Name: Wizualizacja i analiza przepływu krwi i zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie do modelu ostrego zapalenia wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z fluorescencyjnie znakowanymi erytrocytami i pomiaru ciśnienia cząstkowego tlenu za pomocą laserowej fosforymetrii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Pani Risie Otsuce za pomoc techniczną i wsparcie w przeprowadzaniu eksperymentów. Badania te były częściowo finansowane przez Ministerstwo Edukacji, Nauki, Sportu i Kultury, Grant-in-Aid for Young Scientists (B), 2010, 22700476, oraz Fundację Pamięci Suzuken 2010 dla K.T. Ponadto badanie to było wspierane przez program Research and Development of the Next-Generation Integrated Simulation of Living Matter, będący częścią projektu Development and Use of the Next-Generation Supercomputer Project MEXT, a w części przez JST ERATO Suematsu Gas Biology Project.

1. Znakowanie erytrocytów izomerem I izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)
Wszystkie zastosowane protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Wydziału Medycyny Uniwersytetu Keio.
<ol>
 <li> Znieczulić mysz dawcę, a po wykonaniu nacięcia laparotomijnego pobrać krew pełną z żyły głównej dolnej za pomocą strzykawki 1-ml zawierającej niewielką ilość heparyny. Myszy natychmiast uśmiercono poprzez wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu (100 mg/kg i.p.). </li>
 <li> Krew pełną przemyć dwukrotnie w PBS (pH 7.4) poprzez wirowanie przez 5 min przy 400 g w rotorze z koszyczkami odchylanymi. </li>
 <li> Rozpuścić 10 mg FITC w 5 ml 100 mM Na2HPO4 i przefiltrować roztwór przez membranę o porach 0.22-μm. </li>
 <li> W probówce wymieszać 1 ml roztworu FITC z 0.15 ml 3 mM glukozy, 0.25 ml 180 mM NaH2PO4 oraz 1.5 ml 100 mM Na2HPO4. Dodać 0.2 ml osadu RBC i delikatnie opukać probówkę, aby wymieszać zawartość. </li>
 <li> Przechowywać probówkę przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, a następnie dwukrotnie przemyć barwione RBC w PBS. </li>
 <li> Nanieść niewielką ilość zawiesiny RBC na szkiełko podstawowe i sprawdzić, czy RBC wyglądają prawidłowo (tj. czy ich kształt i rozmiar są normalne) oraz czy intensywność fluorescencji jest wystarczająca. </li>
 <li> Zawiesić 0.1 ml RBC w 0.9 ml PBS o pH 7.4 i przechowywać zawiesinę w temperaturze 4 °C do momentu wstrzyknięcia. </li>
</ol>
2. Przygotowanie barwnika wrażliwego na tlen
<ol>
 <li> Rozpuścić 500 mg BSA w 10 ml PBS o pH 7.4. </li>
 <li> Dodać 30 mg Pd(II)-meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine (Pd-TCPP) do roztworu BSA i mieszać przez noc. </li>
 <li> (Opcjonalnie) Wyodrębnić Pd-TCPP związany z BSA, stosując chromatografię grawitacyjną lub kolumnę wirową, aby oddzielić go od wolnego Pd-TCPP. </li>
 <li> Odwirować roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonego Pd-TCPP, a następnie przefiltrować nadsącz przez filtr membranowy o porach 0.22-μm. </li>
 <li> Przechowywać aliquoty po 1 ml w probówkach w temperaturze -20 °C. Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. </li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
 <li>Do obserwacji mikroskopowej mikrokrążenia przygotuj plastikową płytkę z otworem o średnicy 20 mm i przytwierdź taśmą nad otworem kwadratowe szkiełko nakrywkowe o boku 30 mm. </li>
