Name: Test α: Szybkie bezkomórkowe liczenie CD4 przy użyciu całej śliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę α-test do szybkiego liczenia CD4 z użyciem całej śliny bez pobierania krwi. Ta technika umożliwia niedrogie monitorowanie HIV w warunkach polowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania były wspierane przez Harry Winston Research Foundation.

1. Przygotowanie świeżych roztworów roboczych
<ol>
	<li>TBS: 0,05 M roztwór soli buforowanej Trisem, pH 7,8 (TBS). Przygotować 60 ml TBS na płytkę mikrotitracyjną.</li>
	<li>PPE: Elastaza trzustkowa świńska, typ 1 (PPE) dostarczana jest w formie zawiesiny. Wstrząsnąć dokładnie i rozcieńczyć PPE w TBS do stężenia około 0,01 U/ml. Przygotować 6 ml roztworu roboczego na płytkę mikrotitracyjną.</li>
	<li>SA3NA: Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA3NA). Przygotować 0,1 M roztwór zapasowy SA3NA w dimetylosulfotlenku (DMSO) i użyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 6 ml roztworu roboczego na płytkę mikrotitracyjną poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego SA3NA 1/100 w TBS.</li>
	<li>COOMASSIE BLUE: Przygotować 10% roztwór zapasowy Coomassie Brilliant Blue R-250 (Coomassie Blue) w TBS i użyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C. Przygotować 6 ml roztworu roboczego poprzez rozcieńczenie roztworu zapasowego 1/1000 w TBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie śliny
<ol>
	<li>POBIERANIE ŚLINY: W pozycji stojącej pobudź wydzielanie surowicy do śliny, umieszczając w jamie ustnej sialogog, taki jak kwas cytrynowy lub guma do żucia. W przypadku pacjentów z HIV-1, którzy często są bezzębni i nie mogą żuć gumy, wygodnym rozwiązaniem jest bezcukrowy cukierek cytrynowy. Przez pierwsze 3 min połykaj ślinę w razie potrzeby, a przez kolejne 3 min zbieraj ślinę z całej jamy ustnej do zakręcanego kubka. Pozwoli to na uzyskanie około 2 ml śliny. Próbkę należy wykorzystać natychmiast lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>OBRÓBKA ŚLINY: Jeśli próbka była zamrożona, rozmrozić ją w temperaturze 37 °C i umieścić na lodzie. Świeżą lub rozmrożoną próbkę przechowywać w temperaturze 2-4 °C nie dłużej niż przez 3 dni. Nie mieszać śliny w vortexie i unikać pipetowania mucyn, które nie zawierają wysięku surowiczego. Podczas pracy ze śliną należy stosować standardowe środki ostrożności <a href="http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf" target="_blank">http://www.cdc.gov/hicpac/pdf/isolation/Isolation2007.pdf</a> .</li>
</ol>
3. Przygotowanie mikropłytki
<ol>
	<li>BUFOR: Pomiary wykonuje się w trzech powtórzeniach. Do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej dodaje się 130 μL TBS.</li>
	<li>PRÓBKI: Do każdego dołka testowego dodaje się 20 μL śliny, aby uzyskać objętość końcową 150 μl/dołek. Mieszamy poprzez pipetowanie, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>KONTROLE: Kontrola pozytywna zawiera PPE, ale nie zawiera śliny. Kontrola negatywna zawiera ślinę, ale nie zawiera PPE. Do dołka kontroli pozytywnej dodaje się 20 μL TBS. Do dołka kontroli negatywnej dodaje się 20 μL śliny.</li>
	<li>INKUBACJA PPE: Dobrze wstrząśnąć roztworem roboczym PPE. Do każdego dołka, z wyjątkiem dołków kontroli negatywnej, dodać 50 μL roztworu roboczego PPE. Do dołków kontroli negatywnej dodać 50 μL TBS. Inkubować przez 10 min w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>INKUBACJA SUBSTRATU: Do każdego dołka dodać 50 μL roztworu roboczego SA3NA. Inkubować przez 45 min w temperaturze 23 °C.</li>
	<li>COOMASSIE BLUE: Dodać 50 μL roztworu roboczego Coomassie Blue.</li>
	<li>ODCZYT: Odczytać absorbancję w czytniku płytek mikroprzestrzennych przy A405 nm w celu wykrycia rozszczepienia SA3NA, co reprezentuje aktywną α1PI, oraz przy A595 nm w celu wykrycia Coomassie Blue, co reprezentuje zawartość białek.</li>
