Solubilizacja i biokoniugacja kropek kwantowych oraz analizy toksyczności bakteryjnej za pomocą krzywej wzrostu i metody przeliczania kolonii na płytkach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie wysokoprzepustowego przesiewu efektów przeciwbakteryjnych nanocząsteczek z koniugacją lub bez koniugacji z antybiotykami. W tym celu badane są efekty przeciwbakteryjne kropek kwantowych tellurku kadmu skoniugowanych z poly mix oraz B. Kropki kwantowe są najpierw rozpuszczane w kwasie mercaptopropionowym.

Następnie kropki kwantowe są konjugowane z poly mix i B, a następnie bakterie wysiane na płytki z antybiotykami są traktowane zarówno konjugowanymi z antybiotykiem, jak i niekonjugowanymi kropkami kwantowymi. Połowa próbek zostaje poddana naświetlaniu niebieskim światłem o długości fali 440 nanometr przez 30 minut, co powoduje generowanie przez kropki kwantowe ekscytonów i reaktywnych form tlenu w celu oceny wpływu traktowania kropkami kwantowymi na wzrost i przeżywalność bakterii. Wykonuje się pomiary gęstości optycznej oraz zlicza kolonie. Otrzymane dane wskazują, że zastosowanie konjugowanych z antybiotykiem kropek kwantowych tellurku kadmu, a następnie naświetlanie, wywołuje największe efekty bójcze spośród testowanych warunków.

Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu kropek kwantowych tellurku kadmu i ich sprzężenia z polyx in B na wzrost E coli, można ją również zastosować do innych rodzajów nanocząsteczek i antybiotyków w odniesieniu do różnych szczepów bakterii. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ jakikolwiek nadmiar MPA spowoduje agregację kropek kwantowych, a wypipetowanie nawet niewielkiej ilości toline zniszczy filtr.

Choć dzisiaj zaprezentujemy metodę oceny działania przeciwbakteryjnego kropek kwantowych KE IDE sprzężonych z antybiotykiem, podobna metoda może zostać zastosowana w przypadku innych rodzajów kropek kwantowych, takich jak fosforan indu, siarczan cynku oraz jodek kadmu i siarczan cynku. Rozpocznij tę procedurę od przygotowania w szklanej fiolce roztworu kropek kwantowych tellurku kadmu lub CDTE w toluenie o stężeniu 15 µM; zmierz gęstość optyczną (OD) za pomocą spektroskopii absorbancyjnej, a następnie za pomocą pipety przenieś 200 µL tego roztworu zapasowego do szklanej fiolki.

Nie należy używać plastiku. Następnie dodać 800 µL toluenu, 1 mL 200 mM buforu boranowego oraz 2 µL 11,5 M kwasu 3-merkaptopropionowego (MPA). Zamknąć fiolkę i energicznie wstrząsać przez 30 do 60 sekund. Po wstrząsaniu faza wodna i organiczna rozdzielą się samoistnie.

Faza wodna przybierze kolor kropek kwantowych. Aby uniknąć warstwy przejściowej, należy ją usunąć, a następnie odseparować fazę z kropkami kwantowymi i przenieść ją do czystej probówki. W celu oczyszczenia rozpuszczonych kropek kwantowych należy przenieść je do filtra wirówkowego o pojemności 500 µL.

Dodaj 100 µL buforu borowego 50 mM i wiruj przy 3000 ×g przez 13 minut. Przeprowadź to płukanie cztery razy; po ostatnim płukaniu zawieś wypłukane kropki kwantowe w 500 µL buforu borowego i przechowuj w temperaturze 4 °C.

Będą one stabilne przez jeden do dwóch tygodni. Aby oszacować stężenie kropek kwantowych, należy zmierzyć widma absorbancji i emisji. Ta rycina przedstawia kropki kwantowe CDTE pod wpływem lampy UV oraz widma emisji przed i po solubilizacji w wodzie, wykazując pomijalną zmianę właściwości optycznych po wymianie ligandów.

