Name: Metody in vitro Elektroporacja dolnej rombowej wargi zarodków myszy w połowie ciąży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji in vitro dolnej rombowej wargi zarodków myszy w połowie ciąży. Technika umożliwia manipulację ekspresją genów w progenitorach mózgu tylnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Jane Johnson za przeciwciała przeciwko Math1, Ngn1 oraz Ptf1a, a Connie Cepko za plazmid pCAG::GFP. Praca ta była finansowana ze środków NIH R15 1R15HD059922-01.

1. Przygotowania przed elektroporacją
<ol>
 <li>Należy namnożyć DNA do elektroporacji za pomocą metody maxi prep (Prime-It lub Qiagen). Stężenie DNA powinno wynosić co najmniej 1 mg/mL, aby zapewnić efektywny pobór.</li>
 <li>Do probówki do mikrocentryfugi należy przenieść 495 μL DNA i wymieszać z 5 μl 0,01% Fast Green w 1 X PBS (buforze fosforanowym) .</li>
</ol>
2. Pobieranie zarodków
<ol>
 <li>Przeprowadź kontrolowane kryzówki myszy CD-1 (Harlan). Sprawdź obecność czopów pochwowych i przyjmij datę zaobserwowania czopa jako dzień embrionalny (E) 0,5. Zarodki zostaną pobrane 11 dni po zauważeniu czopa (E11,5).</li>
 <li>Umieść wysterylizowane narzędzia w 70% etanolu. Przed użyciem naświetlaj komorę z laminarnym przepływem powietrza światłem UV przez co najmniej jedną godzinę. Spryskaj komorę, tackę sekcyjną i mikroskop sekcyjny 70% etanolem. Podgrzej 1 X PBS do 37 °C.</li>
 <li>W dniu E11,5 przeprowadź eutanazję samicy zgodnie z warunkami zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (ICCUA). Umieść tackę sekcyjną w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Spryskaj brzuch samicy 70% etanolem.</li>
 <li>Otwórz jamę otrzewną i przypnij ściany do tacki sekcyjnej. Wyciągnij rogi macicy tak, aby spoczywały w obrębie jamy otrzewnej.</li>
 <li>Ostrożnie rozetnij ścianę rogu macicy. Używając łyżeczki 20 mm (Fine Scientific Tools), delikatnie oddziel zarodek w pęcherzyku żółtkowym od łożyska. Umieść zarodki w 100 mm naczyniu do hodowli tkankowej wypełnionym wcześniej 10 mL sterylnego 1 X PBS, podgrzanego zgodnie z punktem 2.2.</li>
 <li>Powtórz czynność dla wszystkich obecnych zarodków.</li>
</ol>
3. Elektroporacja zarodków w stadium E11.5 (Rycina 1)
<ol>
 <li>Za pomocą łyżeczki 20 mm przenieś pierwszy zarodek do nowej szalki 100 mm wypełnionej wcześniej 10 mL sterylnego 1XPBS, podgrzanego do 37 °C.</li>
 <li>Użyj pęsety 11 cm z końcówką 0,05 x 0,02 mm (Fine Scientific Tools), aby ostrożnie usunąć i odrzucić worek żółtkowy.</li>
 <li>Ustaw zarodek tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana do góry, zgodnie z rysunkiem w Rysunku 1A. Użyj elektrod płaskich 7 mm (Harvard Apparatus), aby delikatnie przytrzymać zarodek. Elektrody powinny zostać umieszczone po obu stronach rurki neuralnej na poziomie czwartej komory romboidalnej tylnego mózgu. Komora jest widoczna gołym okiem, jednak użycie mikroskopu operacyjnego może ułatwić precyzyjne rozmieszczenie elektrod. Pozycjonowanie elektrod ma kluczowe znaczenie dla określenia regionu, który otrzyma elektroporowany DNA. Jeśli pożądanym celem jest dolna warga romboidalna (LRL) grzbietowej części tylnego mózgu zarodka, elektrody muszą zostać umieszczone tak, aby bezpośrednio flankowały najszerszą część otworu czwartej komory.</li>
 <li>Użyj strzykawki 1 cc, aby pobrać DNA plazmidowe zmieszane z 0,01% Fast Green. 500 μL mieszaniny powinno być wystarczające do elektroporacji co najmniej 8-10 zarodków (patrz 3.5).</li>
 <li>Delikatnie przebij płytkę dachową nad czwartą komorą za pomocą igły tuberkulinowej 25G 5/8 przymocowanej do strzykawki 1 cc i wstrzyknij mieszaninę DNA z barwnikiem do komory. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego przez mieszaninę DNA z barwnikiem (Rysunek 1C). Ilość wstrzykiwanej mieszaniny DNA z barwnikiem wynosi zazwyczaj mniej niż 50 μL. Dokładne ilości różnią się między zarodkami, ponieważ część mieszaniny ma tendencję do wyciekania z komory do PBS otaczającego zarodek. Alternatywną metodą dostarczenia mieszaniny DNA z barwnikiem jest dostęp do układu komorowego poprzez przebicie welum nad śródmózgiem. Podobnie jak wcześniej, prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego przez mieszaninę DNA z barwnikiem.</li>
 <li>Podaj pięć impulsów prostokątnych za pomocą generatora impulsów elektrycznych (BTX) i elektrod płaskich 7 mm. Każdy impuls ma napięcie 50 V i trwa 5 ms, z przerwą 500 ms między impulsami. Tkanka znajdująca się najbliżej elektrody naładowanej dodatnio pobierze plazmid.</li>
</ol>
4. Hodowla embrionów
