Wizualizacja i analiza przepływu krwi i zużycia tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym: zastosowanie do modelu ostrego zapalenia wątroby
August 4th, 2012
System optyczny został opracowany do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego z erytrocytami znakowanymi FITC i do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach za pomocą fosforymetrii wspomaganej laserem. Metoda ta może być stosowana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy, prędkości przepływu krwi i ciśnienia tlenu.
Opracowano system optyczny do wizualizacji mikrokrążenia wątrobowego za pomocą erytrocytów znakowanych fluorescencyjnie oraz do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu w mikronaczyniach za pomocą laserowego obrazowania fosfo. Metoda ta może być stosowana do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikronaczyniowej, średnicy, prędkości przepływu krwi i ciśnienia tlenu. W mikrokrążeniu wątrobowym krew przepływa z wrotnego ES do centralnego Es, tworząc gradient tlenu między nimi.
Stężenie tlenu w wątrobie wpływa zarówno na ekspresję enzymów, jak i patologię, co powoduje analizę przepływu krwi i pomiar tlenu. Ważne tematy badań. Nasza metoda eksperymentalna polega na dożylnym podawaniu czerwonych krwinek znakowanych fluorescencyjnie.
W celu uwidocznienia mikrokrążenia za pomocą fluorescencji do pomiaru ciśnienia parcjalnego tlenu podajemy dożylnie porfirynę palladową, która po wzbudzeniu laserem wydziela fosforyzację w krwiobiegu w stopniu zależnym od stężenia otaczającego tlenu. Proces ten pozwala na ilościową analizę tlenu, pomiar ciśnienia parcjalnego w wątrobie mikrokrążenia wykazał wrotne i centralne ciśnienie parcjalne tlenu w żyłach wrotnych i centralnych wynoszące odpowiednio 59,8 i 38,9 milimetrów słupa rtęci, wykazując skuteczny pomiar stężenia tlenu. Następnie zastosowaliśmy tę metodologię do modelu zapalenia wątroby.
Stwierdziliśmy podwyższone ciśnienie parcjalne tlenu w sinusoidalnym i centralnym ES wrotnym, ale zmniejszoną różnicę ciśnień między wrotnym a centralnym es. Jest to prawdopodobnie spowodowane zmniejszonym zużyciem tlenu w centralnym obszarze Ven z powodu martwicy hepatocytów. Wyniki te pokazują, że nasza metodologia wykorzystania układu optycznego do pomiaru hemodynamiki wątroby i zużycia tlenu jest w stanie wyjaśnić mechanizmy różnych chorób wątroby w mikrokrążeniu wątrobowym.
Gradient tlenu jest podstawowym parametrem obejmującym ekspresję enzymów w regionach okołowrotnych i paracentralnych, rodzajach chorób wątroby związanych z mikrodystrybucją, dlatego ważne jest, aby określić ilościowo przepływ krwi i zużycie tlenu. Aby wyjaśnić mechanizmy, zaletą naszej metody jest bezkontaktowy i ciągły pomiar optyczny, który może określić ilościowo przepływ krwi, średnice naczyń nadmuchowych i gradient tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym. Krew pełną pobrano od myszy dawcy, a erytrocyty przemyto dwukrotnie PBS przez odwirowanie w 400 G przez pięć minut.
Następnie rozpuść dwa miligramy FITC w jednym mililitrze, 100 milimolach wodorofosforanu sodu DI przed przefiltrowaniem przez membranę porową o wielkości 0,2 mikrona. Następnie umieść jednomililitrowy roztwór FITC w probówce wraz z 0,15 mililitra trzymilimolowego roztworu zręcznościowego, 0,25 mililitra 180 milimolowego wodorofosforanu sodu DI i 1,5 mililitra 100 milimolowego wodorofosforanu sodu DI i dotknij, aby wymieszać. Utrzymuj temperaturę pokojową przez dwie godziny przed dwukrotnym umyciem poplamionych krwinek czerwonych za pomocą PBS.
Następnie umieść niewielką ilość zawiesiny RBC na szklanym szkiełku i potwierdź zarówno normalny wygląd RBC, jak i wystarczającą fluorescencję zawieś 0,1 mililitra RBC w 0,9 mililitra PBS i utrzymuj cztery stopnie Celsjusza do użycia Następny, Rozpuść 500 miligramów BSA w 10 mililitrach PBS. Następnie dodaj 30 miligramów porfiryny palladowej i zamieszaj wirówkę przez noc, roztwór w celu usunięcia nierozpuszczonej porfiryny palladowej i przefiltruj natin SUP przez membranę o grubości 0,2 mikrona, jeden mililitr filtratu do probówek i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Uważano, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
Aby zobrazować mikrokrążenie pod mikroskopem, wytnij otwór o średnicy 20 milimetrów w plastikowej płytce i przykryj otwór kwadratową szklanką osłonową 30 milimetrów z boku. Rozłóż główny płat wątroby na plastikowej płytce w pozycji leżącej po kaniulacji żyły ogonowej. Następnie użyj wielu odcinków plastikowej folii spożywczej o wymiarach trzy milimetry na osiem milimetrów, aby przykryć obszar otaczający płat, aby zapobiec ruchowi spowodowanemu oddychaniem i wysuszeniem.