 <li>Zanurz mysz w narkozie, usuń sierść i przygotuj skórę. Umieść cewnik w żyle ogonowej do podawania leków, używając igły 30 G połączonej z 10-cm cewnikiem polietylenowym (PE 10) wypełnionym heparynowanym PBS. </li>
 <li>Po nacięciu pośrodkowym wyciągnij główny płat wątroby na plastikową płytkę i ułóż mysz w pozycji brzusznej. </li>
 <li>Przygotuj małe paski folii spożywczej (3 mm x 8 mm) i ułóż je wokół krawędzi płata wątroby, aby ograniczyć ruchy wątroby podczas oddychania i zapobiec jej wysychaniu. </li>
 <li>Obserwuj mikrokrążenie wątrobowe pod mikroskopem (w świetle przechodzącym) i potwierdź, że w polu widzenia nie występuje zastój przepływu krwi przez co najmniej 15 min. </li>
 <li>Powoli wstrzyknij 0,2 ml znakowanych fluorescencyjnie RBC do obserwacji przepływu krwi lub 0,2 ml roztworu Pd-TCPP do pomiaru pO2. Taka ilość RBC znakowanych FITC będzie stanowić 1/50 wszystkich RBC krążących w wizualizowanym obszarze. </li>
</ol>
4. Wizualizacja przepływu krwi
<ol>
 <li> Wzbudzić FITC poprzez naświetlanie światłem lampy rtęciowej przepuszczonym przez filtr pasmowy (450–490 nm)1. </li>
 <li> zarejestrować obraz fluorescencyjny za pomocą kamery CCD. </li>
</ol>
5. Pomiar pO2
Fosforescencja Pd-TCPP jest stosunkowo słaba i powinna być wykrywana za pomocą detektora o wysokiej czułości. Wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane w ciemni.
<ol>
 <li> Makiama absorpcyjna Pd-TCPP przypada na 410 nm i 532 nm, dlatego do wzbudzenia zaleca się zastosowanie długości fali drugiej harmonicznej wynoszącej 532 nm. Długość fali ta może zostać wygenerowana przez impulsowy laser Nd:YAG2. </li>
 <li> Wprowadź wiązkę z lasera Nd:YAG do odpowiedniego portu w mikroskopie odwróconym i ustaw plamkę wiązki w pozycji centralnej w płaszczyźnie ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna zależy od rozmiaru plamki lasera, który zmienia się poprzez przepuszczenie wiązki przez otwór zwężający (pinhole). </li>
 <li> Aby wykryć fosforescencję, zamocuj filtr długoprzepustowy (&gt;620 nm) oraz fotopowielacz (PMT) do drugiego portu mikroskopu. PMT powinien być czuły na długości fal z zakresu czerwieni, szczególnie w okolicach 700 nm. </li>
 <li> Próbkuj sygnał fosforescencji (500 punktów próbkowanych przy 200 kHz) i oblicz stałą czasową zaniku, dopasowując funkcję wykładniczą do krzywej zaniku. </li>
 <li> Do kalibracji przygotuj dwa zestawy próbek roztworu Pd-TCPP z pO2 150 mmHg i 0 mmHg. Do próbki dodaj 1% objętościowo ditionianu sodu, aby uzyskać warunki beztlenowe. Podczas kalibracji utrzymuj pH próbek na poziomie 7,4 oraz temperaturę 37 °C. </li>
 <li> Wyznacz stałą Sterna-Volmera kq oraz czas zaniku luminescencji w warunkach beztlenowych τ0 w równaniu (1)3. W naszym przypadku, dla roztworów Pd-TCPP w temperaturze 37 °C i pH 7,4, kq wynosi 374 mmHg-1 s-1, a τ0 wynosi 0,74 ms. Parametry pomiarowe te zależą od aparatury (tj. lasera, detektora, innych urządzeń optycznych) oraz metody przetwarzania sygnału, dlatego kalibracja jest niezbędna w każdym systemie pomiarowym4. 
 τ0/τ = 1 + kq • τ0 • pO2     (1) </li>
 <li> Umieść mysz na płytce na stole mikroskopu, obserwuj mikrokrążenie wątroby i dopasuj pozycję docelowego mikronaczynia do punktu plamki lasera. </li>