<ol>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy napełnić zewnętrzne dołki płytki hodowlanej 12-dołkowej 2 mL pożywki DMEM/F12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy konnej, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny/streptomycyny, uprzednio podgrzanej do 37 °C. Warunki hodowli zostały dostosowane na podstawie pracy de Diego i współpracowników.15</li>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy ucisnąć zarodki pęsetą w poprzek (poniżej serca) i usunąć tylną część zarodka. Przednią część należy umieścić w jednym z napełnionych dołków płytki 12-dołkowej.</li>
 <li>Czynność należy powtórzyć dla wszystkich zarodków. Należy napełniać wyłącznie zewnętrzne dołki płytki 12-dołkowej, aby uniknąć zanieczyszczenia kultur.</li>
 <li>Zarodki należy hodować w inkubatorze w temperaturze 37 °C przy 5% CO2. Ekspresja elektroporowanego plazmidu powinna być widoczna w ciągu 24 hr.</li>
 <li>W przypadku potrzeby dłuższego czasu hodowli należy napełnić zewnętrzne dołki nowej płytki 12-dołkowej 2 mL pożywki opisanej w punkcie 4.1. Za pomocą sterylnej łyżeczki należy przenieść zarodki do dołka w nowej płytce. Następnie należy umieścić je ponownie w inkubatorze w 37 °C. Możliwa jest hodowla do 48 hr.</li>
 <li>Po osiągnięciu pożądanego czasu hodowli należy utrwalić zarodki do analizy (patrz poniżej).</li>
</ol>
5. Przygotowanie embrionów do analizy
<ol>
 <li>Płukać zarodki w 1 X PBS w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Powtórzyć czynność.</li>
 <li>Utrwalić zarodki do analizy w 2% paraformaldehydzie (PFA) w 1XPBS przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Płukać zarodki w 1 X PBS w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Powtórzyć czynność.</li>
 <li>Równoważyć zarodki w 30% sacharozie w 1 X PBS przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Zatopić zarodki w związku Optimal Cutting Temperature (O.C.T) przy użyciu kąpieli z suchego lodu i etanolu. Zarodki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Wyciąć przekroje zarodków w kriotomie (Leica) na plastry o grubości 30 μm i zamontować na szkiełkach (VWR, Superfrost Plus). Przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Analiza immunohistochemiczna
<ol>
 <li>Immunohistochemię przeprowadzono zgodnie z opisem w 16. Rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych zastosowane w tej badaniu obejmowały: królicze α-GFP (Invitrogen) 1:2500; mysie α-Mash1 (BD Biosciences) 1:100; królicze α-Ngn1 (Jane Johnson) 1:5000; królicze α-Ptf1a (Jane Johnson) 1:2500; królicze -Math1 (Jane Johnson) 1:100. Inkubować preparaty na płasko, stroną z próbką do góry, w kuwecie do barwienia w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
 <li>Preparaty analizowano przy użyciu mikroskopu złożonego (Olympus BX51).</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Schemat przedstawiony na Ryc. 1A obrazuje eksperyment z elektroporacji. Ryc. 1B przedstawia widok strzałkowy zarodka E11.5 przed manipulacją. Ten sam zarodek po wstrzyknięciu plazmidu zawierającego CAG::GFP w 0,01% Fast Green pokazano na Ryc. 1C, a reprezentatywny, nieutrwalony zarodek wykazujący jednostronną ekspresję GFP w grzbnej części tylnego mózgu 24 h po hodowli przedstawiono na Ryc. 1D. Zakres obszaru LRL, który został pomyślnie poddany elektroporacji, jest zmienny i wydaje się być wysoce zależny od rozmieszczenia elektrod. W naszych badaniach stwierdzono, że 52 z 65 (80%) elektroporowanych zarodków pomyślnie wyekspresowały GFP. Tkankę uznano za pomyślnie poddaną elektroporacji, jeśli wykazano obecność GFP w zlokalizowanych obszarach na kilku przekrojach po utrwaleniu i analizie immunohistochemicznej (patrz poniżej). Zarodki, które nie spełniły tego kryterium, zaklasyfikowano jako nieudane próby elektroporacji.
Dalszą ocenę wydajności elektroporacji można przeprowadzić, wykonując immunohistochemię przeciwko GFP na przekrojach poprzecznych elektroporowanych embrionów na poziomie czwartej komory. Rycina 2 przedstawia reprezentatywne seryjne przekroje embrionu wykazującego jednostronną ekspresję GFP. Rycina 2A przedstawia zidealizowany schemat ilustrujący, że lewa strona embrionu była skierowana w stronę elektrody dodatniej. Przekroje poprzeczne (na poziomach przedstawionych na środkowym rysunku na Rycynie 2A) ujawniają zlokalizowaną ekspresję GFP wyłącznie po lewej stronie tkanki tylnego mózgu (Ryciny 2C i 2D). Elektroporowany obszar LRL nie obejmował całej osi przednio-tylnej rurki nerwowej, ponieważ badanie przekrojów położonych o 300 μm lub więcej rostralnie w stosunku do przekroju pokazanego na Rycynie 2C nie wykazuje ekspresji GFP (Rycina 2B).
