocą sterylnej nici chirurgicznej 7/0 w obszarze tłuszczowym w pobliżu jelita.Okresowo uzupełniaj sól fizjologiczną w szalce Petriego za pomocą sterylnej strzykawki 5 ml, aby zapewnić, że tkanka pozostanie zanurzona i wilgotna. Po upływie czasu ekspozycji wprowadź krezkę z powrotem do jamy brzusznej. Zamknij mięśnie brzucha szwem przerwanym, używając mononici 5-0.Następnie zamknij skórę szwem monofilamentowym 4-0 w sposób przerywany, przemyj obszar szwu naprzemiennie sterylną gazą nasączoną 70% izopropanolem, alkoholem i jodyną, nałóż żel nawilżający na oba oczy szczura i przenieś go z powrotem do klatki w celu rekonwalescencji. W wyznaczonym dniu, po stymulacji, znieczul i uśmierć szczura zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Następnie ponownie otwórz jamę brzuszną i przykryj obszar brzucha kawałkiem folii spożywczej. Teraz ostrożnie wyciągnij jelito cienkie i zlokalizuj dwa zaznaczone okna, używając pincety i mikronożyczek.Wyciąć każde z wyeksponowanych okien krezowych wraz z marginesem tłuszczu. Należy starać się nie przecinać par tętnic i żył w obrębie tłuszczowego marginesu okien, aby zminimalizować ryzyko ich wypełnienia krwią. Należy również ograniczyć przecinanie jelit, co zapobiegnie wydostaniu się ich zawartości.Po kontakcie z oknami natychmiast zanurz każde okno w PBS. Następnie za pomocą pęsety rozłóż tkanki na pozytywnie naładowanych szkiełkach mikroskopowych, montując dwie tkanki na jednym szkiełku. Po częściowym wyschnięciu tkanek usuń nadmiar tłuszczu za pomocą ostrza skalpela.Utrwal próbki w metanolu przez 30 min w temperaturze -20 °C, umieszczając je w zamrażarce. Osusz preparaty w próżni, aby usunąć nadmiar roztworu buforu. Ponadto obrysuj tkanki pisakiem woskowym, aby zapobiec niekontrolowanemu wypływowi roztworów przeciwciał poza obszar tkanki.Następnie nanieś kroplami około 200 µL rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego, aby pokryć całą tkankę. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyj tkanki buforem PBS z dodatkiem 0,1% sapiny, stosując trzy wymiany buforu. Następnie dodaj roztwór przeciwciała wtórnego strep adin peroxidase i inkubuj w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę; po trzech przemyciach inkubuj próbki w Vector Nova Red przez 15 minut.Przepłukać wodą przed montowaniem preparatów. Zanurzyć 10 razy w 95% etanolu, a następnie przeprowadzić kolejne etapy odwodnienia. Pozostawić preparaty do wyschnięcia, pokryć tkanki cienką warstwą odpowiedniej ilości medium, a po suszeniu próżniowym i opisaniu, założyć szkiełka zakrywające.Preparaty. Przykryć próbki tkanek rozcieńczonym roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.Przemyć trzykrotnie w PBS z dodatkiem 0,1% saponiny, wykonując każde płukanie przez 10 minut. Następnie dodać przeciwciało wtórne i inkubować przez jedną godzinę. Przepłukać w PBS z dodatkiem 0,1% saponiny, zamontować preparaty na szkiełkach w PBS z glicerolem i zabezpieczyć lakierem do paznokci.W tym miejscu szczegółowo opisujemy modyfikację zwykłej szalki Petriego w celu wykorzystania jej jako pola operacyjnego. Do zapewnienia gładkiej powierzchni, przez którą krezka jest przeciągana przez wcześniej wycięty otwór, użyto żółtej glinki modelarskiej. Ponownie, okna krezkowe widoczne tutaj na polu operacyjnym w okresie eksternalizacji są definiowane jako cienkie, półprzezroczyste błony znajdujące się między parami tętnic i żył zasilającymi tutaj jelito.Barwienie PCAM pozwala zidentyfikować wszystkie typy naczyń w hierarchii przebudowujących się sieci mikro naczyniowych w określonych punktach czasowych po eksternalizacji. Obrazy te mogą być wykorzystane do ilościowego określenia parametrów angiogennych w konkretnych punktach czasowych po stymulacji.Oznakowanie PCAM pozwala na rozróżnienie tętnic od żył. Należy zauważyć, że tętnice doprowadzające zazwyczaj charakteryzują się mniejszymi średnicami i wydłużoną morfologią komórek śródbłonka w porównaniu do odpowiadających im żył. Typowe cechy przebudowy sieci obejmują obszar unaczynienia, kiełkowanie kapilar oraz gęstość naczyń.Kwantyfikacja tych różnych wskaźników angiogennych pozwala scharakteryzować przebieg czasowy wzrostu sieci. Kiełkowanie naczyń kapilarnych z istniejących już naczyń osiąga szczyt między trzecim a piątym dniem, a do dziesiątego dnia powraca do poziomu podstawowego (niestymulowanego). W naszym laboratorium ten przejściowy wzrost kiełkowania jest następowany przez zwiększenie obszaru unaczynionego oraz gęstości naczyń.Ten system modelowy został wykorzystany do identyfikacji nowych zmian fenotypowych w komórkach w określonych punktach czasowych podczas procesu przebudowy. Labelowanie immunofluorescencyjne PCA barwi komórki śródbłonka na czerwono, natomiast labelowanie beta-tubuliną klasy III barwi nerwy oraz pasożyty wzdłuż naczyń angiogennych na zielono. Co ciekawe, w tkankach niestymulowanych ekspresja beta-tubuliny klasy III jest specyficzna dla nerwów.W przeciwieństwie do tego, w szczytowym okresie kiełkowania naczyń włosowatych, beta-tubulina klasy trzeciej jest ekspresowana przez komórki okołonaczyniowe. Tego rodzaju wynik podkreśla użyteczność tego prostego i solidnego modelu angiogenezy w identyfikowaniu nowych typów komórek zaangażowanych w proces angiogenezy. Do 10. dnia wzorzec ekspresji beta-tubuliny klasy trzeciej zaczyna powracać do stanu niepobudzonego.Model ten mógłby potencjalnie zostać wykorzystany również do badań nad liniami komórkowymi. Wykonalność włączenia komórek do przebudowującej się tkanki krezkowej została potwierdzona w tych badaniach wstępnych, w których wcześniej znakowane komórki szpiku kostnego lub mezenchymalne komórki macierzyste były wprowadzane na okna krezkowe podczas 20 minutowego okresu ekspozycji zewnętrznej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać nasz model internalizacji krezki szczura do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej we wzrost sieci mikronaczyniowej.Tę prostą technikę można przeprowadzić w czasie od około 45 minut do jednej godziny. Należy pamiętać, że po zabiegu chirurgicznym kluczowe jest delikatne obchodzenie się z krezką oraz unikanie przebicia naczyń krwionośnych. Można zastosować znakowanie immunologiczne w celu identyfikacji wielu typów komórek wzdłuż naczyń krwionośnych.Można również przeprowadzić znakowanie naczyń limfatycznych i nerwów. Pozwala to na badanie nie tylko komórkowych zmian fenotypowych związanych z angiogenezą, ale także koordynacji między angiogenezą, neurogenezą a limfangiogenezą.

