Name: Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz testy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i liczby płytek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Poznaj metodę biokoniugacji kropek kwantowych CdTe z antybiotykami i testowania ich przeciwbakteryjnej aktywności przy aktywacji światłem. Technika ta umożliwia badanie nowych środków bakteriobójczych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana przez program NSERC Individual Discovery, program NSERC/CIHR Collaborative Health Research Program (CHRP) oraz program NSERC CREATE Canadian Astrobiology Training Program (CATP).

1. Solubilizacja kropek kwantowych (QD)
Jest to metoda odpowiednia dla CdTe. Podobne metody można zastosować w przypadku innych rodzajów kropek kwantowych (QD), takich jak InP/ZnS20 i CdSe/ZnS 21.
<ol>
 <li>Przygotować roztwór kropek kwantowych (QD) CdTe w toluenie o stężeniu 15 μM (gęstość optyczna = 2,5 przy pierwszym piku ekscytonowym).</li>
 <li>Przenieść 200 μL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki. Nie używać plastiku!</li>
 <li>Dodać 800 μL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boratowego (pH 9) oraz 2 μL 11,5 M kwasu merkaptopropionowego (MPA).</li>
 <li>Zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30-60 sekund.</li>
 <li>Fazy wodna i organiczna rozdzielą się samoistnie. Faza wodna przybierze kolor kropek kwantowych. Aby usunąć warstwę toluenu, należy ją odessać i odrzucić. Następnie przenieść fazę wodną do czystej fiolki.</li>
 <li>Oczyścić rozpuszczalne QD poprzez czterokrotne przemycie/filtrowanie przy użyciu filtra wirowego o progu odcięcia 10000 Da i pojemności 500 μL. Filtry należy wirować przy 3000 x g przez 13 minut. Przez co najmniej dwa ostatnie etapy przemywać docelowym buforem.</li>
 <li>Po ostatnim przemyciu zawiesić oczyszczone QD w 50 mM buforze boratowym o żądanym pH i przechowywać w temperaturze 4 °C. Będą one stabilne przez 1-2 tygodnie.</li>
 <li>Zmierzyć widma absorbancji i emisji, aby oszacować stężenie na podstawie opublikowanych wzorów 22.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki: Rysunek 1 przedstawia obraz CdTe QDs pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, wykazując pomijalną zmianę po wymianie otoczki. Wartości rozmiaru to średnica rdzenia zmierzona za pomocą mikroskopii elektronowej.
2. Koniugacja kropek kwantowych z antybiotykiem
Ta część protokołu ma zastosowanie do każdej ujemnie naładowanej nanocząstki rozpuszczalnej w wodzie, w tym do większości komercyjnych QD, cząstek metali i innych19.
<ol>
 <li>Można zastosować dowolną cząsteczkę, która albo samoorganizuje się na ujemnie naładowanych rozpuszczonych QD, albo posiada grupę reakcyjną umożliwiającą koniugację, np. aminę pierwszorzędową. W tym przykładzie wykorzystujemy polymyxynę B (PMB), która jest dodatnio naładowana i samoorganizuje się bez konieczności stosowania reagentów do koniugacji. Rozpuścić PMB w H2O do stężenia 60 μM. (Jeśli wybrany antybiotyk nie jest rozpuszczalny w H2O, rozpuścić go w DMSO lub etanolu w stężeniu 0,1-1 mM). Będzie to roztwór 10x (w H2O) lub roztwór 100x (w rozpuszczalniku).</li>
 <li>Obliczyć ilość roztworu QD potrzebną do eksperymentów nad toksycznością bakteryjną. Dla płytki 96-dołkowej z objętością 0,3 mL na dołek w czterech powtórzeniach wymagane jest 0,5 mL koniugatu o stężeniu 200 nM. Przygotować dwie probówki zawierające 100 μL kropek kwantowych o stężeniu 1 μM w 50 mM buforze boratowym.</li>
 <li>W przypadku sprzęgania z aminą pierwszorzędową przygotować roztwór węglowanimidu 1-etylo-3-[3-dimetylaminopropyl]o (EDC) o stężeniu 19 mg/mL (100 mM) w H2O. Roztwór EDC jest niestabilny; należy go użyć natychmiast, a pozostałość wyrzucić.</li>
 <li>Do probówki z koniugatem dodać 50 μL 10x roztworu antybiotyku (w H2O) lub 5 μL roztworu 100x (w rozpuszczalniku). Dla koniugacji PMB:CdTe w stosunku molowym 30:1 dodać 50 μL PMB o stężeniu 60 μM. Do probówki kontrolnej z samymi QD dodać H2O lub rozpuszczalnik.</li>
 <li>W razie potrzeby dodać 1 μL roztworu stokowego EDC do probówki z koniugatem.</li>
 <li>Uzupełnić objętość koniugatu do 0,5 mL za pomocą odpowiedniego buforu (bufor boratowy lub PBS; nie stosować buforów zawierających aminy, takich jak Tris, ponieważ hamują one działanie EDC).</li>
 <li>Zabezpieczyć probówki przed światłem za pomocą folii aluminiowej i umieścić na nutatorze lub kołysce na 1 h. W przypadku wystąpienia agregacji powtórzyć koniugację z niższymi stężeniami antybiotyku. Zwiększać stężenie stopniowo, aż do momentu, gdy cząstki przestaną agregować.</li>
 <li>Przemyć koniugaty, przepuszczając je przez odpowiedni filtr. Próg odcięcia masy cząsteczkowej 10000 jest odpowiedni dla większości antybiotyków, ale nie dla białek lub przeciwciał.</li>
 <li>W zależności od cząsteczki do oszacowania liczby cząsteczek antybiotyku na jedno QD można zastosować różne metody: spektroskopię absorbancyjną lub fluorescencyjną, elektroforezę żelową lub spektroskopię w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki. W tym przykładzie koniugacja PMB jest charakteryzowana zmianami w widmie emisji QD. Rysunek 2 przedstawia widma kropel kwantowych CdTe po dodaniu PMB.
3. Przygotowanie bakterii do przesiewania w płytkach 96-dołkowych; oznaczenie IC50 antybiotyku
Metoda ta ma zastosowanie do niemal każdego szczepu bakterii hodowanego na odpowiedniej pożywce18. Dokładny czas trwania pomiarów zależy od szybkości wzrostu bakterii. W naszym przykładzie wykorzystano Escherichia coli hodowane na pożywce LB (lysogeny broth).
<ol>
 <li>Aby wybrać odpowiednie stężenia koniugatów QD, należy znać IC50 antybiotyku przeznaczonego do koniugacji oraz ustalić, czy same QD są toksyczne. Proces ten należy rozpocząć 2 dni przed eksperymentem z koniugacją. Wieczorem, stosując właściwe techniki sterylności i bezpieczeństwa biologicznego, zaszczepić 10 mL pożywki do wzrostu bakterii świeżą kolonią.</li>