Użyteczność tego testu w manipulacji ekspresją genów zależy od stabilności domen ekspresji białek endogennych. Wykazano, że LRL posiada unikalne domeny progenitorowe, które charakteryzują się różnicową ekspresją proneuralnych czynników transkrypcyjnych (omówiono w 1). Do analizy wybrano podzbiór tych czynników (Mash1, Math1, Ngn1 i Ptf1a) ze względu na ich proponowane i/lub opisane role w specyfikacji precerebellarnych podtypów neuronalnych w LRL, co stanowi przedmiot przyszłych badań 16-18. Wszystkie cztery białka wykazują wysoce charakterystyczne domeny ekspresji w tylnej części tylnego mózgu w dniu E11.5 16-18. Zaobserwowano, że zarodki poddane hodowli nie zwiększały swojej wielkości, a także nie inicjowały produkcji nabłonka splotu naczyniówkowego ani ewaginacji LRL i płyty dachowej, czyli zdarzeń morfologicznych występujących między E11.5 a E12.5 5. Na podstawie tych obserwacji ustalono, że prawidłowy rozwój w tych zarodkach został zatrzymany lub znacząco opóźniony, a porównywalną grupą kontrolną dla zarodków hodowlanych powinny być zarodki niepoddane hodowli w dniu E11.5.
Aby upewnić się, że hodowla i elektroporacja nie wpływają na poziomy białek endogennych, przeanalizowano za pomocą immunohistochemii (IHC) cztery różne białka w 34 różnych embrionach, które poddano elektroporacji, a następnie hodowano przez co najmniej 24 hr. Tabela I przedstawia liczbę analizowanych embrionów dla każdego markera oraz procent analizowanych embrionów, które zachowały prawidłowe poziomy białek. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne dane IHC dla dwóch z analizowanych białek: Mash1 (Rysunki 3A oraz 3B) i Math1 (Rysunki 3C i 3D). Zaobserwowano, że większość embrionów zachowała prawidłowe poziomy ekspresji po elektroporacji i hodowli (Rysunki 3B i 3D) w porównaniu do embrionów kontrolnych w stadium E11.5 (Rysunki 3A i 3C). Co istotne, charakterystyczne domeny ekspresji tych białek nie zostały zaburzone.
<img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig1.jpg" alt="Rozwój cewy nerwowej: Schemat i obrazy zarodka, IV komora mózgu, mikroskopia fluorescencyjna." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Elektroporacja zarodków w dniu E11,5. (A) Schemat eksperymentu z elektroporacją. Zarodek w dniu E11,5 zostaje wyizolowany, a plazmid ekspresyjny w 0,01% Fast Green jest wstrzykiwany do czwartej komory mózgu. Następnie zarodek zostaje umieszczony pomiędzy elektrodami i poddany impulsowi o napięciu 50 V przed przeniesieniem do hodowli. (B) Widok strzałkowy zarodka w dniu E11,5 przed wstrzyknięciem. (C) Ten sam zarodek E11,5 po wstrzyknięciu plazmidu w 0,01% Fast Green. (D) Jednostronna ekspresja GFP w rombence obserwowana w zarodku E11,5 po 24 h hodowli. mb – śródmózowie; 4v – czwarta komora mózgu.
<img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig2.jpg" alt="Schemat neuroanatomiczny: przekroje mózgu i mikroskopia fluorescencyjna obszaru 4v w widoku poprzecznym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ekspresja GFP w tkance poddanej elektroporacji. (A) Schemat po lewej przedstawia rozmieszczenie elektrod wokół zarodka w stadium E11.5. Środkowy schemat przedstawia pobranie i ekspresję plazmidu kodującego GFP po lewej stronie zarodka. Schemat po prawej to schematyczny, idealny przekrój poprzeczny wykonany przez zarodek na poziomach zaznaczonych czarnymi liniami na środkowym schemacie. (B−D) Immunohistochemia GFP na przekrojach poprzecznych przez poddanego elektroporacji zarodka E11.5 po 24 h hodowli. Strzałki wskazują płytkę dachową (rp), która zatrzymuje przeciwciało wtórne. Obrazy wykonano przy powiększeniu 10X. Względne poziomy przedstawionych przekrojów zaznaczono poziomymi liniami na środkowym schemacie w (A). mb- śródmózgowie; 4v- czwarta komora; rp- płytka dachowa.
<img src="/files/ftp_upload/3983/3983fig3.jpg" alt="Wyniki immunofluorescencji; ekspresja α-Mash1 i α-Math1, porównanie warunków hodowli komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Ekspresja endogennych białek w dolnej wargi rombowej. Immunohistochemia dla Mash1 (A i B) lub Math1 (C i D) porównująca przekroje poprzeczne zarodków w stadium E11.5, które nie były hodowane (A, C), z zarodkami poddanymi elektroporacji CAG::GFP i hodowanymi przez 24 h (B i D). Zdjęcia wykonane przy 10-krotnym powiększeniu.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Analizowany pronuralny czynnik transkrypcyjny</td>
 <td>Liczba analizowanych zarodków</td>
 <td>Procent zachowania normalnych wzorców ekspresji</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Math1</td>
 <td>15</td>
 <td>86.7%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mash1</td>
 <td>12</td>
 <td>83.3%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ngn1</td>
 <td>7</td>
 <td>71.4%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ptf1a</td>
 <td>6</td>
 <td>100%</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela I. Procent zarodków poddanych elektroporacji i hodowli, które zachowały prawidłowe domeny proneuralnych czynników transkrypcyjnych w LRL.