Uwidocznij krążenie wątrobowe za pomocą mikroskopu transmisyjnego i upewnij się, że nie ma zastoju w przepływie krwi w polu widzenia przez co najmniej 15 minut. Aby obserwować przepływ krwi, stopniowo wstrzyknij. Wskaż dwa mililitry fluorescencyjnie znakowanych krwinek czerwonych.
Aby zmierzyć ciśnienie parcjalne tlenu, wstrzyknij 0,2 mililitra roztworu porfiryny palladowej. Erytrocyty oznaczone przez FITC będą stanowić jedną 50 wszystkich erytrocytów w obiegu w wizualizowanym regionie, wzbudzić FITC poprzez naświetlanie go lampą rtęciową przepuszczoną przez filtr pasmowy o długości od 450 do 490 nanometrów i zarejestrować fluorescencję za pomocą kamery CCD. Fosforescencja palladowo-porfirynowa jest stosunkowo słaba i wymaga detektora o wysokiej czułości oraz zaciemnionego pomieszczenia.
Piki absorpcji palladu porfiryny wynoszą około 410 i 532 nanometrów, a zalecana jest długość fali drugiej harmonicznej 532 nanometrów. Ta długość fali jest wytwarzana przez neodymowy laser impulsowy YAG, który łączy wiązkę laserową z odwróconym mikroskopem i dostosowuje się tak, aby wiązka oświetlała środek płaszczyzny ogniskowej. Rozdzielczość przestrzenna lasera zależy od wielkości plamki, którą można regulować, przepuszczając wiązkę przez otwór otworkowy.
Podłącz również filtr długoprzepustowy i rurkę fotopowielacza do mikroskopu, aby wykryć fosforescencję. PMT powinien być czuły na fale czerwone, zwłaszcza około 700 nanometrów. Próbkuj sygnał fosforyzujący i oblicz stałą czasową zaniku, stosując funkcję wykładniczą.
W tym eksperymencie pobraliśmy próbki z 500 punktów przy 200 kilohercach. Aby skalibrować, przygotuj dwa roztwory palladowo-porfiryny o ciśnieniu parcjalnym tlenu 150 i zerowej milimetrze rtęci każdy. W przypadku roztworu rtęci o wartości zero milimetrów dodaj do próbek 1% dihi sodu, aby stworzyć warunki, w których tlen jest nieobecny podczas kalibracji.
Utrzymuj pH próbki na poziomie 7,4 i temperaturę 37 stopni Celsjusza. Ustaw mysz na stoliku mikroskopu i dostosuj mikronaczynia, dla których chcesz uwidocznić mikrokrążenie wątrobowe, do punktu lasera szybkie myszy z wolnym dostępem do wody przez noc, wstrzyknij paracetamol w dawce 200 miligramów na kilogram dootrzewnowo 24 godziny od wstrzyknięcia, znieczul mysz i odsłoń wątrobę z środkowym nacięciem. Jeśli występuje zapalenie wątroby, będzie ono łatwo widoczne gołym okiem poprzez martwicę w okolicy przyśrodkowej.
Nasz pomiar ciśnienia cząstkowego tlenu i mikronaczyń wątrobowych u myszy wykazał średnie ciśnienie tlenu dla wrotnych es, gleb zatokowych i żył centralnych wynoszące odpowiednio 59,8, 48,2 i 38,9 milimetrów słupa rtęci. Innymi słowy, gradient tlenu od portalu do centralnego ES wskazuje na wystarczające uwalnianie tlenu z erytrocytów podczas ich przechodzenia przez sinusoidy. Przygotowaliśmy myszy z zapaleniem wątroby wywołanym paracetamolem do pomiaru mikronaczyń wątrobowych.
Jako przykładowy model patologii stwierdziliśmy, że ciśnienie parcjalne tlenu w żyłach wrotnych, sinusoidalnych i centralnych E było wyższe w grupie paracetamolu w porównaniu z normalnymi myszami. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi i centralnymi wynosiła 20,9 milimetra rtęci dla normalnych myszy i 16,9 milimetra rtęci dla myszy modelowych zapalenia wątroby. Różnica ciśnień parcjalnych tlenu między żyłami wrotnymi i centralnymi wynosiła 20,9 milimetra rtęci dla normalnych myszy i 16,9 milimetra rtęci dla myszy modelowych zapalenia wątroby.
Gradient tlenu w mikrokrążeniu wątrobowym powstaje głównie w wyniku dostarczania tlenu z żyły wrotnej, który jest zużywany przez hepatocyty, martwica hepatocytów w centralnym obszarze żylnym spowodowana paracetamolem powoduje zmniejszenie zużycia tlenu, mikrokrążenie w dół, a tym samym problemy związane z hemodynamiką. Zaopatrzenie w tlen i zużycie tlenu są zaangażowane w wiele form chorób wątroby. Wykonaliśmy model ostrego zapalenia wątroby i stwierdziliśmy wzrost ciśnienia tlenu w mikronaczyniach.
