Test α: Szybkie bezkomórkowe oznaczanie liczby limfocytów CD4 z wykorzystaniem całej śliny

Istnieje pilna potrzeba opracowania przystępnej cenowo metody zliczania limfocytów CD4 w celu monitorowania przebiegu zakażenia HIV w regionach o ograniczonych zasobach. Niniejszy film prezentuje niskokosztowy test przesiewowy typu point-of-care, w którym liczba CD4 jest określana na podstawie obecności inhibitora proteinazy Alpha 1-PI w ślinie. W tym celu badanemu lub pacjentowi podaje się najpierw cukierek cytrynowy, aby pobudzić wydzielanie płynu surowiczego do śliny.

Ślinę zbiera się do naczynia na próbkę, a następnie przenosi do płytki assay z 96 dołkami. Następnie do śliny dodaje się nasycającą ilość białka proteinazy – porcine pancreatic elastase, która wiąże i hamuje alpha one pi. W kolejnym kroku dodaje się kolorymetryczny substrat elastazy.

Pozostała niezwiązana elastaza rozszczepia substrat, co powoduje zmianę barwy z przezroczystej na żółtą. Do dołków dodaje się błękit Kumasi w celu zabarwienia całkowitego białka, a następnie za pomocą czytnika mikropłytek wykonuje się pomiary kolorymetryczne. Ostatecznie wyznacza się stosunek alfa 1-antytrypsyny do całkowitego białka i wykorzystuje go do dokładnej oceny liczby limfocytów CD4 na podstawie wartości indeksu.

Technika ta wykazuje kilka zalet w porównaniu z istniejącą metodą, jaką jest cytometria przepływowa. Badanie można przeprowadzić w terenie bez pobierania krwi, co jest traumatyzujące i kosztowne, bez użycia drogich przeciwciał monoklonalnych, bez konieczności posiadania specjalistycznego wykształcenia technicznego oraz bez potrzeby chłodzenia lub transportu próbek. Metoda ta przełamuje krytyczną barierę w interwencjach przeciwko AIDS i powinna mieć istotny wpływ na koszty i wyniki zdrowotne pacjentów oraz częstotliwość transmisji HIV, co w konsekwencji ma znaczący wpływ na gospodarkę światową.

Metoda ta może dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób Alpha i PI regulują liczbę limfocytów T CD4 poprzez adhezję i migrację, ale może być również zastosowana do innych układów, na przykład do badania tego, jak inhibitory innych białek regulują adhezję i migrację innych typów komórek. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy odkryliśmy, że poziom Alpha 1 PI u pacjentów z zakażeniem HIV jest tak niski, że w rzeczywistości ogranicza on liczbę limfocytów T CD4 przedostających się do krwi. Protokół należy rozpocząć od przygotowania niezbędnych roztworów roboczych dla każdej z używanych mikropłytek.

Przygotuj 60 mililitrów 0,05 molarnego buforu TBS (tris-buffered saline) o pH 7,8. Ponadto, dla każdej mikropłytki, przygotuj sześć mililitrów porcine pancreatic elastase typu pierwszego (PPE). Dobrze wymieszaj zawiesinę PPE, a następnie rozcieńcz ją w TBS do stężenia około 0,01 jednostek na mililitr.

Następnie należy przygotować 0,1 molarny roztwór zapasu substratu kolorymetrycznego SA three NA w DMSO. Roztwór zapasu ten należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20°C, jeśli nie będzie użyty od razu. Przygotuj sześć mililitrów roztworu roboczego dla każdej mikropłytki, rozcieńczając go w stosunku 1:100 w TBS. Na koniec przygotuj roztwór zapasu 10% kumasi brilliant blue R two 50 w TBS i zużyj go natychmiast lub przechowuj w temperaturze -20°C, jeśli nie będzie użyty od razu.

Przygotuj sześć mililitrów dla każdej mikropłytki, rozcieńczając roztwór stokowy 1:1000 w buforze TBS. Podczas pracy ze śliną ważne jest zachowanie odpowiednich środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, przy badanej osobie lub pacjencie w pozycji stojącej. Umieść SGO w jamie ustnej, aby stymulować wysięk surowicy.

Rola pacjenta z HIV w tej demonstracji jest odgrywana przez asystenta badawczego. Bezcukrowy cukierek cytrynowy jest wygodny dla pacjentów z HIV, którzy często są bezzębnymi i nie mogą żuć gumy; należy go połykać w razie potrzeby przez pierwsze trzy minuty, a następnie przez kolejne trzy minuty zbierać ślinę z całej jamy ustnej do pojemnika na próbkę. Pozwoli to na uzyskanie około 2 ml śliny.

Jeśli ślina nie zostanie wykorzystana niezwłocznie, należy ją zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C; w dniu analizy próbkę należy ogrzać do 37°C. Po rozmrożeniu ślinę można przechowywać w temperaturze od 2 do 4°C przez maksymalnie trzy dni. Każdą próbkę oraz kontrolę należy nanieść w trzech powtórzeniach na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem; w celu przygotowania testu do każdego dołka z próbką i kontrolą należy dodać 130 µL buforu TBS.

Następnie, unikając kontaktu z mucyną, która jest lepka i nie zawiera wysięku surowiczego, przenieś 20 µL śliny do każdych z trzech dołków testowych oraz trzech dołków kontroli negatywnej. Następnie dodaj 20 µL TBS do dołków kontroli pozytywnej, mieszając za pomocą pipetowania.