 <li>Następnego dnia, 1-2 godziny przed eksperymentem, napełnić każdy dołek płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością pożywki. Za pomocą pipety wielokanałowej zaszczepić każdy dołek ilością od 1-50 μL kultury bakteryjnej (stężenie będzie zależeć od szybkości wzrostu danego szczepu i musi zostać skalibrowane w laboratorium).</li>
 <li>Umieścić płytkę w czytniku płytek i ustawić pomiar co 10 minut przez 2 godziny przy określonej długości fali (zazwyczaj 600 nm). Monitorować płytkę, aby bakterie nie osiągnęły zbyt wysokiej gęstości zbyt szybko.</li>
 <li>Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0,1-0,15, wyjąć płytkę z czytnika i zakończyć pomiar.</li>
 <li>Dodać sam lek oraz same QD w różnych stężeniach, wykonując pomiary w co najmniej trzech powtórzeniach. Jedną stronę płytki wykorzystać jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę poddać naświetlaniu. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 3. Stężenia powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawierał jedno stężenie, które w niewielkim stopniu hamuje wzrost bakterii, oraz jedno, które całkowicie je zabija.</li>
 <li>Osłonić „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Pozostałą stronę naświetlić lampą o pożądanej długości fali. Stosujemy specjalistyczną lampę do płytek 96-dołkowych o długości fali 440 nm, zbudowaną z diod LED 2,4 mW (Rysunek 4), i naświetlamy przez 30-60 min. Czarne płytki z przezroczystym dnem pomagają chronić nienaświetlane bakterie przed światłem rozproszonym. Między stroną naświetlaną a nienaświetlaną można również pozostawić pustą kolumnę.</li>
 <li>Po naświetlaniu umieścić płytkę w czytniku i rejestrować OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin, w zależności od szybkości wzrostu. Jeśli to możliwe, utrzymać temperaturę &lt; 32 °C, aby zapobiec wysychaniu kultur.</li>
 <li>Wykreślić krzywe wzrostu w wybranym punkcie czasowym w funkcji log [stężenia] i wyznaczyć IC50 antybiotyku za pomocą równania Hilla:</li>
</ol>
<img alt="Równanie regresji nieliniowej dla analizy krzywej dawka-odpowiedź ze zmiennymi ymax, ymin, IC50, H." src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
gdzie H to współczynnik Hilla, ymax to najwyższy punkt wzrostu (idealnie na plateau), a ymin to punkt zerowy, również idealnie na plateau. Mało prawdopodobne jest, aby same kropki kwantowe (QDs) wykazały znaczną toksyczność dla komórek przy zastosowanych stężeniach, zatem wartość ta nie zostanie wyznaczona.
Reprezentatywne wyniki. Pod koniec okresu rejestracji czyste studzienki będą wskazywać na całkowity śmierć komórek, a wzdłuż rosnących stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórek. Bakterie powinny wykazywać krzywe wzrostu w kształcie litery S (Rysunek 5 A); położenie maksymalnego plateau będzie się znacznie różnić w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać określony punkt czasowy jako reprezentatywny i nanieść wartości na wykres w funkcji Log[antibiotic], aby wyznaczyć IC50 (Rysunek 5 B). Aby ocenić toksyczność QD, można również nanieść na wykres przeżywalność w funkcji Log[QD], jednak uzyskanie znaczącego efektu zabijania bakterii za pomocą samych QD jest rzadkie (Rysunek 5 C).
4. Przygotowanie bakterii do przesiewu w 96-dołkowej płytce z antybiotykiem/kropkami kwantowymi (QDs)
<ol>
 <li>Dzień przed eksperymentem, z zachowaniem odpowiednich technik sterylności i bezpieczeństwa biologicznego, zaszczep 10 mL kultury z świeżej kolonii do odpowiedniego medium bogatego. Konjugat QD-antybiotyk należy przygotować tego dnia, chyba że jest on wysoce niestabilny.</li>
 <li>Na 1-2 godziny przed eksperymentem wypełnij każdą z studni płytki 96-dołkowej z przezroczystym dnem niemal maksymalną ilością medium wzrostowego. Za pomocą pipety wielokanałowej zaszczep każdą studnię 1-50 μL kultury bakteryjnej.</li>
 <li>Umieść płytkę w czytniku płytek i ustaw odczyt co 10 minut przez 2 godziny przy tej samej długości fali, co w Części 3.</li>
 <li>Gdy wszystkie komórki osiągną OD=0,1-0,15, wyjmij płytkę z czytnika i zatrzymaj rejestrację.</li>
 <li>Dodaj konjugaty QD w różnych stężeniach, wykonując pomiar w przynajmniej czterech powtórzeniach. Jedną stronę płytki wykorzystaj jako kontrolę „ciemną”, a drugą połowę jako oświetloną. Sugerowany układ przedstawiono na Rysunku 6. Pasek kontrolny zawierający wyłącznie bakterie powinien być zawsze uwzględniany na wypadek, gdyby problemy z kulturą, temperaturą itp. wpłynęły na warunki wzrostu. Należy również uwzględnić pojedyncze paski zawierające tylko lek oraz tylko QD, aby upewnić się, że odpowiadają one płytce kontrolnej przygotowanej wcześniej. Pozostałe studnie przeznacz dla konjugatów, aby zapewnić odpowiednią statystykę.</li>
 <li>Osłoń „ciemną” stronę płytki folią aluminiową. Wystaw drugą stronę na działanie lampy o pożądanej długości fali.</li>
 <li>Po ekspozycji na światło umieść płytkę w czytniku płytek i rejestruj OD 600 co 10 minut przez 5-12 godzin. Jeśli to możliwe, utrzymuj temperaturę &lt; 32 °C, aby uniknąć wysychania kultur.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki. Połączenie QD i antybiotyku może być mniej toksyczne niż sam antybiotyk, równie toksyczne lub bardziej toksyczne. Można to określić ilościowo za pomocą krzywych wzrostu i pomiarów IC50. Na Rysunku 7 przedstawiono przykład koniugatów o toksyczności równej samemu antybiotykowi oraz przykład koniugatów o większej toksyczności.
5. Liczenie kolonii na płytkach
<ol>
 <li>Wybierz jedną lub więcej studzienek z przetworzonej płytki 96-dołkowej do przeprowadzenia rozcieńczeń seryjnych i zliczania kolonii.</li>