</ol>
6. Model zapalenia wątroby
<ol>
 <li> Pozostawić myszy na czczo z wolnym dostępem do wody przez noc. </li>
 <li> Przygotować roztwór paracetamolu (APAP) w DMSO o stężeniu 20 mg/ml. </li>
 <li> Wstrzyknąć go dootrzewnowo w dawce 1 ml/100 g mc (tj. 200 mg/kg mc). Po iniekcji mysz może mieć wolny dostęp do pożywienia i wody 5. </li>
 <li> 24 godziny po iniekcji znieczulić mysz i odsłonić wątrobę, wykonując nacięcie pośrodkowe. W przypadku wywołania zapalenia wątroby, martwica w obszarze okołodocentralnym będzie łatwo widoczna gołym okiem. </li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Przykładowe obrazy mikrokrążenia wątrobowego przedstawiono na Rysunku 1, gdzie (a) jest obrazem w świetle przechodzącym, a (b) obrazem fluorescencyjnym. W filmie wideo widoczne są pojedyncze erytrocyty znakowane FITC, a żyłki wrotne, sinusoidy i żyłki centralne rozpoznano na podstawie kierunków przepływu krwi.
Jak pokazano na Rysunku 2, plamka lasera naświetlająca żyłę środkową przez obiektyw x100 miała średnicę około 10 μm. Wewnątrznaczyniowe pO2 w mikrokrążeniu wątrobowym mierzono u samców myszy C57BL/6, a Rysunek 3(a) przedstawia zależności między pO2 a średnicą naczyń w żyłach wrotnych i środkowych. Gradient pO2 od żył wrotnych do środkowych wskazuje, że erytrocyty efektywnie uwalniają tlen podczas przechodzenia przez zatoki wątrobowe. Jak pokazano na Rysunku 3(b), średnie pO2 wynosiło 59,8 mmHg w naczyniach wrotnych, 48,2 mmHg w zatokach i 38,9 mmHg w żyłach środkowych.
Kiedy wywołaliśmy ostre zapalenie wątroby poprzez domięśniowe wstrzyknięcie APAP, wewnątrznaczyniowe pO2 uległo znacznemu podwyższeniu w każdej części mikrokrążenia wątrobowego: p&lt;0,05 w żyłach wrotnych oraz p&lt;0,01 w zatokach i żyłach centralnych (Rycina 3(c)). 
<img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig1.jpg" alt="Tworzenie sieci naczyniowej, obrazy mikroskopowe; fluorescencja czerwona i zielona, analiza tkanki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obrazy przy małym powiększeniu przedstawiające mikrokrążenie wątrobowe w (a) świetle przechodzącym i (b) fluorescencji. 
<img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig2.jpg" alt="Obraz mikroskopowy tkanki roślinnej z zieloną fluorescencją do analizy struktury komórkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Obraz plamki laserowej naświetlającej docelową żyłkę centralną w celu pomiaru pO2.
<img src="/files/ftp_upload/3996/3996fig3.jpg" alt="Diagramy analizy napięcia tlenu (pO2): średnica CV vs PV, rozkład pO2, efekty kontrolne vs APAP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Gradient pO2 w mikrokrążeniu wątrobowym zdrowych myszy kontrolnych oraz myszy z uszkodzeniem wątroby wywołanym podaniem paracetamolu. (a) przedstawia pO2 w zależności od średnicy naczyń dla żyłek wrotnych (PV) i żyłek centralnych (CV), a (b) przedstawia gradient tlenu od PV do CV poprzez sinusoidy (S). Różnica pO2 między PV a CV odzwierciedla zużycie tlenu przez hepatocyty lub inne komórki miąższowe. (c) pokazuje, że w warunkach zapalenia wątroby wywołanego podaniem APAP, pO2 było znacząco podwyższone w PV, S i CV, a gradient pO2 uległ zmniejszeniu, co wskazuje na upośledzenie zużycia tlenu w wątrobie.