<ol><li>Ray, R. S., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rautenlippe+Redux+--+toward+a+unified+view+of+the+precerebellar+rhombic+lip%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Rautenlippe Redux -- toward a unified view of the precerebellar rhombic lip.</a> Current opinion in cell biology. 21, 741-747 (2009).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48, 17-24 (2005).</li>
<li>Wingate, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rhombic+lip+and+early+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The rhombic lip and early cerebellar development.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 11, 82-88 (2001).</li>
<li>Wingate, R. J., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+rhombic+lip+in+avian+cerebellum+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">The role of the rhombic lip in avian cerebellum development.</a> Development (Cambridge, England). 126, 4395-4404 (1999).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22Development+of+Cerebellar+System%3A+In+relation+to+its+evolution%2C+structure%2C+and+function%22">Development of Cerebellar System: In relation to its evolution, structure, and function</a>. , CRC Press, Inc. Boca Raton. (1997).</li>
<li>Farago, A. F., Awatramani, R. B., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+brainstem+cochlear+nuclear+complex+is+revealed+by+intersectional+and+subtractive+genetic+fate+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Assembly of the brainstem cochlear nuclear complex is revealed by intersectional and subtractive genetic fate maps.</a> Neuron. 50, 205-218 (2006).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48, 31-43 (2005).</li>
<li>Rodriguez, C. I., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+the+precerebellar+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Origin of the precerebellar system.</a> Neuron. 27, 475-486 (2000).</li>
<li>Taber-Pierce, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+nuclei+griseum+ponitis%2C+corporis+pontobulbaris+and+reticularis+tegmenti+pontis+%28bechterew%29+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the nuclei griseum ponitis, corporis pontobulbaris and reticularis tegmenti pontis (bechterew) in mouse.</a> J. Comp. Neurol. 126, 219-240 (1966).</li>
<li>Dipietrantonio, H. J., Dymecki, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zic1+levels+regulate+mossy+fiber+neuron+position+and+axon+laterality+choice+in+the+ventral+brain+stem%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Zic1 levels regulate mossy fiber neuron position and axon laterality choice in the ventral brain stem.</a> Neuroscience. 162, 560-573 (2009).</li>
<li>Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+gene+expressions+by+electroporation+in+the+developing+brain+of+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos.</a> Differentiation. 70, 155-162 (2002).</li>
<li>Taniguchi, H., Kawauchi, D., Nishida, K., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classic+cadherins+regulate+tangential+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+hindbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Classic cadherins regulate tangential migration of precerebellar neurons in the caudal hindbrain.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1923-1931 (2006).</li>
<li>Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+nucleogenesis+by+precerebellar+neurons%3A+involvement+of+ventricle-directed%2C+radial+fibre-associated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration.</a> Development (Cambridge, England). 133, 1113-1123 (2006).</li>
<li>Okada, T., Keino-Masu, K., Masu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+and+nucleogenesis+of+mouse+precerebellar+neurons+visualized+by+in+utero+electroporation+of+a+green+fluorescent+protein+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Migration and nucleogenesis of mouse precerebellar neurons visualized by in utero electroporation of a green fluorescent protein gene.</a> Neuroscience research. 57, 40-49 (2007).</li>
<li>de Diego, I., Kyriakopoulou, K., Karagogeos, D., Wassef, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+influences+on+the+migration+of+precerebellar+neurons+in+the+caudal+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Multiple influences on the migration of precerebellar neurons in the caudal medulla.</a> Development (Cambridge, England). 129, 297-306 (2002).</li>
<li>Landsberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindbrain+rhombic+lip+is+comprised+of+discrete+progenitor+cell+populations+allocated+by+Pax6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Hindbrain rhombic lip is comprised of discrete progenitor cell populations allocated by Pax6.</a> Neuron. 48, 933-947 (2005).</li>
<li>Hoshino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47, 201-213 (2005).</li>
<li>Yamada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+of+climbing+fiber+neurons+and+their+developmental+dependence+on%5BTitle%5D)+AND+%22Ptf1a.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin of climbing fiber neurons and their developmental dependence on.</a> Ptf1a. J. Neurosci. 27, 10924-10934 (2007).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Technika elektroporacji in vitro przedstawiona w niniejszym badaniu jest nową metodologią, która może być efektywnie wykorzystana do manipulacji ekspresją genów w embrionach w wieku poniżej 12 dni gestacji. Umieszczenie embrionów w hodowli umożliwia ekspresję wprowadzonego genu i zapobiega letalności obserwowanej w przypadku pozostawienia poddanych elektroporacji embrionów in vivo. Technika ta pozwala na manipulację ekspresją genów w progenitorach embrionalnych, które wcześniej były niedostępne dla bada...