</ol>
4. Oblicz indeks α1PI
<ol>
	<li>NORMALIZACJA ŚREDNICH A405 nm ORAZ A595 nm: Dla każdego pomiaru wykonanego w trzech powtórzeniach obliczyć średnią. Od średniej dla próbki odjąć średnią dla kontroli negatywnej. Aby zminimalizować różnice między płytkami, znormalizować średnie, dzieląc każdą średnią dla próbki przez średnią dla kontroli pozytywnej w następujący sposób: 
	 </li>
</ol>
<img alt="Wzór obliczania znormalizowanej absorbancji; metoda stosunku; równanie dla analizy spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/3999/3999eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
<ol start="2">
	<li>OBLICZ WSKAŹNIK α1PI INEX: Podziel znormalizowaną wartość A405 nm przez znormalizowaną wartość A595 nm: 
	 </li>
</ol>
<img alt="Wzór na równowagę statyczną; równanie indeksu α₁PI, znormalizowana absorbancja A405/A595 w spektroskopii." src="/files/ftp_upload/3999/3999eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2"> 
5. Reprezentatywne wyniki
Aby ustalić, czy test α może być odpowiedni do zastosowania jako szybki test przesiewowy w punkcie opieki (point-of-care) do monitorowania liczby limfocytów CD4 w regionach endemicznych o ograniczonych zasobach, pobrano stymulowaną ślinę od 20 kobiet i 11 mężczyzn zakażonych HIV-1, którzy zgłosili się do kliniki na rutynowe badania w Kamerunie. Zgodnie z wstępnymi obserwacjami poczynionymi podczas opracowywania testu α przy użyciu śliny pobranej w Nowym Jorku, indeks α1PI w ślinie pobranej w Kamerunie korelował z liczbą CD4 (r2=0,91, p&lt;0,0001. n=31). Zależność tę określono za pomocą trzymającej się parametrów krzywej sigmoidalnej, co jest spójne z zależnością dawka-odpowiedź (Rysunek 2A). 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi (Rysunek 2B).
W poprzednim badaniu ustaliliśmy, że limfocyty T CD4+ wykazują cykl sinusoidalny o periodyczności 23±3,5 dnia u osób z HIV-1 oraz u osób z dziedziczną postacią niedoboru α1PI (PIZZ)3. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przykład komputerowej analizy krzywej sinusoidalnej cykliczności CD4 u zdrowej kontroli bez HIV-1, wykazującej periodyczność 27 dni (Rycina 3A).
Analiza wygenerowanej komputerowo krzywej sinusoidalnej zmian liczby limfocytów T CD4+ u 6 badanych pozwoliła uzyskać wartości amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji3. Zgodnie z oczekiwaniami, oś oscylacji była skorelowana z amplitudą (r2=0,96, p=0,009, n=6) (Rycina 3B). U pacjentów z niską liczbą limfocytów T CD4+ cykliczne zmiany ich liczby były niewielkie, natomiast u pacjentów z wysoką liczbą limfocytów T CD4+ zmiany cykliczne były duże.
Ponieważ linia regresji przedstawiona na Ryc. 2 szacuje oś oscylacji, a oś oscylacji jest skorelowana z amplitudą, można obliczyć amplitudę dla linii regresji, szacując tym samym, o ile powyżej i poniżej linii regresji spodziewane są wahania limfocytów T CD4+ wynikające z cykliczności (Ryc. 3C). Po nałożeniu amplitudy obliczonej na Ryc. 3C oraz przedziału ufności obliczonego na Ryc. 2B stwierdzono, że amplituda (linia zielona) mieści się w 95% przedziale ufności (linia niebieska) (Ryc. 3D).
<img alt="Schemat procesu pobierania śliny i pomiaru absorbancji przy użyciu mikropłytki w celu wykrycia białek." src="/files/ftp_upload/3999/3999fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Podsumowanie procedury: Umieszczenie kwasu cytrynowego w jamie ustnej i pobranie śliny. Dodanie rozcieńczonej śliny do studzienek mikropłytki w trzech powtórzeniach. Dodanie PPE do każdej studzienki i inkubacja przez 15 min w 23 °C. Dodanie substratu PPE do każdej studzienki i inkubacja przez 45 min w 23 °C. Dodanie Coomassie Blue i odczyt przy 405 nm w celu wykrycia aktywności PPE oraz przy 595 nm w celu wykrycia białek.