<ol><li>Ishikawa, M., Sekizuka, E., Shimizu, K., Yamaguchi, N., Kawase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+RBC+velocities+in+the+rat+pial+arteries+with+an+image-intensified+high-speed+video+camera+system%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Measurement of RBC velocities in the rat pial arteries with an image-intensified high-speed video camera system.</a> Microvasc. Res. 56, 166-172 (1998).</li>
<li>Tsukada, K., Sekizuka, E., Oshio, C., Tsujioka, K., Minamitani, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cell+velocity+and+oxygen+tension+measurement+in+cerebral+microvessels+by+double-wavelength+photoexcitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Red blood cell velocity and oxygen tension measurement in cerebral microvessels by double-wavelength photoexcitation.</a> J. Appl. Physiol. 96, 1561-1568 (2004).</li>
<li>Stern, O., Volmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Abklingzeit+der+Fluoreszenz%5BTitle%5D)+AND+%22Physik.+Zeitschr%22%5BJournal%5D)">Über die Abklingzeit der Fluoreszenz.</a> Physik. Zeitschr. 20, 183-188 (1919).</li>
<li>Rumsey, W. L., Vanderkooi, J. M., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+phosphorescence%3A+a+novel+method+for+measuring+oxygen+distribution+in+perfused+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of phosphorescence: a novel method for measuring oxygen distribution in perfused tissue.</a> Science. 241, 1649-1651 (1988).</li>
<li>Soga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+metabolomics+reveals+ophthalmic+acid+as+an+oxidative+stress+biomarker+indicating+hepatic+glutathione+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential metabolomics reveals ophthalmic acid as an oxidative stress biomarker indicating hepatic glutathione consumption.</a> J. Biol. Chem. 281, 16768-16776 (2006).</li>
<li>Goda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+heme+oxygenase+isoforms+in+rat+liver.+Topographic+basis+for+carbon+monoxide-mediated+microvascular+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Distribution of heme oxygenase isoforms in rat liver. Topographic basis for carbon monoxide-mediated microvascular relaxation.</a> J. Clin. Invest. 101, 604-612 (1998).</li>
<li>Grote, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGrote%2C+J+%22Physiologie+der+Menschen%22">Physiologie der Menschen</a>. , 20th edn, Springer-Verlag. New York. 560(1980).</li>
<li>Suganuma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythrocytes+with+T-state-stabilized+hemoglobin+as+a+therapeutic+tool+for+postischemic+liver+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Erythrocytes with T-state-stabilized hemoglobin as a therapeutic tool for postischemic liver dysfunction.</a> Antioxid Redox Signal. 8, 1847-1855 (2006).</li>
<li>Vanderkooi, J. M., Maniara, G., Green, T. J., Wilson, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+method+for+measurement+of+dioxygen+concentration+based+upon+quenching+of+phosphorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An optical method for measurement of dioxygen concentration based upon quenching of phosphorescence.</a> J. Biol. Chem. 262, 5476-5482 (1987).</li>
<li>Bernal, W., Auzinger, G., Dhawan, A., Wendon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+liver+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute liver failure.</a> Lancet. 376, 190-201 (2010).</li>
<li>Hinson, J. A., Roberts, D. W., James, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+acetaminophen-induced+liver+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Handb.+Exp.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of acetaminophen-induced liver necrosis.</a> Handb. Exp. Pharmacol. 169, 369-405 (2010).</li>
<li>Hinson, J. A., Reid, A. B., McCullough, S. S., James, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen-induced+hepatotoxicity%3A+role+of+metabolic+activation%2C+reactive+oxygen%2Fnitrogen+species%2C+and+mitochondrial+permeability+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen-induced hepatotoxicity: role of metabolic activation, reactive oxygen/nitrogen species, and mitochondrial permeability transition.</a> Drug Metab. Rev. 36, 805-822 (2004).</li>
<li>Lieber, C. S. Medical disorders of alcoholism. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLieber%2C+CS+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 333, 1058-1065 (1995).</li>
<li>Zimmerman, H. J., Maddrey, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetaminophen+%28paracetamol%29+hepatotoxicity+with+regular+intake+of+alcohol%3A+analysis+of+instances+of+therapeutic+misadventure%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Acetaminophen (paracetamol) hepatotoxicity with regular intake of alcohol: analysis of instances of therapeutic misadventure.</a> Hepatology. 22, 767-773 (1995).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Dostarczanie tlenu do tkanek jest kluczową funkcją mikrokrążenia, a wiele publikacji opisuje choroby związane z anatomią i reologią mikronaczyniową6. Przepływ krwi w wątrobie stanowi kombinację krwi tętniczej i żylnej. Około 30% przepływu krwi do wątroby to dobrze natlenowana krew dostarczana przez tętnicę wątrobową, a pozostałe 70%, dostarczane przez żyłę wrotną, to słabo natlenowany odpływ żylny z śledziony i przewodu pokarmowego7. Choroby wątroby, takie jak stłuszczenie wątroby, wstrząs czy nowot...