<table><tbody><tr><td>Kriotostat</td><td>Leica Microsystems</td><td>CM-1850</td><td></td></tr><tr><td>Biologia końcówka pęsety DUMONT traktowanej metodą Dumoxel</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>perforowana łyżeczka MORIA 20 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Generator elektroporacji prostokątnej ECM 830</td><td>BTX (VWR)</td><td>47745-928</td><td></td></tr><tr><td>Elektrody Tweezertrodes* 7 mm firmy Harvard Apparatus </td><td>BTX (Fisher)</td><td>BTX450165</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Isotemp CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Inkubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>1325525</td><td></td></tr><tr><td>NAPCO CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Regulator gazu</td><td>Fisher Scientific</td><td>15497020</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli tkankowej z 12 dołkami</td><td>BD Falcon (Fisher)</td><td>877229</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Pożywka płynna DMEM/F-12 (1:1); z L-glutaminą i HEPES; 500 ml </td><td>Thermo Scientific (Fisher)</td><td>SH3002301</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska od dawców HyClone*</td><td>Thermo Scientific (Fisher)</td><td>SH3007402</td><td></td></tr><tr><td>płódkowa surowica bydlęca, kwalifikowana, inaktywowana termicznie</td><td>Invitrogen</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>cellgro* 10 000 IU penicyliny, 10 000&amp;mu;g/ml streptomycyny </td><td>Mediatech (Fisher)</td><td>MT-30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>HyClone* L-glutamina; 200 mM w 0,85% NaCl </td><td>Thermo Scientific (Fisher)</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Green</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41053-0250</td><td>0.01%</td></tr></tbody></table>

in vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

In vitro Electroporation of the Lower Rhombic Lip of Midgestation Mouse Embryos

Warga rombowa (rhombic lip) to zarodkowy neuroepithelium znajdujący się w rombencephalonie, na styku rurki neuralnej i płyty dachowej czwartej komory (przegląd w 1). Wargę rombową można podzielić na górną wargę rombową (URL), która obejmuje rombomer 1 (r1) i generuje neurony móżdżku, oraz dolną wargę rombową (LRL), z której wywodzą się różnorodne linie neuronalne pnia mózgu 2-4. Pochodne LRL obejmują neurony słuchowe jąder ślimakowych oraz neurony jąder przedmóżdżkowych zaangażowane w regulację równowagi i kontrolę motoryczną 5-8. Neurogeneza z LRL zachodzi w szerokim oknie czasowym obejmującym dni embrionalne (E) 9,5-16,55, 9. Różne linie neuronalne wyłaniają się z LRL jako komórki pomitotyczne (lub powstają) w odrębnych dniach rozwojowych w trakcie tego okna neurogenicznego. 
Elektroporacja konstruktów ekspresji genów może być wykorzystana do manipulowania ekspresją genów w progenitorach LRL i potencjalnie zmieniać los neuronów powstających w tym obszarze 10-12. Zmiana ekspresji genów progenitorów LRL u myszy poprzez elektroporację in utero okazała się bardzo skuteczna w manipulowaniu liniami komórkowymi powstającymi w 12,5 dniu embrionalnym (E12.5) lub później 10, 12-14. Elektroporacje in utero przeprowadzone przed E12.5 były nieskuteczne głównie ze względu na śmiertelność związaną z nakłuciem dachu czwartej komory, co jest niezbędnym krokiem w dostarczaniu egzogennego DNA elektroporowanego do LRL. Jednak wiele linii pochodnych z LRL powstaje w LRL wcześniej niż w E12.5 9. Te wczesne linie obejmują neurony tworzące jądra siatkowe boczne, klinowe zewnętrzne i oliwne dolne układu precerebellarnego, których funkcją jest łączenie sygnałów z rdzenia kręgowego i kory z móżdżkiem 5. Aby manipulować ekspresją w LRL embrionów młodszych niż E12.5, opracowaliśmy system in vitro, w którym embriony są poddawane hodowli po elektroporacji.
Niniejsze badanie przedstawia wydajną i skuteczną metodę manipulacji ekspresją genów progenitorów LRL na etapie E11.5. Embriony poddane elektroporacji zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) sterowanym przez szeroko aktywny promotor CAG w sposób powtarzalny wykazywały ekspresję GFP po 24 godzinach hodowli. Krytycznym aspektem tego badania jest fakt, że ekspresja genów ulega zmianie wyłącznie z powodu ekspresji genu egzogennego, a nie w wyniku efektów wtórnych wynikających z technik elektroporacji i hodowli. Stwierdzono, że endogenne wzorce ekspresji genów pozostają niezmienione w embrionach poddanych elektroporacji i hodowli. Metodę tę można wykorzystać do zmiany losów komórek wywodzących się z LRL embrionów młodszych niż E12.5 poprzez wprowadzenie plazmidów do nadekspresji lub wyciszenia (poprzez RNAi) różnych pro-neuronalnych czynników transkrypcyjnych.

Niniejsza praca opisuje opracowanie techniki elektroporacji in vitro, która umożliwia manipulację ekspresją genów w dolnej części wargi rombowej embrionów w połowie okresu gestacji.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Warga rombowa jest embrionalnym neuroepithelium zlokalizowanym w tylnym mózgu, na styku rurki neuralnej i płyty dachowej czwartej komory...