Ta część protokołu ma zastosowanie do każdych ujemnie naładowanych nanocząstek solaryzowanych w wodzie, w tym do mchów, komercyjnych kropek kwantowych, cząsteczek metali i innych. W tym przykładzie antybiotyk polymykzyna B (PMB) zostanie sprzężony z kropkami kwantowymi w stosunku molowym 30:1. PMB jest naładowany dodatnio i samoorganizuje się bez konieczności sprzęgania. Odczynniki: rozpuścić PMB w wodzie.

Przy stężeniu 60 µM. Dla płytki 96-dołkowej z 0,3 ml bakterii na dołek w czterech powtórzeniach. 0,5 ml koniugatu o stężeniu 200 nM jest wystarczające, aby przygotować tę mieszaninę, dodając 100 µl kropek kwantowych o stężeniu 1 µM w 50 mM buforze boratowym do probówki do mikrocentryfugi.

Następnie do probówki z koniugatem dodaj 50 µL 10 x lub 60 µM roztworu antybiotyku PMB w wodzie. Do probówki kontrolnej dodaj 50 µL wody. Uzupełnij objętość do 0,5 mL za pomocą 50 mM buforu acetate. Osłoń probówki przed światłem folią aluminiową i umieść je na rotatorze na jedną godzinę.

W przypadku wystąpienia agregacji należy powtórzyć koniugację przy użyciu niższych stężeń antybiotyku. Dobieraj stężenie metodą miareczkowania w górę, aż do momentu, gdy cząstki przestaną agregować podczas przemywania koniugatów. Przelej roztwory przez filtr o progu odcięcia 10 000 Da, który jest odpowiedni dla większości antybiotyków, lecz nie dla białek ani przeciwciał.

Na koniec należy oszacować liczbę cząsteczek antybiotyku na jedną kropkę kwantową za pomocą spektroskopii absorbancyjnej lub fluorescencyjnej, elektroforezy w żelu lub spektroskopii w podczerwieni z transformacją Fouriera. Na tej rycinie przedstawiono typowe widma absorbancji i emisji kropek kwantowych przed koniugacją z PMB oraz widmo emisji po dodaniu 160 równoważników molowych PMB.

Przedstawiono tutaj zależność między stosunkiem PMB a intensywnością emisji kropek kwantowych (oznaczoną kwadratami) oraz położeniem szczytu długości fali (oznaczonym trójkątami). Wraz ze wzrostem stężenia PMB intensywność emisji QD maleje, co skutkuje przesunięciem szczytowej długości fali emisji. Kolejna część protokołu jest przeprowadzana wieczorem na dwa dni przed eksperymentem z koniugacją w celu oznaczenia połowicznego maksymalnego stężenia hamującego lub IC 50 antybiotyku oraz toksyczności kwantowej.

Zaszczep 10 mililitrów pożywki LB świeżą kolonią e coli. Następnego dnia, na jedną do dwóch godzin przed eksperymentem, napełnij każde wgłębienie przezroczystej płytki 96-dołkowej. Płytka testowa z pożywką wzrostową powinna zostać przygotowana zgodnie z przedstawionym tutaj schematem.

Próbki należy wysiać w trzech powtórzeniach, a stężenia antybiotyków powinny obejmować zakres wystarczająco szeroki, aby zawierał jedno stężenie, które w niewielkim stopniu hamuje wzrost bakterii, oraz jedno, które je całkowicie eliminuje. Należy również w trzech powtórzeniach uwzględnić wszystkie studzienki zawierające kropki kwantowe w stężeniach, które będą stosowane w eksperymentach z koniugatami. Używając pipety wielokanałowej, należy napełnić odpowiednie studzienki od 1 do 50 µL kultury bakteryjnej.