<img alt="Wykres indeksu komórek CD4 i α1PI przedstawiający punkty danych i linie dopasowania; analiza badania immunologicznego." src="/files/ftp_upload/3999/3999fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie testu α ze standardową metodą zliczania komórek CD4. A) Test α przeprowadzono poprzez ilościowe oznaczenie indeksu α1PI w stymulowanej całej ślinie jam ustnej. Liczbę komórek CD4 oznaczono w niezależnym laboratorium medycznym przy użyciu standardowej cytometrii przepływowej. Krew do cytometrii przepływowej oraz ślinę pobrano podczas tej samej wizyty w klinice. Zależność między indeksem α1PI a liczbą komórek CD4 określono za pomocą 3-parametrycznej krzywej sigmoidalnej (r2=0,91, p&lt;0,0001, n=31). B) 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi.
<img alt="Wykresy analizy komórek CD4; A: fluktuacje tygodniowe, B-D: korelacja indeksu α1PI; wykres analizy danych." src="/files/ftp_upload/3999/3999fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dokładność obliczania liczby komórek CD4 przy użyciu indeksu α1PI. A) Komórki CD4+ T wykazywały cykle sinusoidalne z 27-dniową periodycznością u zdrowej kontroli niezakażonej HIV-1. Przedstawiono oś oscylacji (czerwona przerywana linia). B) Komputerowa analiza fali sinusoidalnej cykliczności limfocytów T CD4 została wykorzystana do obliczenia amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji u 4 pacjentów z HIV-1, 1 pacjenta z PIzz niezakażonego HIV-1 oraz u zdrowej kontroli niezakażonej HIV-1 przedstawionej w części A. Zależność między amplitudą limfocytów T CD4+ a osią oscylacji została określona przez 3-parametryczną krzywą sigmoidalną (r2=0,96, p=0,009, n=6). C) Zależność sigmoidalna między amplitudą a osią oscylacji wyprowadzona w części B) została wykorzystana do obliczenia oczekiwanej amplitudy (zielone linie) punktów wzdłuż linii regresji (czarna linia) z Rysunku 2. D) Przedział oczekiwanej amplitudy (zielone linie) różnił się znacząco od 95% przedziału ufności (niebieskie linie), co określono za pomocą testu suma rang Manna-Whitneya (na podstawie porównania mediany różnicy między 95% przedziałem ufności a linią regresji (63 komórki/μl) oraz mediany różnicy między linią amplitudy a linią regresji (37 komórek/μl); p=0,001).

<ol><li>Friedlander, Y., Kark, J. D., Eisenberg, S., Stein, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calculation+of+LDL-cholesterol+from+total+cholesterol%2C+triglyceride+and+HDL-cholesterol%3A+a+comparison+of+methods+in+the+Jerusalem+Lipid+Research+Clinic+Prevalence+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Isr.+J.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calculation of LDL-cholesterol from total cholesterol, triglyceride and HDL-cholesterol: a comparison of methods in the Jerusalem Lipid Research Clinic Prevalence Study.</a> Isr. J. Med. Sci. 18, 1242-1252 (1982).</li>
<li>Lapidot, T., Petit, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+of+stem+cell+mobilization%3A+The+roles+of+chemokines%2C+proteolytic+enzymes%2C+adhesion+molecules%2C+cytokines%2C+and+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines, and stromal cells.</a> Exp. Hematol. 30, 973-981 (2002).</li>
<li>Bristow, C. L. α1Antitrypsin therapy increases CD4+ lymphocytes to normal values in HIV-1 patients. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBristow%2C+CL+%22Soluble+factors+mediating+innate+immune+responses+to+HIV+infection%22">Soluble factors mediating innate immune responses to HIV infection</a>. Alfano, M. , Bentham Science Publishers. (2010).</li>
<li>Bristow, C. L., Patel, H., Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self+antigen+prognostic+for+human+immunodeficiency+virus+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Self antigen prognostic for human immunodeficiency virus disease progression.</a> Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8, 937-942 (2001).</li>