 <li>Przygotuj rozcieńczenia seryjne dla każdej z wybranych próbek bakterii w PBS lub roztworze soli fizjologicznej (0,9 % NaCl). Przenieś 20 μL roztworu bakteryjnego i rozcieńcz go w 180 μL roztworu soli fizjologicznej, wymień końcówkę pipety, wymieszaj i przenieś 20 μL rozcieńczonego roztworu bakteryjnego do 180 μL roztworu soli fizjologicznej. Powtórz czynność 6 razy.</li>
 <li>Pobierz 10 μL z każdego rozcieńczenia i wysej na odpowiednią płytkę z podłożem stałym. Wszystkie 8 stężeń jednej próbki można wysiać na okrągłej szalce Petriego o średnicy 10 cm, choć preferowane są szalki prostokątne, ponieważ ułatwia to zachowanie równego rozmieszczenia.</li>
 <li>Pozostaw do wyschnięcia na blacie przez 15 min, a następnie inkubuj w temperaturze odpowiedniej dla danej bakterii przez 16 godzin.</li>
 <li>Zlicz kolonie i oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) zgodnie ze wzorem: (liczba kolonii x czynnik rozcieńczenia)/objętość wysiana = CFU/mL.</li>
</ol>
Rysunek 8 przedstawia przykładową płytkę z CFU.
6. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Fotoluminescencja CdTe, widma emisji, kropki kwantowe, próbki w fiolkach, wykres analizy spektralnej." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Kropki kwantowe (QDs) CdTe. (A) Osiem preparatów QDs CdTe naświetlonych lampą UV (365 nm). (B) Widma absorbancji i emisji pięciu wybranych rozmiarów przed i po solubilizacji w wodzie. Linie przerywane reprezentują widma w toluenie, a linie ciągłe w wodzie.
<img alt="Widma emisji i wykres absorbancji; stosunek PMB:CdTe w funkcji długości fali; analiza fotoniczna." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza widmowa i żelowa koniugatów QD-PMB. W tym przykładzie zastosowano kropki kwantowe (QDs) CdTe emitujące światło pomarańczowe; wpływ na inne rodzaje QDs będzie musiał zostać oceniony dla każdego eksperymentu. (A) Typowe widmo absorbancji (szara linia) i widmo emisji (czarna linia) QDs przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji (linia przerywana) po dodaniu 160 równoważników molowych PMB. (B) Zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji QDs (kwadraty) oraz położeniem szczytu długości fali (trójkąty).
<img alt="Układ płytki w teście wzrostu E. coli; rozcieńczenia seryjne PMB i QD; konfiguracja eksperymentalna i analiza." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sugerowany układ płytki dla kontrolnego wzrostu. Przedstawiono szeroki zakres stężeń PMB i QD. Jedna połowa płytki jest naświetlana (zaznaczona na niebiesko), a druga, identyczna połowa, jest chroniona przed światłem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.
<img alt="Matryca LED do wzbudzenia optycznego w eksperymentach fotonicznych; góra wyłączona, dół zapalona, emituje niebieskie światło." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Specjalistyczna lampa z 96 diodami LED do jednorodnego naświetlania płytek, przedstawiająca wygląd w stanie wyłączonym i włączonym. Można również użyć typowej przenośnej lampy UV, jednak nie zapewni ona jednorodnego pokrycia całej płytki.
<img alt="Wykres hamowania wzrostu bakterii i analizy przeżywalności; efekt światła PMB; badanie odpowiedzi optycznej." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przykładowe wyniki dla płyt kontrolnych wzrostu. (A) Reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od 0 do całkowitej śmierci komórek. Symbole puste oznaczają sam PMB z podanymi stężeniami; symbole pełne oznaczają CdTe-PMB bez naświetlania; a symbole częściowo wypełnione oznaczają CdTe-PMB z naświetlaniem. Naświetlanie nie miało wpływu na próbki zawierające tylko PMB, dlatego krzywe te pominięto dla przejrzystości. Wszystkie konjugaty PMB-CdTe mają stosunek PMB:QD wynoszący 30:1. (B) Wykresy wartości krzywej wzrostu w 200 min w funkcji Log[PMB] wraz z dopasowaniem do równania (1). W celu kontroli efektów światła wykonano krzywą dla samego antybiotyku przy 30 min ekspozycji na światło. (C) Przeżywalność bakterii w 200 min w funkcji stężenia QD z użyciem QD CdTe. Przy ekspozycji na światło widoczna jest pewna toksyczność, jednak zbyt mała, aby wyznaczyć wartość IC50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększony rysunek</a>.
<img alt="Schemat rozmieszczenia na mikropłytce; E. coli, kropki kwantowe (QD), seria stężeń PMB do testów bioassay." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Sugerowany układ płytki do testowania koniugatów. Podświetlona na niebiesko połowa płytki powinna być wystawiona na działanie światła, a połowa niewyróżniona powinna być chroniona. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą rycinę</a>.
<img alt="Test inhibicji wzrostu bakterii, OD 600 w funkcji log[PMB], porównanie formulacji PMB; wykres eksperymentalny." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Przykładowe wyniki dla płytki testowej z koniugatami. Wartości krzywej wzrostu w 200 min naniesiono na wykres i dopasowano do równania (1). (A) Koniugaty CdTe-PMB wykazują zwiększoną toksyczność w porównaniu do samego PMB. (B) Koniugaty nanocząsteczek złota Au-PMB nie wykazują zwiększonej toksyczności w porównaniu do samego PMB.
<img alt="Wzrost kolonii bakteryjnych, seria rozcieńczeń na płytce agarowej, układ eksperymentalny, analiza mikrobiologiczna." src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Przykład płytki CFU. E. coli zasiane w płytce 96-dołkowej poddano działaniu QD-PMB z naświetlaniem lub bez naświetlania przez 30 min, następnie inkubowano w 32 °C przez 4 godziny. Wykonano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 μL rozcieńczeń od 100 X do 107 X wysiano na płytki agarowe. Płytki inkubowano w 37 °C, a kolonie policzono po 16 godzinach. Na płytce zaznaczono rozcieńczenia wzdłuż rzędów; kolumny to: (A) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe (C) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe, (D) 0.06 μM PMB + 2 nM CdTe naświetlane, (E) 0.12 μM PMB + 4 nM CdTe naświetlane, (F) 0.2 μM PMB + 6.7 nM CdTe naświetlane.

