Wizualizacja i analiza przepływu krwi oraz zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie w modelu ostrego zapalenia wątroby

Opracowano system optyczny do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z wykorzystaniem erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach za pomocą obrazowania fosforowego wspomaganego laserem. Metoda ta może być wykorzystana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikronaczyniowej, średnicy, prędkości przepływu krwi oraz napięcia tlenowego. W mikrokrążeniu wątrobowym krew przepływa z zatok portalnych do zatok centralnych, co tworzy gradient tlenowy między nimi.

Stężenie tlenu w wątrobie wpływa zarówno na ekspresję enzymów, jak i na patologię, co sprawia, że analiza przepływu krwi i pomiar tlenu są istotnymi tematami badawczymi. Nasza metoda eksperymentalna polega na dożylnym podaniu erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie.

W celu wizualizacji mikrokrażenia z wykorzystaniem fluorescencji do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu, podajemy dożylnie porfirynę palladu, która pod wpływem wzbudzenia laserem emituje fosforescencję w krwiobiegu w stopniu zależnym od stężenia tlenu w otoczeniu. Proces ten umożliwia ilościową analizę tlenu; pomiar ciśnienia parcjalnego tlenu w mikrokrażeniu wątrobowym wykazał ciśnienie parcjalne tlenu w żyłach wrotnych i centralnych wynoszące odpowiednio 59,8 oraz 38,9 mmHg, co dowodzi skuteczności pomiaru stężenia tlenu. Następnie zastosowaliśmy tę metodologię w modelu zapalenia wątroby.

Stwierdziliśmy podwyższone ciśnienie parcjalne tlenu w zatokach sinusoidalnych wnętrzpylnych oraz w żyłkach centralnych, lecz obniżoną różnicę ciśnień między żyłkami wnętrzpylnymi a centralnymi. Jest to prawdopodobnie wynik zmniejszonego zużycia tlenu w obszarze żyły centralnej z powodu martwicy hepatocytów. Wyniki te pokazują, że nasza metodologia wykorzystująca system optyczny do pomiaru hemodynamiki wątrobowej i zużycia tlenu jest zdolna do wyjaśnienia mechanizmów różnych chorób wątroby w obrębie mikrokrażenia wątrobowego.

Gradient tlenowy jest kluczowym parametrem wpływającym na ekspresję enzymów w obszarach okołowrotnych i okożylnych oraz rodzaje chorób wątroby związanych z mikro rozkładem, dlatego istotne jest ilościowe określenie przepływu krwi i zużycia tlenu. Aby wyjaśnić te mechanizmy, zaletą naszej metody jest bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny, który pozwala ilościowo określić przepływ krwi, średnice naczyń oraz gradient tlenowy w mikrokrążeniu wątrobowym. Pobrano krew pełną od myszy dawcy, a erytrocyty dwukrotnie przemyto PBS-em poprzez wirowanie przy 400 G przez pięć minut.

Następnie rozpuść 2 mg FITC w 1 mL 100 mM DI wodorofosforanu sodu, a następnie przefiltruj roztwór przez membranę o rozmiarze porów 0,2 µm. Do probówki przelej 1 mL roztworu FITC oraz dodaj 0,15 mL 3 mM roztworu dekstranu, 0,25 mL 180 mM DI wodorofosforanu sodu oraz 1,5 mL 100 mM DI wodorofosforanu sodu, po czym wymieszaj poprzez delikatne opukiwanie. Przechowuj w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a następnie dwukrotnie przemyj zabarwione RBC buforem PBS.

Następnie nanieś niewielką ilość zawiesiny RBC na szkiełko przedmiotowe i potwierdź prawidłowy wygląd RBC oraz wystarczającą fluorescencję. Zawieś 0,1 milliliter RBC w 0,9 milliliter PBS i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsius do momentu użycia. Następnie rozpuść 500 milligrams BSA w 10 milliliters PBS. Dodaj 30 milligrams porfiryny palladu i mieszaj przez noc. Odwiruj roztwór, aby usunąć nierozpuszczoną porfirynę palladu, a następnie przefiltruj nadsącz przez membranę po o porach 0,2 micron. Przenieś jeden milliliter filtratu do probówek i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsius. Należy pamiętać, aby unikać wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.

Aby zwizualizować mikrokrążenie mikroskopowo, wytnij otwór o średnicy 20 mm w plastikowej płytce i zakryj go kwadratowym szkiełkiem podstawowym o boku 30 mm. Po kaniulacji żyły ogonowej rozłóż główny płat wątroby na plastikowej płytce w pozycji brzusznej. Następnie użyj kilku fragmentów plastikowej folii spożywczej o wymiarach 3 mm na 8 mm, aby przykryć obszar wokół płata w celu zapobiegania przesunięciom wynikającym z oddychania oraz wysychaniu.