rat-mesentery-exteriorization-model-for-investigating-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zewnętrznienie trzewiakowate szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Test angiogenezy w krezoni szczura

Mysia siatkówka noworodka dostarcza dobrze scharakteryzowanego fizjologicznego modelu angiogenezy, który pozwala na badanie ról różnych genów lub leków modulujących angiogenezę w kontekście in vivo. Barwienie immunofluorescencyjne w celu dokładnej wizualizacji splotu naczyniowego ma kluczowe znaczenie dla powodzenia tego typu badań.

Barwienie immunofluorescencyjne siatkówki noworodka myszy w celu zbadania angiogenezy in vivo

Protokół opisuje test mikrokieszeni rogówki, tak jak został on opracowany u myszy.

Test mikrokieszeni rogówki: model angiogenezy w oku myszy

Opisujemy test czopa matrigelowego, aby zilustrować potencjał angiogenny puli czynników wydzielanych przez komórki nowotworowe za pomocą dwóch uzupełniających się metod obrazowania, ultradźwięków i endomikroskopii. Matrigel, żel naśladujący macierz zewnątrzkomórkową (ECM), jest wykorzystywany do wprowadzenia gospodarza (myszy) z czynnikami angiogennymi wydzielanymi do kondycjonowanego podłoża (CM).

Monitorowanie funkcjonalności i morfologii układu krwionośnego rekrutowanego przez czynniki wydzielane przez szybko rosnące komórki nowotworowe

Ten protokół opisuje obrazowanie intrażyciowe transgenicznych myszy wykazujących ekspresję specyficznych dla komórek markerów fluorescencyjnych. Obrazowanie przyżyciowe zapewnia nieinwazyjną metodę obserwacji w wysokiej rozdzielczości u żywych zwierząt za pomocą wszczepialnych okien, przez które możliwa jest mikroskopowa wizualizacja procesów. Ta metoda jest szczególnie przydatna do badania procesów podłużnych.

Mikroskopia przyżyciowa naczyń krwionośnych związanych z nowotworem przy użyciu zaawansowanych komór okiennych grzbietowych fałdów skórnych na transgenicznych myszach fluorescencyjnych

Angiogeneza obejmuje interakcje wielokomórkowe, wielosystemowe, które muszą być badane w fizjologicznie odpowiednim środowisku. Celem tego badania jest wykazanie zdolności modelu hodowli krezki szczurów do dokonywania poklatkowych porównań nienaruszonych sieci mikronaczyniowych podczas angiogenezy.

Metoda ex vivo do obrazowania poklatkowego sieci mikronaczyniowych krezki szczura

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Angiogeneza kiełkowania, fundamentalna dla rozwoju i choroby, obejmuje złożone procesy molekularne i mechaniczne. Przedstawiamy wszechstronny model 2,5D ex vivo, który analizuje kiełkowanie komórek z tętnic szyjnych świń, ujawniając angiogenezę zależną od sztywności i wyraźną mechanikę komórek lidera-podążacza. Model ten pomaga w rozwijaniu strategii inżynierii tkankowej i podejść do terapii nowotworów.

Model 2.5D do mechanicznej charakterystyki ex vivo angiogenezy kiełkowania w żywej tkance

Poznaj model eksterioryzacji krezki szczura do badania dynamiki komórkowej w angiogenezie. Ta metoda umożliwia wizualizację sieci naczyniowej na poziomie pojedynczych komórek i identyfikację nowych fenotypów.

Eksterioryzacja krezki szczura: model do badania dynamiki komórkowej zaangażowanej w angiogenezę

Przeglądaj więcej filmów