Ogólnym celem tej procedury jest manipulacja ekspresją genów w progenitorach embrionalnego tylnego mózgu poprzez wprowadzenie plazmidowego DNA metodą elektroporacji we wczesnych punktach czasowych rozwoju płodowego. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie embrionów w 11,5 dniu rozwoju płodowego i ich ułożenie stroną grzbietową do góry w sterylnym roztworze soli fosforanowej (PBS). Drugim krokiem jest wstrzyknięcie około 50 µL plazmidu ekspresyjnego w 0,01% fast green.W przypadku udanego wstrzyknięcia cały układ komorowy zostanie wypełniony mieszaniną DNA i barwnika fast green. Następnie embrion zostaje poddany impulsowi elektrycznemu. Strona embrionu znajdująca się najbliżej dodatnio naładowanej elektrody pobierze plazmidowe DNA.Druga strona będzie służyć jako wewnętrzna kontrola negatywna. Ostatnim krokiem jest umieszczenie embrionów w hodowli tkankowej na co najmniej 24 godziny. W rezultacie gen poddany elektroporacji ulegnie ekspresji po 24 godzinach hodowli, co można ocenić za pomocą immunohistochemii.Zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość manipulacji progenitorami embrionalnego tylnego mózgu na wcześniejszych etapach rozwoju płodowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak wpływ różnych genów neuronalnych na losy progenitorów embrionalnych. Procedurę należy rozpocząć od wysterylizowania narzędzi sekcyjnych oraz komory z laminarnym przepływem powietrza zgodnie z towarzyszącym manuskryptem.Aby pobrać zarodki, umieść uśpioną samicę myszy w 11,5 dniu ciąży (E 11.5) na tacy sekcyjnej w dygestorium. Następnie spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Otwórz jamę otrzewną i przypnij ściany do tacy sekcyjnej.Następnie wyciągnij rogi macicy tak, aby spoczywały w jamie otrzewnej. Za pomocą pęsety ostrożnie otwórz ścianę rogu macicy. Używając łyżeczki o szerokości 20 milimetrów, delikatnie usuń embriony w pęcherzykach żółtkowych z łożyska.Następnie umieść embriony w 100 mm szalce do hodowli tkankowej, wypełnionej 10 ml sterylnego, podgrzanego roztworu 1× PBS. Na tym etapie przenieś pierwszy embrion do nowej szalki 100 mm wypełnionej 10 ml sterylnego roztworu 1× PBS, który został podgrzany do 37 °C.Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć worek żółtkowy. Potem ustaw zarodek tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana do góry. Delikatnie przytrzymaj zarodek za pomocą siedmiomilimetrowych elektrod płaskich pod mikroskopem sekcyjnym.Umieść elektrody po obu stronach cewy nerwowej na poziomie czwartej komory romboidalnej tylnego mózgu. Następnie, za pomocą strzykawki 1 cc, pobierz mieszaninę plazmidowego DNA i 0,01% Fast screen; zazwyczaj 500 µL mieszaniny powinno być wystarczające do elektroporacji co najmniej ośmiu do 10 embrionów. Następnie, delikatnie przebij płytkę dachową nad czwartą komorą za pomocą igły tuberkulinowej 25G o długości 5/8 cala przymocowanej do strzykawki 1 CC.Następnie wstrzyknij około 50 µL mieszaniny DNA DI do komory. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego mieszaniną DNA DI. Alternatywną metodą dostarczenia mieszaniny DNA DI jest uzyskanie dostępu do układu komorowego poprzez przebicie błony naczyniowej pokrywającej śródmózgowie, włączenie generatora impulsów, a następnie podanie pięciu impulsów prostokątnych za pomocą generatora impulsów elektrodowych i elektrod płaskich o rozmiarze 7 mm do tkanki znajdującej się najbliżej elektrody dodatniej.Przygotowując plazmid w komorze z laminarnym przepływem powietrza, napełnij dołki 12-dołkowej płytki hodowlanej dwiema mililitrami podgrzanej do 37°C pożywki DME MF 12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy konnej, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Następnie chwyć embrion w części środkowej za pomocą pęsety. Usuń tylną część embrionu, a część przednią umieść w jednym z napełnionych dołków płytki hodowlanej.Powtórz procedurę dla wszystkich embrionów i wypełnij tylko zewnętrzne dołki płytki 12-dołkowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli, inkubuj embriony w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% carbon dioxide przez 24 godziny w celu ekspresji elektroporowanego plazmidu. Jeśli pożądany jest dłuższy czas hodowli, napełnij dołki nowej płytki 12-dołkowej dwiema mililitrami medium D-M-E-M-F 12.Przenieś embriony za pomocą wysterylizowanej łyżeczki do dołków nowej płytki. Następnie umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez maksymalnie 48 godzin w celu utrwalenia embrionów do analizy. Napełnij płytkę 12-dołkową roztworem 1× PBS, następnie przenieś do niej embriony i płucz w temperaturze 4 °C przez pięć minut.Następnie utrwal zarodki w 2% paraformaldehydzie w 1× PBS przez dwie godziny w temperaturze 4°C. Potem wypłucz je trzykrotnie w 1× PBS w temperaturze 4°C przez pięć minut. Następnie napełnij nową płytkę 12-dołkową 30% sacharozą w 1× PBS.Przenieś embriony do tych dołków i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C w celu równoważenia. Następnie zamknij embriony w związku OCT (optimal cutting temperature compound), korzystając z kąpieli w etanolu z suchym lodem, lub przechowuj je w temperaturze -20 °C. Na koniec wykonaj skrawki embrionów o grubości 30 µm za pomocą kriotomu.Przymocuj je do szkiełek przedmiotowych i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia badań histochemicznych. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywnymi rezultatami immunohistochemii GFP w przekrojach poprzecznych zarodka E 11.5 po 24 godzinach hodowli z zastosowaniem elektroporacji. Strzałki wskazują płytkę dachową, w której uwięzione zostało przeciwciało wtórne.Wyniki pokazują, że obszar elektroporacji dolnej wargi ROIC był ograniczony i nie obejmował całej osi przednio-tylnej cewy nerwowej. Przedstawiono tutaj wyniki dla dwóch analizowanych białek: MASH1 oraz MATH1. Zaobserwowano, że większość embrionów zachowuje normalne poziomy ekspresji po elektroporacji i hodowli w porównaniu z embrionami kontrolnymi w stadium 11.5. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wykorzystania testu elektroporacji in vitro do manipulowania ekspresją genów w komórkach progenitorowych zarodkowej błony mysiej.