<ol><li>Michalet, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dots+for+live+cells%2C+in+vivo+imaging%2C+and+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics.</a> Science. 307, 538-544 (2005).</li>
<li>Jamieson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+applications+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Biological applications of quantum dots.</a> Biomaterials. 28, 4717-4732 (2007).</li>
<li>Asokan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+heat+transfer+fluids+in+the+synthesis+of+high-quality+CdSe+quantum+dots%2C+core%2Fshell+quantum+dots%2C+and+quantum+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of heat transfer fluids in the synthesis of high-quality CdSe quantum dots, core/shell quantum dots, and quantum rods.</a> Nanotechnology. 16, 2000-2011 (2005).</li>
<li>Chan, W. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+quantum+dots+for+multiplexed+biological+detection+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Luminescent quantum dots for multiplexed biological detection and imaging.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 13, 40-46 (2002).</li>
<li>Chan, W. C. W., Nie, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantum+dot+bioconjugates+for+ultrasensitive+nonisotopic+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection.</a> Science. 281, 2016-2018 (1998).</li>
<li>Biju, V., Itoh, T., Ishikawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+quantum+dots+to+cells%3A+bioconjugated+quantum+dots+for+targeted+and+nonspecific+extracellular+and+intracellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Delivering quantum dots to cells: bioconjugated quantum dots for targeted and nonspecific extracellular and intracellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 39, 3031-3056 (2010).</li>
<li>Boucher, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bad++bugs%2C+no+drugs%3A+no+ESKAPE%21+An+update+from+the+Infectious+Diseases+Society+of+America%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Bad bugs, no drugs: no ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America.</a> Clin. Infect. Dis. 48, 1-12 (2009).</li>
<li>Morones, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bactericidal+effect+of+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The bactericidal effect of silver nanoparticles.</a> Nanotechnology. 16, 2346-2353 (2005).</li>
<li>Mitoraj, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light+inactivation+of+bacteria+and+fungi+by+modified+titanium+dioxide%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Visible light inactivation of bacteria and fungi by modified titanium dioxide.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 6, 642-648 (2007).</li>
<li>Fu, G., Vary, P. S., Lin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatase+TiO2+nanocomposites+for+antimicrobial+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Anatase TiO2 nanocomposites for antimicrobial coatings.</a> J. Phys. Chem. B. 109, 8889-8898 (2005).</li>
<li>Chung, C. J., Lin, H. I., Tsou, H. K., Shi, Z. Y., He, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antimicrobial+TiO2+coating+for+reducing+hospital-acquired+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+B.+Appl.+Biomater%22%5BJournal%5D)">An antimicrobial TiO2 coating for reducing hospital-acquired infection.</a> J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 85, 220-224 (2008).</li>
<li>Nair, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+size+scale+of+ZnO+nanoparticles+and+microparticles+on+toxicity+toward+bacteria+and+osteoblast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Role of size scale of ZnO nanoparticles and microparticles on toxicity toward bacteria and osteoblast cancer cells.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 20, Suppl . 1. S235-S241 (2009).</li>
<li>Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. C., Kahru, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+nanosized+and+bulk+ZnO%2C+CuO+and+TiO2+to+bacteria+Vibrio+fischeri+and+crustaceans+Daphnia+magna+and+Thamnocephalus+platyurus%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus.</a> Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).</li>
<li>Rincon, A. G., Pulgarin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+coaxial+photocatalytic+reactor+%28CAPHORE%29+in+the+TiO2+photo-assisted+treatment+of+mixed+Escherichia+coli+and+Bacillus+subtilis+and+the+bacterial+community+present+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Catal.+Today%22%5BJournal%5D)">Use of coaxial photocatalytic reactor (CAPHORE) in the TiO2 photo-assisted treatment of mixed Escherichia coli and Bacillus subtilis and the bacterial community present in wastewater.</a> Catal. Today. 101, 331-344 (2005).</li>
<li>Neal, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+inferred+from+bacterium-nanoparticle+interactions+about+the+potential+consequences+of+environmental+exposure+to+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">What can be inferred from bacterium-nanoparticle interactions about the potential consequences of environmental exposure to nanoparticles.</a> Ecotoxicology. 17, 362-371 (2008).</li>
<li>Kovochich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicity+of+C60+aggregates+toward+mammalian+cells%3A+role+of+tetrahydrofuran+%28THF%29+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicity of C60 aggregates toward mammalian cells: role of tetrahydrofuran (THF) decomposition.</a> Environ. Sci. Technol. 43, 6378-6384 (2009).</li>
<li>Hoshino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physicochemical+properties+and+cellular+toxicity+of+nanocrystal+quantum+dots+depend+on+their+surface+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification.</a> Nano Letters. 4, 2163-2169 (2004).</li>
<li>Dumas, E. M., Ozenne, V., Mielke, R. E., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+CdTe+Quantum+Dots+in+Bacterial+Strains%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+NanoBiosci%22%5BJournal%5D)">Toxicity of CdTe Quantum Dots in Bacterial Strains.</a> IEEE Trans. NanoBiosci. 8, 58-64 (2009).</li>
<li>Park, S., Chibli, H., Wong, J., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+activity+and+cellular+toxicity+of+nanoparticle-polymyxin+B+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial activity and cellular toxicity of nanoparticle-polymyxin B conjugates.</a> Nanotechnology. 22, 185101(2011).</li>
<li>Cooper, D. R., Dimitrijevic, N. M., Nadeau, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosensitization+of+CdSe%2FZnS+QDs+and+reliability+of+assays+for+reactive+oxygen+species+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Photosensitization of CdSe/ZnS QDs and reliability of assays for reactive oxygen species production.</a> Nanoscale. 2, 114-121 (2010).</li>
<li>Pong, B. K., Trout, B. L., Lee, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+ligand-exchange+for+efficient+solubilization+of+CdSe%2FZnS+quantum+dots+in+water%3A+A+procedure+guided+by+computational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modified ligand-exchange for efficient solubilization of CdSe/ZnS quantum dots in water: A procedure guided by computational studies.</a> Langmuir. 24, 5270-5276 (2008).</li>
<li>Narayanaswamy, A., Feiner, L. F., Meijerink, A., Zaag, P. J. vander <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+temperature+and+dot+size+on+the+spectral+properties+of+colloidal+InP%2FZnS+core-shell+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Nano%22%5BJournal%5D)">The effect of temperature and dot size on the spectral properties of colloidal InP/ZnS core-shell quantum dots.</a> Acs Nano. 3, 2539-2546 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Nanocząstki stanowią obiecujące podejście do tworzenia nowych środków przeciwdrobnoustrojowych. Analiza krzywej wzrostu jest sposobem monitorowania gęstości komórek bakteryjnych, który pozwala odróżnić komórki aktywnie rosnące od komórek o zahamowanym wzroście. W połączeniu z liczeniem kolonii na płytkach umożliwia ona dokładną analizę potencjału antybiotykowego koniugatu. Format 96-dołkowy pozwala na stosunkowo wysokoprzepustowe zmiany stężeń i innych warunków, takich jak ekspozycja na światło; ta ostatnia jest kluczowa...