Stężenie będzie zależało od szybkości wzrostu danego szczepu i będzie wymagało odpowiedniej kalibracji. Aby monitorować wzrost, należy umieścić płytkę w czytniku płytek i ustawić pomiar co 10 minut przez dwie godziny przy długości fali 600 nanometrów. Gdy wszystkie komórki osiągną OD od 0,1 do 0,15, należy wyjąć płytkę z czytnika i zakończyć pomiar.

Następnie dodaj PMB w kropkach kwantowych do odpowiednich dołków i osłoń połowę płytki folią aluminiową w trzech powtórzeniach. Następnie umieść płytkę pod specjalną lampą 440 nanometrów wykonaną z diod LED 2,4 miliwata na 30 minut, aby naświetlić oświetloną stronę płytki. Po naświetleniu umieść płytkę w czytniku płytek i rejestruj OD 600 co 10 minut przez okres od pięciu do 12 godzin, w zależności od szybkości wzrostu. Używając oprogramowania, utrzymuj temperaturę poniżej 32 stopni Celsjusza, jeśli to możliwe, aby zapobiec wysychaniu kultur.

Nanieś krzywe wzrostu w wybranym punkcie czasowym w funkcji logarytmu stężenia i wyznacz IC 50 antybiotyku, korzystając z wyświetlonego na ekranie równania Hilla, gdzie H oznacza współczynnik Hilla. Y max to najwyższy punkt wzrostu, a Y min to punkt zerowy, również najlepiej znajdujący się na plateau. Pod koniec okresu inkubacji przeźroczyste studzienki będą wskazywać na całkowitą śmierć komórek, a wzdłuż zwiększających się stężeń leku powinien pojawić się gradient gęstości komórek.

Bakterie powinny wykazywać S-kształtne krzywe wzrostu, tak jak pokazano tutaj. Położenie maksymalnego plateau będzie znacznie różnić się w zależności od szczepu, a także zależeć od temperatury. Można wybrać konkretny punkt czasowy jako reprezentatywny, a następnie nanieść wartości na wykres w funkcji logarytmu stężenia antybiotyku, aby wyznaczyć IC 50 do oceny kropek kwantowych.

Można również wykreślić przeżywalność w zależności od toksyczności względem logarytmu stężenia kropek kwantowych, jednak osiągnięcie znacznego efektu bakteriobójczego przy użyciu samych kropek kwantowych w zastosowanym stężeniu zdarza się rzadko. Po określeniu toksyczności samych kropek kwantowych i samych antybiotyków, ten sam protokół można zastosować do określenia toksyczności antybiotyku. Przedstawiono sprzężone kropki kwantowe.

Oto przykładowy układ testu. Należy pamiętać, że koniugaty są badane w rosnących stężeniach w czterech powtórzeniach; należy uwzględnić pasek kontrolny zawierający wyłącznie bakterie, pasek zawierający wyłącznie lek oraz dołki z próbkami zawierającymi wyłącznie kropki kwantowe. Odczyty OD 600 mogą następnie posłużyć do wygenerowania krzywych wzrostu i wartości IC50, podobnie jak wcześniej.

Rysunek ten przedstawia przykład koniugatów, których toksyczność jest porównywalna z toksycznością samego antybiotyku, oraz przykład koniugatów o większej toksyczności. Aby określić liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) dla każdego stanu, należy wybrać jedną lub więcej studzienek z potraktowanej płytki 96-dołkowej w celu wykonania posiewu na płytki. Należy przygotować rozcieńczenia seryjne każdej z wybranych próbek bakteryjnych w roztworze soli fizjologicznej.

W tym celu pipetujemy 180 µL roztworu soli fizjologicznej do odpowiednich kolumn. Przenosimy 20 µL zawiesiny bakteryjnej i rozcieńczamy ją 180 µL roztworem soli fizjologicznej. Po zmianie końcówki pipety mieszamy i przenosimy 20 µL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej do 180 µL roztworu soli fizjologicznej.