<table><tbody><tr><td>Pd(II) meso-tetra(4-karboksyfenyl)porfina</td><td>Frontier Scientific, Inc.</td><td>PdT790</td><td></td></tr><tr><td>Izomer I izotiocyjanianu fluoresceiny</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>F7250</td><td></td></tr><tr><td>Paracetamol</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A7085</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>fotopowielacz</td><td>hamamatsu photonics k.k</td><td>H10722-20</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Visualization and Analysis of Blood Flow and Oxygen Consumption in Hepatic Microcirculation: Application to an Acute Hepatitis Model

Wątroba charakteryzuje się znaczną rozbieżnością między podażą a zapotrzebowaniem na tlen, ponieważ zużycie tlenu w tym narządzie jest stosunkowo wysokie, podczas gdy około 70% dopływu krwi do wątroby stanowi słabo utlenowana krew z żyły wrotnej pochodząca z przewodu pokarmowego i śledziony. Tlen jest dostarczany do hepatocytów przez krew płynącą z końcowej gałęzi żyły wrotnej do żyłki centralnej poprzez sinusoidy, co tworzy gradient tlenowy w zrazikach wątrobowych. Gradient tlenowy jest istotnym parametrem fizycznym, który wpływa na ekspresję enzymów w górnym i dolnym odcinku mikrokrążenia wątrobowego, jednak brak technik pomiaru zużycia tlenu w tym obszarze opóźnił wyjaśnienie mechanizmów związanych z metabolizmem tlenu w wątrobie. W związku z tym zastosowaliśmy erytrocyty znakowane FITC do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego oraz laserową fosforymetrię do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w tamtejszych mikronaczyniach. Bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny pozwala na ilościowe określenie prędkości przepływu krwi, średnic naczyń oraz gradientów tlenowych związanych z zużyciem tlenu w wątrobie. W modelu ostrego zapalenia wątroby, indukowanego podaniem paracetamolu myszom, zaobserwowaliśmy zwiększone ciśnienie tlenu zarówno w żyłkach wrotnych, jak i centralnych, ale zmniejszony gradient tlenowy w sinusoidach, co wskazuje, że martwica hepatocytów w strefie okołocentralnej może prowadzić do wzrostu ciśnienia tlenu i wpływać na ekspresję enzymów w strefie okołowrotnej. Podsumowując, nasze optyczne metody pomiaru hemodynamiki wątrobowej i zużycia tlenu mogą ujawnić mechanizmy związane z chorobami wątroby.

Opracowano system optyczny służący do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych FITC oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy naczyń, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego.

Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Występuje znaczna rozbieżność między podażą a zapotrzebowaniem na tlen w wątrobie, ponieważ zużycie tlenu przez miąższ wątroby jest stosunkowo wysokie, lecz około 70%...

