In vitro elektroporacja dolnej wargi rombowej zarodków myszy w połowie okresu gestacji

Ogólnym celem tej procedury jest manipulacja ekspresją genów w progenitorach embrionalnego tylnego mózgu poprzez wprowadzenie plazmidowego DNA metodą elektroporacji we wczesnych punktach czasowych rozwoju płodowego. Osiąga się to poprzez wstępne wyizolowanie embrionów w 11,5 dniu rozwoju płodowego i ich ułożenie stroną grzbietową do góry w sterylnym roztworze soli fosforanowej (PBS). Drugim krokiem jest wstrzyknięcie około 50 µL plazmidu ekspresyjnego w 0,01% fast green.

W przypadku udanego wstrzyknięcia cały układ komorowy zostanie wypełniony mieszaniną DNA i barwnika fast green. Następnie embrion zostaje poddany impulsowi elektrycznemu. Strona embrionu znajdująca się najbliżej dodatnio naładowanej elektrody pobierze plazmidowe DNA.

Druga strona będzie służyć jako wewnętrzna kontrola negatywna. Ostatnim krokiem jest umieszczenie embrionów w hodowli tkankowej na co najmniej 24 godziny. W rezultacie gen poddany elektroporacji ulegnie ekspresji po 24 godzinach hodowli, co można ocenić za pomocą immunohistochemii.

Zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest możliwość manipulacji progenitorami embrionalnego tylnego mózgu na wcześniejszych etapach rozwoju płodowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w tej dziedzinie, takie jak wpływ różnych genów neuronalnych na losy progenitorów embrionalnych. Procedurę należy rozpocząć od wysterylizowania narzędzi sekcyjnych oraz komory z laminarnym przepływem powietrza zgodnie z towarzyszącym manuskryptem.

Aby pobrać zarodki, umieść uśpioną samicę myszy w 11,5 dniu ciąży (E 11.5) na tacy sekcyjnej w dygestorium. Następnie spryskaj brzuch myszy 70% etanolem. Otwórz jamę otrzewną i przypnij ściany do tacy sekcyjnej.

Następnie wyciągnij rogi macicy tak, aby spoczywały w jamie otrzewnej. Za pomocą pęsety ostrożnie otwórz ścianę rogu macicy. Używając łyżeczki o szerokości 20 milimetrów, delikatnie usuń embriony w pęcherzykach żółtkowych z łożyska.

Następnie umieść embriony w 100 mm szalce do hodowli tkankowej, wypełnionej 10 ml sterylnego, podgrzanego roztworu 1× PBS. Na tym etapie przenieś pierwszy embrion do nowej szalki 100 mm wypełnionej 10 ml sterylnego roztworu 1× PBS, który został podgrzany do 37 °C.

Następnie ostrożnie usuń i wyrzuć worek żółtkowy. Potem ustaw zarodek tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana do góry. Delikatnie przytrzymaj zarodek za pomocą siedmiomilimetrowych elektrod płaskich pod mikroskopem sekcyjnym.

Umieść elektrody po obu stronach cewy nerwowej na poziomie czwartej komory romboidalnej tylnego mózgu. Następnie, za pomocą strzykawki 1 cc, pobierz mieszaninę plazmidowego DNA i 0,01% Fast screen; zazwyczaj 500 µL mieszaniny powinno być wystarczające do elektroporacji co najmniej ośmiu do 10 embrionów. Następnie, delikatnie przebij płytkę dachową nad czwartą komorą za pomocą igły tuberkulinowej 25G o długości 5/8 cala przymocowanej do strzykawki 1 CC.

Następnie wstrzyknij około 50 µL mieszaniny DNA DI do komory. Prawidłowe wstrzyknięcia charakteryzują się wypełnieniem całego układu komorowego mieszaniną DNA DI. Alternatywną metodą dostarczenia mieszaniny DNA DI jest uzyskanie dostępu do układu komorowego poprzez przebicie błony naczyniowej pokrywającej śródmózgowie, włączenie generatora impulsów, a następnie podanie pięciu impulsów prostokątnych za pomocą generatora impulsów elektrodowych i elektrod płaskich o rozmiarze 7 mm do tkanki znajdującej się najbliżej elektrody dodatniej.

Przygotowując plazmid w komorze z laminarnym przepływem powietrza, napełnij dołki 12-dołkowej płytki hodowlanej dwiema mililitrami podgrzanej do 37°C pożywki DME MF 12 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 5% surowicy konnej, 1% glutaminy oraz 1% penicyliny i streptomycyny. Następnie chwyć embrion w części środkowej za pomocą pęsety. Usuń tylną część embrionu, a część przednią umieść w jednym z napełnionych dołków płytki hodowlanej.

Powtórz procedurę dla wszystkich embrionów i wypełnij tylko zewnętrzne dołki płytki 12-dołkowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia hodowli, inkubuj embriony w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% carbon dioxide przez 24 godziny w celu ekspresji elektroporowanego plazmidu. Jeśli pożądany jest dłuższy czas hodowli, napełnij dołki nowej płytki 12-dołkowej dwiema mililitrami medium D-M-E-M-F 12.

Przenieś embriony za pomocą wysterylizowanej łyżeczki do dołków nowej płytki. Następnie umieść je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i inkubuj przez maksymalnie 48 godzin w celu utrwalenia embrionów do analizy. Napełnij płytkę 12-dołkową roztworem 1× PBS, następnie przenieś do niej embriony i płucz w temperaturze 4 °C przez pięć minut.

Następnie utrwal zarodki w 2% paraformaldehydzie w 1× PBS przez dwie godziny w temperaturze 4°C. Potem wypłucz je trzykrotnie w 1× PBS w temperaturze 4°C przez pięć minut. Następnie napełnij nową płytkę 12-dołkową 30% sacharozą w 1× PBS.

Przenieś embriony do tych dołków i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C w celu równoważenia. Następnie zamknij embriony w związku OCT (optimal cutting temperature compound), korzystając z kąpieli w etanolu z suchym lodem, lub przechowuj je w temperaturze -20 °C. Na koniec wykonaj skrawki embrionów o grubości 30 µm za pomocą kriotomu.

Przymocuj je do szkiełek przedmiotowych i przechowuj w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia badań histochemicznych. Przedstawione tutaj wyniki są reprezentatywnymi rezultatami immunohistochemii GFP w przekrojach poprzecznych zarodka E 11.5 po 24 godzinach hodowli z zastosowaniem elektroporacji. Strzałki wskazują płytkę dachową, w której uwięzione zostało przeciwciało wtórne.

Wyniki pokazują, że obszar elektroporacji dolnej wargi ROIC był ograniczony i nie obejmował całej osi przednio-tylnej cewy nerwowej. Przedstawiono tutaj wyniki dla dwóch analizowanych białek: MASH1 oraz MATH1. Zaobserwowano, że większość embrionów zachowuje normalne poziomy ekspresji po elektroporacji i hodowli w porównaniu z embrionami kontrolnymi w stadium 11.5. Po opanowaniu technika ta może zostać wykonana w ciągu jednej do dwóch godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat wykorzystania testu elektroporacji in vitro do manipulowania ekspresją genów w komórkach progenitorowych zarodkowej błony mysiej.