<table><tbody><tr><td>Składnik buforu boranowego nr 1</td><td>Fisher</td><td>Boric acid A-74-1</td><td></td></tr><tr><td>Składnik buforu boranowego nr 2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Sodium Tetraborate B9876</td><td></td></tr><tr><td>MPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5801</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 500</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9322</td><td>Dostępne różne MWCO</td></tr><tr><td>Fiolki szklane</td><td>Fisher</td><td>03-338C</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>Polymyxyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004</td><td></td></tr><tr><td>Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 1</td><td>Fisher</td><td>NaCl S271</td><td></td></tr><tr><td>Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 2</td><td>BD</td><td>Tryptone 211705</td><td></td></tr><tr><td>Składnik pożywki do wzrostu bakterii (LB) nr 3</td><td>BD</td><td>Yeast Extract 211929</td><td></td></tr><tr><td>Lampa do naświetlania</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z przezroczystym dnem</td><td>Fisher</td><td>07-200-567 lub 07-200-730</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr fluorescencyjny</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Czytnik płytek absorbancji</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoAgar do pożywek stałych</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.1</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego okrągłe</td><td>Fisher</td><td>08-75-12</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego prostokątne</td><td>Fisher</td><td>08-757-11A</td><td></td></tr></tbody></table>

solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Kropki kwantowe (QDs) to fluorescencyjne nanocząstki półprzewodnikowe o widmach emisji zależnych od rozmiaru, które mogą być pobudzane szerokim zakresem długości fal. Ze względu na swoją jasną i stabilną fluorescencję, QDs wzbudziły duże zainteresowanie w obszarze obrazowania, diagnostyki i terapii1,2 3,4,5. QDs mogą być konjugowane z różnymi cząsteczkami biologicznie aktywnymi w celu wiązania z bakteriami i komórkami ssaków6.
Kropki kwantowe (QDs) są również szeroko badane jako czynniki cytotoksyczne do ukierunkowanego zwalczania bakterii. Pojawianie się wielolekoopornych szczepów bakteryjnych szybko staje się kryzysem zdrowia publicznego, szczególnie w przypadku patogenów Gram-ujemnych 7. Ze względu na dobrze znany efekt przeciwdrobnoustrojowy niektórych nanomateriałów, zwłaszcza Ag, istnieje setki badań analizujących toksyczność nanocząstek wobec bakterii 8. Badania bakteriologiczne przeprowadzono również z zastosowaniem innych rodzajów półprzewodnikowych nanocząstek, zwłaszcza TiO2 9,10-11, ale także ZnO12 i innych, w tym CuO 13. W badaniach tych przeprowadzono niektóre porównania szczepów bakteryjnych, zazwyczaj zestawiając szczep Gram-ujemny ze szczepem Gram-dodatnim. W przypadku wszystkich tych cząstek mechanizmy toksyczności przypisuje się utlenianiu: albo fotogenerowaniu reaktywnych form tlenu (ROS) przez cząstki, albo bezpośredniemu uwalnianiu jonów metali, które mogą powodować toksyczność oksydacyjną. Nawet w odniesieniu do tych materiałów wyniki różnych badań znacznie się różnią. W niektórych opracowaniach zgłaszano, że badany szczep Gram-dodatni jest bardziej wrażliwy niż Gram-ujemny 10; w innych obserwowano sytuację odwrotną 14. Badania te zostały szczegółowo omówione w przeglądach literatury 15.
W przypadku wszystkich badań nad nanocząsteczkami skład cząstek, ich rozmiar, chemia powierzchni, starzenie/rozpad próbki oraz długość fali, moc i czas ekspozycji na światło mogą w znacznym stopniu wpływać na wyniki. Ponadto należy wziąć pod uwagę produkty uboczne syntezy oraz rozpuszczalniki16 17. W celu opracowania skutecznych nowych preparatów nanomedycznych konieczne jest zastosowanie technik wysokoprzepustowego przesiewania.
Kropki kwantowe CdTe wykazują działanie przeciwdrobnoustrojowe samodzielnie18 lub w połączeniu z antybiotykami. W poprzednim badaniu wykazaliśmy, że sprzęganie antybiotyków z CdTe może zwiększyć toksyczność wobec bakterii, ale zmniejszyć toksyczność wobec komórek ssaków, co wynika ze zmniejszonej produkcji reaktywnych form tlenu przez konjugaty19. Choć jest mało prawdopodobne, aby związki zawierające kadm zostały dopuszczone do stosowania u ludzi, takie preparaty mogłyby być wykorzystywane do dezynfekcji powierzchni lub sterylizacji wody.
W niniejszym protokole przedstawiamy prostą metodę solubilizacji kropek kwantowych CdTe za pomocą kwasu mercaptopropionowego (MPA). Kropki kwantowe są gotowe do użycia w ciągu godziny. Następnie demonstrujemy ich sprzęganie z czynnikiem przeciwdrobnoustrojowym.
Druga część protokołu przedstawia test inhibicji bakterii w 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem konjugowanych i niekonjugowanych kropek kwantowych (QD). Gęstość optyczna jest odczytywana przez wiele godzin, co pozwala na ocenę efektów dodania QD i ekspozycji na światło zarówno natychmiast, jak i po okresie regeneracji. Przedstawiamy również metodę liczenia kolonii w celu ilościowego określenia przeżywalności bakterii.

Nanocząstki, takie jak półprzewodnikowe kropki kwantowe (QDs), mogą być wykorzystywane do tworzenia agentów fotoaktywowalnych w zastosowaniach przeciwdrobnoustrojowych lub przeciwnowotworowych. Niniejsza technika przedstawia sposób nadawania rozpuszczalności w wodzie kropkom kwantowym z tellurku kadmu (CdTe), ich sprzęganie z antybiotykiem oraz przeprowadzanie testu inhibicji bakteryjnej w oparciu o krzywe wzrostu i liczenie kolonii na płytkach.

Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Kropki kwantowe (QDs) to fluorescencyjne półprzewodnikowe nanocząstki o widmach emisji zależnych od rozmiaru, które mogą być wzbudzane za pomocą szerokiego zakresu długości fal. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego przesiewu efektów przeciwbakteryjnych nanocząstek z koniugacją lub bez koniugacji z antybiotykami. W tym celu badane są efekty przeciwbakteryjne kropek kwantowych tellurku kadmu skoniugowanych z polymiksem oraz B. Kropki kwantowe są najpierw rozpuszczane w kwasie mercaptoproponowym.Następnie kropki kwantowe są koniugowane z poly mix i B, a następnie bakterie wysiane na płytkach z antybiotykami są traktowane zarówno koniugowanymi z antybiotykiem, jak i niekoniugowanymi kropkami kwantowymi. Połowa próbek jest poddawana naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 440 nanometrów przez 30 minut, co powoduje generowanie przez kropki kwantowe ekscytonów i reaktywnych form tlenu, aby ocenić wpływ traktowania kropkami kwantowymi na wzrost i przeżywalność bakterii. Wykonuje się pomiary gęstości optycznej oraz zlicza kolonie. Uzyskane dane wskazują, że zastosowanie kropkami kwantowymi z tellurku kadmu koniugowanymi z antybiotykiem, a następnie naświetlanie, daje największe efekty bakteriobójcze spośród badanych warunków.Choć ta metoda pozwala uzyskać wgląd w wpływ kropek kwantowych tellurku kadmu i ich koniugacji z polyx in B na wzrost E coli, można ją również zastosować do innych rodzajów nanocząsteczek i antybiotyków w odniesieniu do różnych szczepów bakterii. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mogą napotkać trudności, ponieważ jakikolwiek nadmiar MPA spowoduje agregację kropek kwantowych, a jeśli zostanie wypipetowana nawet niewielka ilość toline, doprowadzi to do zniszczenia filtra.Choć dzisiaj zaprezentujemy metodę oceny działania przeciwbakteryjnego kropek kwantowych KE IDE sprzężonych z antybiotykiem, podobna metoda może zostać zastosowana w przypadku innych rodzajów kropkek kwantowych, takich jak fosforan indu, siarczan cynku oraz jodek kadmu z siarczanem cynku. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania w szklanej fiolce 15 µM roztworu kropkek kwantowych tellurku kadmu (CDTE) w toluenie; za pomocą spektroskopii absorbancyjnej należy zmierzyć gęstość optyczną (OD), a następnie za pomocą pipety przenieść 200 µL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki.Nie używać plastiku. Następnie dodać 800 µL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boratowego oraz 2 µL 11,5 M kwasu 2-merkaptopropionowego (MPA), zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30 do 60 sekund. Po wstrząsaniu faza wodna i organiczna oddzielą się samoistnie.Faza wodna przyjmie kolor kropek kwantowych. Aby uniknąć warstwy przejściowej, należy ją usunąć, a następnie oddzielić fazę z kropkami kwantowymi i przenieść ją do czystej probówki. W celu oczyszczenia rozpuszczonych kropek kwantowych należy przenieść je do filtra wirówkowego o pojemności 500 µL.Dodaj 100 µL buforu bore eight o stężeniu 50 mM i wiruj z prędkością 3000 ×g przez 13 minut. Powtórz to przemywanie czterokrotnie. Po ostatnim przemywaniu zawieś oczyszczone kropki kwantowe w 500 µL buforu bore i przechowuj w temperaturze 4 °C.Będą one stabilne przez jeden do dwóch tygodni. W celu oszacowania stężenia kropek kwantowych należy zmierzyć widma absorbancji i emisji. Rysunek ten przedstawia kropki kwantowe CDTE pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, co wskazuje na pomijalne zmiany właściwości optycznych po wymianie ligandów.Ta część protokołu ma zastosowanie do każdej ujemnie naładowanej nanocząsteczki solaryzowanej w wodzie, w tym do mchu, komercyjnych kropek kwantowych, cząsteczek metali i innych. W tym przykładzie antybiotyk polymyksyna B (PMB) zostanie sprzężony z kropkami kwantowymi w stosunku molarnym 30:1. PMB jest dodatnio naładowany i ulega samoroskładaniu bez konieczności sprzęgania. Odczynniki: rozpuścić PMB w wodzie.W stężeniu 60 µM. Dla płytki 96-dołkowej z 0,3 ml bakterii na dołek w czterech powtórzeniach. 0,5 ml koniugatu o stężeniu 200 nM jest wystarczające, aby przygotować ten roztwór, dodając 100 µl kropek kwantowych o stężeniu 1 µM w 50 mM buforze borowym do probówki do mikrocentryfugi.Następnie do probówki z koniugatem należy dodać 50 µL 10x lub 60 µM roztworu antybiotyku PMB w wodzie. Do probówki kontrolnej należy dodać 50 µL wody. Objętość należy uzupełnić do 0,5 mL za pomocą 50 mM buforu ATE. Probówki należy osłonić przed światłem folią aluminiową i umieścić na rotatorze na jedną godzinę.Jeśli dojdzie do agregacji, powtórzyć koniugację z zastosowaniem niższych stężeń antybiotyku. Miareczkować stężenie w górę, aż cząstki przestaną agregować podczas przemywania koniugatów. Przetłoczyć roztwory przez filtr o progu odcięcia 10 000 Da, który jest odpowiedni dla większości antybiotyków, ale nie dla białek lub przeciwciał.Na koniec należy oszacować liczbę cząsteczek antybiotyku na jedną kropkę kwantową za pomocą spektroskopii absorbancji lub fluorescencji, elektroforezy w żelu lub spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Rysunek ten przedstawia typowe widma absorbancji i emisji kropek kwantowych przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji po dodaniu 160 równoważników molowych PMB.Przedstawiono tutaj zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji kropek kwantowych (oznaczoną kwadratami) oraz położeniem maksimum długości fali (oznaczonym trójkątami). Wraz ze wzrostem stężenia PMB intensywność emisji QD maleje, co prowadzi do przesunięcia maksimum długości fali emisji. Kolejna część protokołu jest wykonywana wieczorem na dwa dni przed eksperymentem koniugacji w celu wyznaczenia połowicznej maksymalnej stężenia hamującego lub IC 50 antybiotyku oraz toksyczności kwantowej.Zaszczep 10 ml pożywki LB świeżą kolonią e coli. Następnego dnia, na jedną do dwóch godzin przed eksperymentem, napełnij każde wgłębienie przezroczystej płytki 96-dołkowej. Przy użyciu pożywki wzrostowej płytka do testu powinna zostać przygotowana zgodnie z przedstawionym tutaj schematem.Próbki należy wysiać w trzech powtórzeniach, a stężenia antybiotyków powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawrzeć jedno stężenie, które w niewielkim stopniu hamuje wzrost bakterii, oraz jedno, które całkowicie je eliminuje. Należy również uwzględnić w trzech powtórzeniach wszystkie dołki zawierające kropki kwantowe w stężeniach, które będą stosowane w eksperymentach z koniugatami. Za pomocą pipety wielokanałowej należy napełnić odpowiednie dołki od 1 do 50 µL kultury bakteryjnej.Stężenie będzie zależeć od szybkości