in-vitro-electroporation-lower-rhombic-lip-midgestation-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

In vitro elektroporacja dolnego płata romboidalnego zarodków myszy w środkowym okresie ciąży

In-utero in-vivo iniekcja i elektroporacja zarodkowego neokortyksu myszy stanowią potężne narzędzie do manipulacji pojedynczymi komórkami progenitorowymi ...

Wewnątrzkomorowe wstrzyknięcie i elektroporacja in utero embrionów myszy w 15. dniu rozwoju (E15)

W niniejszej pracy przedstawiamy dwie techniki manipulowania ekspresją genów w komórkach zwojowych siatkówki (RGCs) myszy za pomocą elektroporacji in utero oraz ex vivo. Techniki te pozwalają badać, w jaki sposób zmiany w ekspresji genów wpływają na rozwój RGCs, prowadzenie aksonów oraz właściwości funkcjonalne.

Elektroporacja in utero oraz ex vivo w celu ekspresji genów w komórkach zwojowych siatkówki myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

Kontrola ekspansji somatycznych komórek macierzystych jest głównym czynnikiem utrudniającym ich badanie oraz zastosowanie w terapii. W niniejszym opracowaniu opisujemy system czasowej kontroli ekspansji neuronalnych komórek macierzystych podczas rozwoju oraz w wieku dorosłym, który może zostać wykorzystany do zwiększenia liczby neuronów generowanych w mózgu myszy.

Ekspansja embrionalnych i dorosłych komórek macierzystych układu nerwowego poprzez elektroporację in utero lub stereotaksycyjne wstrzyknięcie wirusowe

Pomimo funkcjonalnego i medycznego znaczenia podwzgórza, rzadko próbowano genetycznej manipulacji jego rozwojem in utero. Przedstawiamy szczegółową procedurę elektroporacji in utero do podwzgórza myszy i pokazujemy reprezentatywne wyniki całkowitej i częściowej (regionalnej) transfekcji podwzgórza.

Manipulacja genetyczna myszy rozwijającej podwzgórze poprzez elektroporację in utero

Demonstrujemy metodę szczepienia hodowanych komórek w określone miejsca wczesnych embrionów myszy, aby określić ich potencjał in vivo. Wprowadzamy również zoptymalizowaną metodę elektroporacji, która wykorzystuje szklane naczynia włosowate o znanej średnicy, co pozwala na precyzyjne dostarczenie egzogennego DNA do kilku komórek w zarodkach.

Metody precyzyjnie zlokalizowanego transferu komórek lub DNA do wczesnych zarodków myszy po implantacji

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak specyficznie transfekować różne regiony w ośrodkowym układzie nerwowym C57BL/6 za pomocą elektroporacji in utero. W tym protokole zawarte są szczegółowe instrukcje dotyczące transfekcji regionów, które rozwijają się w korę, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i prążkowie.

Kora mózgowa, hipokamp, wzgórze, podwzgórze, jądro przegrody bocznej i jądro prążkowia specyficzne dla macicy elektroporacja u myszy C57BL/6

Podwójna elektroporacja w macicy pozwala na celowanie w populacje komórek, które są przestrzennie i czasowo oddzielone. Technika ta jest przydatna do wizualizacji interakcji między tymi populacjami komórek przy użyciu białek fluorescencyjnych w normalnych warunkach, ale także po eksperymentach funkcjonalnych w celu zakłócenia interesujących genów.

Podwójna elektroporacja in utero w celu ukierunkowania na czasowo i przestrzennie oddzielone populacje komórek

Tutaj opisujemy metodę efektywnego manipulowania krytycznymi ścieżkami rozwojowymi w łożysku myszy in vivo. Odbywa się to poprzez wstrzyknięcie i elektroporację plazmidów CRISPR do łożysk ciężarnych matek w 12,5 dniu embrionalnym.

Mysz In Vivo Ukierunkowana manipulacja CRISPR

Poznaj metodę elektroporacji in vitro dolnej rombowej wargi zarodków myszy w połowie ciąży. Technika umożliwia manipulację ekspresją genów w progenitorach mózgu tylnego.

In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Przeglądaj więcej filmów