Nasz system optyczny może być używany do badania mechanizmów fizjologicznych i patologicznych poprzez analizę struktury mikronaczyniowej, a nie rozkładu przepływu i zużycia tlenu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Opracowano układ optyczny do wizualizacji mikrokrążenia wątroby za pomocą erytrocytów z oznaczeniem fluorescencyjnym oraz do pomiaru ciśnienia częściowego tlenu w mikronaczyniach za pomocą fosforimetrii asystowanej laserem. Ta innowacyjna metoda pozwala na badanie zarówno fizjologicznych, jak i patologicznych mechanizmów poprzez analizę struktury mikrokrążenia, średnicy, prędkości przepływu krwi i napięcia tlenowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Mikrokrążenie
- Pomiar tlenu
Tło
- Mikrokrążenie wątrobowe obejmuje przepływ krwi od żyły wrotnej do centralnych żył.
- Istnieje gradient tlenu między tymi dwoma regionami.
- Stężenie tlenu w wątrobie wpływa na ekspresję enzymów i patologię.
- Rozumienie przepływu krwi i poziomów tlenu jest kluczowe dla badań.
Cel badania
- Wizualizacja mikrokrążenia wątroby.
- Pomiar ciśnienia częściowego tlenu w mikronaczyniach.
- Analiza związku między przepływem krwi a napięciem tlenu.
Zastosowane metody
- Dożylne podawanie fluorescencyjnie oznaczonych czerwonych krwinek.
- Wizualizacja mikrokrążenia za pomocą układu optycznego.
- Pomiar stężenia tlenu metodą fosforimetrii asystowanej laserem.
- Analiza struktury mikrokrążenia i prędkości przepływu krwi.
Główne wyniki
- Udana wizualizacja mikrokrążenia wątroby.
- Dokładne pomiary ciśnienia częściowego tlenu w mikronaczyniach.
- Wgląd w fizjologiczne i patologiczne mechanizmy.
- Ustanowienie metody dla przyszłych badań nad funkcją wątroby.
Wnioski
- Opracowany układ optyczny jest skuteczny w badaniu mikrokrążenia wątroby.
- Ta metoda może zwiększyć zrozumienie patologii wątroby.
- Przyszłe badania mogą wykorzystać to podejście do różnych badań fizjologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This optical method enables direct visualization and quantification of hepatic microcirculation and oxygen gradients, providing mechanistic insights into liver disease pathophysiology. By linking hemodynamic changes to enzyme expression patterns and zonation-specific injury, it supports target validation in hepatotoxicity and metabolic disease models. The approach offers a translational bridge from discovery to preclinical evaluation by revealing early functional alterations in liver microcirculation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by correlating oxygen gradient alterations with zonated enzyme expression and pathology.
- Operational Value: Enables functional target validation through real-time, label-based hemodynamic readouts in disease models.
- Predictive Value: Supports predictive confidence by identifying early shifts in oxygen consumption that precede structural damage.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems with quantifiable oxygen and flow parameters for compound screening.
- Reproducibility: Delivers continuous, non-contact measurements that standardize hemodynamic assessments across studies.
- Platform Utility: Generates scalable outputs (vessel diameter, flow velocity, pO2) suitable for high-content analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models acute hepatitis by demonstrating how pericentral necrosis alters oxygen gradients and downstream metabolic signaling.
- Translational Continuity: Connects microvascular dysfunction to enzyme expression shifts, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables early detection of hemodynamic changes that inform go/no-go progression in preclinical pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by providing functional hemodynamic data that informs target engagement and pathway modulation studies prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking portal-to-central oxygen gradients to metabolic zonation and enzyme activity.
- Screening: Delivers quantitative outputs (flow velocity, vessel diameter, pO2) that enable compound effect stratification in liver models.
- Analytics: Provides decay-time-based oxygen measurements and flow metrics that facilitate comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects hemodynamic shifts to zonated pathology, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable optical platform for longitudinal monitoring of liver microcirculation across disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly measuring oxygen gradients that drive hepatic zonation and enzyme expression.
- Operational Value: Ensures standardization through non-contact, continuous optical measurement independent of probe loading variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early hemodynamic biomarkers of liver injury before histologic endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by revealing oxygen consumption changes predictive of zonated toxicity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in intravital microscopy, fluorescent labeling, and phosphorescence lifetime imaging.
- Depends on laser systems with specific wavelength excitation (e.g., 532 nm second harmonic) and sensitive red-shifted detection (PMT ~700 nm).
- Necessitates cross-team standardization for consistent calibration using defined pO2 references (0 and 150 mmHg) under controlled pH and temperature.
- Involves adaptation considerations when extending to other microvascular beds due to differences in flow dynamics and oxygen solubility.
- Includes practical limitations such as signal attenuation in deeply embedded vessels and the need for surgical access to hepatic tissue.