Opracowano system optyczny do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach za pomocą obrazowania fosforowego wspomaganego laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikronaczyniowej, średnicy, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego. W mikrokrążeniu wątrobowym krew przepływa z zatok portalnych do zatok centralnych, co tworzy gradient tlenowy między nimi.Stężenie tlenu w wątrobie wpływa zarówno na ekspresję enzymów, jak i na patologię, co sprawia, że analiza przepływu krwi i pomiar tlenu są istotnymi tematami badawczymi. Nasza metoda eksperymentalna polega na dożylnym podaniu erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie.W celu wizualizacji mikrokrażenia z wykorzystaniem fluorescencji do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu, podajemy dożylnie porfirynę palladu, która pod wpływem wzbudzenia laserem emituje fosforescencję w krwiobiegu w stopniu zależnym od stężenia tlenu w otoczeniu. Proces ten umożliwia ilościową analizę tlenu; pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrokrażeniu wątrobowym wykazał ciśnienie parcjalne tlenu w żyłach wrotnych i centralnych wynoszące odpowiednio 59,8 oraz 38,9 mmHg, co dowodzi skuteczności pomiaru stężenia tlenu. Następnie zastosowaliśmy tę metodologię w modelu zapalenia wątroby.Stwierdziliśmy podwyższone ciśnienie parcjalne tlenu w zatokach sinusoidalnych wnętrzpylnych oraz w żyłkach centralnych, lecz obniżoną różnicę ciśnień między żyłkami wnętrzpylnymi a centralnymi. Jest to prawdopodobnie wynik zmniejszonego zużycia tlenu w obszarze żyły centralnej z powodu martwicy hepatocytów. Wyniki te pokazują, że nasza metodologia wykorzystująca system optyczny do pomiaru hemodynamiki wątrobowej i zużycia tlenu jest zdolna do wyjaśnienia mechanizmów różnych chorób wątroby w obrębie mikrokrażenia wątrobowego.Gradient tlenowy jest kluczowym parametrem wpływającym na ekspresję enzymów w obszarach okołowrotnych i okożylnych oraz rodzaje chorób wątroby związanych z mikro rozkładem, dlatego istotne jest ilościowe określenie przepływu krwi i zużycia tlenu. Aby wyjaśnić te mechanizmy, zaletą naszej metody jest bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny, który pozwala ilościowo określić przepływ krwi, średnice naczyń oraz gradient tlenowy w mikrokrążeniu wątrobowym. Pobrano krew pełną od myszy dawcy, a erytrocyty dwukrotnie przemyto PBS-em poprzez wirowanie przy 400 G przez pięć minut.Następnie rozpuść 2 mg FITC w 1 mL 100 mM DI wodorofosforanu sodu, a następnie przefiltruj roztwór przez membranę o rozmiarze porów 0,2 µm. Do probówki przelej 1 mL roztworu FITC oraz dodaj 0,15 mL 3 mM roztworu dekstranu, 0,25 mL 180 mM DI wodorofosforanu sodu oraz 1,5 mL 100 mM DI wodorofosforanu sodu, po czym wymieszaj poprzez delikatne opukiwanie. Przechowuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie dwukrotnie przemyj zabarwione RBC buforem PBS.Następnie nanieś niewielką ilość zawiesiny RBC na szkiełko przedmiotowe i potwierdź prawidłowy wygląd RBC oraz wystarczającą fluorescencję. Zawieś 0,1 milliliter RBC w 0,9 milliliter PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius do momentu użycia. Następnie rozpuść 500 milligrams BSA w 10 milliliters PBS. Dodaj 30 milligrams porfiryny palladu i mieszaj przez noc. Odwiruj roztwór, aby usunąć nierozpuszczoną porfirynę palladu, a następnie przefiltruj nadsącz przez membranę po o porach 0,2 micron. Przenieś jeden milliliter filtratu do probówek i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsius. Należy pamiętać, aby unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.Aby zwizualizować mikrokrążenie mikroskopowo, wytnij otwór o średnicy 20 mm w plastikowej płytce i zakryj go kwadratowym szkiełkiem podstawowym o boku 30 mm. Po kaniulacji żyły ogonowej rozłóż główny płat wątroby na plastikowej płytce w pozycji brzusznej. Następnie użyj kilku fragmentów plastikowej folii spożywczej o wymiarach 3 mm na 8 mm, aby przykryć obszar wokół płata w celu zapobiegania przesunięciom wynikającym z oddychania oraz wysychaniu.Wizualizuj krążenie wątrobowe za pomocą mikroskopu transmisyjnego i upewnij się, że w polu widzenia nie występuje zastój przepływu