wzrostu konkretnego szczepu i będzie wymagało odpowiedniej kalibracji. Aby monitorować wzrost, umieść płytkę w czytniku płytek i ustaw odczyt co 10 minut przez dwie godziny przy 600 nanometrach. Gdy wszystkie komórki osiągną OD od 0,1 do 0,15, wyjmij płytkę z czytnika i zatrzymaj pomiar.Następnie do odpowiednich dołków dodaj PMB w kropkach kwantowych i w trzech powtórzeniach osłoń połowę płytki folią aluminiową. Następnie umieść płytkę pod specjalną lampą o długości fali 440 nanometrów, wykonaną z diod LED o mocy 2,4 miliwata, na 30 minut, aby naświetlić oświetloną stronę płytki. Po naświetlaniu umieść płytkę w czytniku płytek i rejestruj OD 600 co 10 minut przez okres od 5 do 12 godzin, w zależności od tempa wzrostu. Jeśli to możliwe, za pomocą oprogramowania utrzymuj temperaturę poniżej 32 stopni Celsjusza, aby zapobiec wysychaniu kultur.Nanieś krzywe wzrostu dla wybranego punktu czasowego w funkcji logarytmu stężenia i wyznacz IC 50 antybiotyku, korzystając z wyświetlonego na ekranie równania Hilla, gdzie H jest współczynnikiem Hilla. Y max to najwyższy punkt wzrostu, a Y min to punkt zerowy, najlepiej również znajdujący się na plateau. Pod koniec okresu pomiaru przeźroczyste studzienki będą wskazywać na całkowitą śmierć komórek, a wzdłuż rosnących stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórkowej.Bakterie powinny wykazywać krzywe wzrostu w kształcie litery S, jak pokazano tutaj. Położenie maksymalnego plateau będzie się znacznie różnić w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać konkretny punkt czasowy jako reprezentatywny i wykreślić wartości w funkcji logarytmu stężenia antybiotyku, aby wyznaczyć IC 50 w celu oceny kropek kwantowych.Można również wykreślić przeżywalność w zależności od logarytmu stężenia kropek kwantowych, jednak uzyskanie znaczącego efektu bakteriobójczego przy użyciu samych kropek kwantowych w zastosowanym stężeniu zdarza się rzadko. Po określeniu toksyczności samych kropek kwantowych oraz samych antybiotyków, ten sam protokół można zastosować w celu określenia toksyczności antybiotyku. Przedstawiono skoniugowane kropki kwantowe.Poniżej przedstawiono przykładowy układ analizy. Należy pamiętać, że koniugaty są testowane w rosnących stężeniach w czterech powtórzeniach; należy uwzględnić pasek kontrolny zawierający wyłącznie bakterie, pasek zawierający wyłącznie lek oraz studzienki z próbkami zawierającymi wyłącznie kropki kwantowe. Odczyty OD 600 mogą następnie posłużyć do wygenerowania krzywych wzrostu i wartości IC₅₀, podobnie jak wcześniej.Rysunek ten przedstawia przykład koniugatów o toksyczności porównywalnej do samego antybiotyku oraz przykład koniugatów o większej toksyczności. Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) dla każdego wariantu, należy wybrać jedną lub więcej studniek z poddanej działaniu preparatów płytki 96-dołkowej w celu wykonania posiewów na płytkach. Wybrane próbki bakteryjne należy poddać rozcieńczeniom seryjnym w roztworze soli fizjologicznej.Aby to zrobić, nanieś pipetą 180 µL roztworu soli fizjologicznej do odpowiednich kolumn. Przenieś 20 µL zawiesiny bakteryjnej i rozcieńcz ją 180 µL roztworu soli fizjologicznej. Zmień końcówkę pipety, wymieszaj i przenieś 20 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do 180 µL roztworu soli fizjologicznej.Powtórz ten proces sześciokrotnie. Następnie pobierz po 10 µL z każdych z sześciu ostatnich rozcieńczeń i nanieś je na prostokątną płytkę do augera. Na prostokątnej płytce można nanieść 36 plamek.Pozostaw płytkę do wyschnięcia na blacie przez 15 minut, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Po inkubacji oblicz liczbę kolonii, aby wyznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie na mililitr. Pomnóż liczbę kolonii przez czynnik rozcieńczenia i podziel przez objętość naniesioną na płytkę, aby określić wpływ traktowań na wzrost bakterii.Gęstość komórek e coli zmierzono przy OD 600. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od zera do całkowitej śmierci komórek. Otwarte symbole oznaczają sam PMB wraz z podanymi stężeniami.Pełne symbole oznaczają C-D-T-E-P-M-B bez napromieniowania, a symbole półpełne oznaczają C-D-T-E-P-M-B z napromieniowaniem. Napromieniowanie nie miało wpływu na próbki zawierające wyłącznie PMB, dlatego w celu zwiększenia przejrzystości wykresy te pominięto. Przedstawiono tutaj wykresy wartości krzywej wzrostu po 200 minutach w funkcji log PMB oraz dopasowania do tego równania w celu wyznaczenia wartości IC 50 dla kontroli wpływu światła.Krzywą sporządzono przy zastosowaniu wyłącznie antybiotyku i 30-minutowej ekspozycji na światło. Rysunek ten przedstawia przeżywalność bakterii po 200 minutach w zależności od stężenia QD przy użyciu kropek kwantowych CDTE. Przy ekspozycji na światło zaobserwowano pewną toksyczność, jednak była ona zbyt mała, aby wyznaczyć wartość IC 50.Wskazuje to, że toksyczność samego CDTE w stężeniach zastosowanych w eksperymencie koniugacji jest pomijalna w porównaniu do wpływu różnych preparatów na wzrost komórek. Wartości krzywej wzrostu z 200. minuty zostały naniesione na wykres i dopasowane do równania przedstawionego wcześniej, jak pokazano tutaj. Koniugaty C-D-T-E-P-M-B wykazały większą toksyczność niż sam PMB. W porównaniu z nimi koniugaty złotych nanocząsteczek A-U-P-M-B nie wykazały zwiększonej toksyczności względem samego PMB w celu określenia wpływu preparatów na przeżywalność bakterii.Liczbę jednostek tworzących kolonie określono dla E. coli osadzonych na płytce 96-dołkowej, poddanych działaniu P-M-B-Q-D-P-M-B lub samego QD, z naświetlaniem promieniami I lub bez, przez 30 minut, a następnie inkubowanych w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Przygotowano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 µL roztworów od 100x do 10⁷x naniesiono na płyty agarowe. Płyty inkubowano w temperaturze 37 °C i przeliczono kolonie po 16 godzinach.W tym przykładzie kolumny płyty od A do C przedstawiają bakterie traktowane zwiększającymi się stężeniami CDTE. Konjugaty bez naświetlania oraz kolumny od D do F to bakterie traktowane zwiększającymi się stężeniami konjugatów. Wraz z 30-minutowym naświetlaniem, wzdłuż wierszy przedstawiono rozcieńczenia.Dane wskazują, że po napromieniowaniu koniugaty wykazują silniejsze hamowanie wzrostu bakterii w porównaniu do koniugatów nienapromieniowanych. Należy pamiętać, że odczynniki zawierające Ca są niezwykle toksyczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i gogli ochronnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat przeprowadzania wysokoprzepustowego przesiewu efektu przeciwbakteryjnego nanocząsteczek z koniugacją do antybiotyków lub bez niej.