<li>Bristow, C. L., Babayeva, M. A., LaBrunda, M., Mullen, M. P., Winston, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B11Proteinase+Inhibitor+regulates+CD4%2B+lymphocyte+levels+and+is+rate+limiting+in+HIV-1+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">α1Proteinase Inhibitor regulates CD4+ lymphocyte levels and is rate limiting in HIV-1 disease.</a> PLoS One. , Forthcoming (2011).</li>
<li>de Almeida, P. D. V., Gregio, A. M. T., Machado, M. A. N., de Lima, A. A. S., Azevedo, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva+Composition+and+Functions%3A+A+Comprehensive+Review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Contemp.+Dent.+Pract%22%5BJournal%5D)">Saliva Composition and Functions: A Comprehensive Review.</a> J. Contemp. Dent. Pract. 9, 72-80 (2008).</li>
<li>Edgar, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saliva%3A+its+secretion%2C+composition+and+funcitons%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Dent.+J%22%5BJournal%5D)">Saliva: its secretion, composition and funcitons.</a> Br. Dent. J. , 172-305 (1992).</li>
<li>Bristow, C. L., Meo, F. di, Arnold, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activity+of+%CE%B11proteinase+inhibitor+and+++2macroglobulin+in+human+serum%3A+Application+to+insulin-dependent+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Specific activity of α1proteinase inhibitor and 2macroglobulin in human serum: Application to insulin-dependent diabetes mellitus.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 89, 247-259 (1998).</li>
<li>Pederson, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+levels+of+%CE%B12-macroglobulin%2C+%CE%B11-antitrypsin%2C+C-reactive+protein%2C+cathepsin+G+and+elastase+in+humans+with+or+without+destructive+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Salivary levels of α2-macroglobulin, α1-antitrypsin, C-reactive protein, cathepsin G and elastase in humans with or without destructive periodontal disease.</a> Arch. Oral Biol. 40, 1151-1155 (1995).</li>
<li>Shak, S., Capon, D. J., Hellmiss, R., Marsters, S. A., Baker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+DNase+I+reduces+the+viscosity+of+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Recombinant human DNase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum.</a> PNAS. 87, 9188-9192 (1990).</li>
<li>LeVeque, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicenter%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled%2C+dose-+titration+study+of+oral+pilocarpine+for+treatment+of+radiation-induced+xerostomia+in+head+and+neck+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Oncol%22%5BJournal%5D)">A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled, dose- titration study of oral pilocarpine for treatment of radiation-induced xerostomia in head and neck cancer patients.</a> J. Clin. Oncol. 11, 1124-1131 (1993).</li>
<li>Stevens, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+new+CD4+enumeration+technologies+for+resource-constrained+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluating new CD4 enumeration technologies for resource-constrained countries.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, S29-S38 (2008).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+ART+guidelines+for+adults+and+adolescents+-+evidence+map%22">2010 ART guidelines for adults and adolescents - evidence map</a>. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html">http://www.who.int/hiv/topics/treatment/evidence/en/index.html</a> (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Nierozcieńczona surowica zawiera medianowo 36 μM α1PI oraz 3,6 μM α2makroglobuliny (α2M), co stanowi 10-krotną różnicę 8. Oba białka konkurują o wiązanie z PPE. Te dwie właściwości – stężenie i powinowactwo do PPE – zostały wykorzystane do opracowania metody umożliwiającej specyficzne pomiary α1PI w normalnej surowicy w obecności konkurującej α2M 8. Metoda ta pozwala na wykrycie stężenia μ1PI już na poziomie 50 nM w 0,3% surowicy. Prz...