krwi przez co najmniej 15 minut. Aby obserwować przepływ krwi, stopniowo wstrzyknij 0,2 ml fluorescencyjnie znakowanych RBCs.Aby zmierzyć ciśnienie parcjalne tlenu, należy wstrzyknąć 0,2 milliliters roztworu porfiryny palladu. RBC znakowane FITC będą stanowić jedną pięćdziesiątą wszystkich RBC w krwiobiegu w wizualizowanym obszarze; należy wzbudzić FITC, naświetlając go lampą rtęciową z zastosowaniem filtra pasmowego 450 do 490 nanometer, a następnie zarejestrować fluorescencję za pomocą kamery CCD. Fosforescencja porfiryny palladu jest stosunkowo słaba i wymaga detektora o wysokiej czułości oraz zaciemnionego pomieszczenia.Piki absorpcyjne porfiryny palladu znajdują się w okolicach 410 i 532 nanometrów, dlatego zaleca się stosowanie długości fali drugiej harmonicznej wynoszącej 532 nanometry. Długość fali ta jest generowana przez impulsowy laser neodymowy YAG; należy podłączyć wiązkę laserową do mikroskopu odwróconego i ustawić ją tak, aby wiązka oświetlała środek płaszczyzny ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna lasera zależy od wielkości plamki, którą można regulować, przepuszczając wiązkę przez otwór zwężający.Do mikroskopu należy dołączyć również filtr długoprzepustowy oraz fotopowielacz w celu wykrycia fosforescencji. Fotopowielacz powinien być czuły na długości fal czerwonych, zwłaszcza w okolicach 700 nanometrów. Należy zarejestrować sygnał fosforescencji i obliczyć stałą czasową zaniku, stosując funkcję wykładniczą.W tym eksperymencie pobrano próbki z 500 punktów przy częstotliwości 200 kilohertz. W celu przeprowadzenia kalibracji należy przygotować dwa roztwory porfiryny palladu z ciśnieniem parcjalnym tlenu wynoszącym odpowiednio 150 oraz zero milimetrów rtęci. Do roztworu o wartości zero milimetrów rtęci należy dodać 1% diwodorosiarczynu sodu do próbek, aby stworzyć warunki całkowitego braku tlenu podczas kalibracji.Utrzymaj pH próbki na poziomie 7,4 oraz temperaturę 37°C. Umieść mysz na stoliku mikroskopu i ustaw naczynia krwionośne wątroby, w których chcesz zwizualizować mikrokrażenie wewnątrzwątrobowe, w punkcie skupienia wiązki lasera. Myszy z wolnym dostępem do wody przez noc wstrzyknąć paracetamolem w dawce 200 mg/kg drogą dosytroniczną. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia znieczulić mysz i odsłonić wątrobę poprzez nacięcie pośrodkowe. W przypadku wystąpienia zapalenia wątroby będzie ono łatwo widoczne gołym okiem poprzez nekrozę w obszarze paracentrycznym.Nasze pomiary ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrażeniowych wątroby u myszy wykazały średnie ciśnienia tlenu odpowiednio 59,8, 48,2 i 38,9 mmHg dla żył wrotnych, sinusoid i żył środkowych. Innymi słowy, gradient tlenowy od żyły wrotnej do żyły środkowej wskazuje na wystarczające uwalnianie tlenu z RBC podczas ich przechodzenia przez sinusoidy. W celu pomiaru parametrów naczyniowych mikrokrażenia wątrobowego przygotowaliśmy model myszy z zapaleniem wątroby indukowanym paracetamolem.Jako przykładowy model patologiczny ustalono, że ciśnienia parcjalne tlenu w żyłach wrotnych, sinusoidach i żyłach środkowych były wyższe w grupie poddanej działaniu paracetamolu w porównaniu z myszami zdrowymi. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi a środkowymi wynosiła 20,9 mmHg dla myszy zdrowych oraz 16,9 mmHg dla myszy w modelu zapalenia wątroby. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi a środkowymi wynosiła 20,9 mmHg dla myszy zdrowych oraz 16,9 mmHg dla myszy w modelu zapalenia wątroby.Gradient tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym wynika głównie z podaży tlenu z żyły wrotnej, który jest zużywany przez hepatocyty. Nekroza hepatocytów w obszarze żyły środkowej wywołana paracetamolem prowadzi do zmniejszenia zużycia tlenu w mikrokrążeniu dystalnym, a tym samym do zaburzeń hemodynamicznych. Podaż i zużycie tlenu są zaangażowane w wiele postaci chorób wątroby. Stworzyliśmy model ostrego zapalenia wątroby i stwierdziliśmy wzrost ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia.Nasz system optyczny może być wykorzystywany do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikro naczyniowej, a także rozkładu przepływu i zużycia tlenu.