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Solubilizacja i bio-koniugacja kwantowychkropek oraz badania toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywych wzrostu i liczenia płytkowego

Ten film demonstruje multipleksowane ilościowe wykrywanie bakterii za pomocą karboksylowanych magnetycznych mikrosfer polistyrenowych barwionych w różne zestawy. Procedura obejmuje tworzenie kompleksów perełkowo-bakteryjnych, separację magnetyczną i analizę opartą na przepływie, umożliwiając precyzyjne i jednoczesne oznaczanie ilościowe wielu bakterii w tym samym dołku reakcyjnym.

Multipleksowa ilościowa detekcja bakterii przy użyciu mikrosfer magnetycznych znakowanych barwnikiem

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Bakterie mogą gromadzić zarówno szkodliwe, jak i korzystne mutacje w ciągu swojego życia. W populacji komórek osobniki, które zgromadziły korzystne mutacje, mogą szybko prześcignąć swoich pobratymców. W tym miejscu przedstawiamy prostą procedurę wizualizacji konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych w czasie przy użyciu fluorescencyjnie znakowanych osobników.

Monitorowanie konkurencji wewnątrzgatunkowej w populacji komórek bakteryjnych poprzez kohodowlę szczepów znakowanych fluorescencyjnie

Dostarczamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania monowalentnych docelowych kropek kwantowych (mQD) z fosforoazotanu DNA o określonej długości. Owijanie DNA odbywa się z dużą wydajnością, dlatego produkty nie wymagają oczyszczania. Demonstrujemy zastosowanie znacznika SNAP do kierowania mQD do receptorów na powierzchni komórki w zastosowaniach obrazowania żywych komórek.

Produkcja i celowanie w monowalentne kropki kwantowe

Infekcje biofilmowe wykazują wysoką tolerancję na chemioterapię. Żaden pojedynczy test nie oddaje złożoności biofilmów. Zamiast tego potrzebne są testy uzupełniające. Przedstawiamy platformę przesiewową (opracowaną dla S. aureus), która łączy testy żywotności, biomasy i matrycy biofilmu. Pozwala to na odkrywanie leków przeciwbiofilmowych, w tym ocenę długoterminowych efektów chemioterapeutycznych.

Platforma testów antybiofilmowych dostosowana do eksploracji bibliotek związków naturalnych

Opracowano test czasu rzeczywistego o wysokiej przepustowości, aby jednocześnie zidentyfikować (1) środki przeciwdrobnoustrojowe penetrujące komórki eukariotyczne skierowane na wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny i (2) ocenić cytotoksyczność komórek eukariotycznych. Wariant tej samej technologii został następnie połączony z technologią cyfrowego dozowania, aby umożliwić łatwe badania w wysokiej rozdzielczości, zależności od dawki oraz dwu- i trójwymiarowej synergii.

Wysokowydajne testy w czasie rzeczywistym z podwójnym odczytem wewnątrzkomórkowej aktywności przeciwdrobnoustrojowej i cytotoksyczności komórek eukariotycznych

Prosty test pomiaru ATP i metoda barwienia żywych/martwych zostały użyte do ilościowego określenia i wizualizacji przeżycia Neisseria gonorrhoeae po leczeniu ceftriaksonem. Protokół ten może zostać rozszerzony w celu zbadania działania przeciwdrobnoustrojowego dowolnego antybiotyku i może być wykorzystany do określenia minimalnego stężenia hamującego antybiotyków w biofilmach bakteryjnych.

Ilościowe badanie wrażliwości na antybiotyki agregatów Neisseria gonorrhoeae przy użyciu komercyjnych testów wykorzystania ATP i barwienia żywych/martwych

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Ten manuskrypt opisuje metodę wykorzystania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczej komórki do wizualizacji i ilościowego określenia konkurencji bakterii w kokulturze.

Kwantyfikacja konkurencji międzybakteryjnej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy protokół oceny skuteczności przeciwbakteryjnej polimeru uwalniającego antybiotyki do symulacji profilaktycznego zastosowania klinicznego za pomocą dostępnego na rynku testu żywotności mikrobiologicznej luminescencyjnego opartego na ATP w czasie rzeczywistym. Metoda ta umożliwia monitorowanie aktywności podłużnej materiałów uwalniających leki i może być szeroko stosowana do testowania przeciwdrobnoustrojowych platform dostarczania leków.

Nowatorska metoda określania podłużnej aktywności przeciwbakteryjnej materiałów uwalniających leki

Poznaj metodę biokoniugacji kropek kwantowych CdTe z antybiotykami i testowania ich przeciwbakteryjnej aktywności przy aktywacji światłem. Technika ta umożliwia badanie nowych środków bakteriobójczych.

Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Przeglądaj więcej filmów