<table><tbody><tr><td>Sialogog, 0,05M kwas cytrynowy</td><td>Eda&amp;#8217;s Sugarfree Candies, 4900 Rear N.20th Street, Philadelphia, PA 19144</td><td>Sugar-Free Lemon dropS</td><td></td></tr><tr><td>Elastaza trzustkowa świńska, typ 1 (EC 3.4.21.36)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 63103</td><td>E1250</td><td></td></tr><tr><td>Succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4760</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytki 96-dołkowe, traktowane do hodowli tkankowych</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ 07417-1886</td><td>35-3072</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek z filtrami dla 405nm i 595nm</td><td>MTX Lab Systems, 8456 Tyco Road, Building D, Vienna, Virginia 22182</td><td>Dynex P97277</td><td></td></tr></tbody></table>

test &alpha;: szybkie bezkomórkowe oznaczanie liczby limfocytów cd4 z wykorzystaniem całej śliny

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

Istnieje pilna potrzeba zapewnienia przystępnego cenowo oznaczania liczby komórek CD4 w celu monitorowania przebiegu HIV. Oznaczanie liczby CD4 jest nieosiągalne w regionach o ograniczonych zasobach ze względu na ograniczenia czasowe i temperaturowe, zaawansowanie techniczne oraz koszt odczynników, w szczególności przeciwciał monoklonalnych służących do pomiaru CD4 na komórkach krwi, co obecnie stanowi jedyną akceptowalną metodę. Powszechnie stosowaną strategią laboratoryjną pozwalającą na oszczędność kosztów i czasu jest obliczanie, a nie mierzenie niektórych wartości krwi. Na przykład poziom LDL jest obliczany na podstawie zmierzonych poziomów cholesterolu całkowitego, HDL i tryglicerydów1. Zatem identyfikacja bezkomórkowych korelatów, które bezpośrednio regulują liczbę limfocytów T CD4+, mogłaby zapewnić dokładną metodę obliczania liczby CD4 ze względu na fizjologiczne znaczenie tych korelatów.
Liczba komórek macierzystych, które przedostają się do krwi i są przeznaczone do przekształcenia w krążące limfocyty T CD4+, jest określana przez chemokinę CXCL12 oraz jej receptor CXCR4 ze względu na ich wpływ na lokomocję2. Proces lokomocji komórek macierzystych do krwi jest dodatkowo regulowany przez powierzchniową elastazę leukocytarną człowieka (HLECS) oraz reaktywny wobec HLECS aktywny inhibitor α1proteinazy (α1PI, α1antytrypsyna, SerpinA1)3. W przebiegu zakażenia HIV-1 α1PI ulega inaktywacji w wyniku procesów chorobowych 4. W wczesnych, bezobjawowych stadiach zakażenia HIV-1 stwierdzono, że poziom aktywnego α1PI był poniżej normy u 100% nieleczonych pacjentów z HIV-1 (mediana=12 μM), a poziomy prawidłowe osiągano w stadiach objawowych4, 5. Wzorzec ten przypisano inaktywacji immunologicznej, a nie niewystarczającej syntezie, inaktywacji proteolitycznej lub utlenianiu. Zaobserwowaliśmy, że u osób z HIV-1 z liczbą &gt;220 komórek CD4/μl, liczba komórek CD4 korelowała z surowiczymi poziomami aktywnego α1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) oraz nieaktywnego α1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Podanie α1PI osobom zakażonym i niezakażonym HIV-1 doprowadziło do gwałtownego wzrostu liczby komórek CD4, co sugeruje, że α1PI bierze udział w regulacji liczby limfocytów T CD4+ we krwi 3.
Przy stymulacji ślina całkowita zawiera wystarczającą ilość eksudatu surowiczego (osocza zawierającego materiał białkowy, który przenika przez ściany naczyń krwionośnych do śliny), aby umożliwić pomiar aktywnej α1PI, a korelacja tego pomiaru stanowi dowód na to, że jest to dokładna metoda obliczania liczby komórek CD4. W skrócie, sialogogi, takie jak guma do żucia lub kwas cytrynowy, stymulują wysięk surowicy do śliny z całej jamy ustnej. Po stymulacji wysięku surowicy aktywność surowiczej α1PI w ślinie jest mierzona poprzez jej zdolność do hamowania aktywności elastazy. Elastaza trzustkowa świni (PPE) jest łatwo dostępnym i tanim źródłem elastazy. PPE wiąże się z α1PI, tworząc kompleks w stosunku jeden do jednego, co zapobiega rozszczepianiu specyficznych substratów przez PPE, jednym z których jest kolorymetryczny peptyd, sukcynylo-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilid (SA3NA). Inkubacja śliny z nasycającym stężeniem PPE przez 10 min w temperaturze pokojowej pozwala na związanie PPE z całą aktywną α1PI w ślinie. Wynikowe zahamowanie PPE przez aktywną α1PI można zmierzyć poprzez dodanie substratu PPE SA3NA. (Rycina 1). Chociaż liczby CD4 są mierzone w odniesieniu do objętości krwi (komórki CD4/μl), stężenie α1PI w ślinie jest powiązane ze stężeniem surowicy w ślinie, a nie z objętością śliny, ponieważ objętość ta może znacznie różnić się w ciągu dnia oraz między osobami6. Jednakże niemal wszystkie białka w ślinie pochodzą z zawartości surowicy, a zawartość białka w ślinie jest mierzalna7. Zatem aktywną α1PI w ślinie oblicza się jako stosunek do zawartości białka w ślinie, co określa się mianem indeksu α1PI. Wyniki przedstawione w niniejszym opracowaniu wykazują, że indeks α1PI stanowi dokładną i precyzyjną fizjologiczną metodę obliczania liczby komórek CD4.