Powtórz ten proces sześć razy. Następnie pobierz po 10 µL z sześciu ostatnich rozcieńczeń i nanieś je w formie plamek na prostokątną płytkę do świdra. Na prostokątnej płytce można nanieść 36 plamek.

Pozostaw płytkę do wyschnięcia na blacie przez 15 minut, a następnie inkubuj ją w temperaturze 37 °C przez 16 godzin. Po inkubacji oblicz liczbę kolonii, aby wyznaczyć jednostki tworzące kolonie na mililitr. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez objętość naniesioną na płytkę, aby określić wpływ zastosowanych zabiegów na wzrost bakterii.

Gęstość komórek e coli zmierzono przy OD 600. Przedstawiono tutaj reprezentatywne krzywe wzrostu bakterii przy różnych stężeniach leku, od zera do całkowitej śmierci komórek. Otwarte symbole oznaczają sam PMB z podanymi stężeniami.

Symbole pełne reprezentują próbki C-D-T-E-P-M-B bez napromieniowania, a symbole półpełne reprezentują próbki C-D-T-E-P-M-B z napromieniowaniem. Napromieniowanie nie miało wpływu na próbki zawierające wyłącznie PMB, dlatego w celu przejrzystości pominięto te krzywe. Przedstawiono tutaj wykresy wartości krzywej wzrostu w 200. minucie w funkcji log PMB oraz dopasowania do tego równania w celu wyznaczenia wartości IC 50, aby kontrolować wpływ światła.

Krzywa została wykonana przy zastosowaniu wyłącznie antybiotyku i 30 minut naświetlania. Rysunek ten przedstawia przeżywalność bakterii po 200 minutach w zależności od stężenia QD przy użyciu kropek kwantowych CDTE. Przy naświetlaniu obserwuje się pewną toksyczność, jednak jest ona zbyt niska, aby wyznaczyć wartość IC 50.

Wskazuje to, że toksyczność samego CDTE w stężeniach zastosowanych w eksperymencie koniugacji jest pomijalna, co pozwala na porównanie wpływu różnych metod traktowania na wzrost komórek. Wartości krzywej wzrostu w 200 minucie zostały naniesione na wykres i dopasowane do równania przedstawionego wcześniej, jak pokazano tutaj. Koniugaty C-D-T-E-P-M-B okazały się bardziej toksyczne niż sam PMB. W porównaniu z nimi, koniugaty złotych nanocząsteczek A-U-P-M-B nie wykazują zwiększonej toksyczności w stosunku do samego PMB w celu określenia wpływu traktowania na przeżywalność bakterii.

Liczbę jednostek tworzących kolonie określono dla bakterii e coli osadzonych na płytce 96-dołkowej, poddanych działaniu P-M-B-Q-D-P-M-B lub samego QD, z naświetlaniem promieniowaniem I lub bez niego przez 30 minut, a następnie inkubowanych w temperaturze 32 °C przez cztery godziny. Wykonano rozcieńczenia seryjne każdej próbki bakteryjnej w roztworze soli fizjologicznej, a następnie 10 µL roztworów od 100x do 10⁷x naniesiono na płyty agarowe. Płyty inkubowano w temperaturze 37 °C, a kolonie policzono po 16 godzinach.

W tym przykładzie kolumny płytki od A do C zawierają bakterie poddane działaniu rosnących stężeń CDTE. Konjugaty bez naświetlania oraz kolumny od D do F to bakterie poddane działaniu rosnących stężeń konjugatów. Wraz z 30-minutowym naświetlaniem, wzdłuż wierszy przedstawiono rozcieńczenia.

Dane wskazują, że po naświetlaniu koniugaty wykazują silniejsze hamowanie wzrostu bakterii w porównaniu do koniugatów bez naświetlania. Należy pamiętać, że odczynniki zawierające ca są niezwykle toksyczne, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek, fartuchów laboratoryjnych i okularów ochronnych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić wysokoprzepustowy screening działania przeciwbakteryjnego nanocząsteczek z koniugacją do antybiotyków lub bez niej.