Wizualizuj krążenie wątrobowe za pomocą mikroskopu transmisyjnego i upewnij się, że w polu widzenia nie występuje zastój przepływu krwi przez co najmniej 15 minut. Aby obserwować przepływ krwi, stopniowo wstrzyknij 0,2 ml fluorescencyjnie znakowanych RBCs.

Aby zmierzyć ciśnienie parcjalne tlenu, należy wstrzyknąć 0,2 milliliters roztworu porfiryny palladu. RBC znakowane FITC będą stanowić jedną pięćdziesiątą wszystkich RBC w krwiobiegu w wizualizowanym obszarze; należy wzbudzić FITC, naświetlając go lampą rtęciową z zastosowaniem filtra pasmowego 450 do 490 nanometer, a następnie zarejestrować fluorescencję za pomocą kamery CCD. Fosforescencja porfiryny palladu jest stosunkowo słaba i wymaga detektora o wysokiej czułości oraz zaciemnionego pomieszczenia.

Piki absorpcyjne porfiryny palladu znajdują się w okolicach 410 i 532 nanometrów, dlatego zaleca się stosowanie długości fali drugiej harmonicznej wynoszącej 532 nanometry. Długość fali ta jest generowana przez impulsowy laser neodymowy YAG; należy podłączyć wiązkę laserową do mikroskopu odwróconego i ustawić ją tak, aby wiązka oświetlała środek płaszczyzny ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna lasera zależy od wielkości plamki, którą można regulować, przepuszczając wiązkę przez otwór zwężający.

Do mikroskopu należy dołączyć również filtr długoprzepustowy oraz fotopowielacz w celu wykrycia fosforescencji. Fotopowielacz powinien być czuły na długości fal czerwonych, zwłaszcza w okolicach 700 nanometrów. Należy zarejestrować sygnał fosforescencji i obliczyć stałą czasową zaniku, stosując funkcję wykładniczą.

W tym eksperymencie pobrano próbki z 500 punktów przy częstotliwości 200 kilohertz. W celu przeprowadzenia kalibracji należy przygotować dwa roztwory porfiryny palladu z ciśnieniem parcjalnym tlenu wynoszącym odpowiednio 150 oraz zero milimetrów rtęci. Do roztworu o wartości zero milimetrów rtęci należy dodać 1% diwodorosiarczynu sodu do próbek, aby stworzyć warunki całkowitego braku tlenu podczas kalibracji.

Utrzymaj pH próbki na poziomie 7,4 oraz temperaturę 37°C. Umieść mysz na stoliku mikroskopu i ustaw naczynia krwionośne wątroby, w których chcesz zwizualizować mikrokrażenie wewnątrzwątrobowe, w punkcie skupienia wiązki lasera. Myszy z wolnym dostępem do wody przez noc wstrzyknąć paracetamolem w dawce 200 mg/kg drogą dosytroniczną. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia znieczulić mysz i odsłonić wątrobę poprzez nacięcie pośrodkowe. W przypadku wystąpienia zapalenia wątroby będzie ono łatwo widoczne gołym okiem poprzez nekrozę w obszarze paracentrycznym.

Nasze pomiary ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrażeniowych wątroby u myszy wykazały średnie ciśnienia tlenu odpowiednio 59,8, 48,2 i 38,9 mmHg dla żył wrotnych, sinusoid i żył środkowych. Innymi słowy, gradient tlenowy od żyły wrotnej do żyły środkowej wskazuje na wystarczające uwalnianie tlenu z RBC podczas ich przechodzenia przez sinusoidy. W celu pomiaru parametrów naczyniowych mikrokrażenia wątrobowego przygotowaliśmy model myszy z zapaleniem wątroby indukowanym paracetamolem.

Jako przykładowy model patologiczny ustalono, że ciśnienia parcjalne tlenu w żyłach wrotnych, sinusoidach i żyłach środkowych były wyższe w grupie poddanej działaniu paracetamolu w porównaniu z myszami zdrowymi. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi a środkowymi wynosiła 20,9 mmHg dla myszy zdrowych oraz 16,9 mmHg dla myszy w modelu zapalenia wątroby. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi a środkowymi wynosiła 20,9 mmHg dla myszy zdrowych oraz 16,9 mmHg dla myszy w modelu zapalenia wątroby.

Gradient tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym wynika głównie z podaży tlenu z żyły wrotnej, który jest zużywany przez hepatocyty. Nekroza hepatocytów w obszarze żyły środkowej wywołana paracetamolem prowadzi do zmniejszenia zużycia tlenu w mikrokrążeniu dystalnym, a tym samym do zaburzeń hemodynamicznych. Podaż i zużycie tlenu są zaangażowane w wiele postaci chorób wątroby. Stworzyliśmy model ostrego zapalenia wątroby i stwierdziliśmy wzrost ciśnienia parcjalnego tlenu w naczyniach mikrokrążenia.

Nasz system optyczny może być wykorzystywany do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikro naczyniowej, a także rozkładu przepływu i zużycia tlenu.