visualization-analysis-blood-flow-oxygen-consumption-hepatic

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wizualizacja i analiza przepływu krwi i zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: Zastosowanie do ostrego modelu zapalenia wątroby

Przeszczepy marginalne, takie jak stłuszczone wątroby, przeszczepy od starszych dawców lub wątroby pobrane po śmierci sercowej (DCD) źle znoszą tradycyjne, zimne przechowywanie statyczne. Opracowaliśmy nowatorski model subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo w celu zachowania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby przed przeszczepem.

Technika subnormotermicznej perfuzji wątroby ex vivo do przechowywania, oceny i naprawy brzeżnych przeszczepów wątroby

Ten artykuł opisuje szczegółową metodę dynamicznego pomiaru i kwantyfikacji prędkości przepływu krwi w poszczególnych naczyniach krwionośnych układu krwionośnego wątroby myszy przy użyciu obrazowania pod mikroskopem przyżyciowym w połączeniu ze specyficzną metodologią pozyskiwania i analizy obrazów.

Obrazowanie pod mikroskopem przyżyciowym wątroby po zakażeniu Leishmania: ocena hemodynamiki wątroby

Narzędzia używane do wizualizacji regeneracji naczyń krwionośnych wymagają metod kontrastowania drzew naczyniowych. Film ten zademonstrował delikatną technikę iniekcji zastosowaną w celu uzyskania optymalnego kontrastu drzew naczyniowych i zilustrował potencjalne korzyści wynikające ze szczegółowej analizy otrzymanej próbki za pomocą μCT i histologicznych odcinków seryjnych.

Wizualizacja regeneracji naczyń krwionośnych i miąższu po 70% częściowej hepatektomii u zdrowych myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół inwazyjnych pomiarów parametrów hemodynamicznych, w tym ciśnienia wrotnego, splanchnicznego przepływu krwi i hemodynamiki ogólnoustrojowej, aby scharakteryzować zespół nadciśnienia wrotnego u szczurów.

Inwazyjna charakterystyka hemodynamiczna zespołu wrotno-nadciśnieniowego u szczurów z marskością wątroby

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentalnej oceny krzepnięcia osocza w tkance wątroby in vivo. W modelu świńskim mikrokrążenie jest badane za pomocą laserowego Dopplera, głębokość krzepnięcia jest mierzona histologicznie, temperatura w miejscu krzepnięcia za pomocą termometru na podczerwień i kamery termograficznej, a efekt uszczelnienia kanałów jest dokumentowany za pomocą eksperymentów z ciśnieniem rozrywającym.

Ocena krzepnięcia osocza na tkance wątroby w dużym modelu zwierzęcym in vivo

Protokół opisuje prostą metodę resekcji nienaruszonej wątroby myszy do badań metabolicznych poprzez perfuzję żyły wrotnej.

Ex vivo Perfuzja wątrobowa przez żyłę wrotną u myszy

Tutaj prezentujemy solidną metodę perfuzji in situ wątroby myszy do badania ostrej i bezpośredniej regulacji metabolizmu wątroby bez naruszania architektury wątroby, ale przy braku czynników pozawątrobowych.

Produkcja glukozy w wątrobie, mocznicozna, i lipoliza oznaczone ilościowo przy użyciu perfundowanego modelu wątroby myszy

Ultraszybkie ultrasonografie dopplerowskie (UFUS) o wysokiej rozdzielczości przestrzennej (100 μm) i czułości stanowi odpowiednią nieinwazyjną metodę obrazowania w celu uzyskania kompleksowego jakościowego przeglądu naczyń wątrobowych. UFUS ułatwia również ilościowe pomiary mikrokrążenia, mając na celu pogłębienie naszej wiedzy na temat mechanizmów chorób naczyniowych.

Obrazowanie i kwantyfikacja unaczynienia wątroby myszy za pomocą ultraszybkich ultradźwięków dopplerowskich

Protokół ten wprowadza nowoczesne, wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby (RHIT) do mikroskopii śródżyciowej (IVM) żywych myszy, które zwiększa stabilność tkanek podczas szybkich i ostrych eksperymentów. Konstrukcja RHIT, drukowana w 3D, oferuje opłacalną produkcję, skalowalność i wszechstronność, umożliwiając długotrwałą obserwację procesów metabolicznych u myszy o różnych rozmiarach.

Wielokrotnego użytku narzędzie do obrazowania wątroby: wielokrotnego użytku narzędzie drukowane w 3D do mikroskopii śródżyciowej wątroby

W tym miejscu przedstawiamy protokół dla otwartego, modyfikowalnego normotermicznego systemu perfuzji ex vivo , zaprojektowanego w celu przezwyciężenia wysokich kosztów i ograniczonej elastyczności istniejących platform, umożliwiając bardziej dostępne, opłacalne i iteracyjne wykorzystanie w przedklinicznych badaniach biomedycznych.

System perfuzji normamicznej o otwartym kodzie źródłowym przeznaczony dla naukowców

Poznaj metodę wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z fluorescencyjnie znakowanymi erytrocytami i pomiaru ciśnienia cząstkowego tlenu za pomocą laserowej fosforymetrii.

Wizualizacja i analiza przepływu krwi i zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie do modelu ostrego zapalenia wątroby (Wideo) | JoVE Journal

Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Przeglądaj więcej filmów