Na tym etapie ważne jest, aby unikać mieszania w wstrząsarku vortex, które mogłoby spowodować powstanie pęcherzyków podczas pipetowania śliny, a także unikać pipetowania cząstek stałych i śluzu. Następnie należy dobrze wstrząsnąć roztworem roboczym dodatniego kontrolera elastazy trzustkowej (PPE), aby go wymieszać, a następnie dodać 50 µL do studzienek z próbkami i kontrolą dodatnią oraz do studzienek z kontrolą ujemną.

Dodaj 50 µL TBS. Mieszanie nie jest konieczne, ponieważ dodana objętość jest wystarczająco duża, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie w mieszaninie śliny. Inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji dodaj do każdej studzienki 50 µL roztworu roboczego substratu elastazy SA three NA. Następnie inkubuj przez kolejne 45 minut w temperaturze 23 °C. Po upływie 45 minut dodaj do każdej studzienki 50 µL roztworu roboczego Coomassie blue.

Następnie odczytaj absorbancję w czytniku mikropłytek przy 405 nm w celu wykrycia rozszczepienia SA trzy NA oraz przy 595 nm w celu wykrycia błękitu kumasi, który reprezentuje całkowitą zawartość białka. Aby obliczyć indeks alpha one PI, najpierw wykorzystaj poniższy wzór, aby uzyskać znormalizowaną absorbancję dla każdej długości fali, dzieląc różnicę między średnią z próbki a średnią z kontroli negatywnej przez różnicę między średnią z kontroli pozytywnej a średnią z kontroli negatywnej. Następnie, aby uzyskać indeks alpha one PI, podziel znormalizowaną absorbancję przy 405 nm przez znormalizowaną absorbancję przy 595 nm, jak pokazano tutaj, aby określić, czy test alpha może być odpowiedni do zastosowania jako test przesiewowy w punkcie opieki (point-of-care) do monitorowania liczby komórek CD4 w endemicznych regionach o ograniczonych zasobach.

Stymulowana ślina została pobrana od 20 kobiet i 11 mężczyzn z HIV 1, którzy zgłosili się na rutynową opiekę do kliniki w Kamerunie; zgodnie z wstępnymi obserwacjami podczas opracowywania testu alfa z użyciem śliny pobranej w Nowym Jorku, indeks alpha one PI oraz ślina pobrana w Kamerunie korelowały z liczbą CD4 z wartością R squared wynoszącą 0,91 i wartością P mniejszą niż 0,0001. Zależność tę określono za pomocą trójparametrowej krzywej sigmoidalnej, co jest zgodne z relacją dawka-odpowiedź. 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi.

W poprzednim badaniu ustaliliśmy, że limfocyty T CD4+ wykazują cykl sinusoidalny o periodyczności 23 ± 3,5 dnia u osób z HIV-1 oraz u osób z dziedzicznym wariantem niedoboru alfa-1-antytrypsyny (PIZZ). Przedstawiony tutaj przykład jest reprezentatywną analizą krzywej sinusoidalnej generowanej komputerowo dla cyklu CD4+ u zdrowej kontroli niezakażonej HIV, wykazującej periodyczność 27-dniową. Analiza krzywej sinusoidalnej generowanej komputerowo zmian limfocytów T CD4+ u sześciu badanych dostarczyła oczekiwanych wartości dla amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji. Oś oscylacji korelowała z amplitudą przy wartości R-kwadrat wynoszącej 0,96 i wartości p równej 0,009.

U pacjentów z niską liczbą limfocytów T CD4+ zmiany cykliczne w liczbie tych komórek były niewielkie, natomiast u pacjentów z wysoką liczbą limfocytów T CD4+ zmiany cykliczne były znaczne, ponieważ przedstawiona tutaj linia regresji szacuje oś oscylacji, a oś oscylacji jest skorelowana z amplitudą. Amplitudę dla linii regresji można obliczyć, aby oszacować, o ile powyżej i poniżej linii regresji spodziewane są wahania liczby limfocytów T CD4+ wynikające z cykliczności; po nałożeniu obliczonej amplitudy oraz przedziału ufności stwierdzono, że amplituda zaznaczona zieloną linią mieści się w 95% przedziale ufności zaznaczonym niebieską linią.

Po opanowaniu tej techniki, czas od momentu pobrania śliny do przekazania pacjentowi liczby komórek CD4 może wynieść 90 minut. Procedura ta jest przeznaczona do stosowania jako test przesiewowy do monitorowania liczby komórek CD4. Jeśli u pacjenta wystąpią istotne zmiany w liczbie komórek CD4, należy przeprowadzić dalszą diagnostykę z użyciem cytometrii przepływowej, aby potwierdzić poprawność pomiarów liczby komórek CD4 i pomóc w podjęciu decyzji terapeutycznych.

W kolejnym etapie rozwoju test z mikro płytki zostanie przekształcony w technologię pasków testowych, co umożliwi przeprowadzanie badań bez użycia aparatury lub energii elektrycznej. Przeniesienie HIV poprzez ślinę jest mało prawdopodobne, jednak pacjenci z HIV często cierpią na inne choroby zakaźne, takie jak gruźlica i wirusowe zapalenie wątroby typu C, dlatego należy pamiętać, że praca ze śliną – podobnie jak z krwią – może być niezwykle niebezpieczna ze względu na nieznane cząstki zakaźne. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i innego osobistego sprzętu ochrony indywidualnej.