Opisano metodę enumeracji CD4, tzw. α-test, która wykorzystuje pełną ślinę do szybkiego i dokładnego oznaczania liczby komórek CD4. α-test jest niezwykle tani i eliminuje konieczność specjalistycznego szkolenia technicznego, stosowania kosztownych odczynników, takich jak przeciwciała monoklonalne, użycia aparatury, chłodzenia, transportu próbek, a także pobierania i przetwarzania krwi.

Test &alpha;: Szybkie bezkomórkowe oznaczanie liczby limfocytów CD4 z wykorzystaniem całej śliny

Istnieje pilna potrzeba wprowadzenia przystępnych cenowo metod wyznaczania liczby limfocytów CD4 w celu monitorowania przebiegu zakażenia HIV. Wyznaczanie liczby CD4 jest niedostępne w regionach o ograniczonych zasobach ze względu na czas...

Istnieje pilna potrzeba opracowania przystępnej cenowo metody zliczania limfocytów CD4 w celu monitorowania przebiegu zakażenia HIV w regionach o ograniczonych zasobach. Niniejszy film prezentuje niskokosztowy test przesiewowy typu point-of-care, w którym liczba CD4 jest określana na podstawie obecności inhibitora proteinazy Alpha 1-PI w ślinie. W tym celu badanemu lub pacjentowi podaje się najpierw cukierek cytrynowy, aby pobudzić wydzielanie płynu surowiczego do śliny.Ślinę zbiera się do naczynia na próbkę, a następnie przenosi do płytki assay z 96 dołkami. Następnie do śliny dodaje się nasycającą ilość białka proteinazy – porcine pancreatic elastase, która wiąże i hamuje alpha one pi. W kolejnym kroku dodaje się kolorymetryczny substrat elastazy.Pozostała niezwiązana elastaza rozszczepia substrat, co powoduje zmianę barwy z przezroczystej na żółtą. Do dołków dodaje się błękit Kumasi w celu zabarwienia całkowitego białka, a następnie za pomocą czytnika mikropłytek wykonuje się pomiary kolorymetryczne. Ostatecznie wyznacza się stosunek alfa 1-antytrypsyny do całkowitego białka i wykorzystuje go do dokładnej oceny liczby limfocytów CD4 na podstawie wartości indeksu.Technika ta wykazuje kilka zalet w porównaniu z istniejącą metodą, jaką jest cytometria przepływowa. Badanie można przeprowadzić w terenie bez pobierania krwi, co jest traumatyzujące i kosztowne, bez użycia drogich przeciwciał monoklonalnych, bez konieczności posiadania specjalistycznego wykształcenia technicznego oraz bez potrzeby chłodzenia lub transportu próbek. Metoda ta przełamuje krytyczną barierę w interwencjach przeciwko AIDS i powinna mieć istotny wpływ na koszty i wyniki zdrowotne pacjentów oraz częstotliwość transmisji HIV, co w konsekwencji ma znaczący wpływ na gospodarkę światową.Metoda ta może dostarczyć informacji o tym, w jaki sposób Alpha i PI regulują liczbę limfocytów T CD4 poprzez adhezję i migrację, ale może być również zastosowana do innych układów, na przykład do badania tego, jak inhibitory innych białek regulują adhezję i migrację innych typów komórek. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy odkryliśmy, że poziom Alpha 1 PI u pacjentów z zakażeniem HIV jest tak niski, że w rzeczywistości ogranicza on liczbę limfocytów T CD4 przedostających się do krwi. Protokół należy rozpocząć od przygotowania niezbędnych roztworów roboczych dla każdej z używanych mikropłytek.Przygotuj 60 mililitrów 0,05 molarnego buforu TBS (tris-buffered saline) o pH 7,8. Ponadto, dla każdej mikropłytki, przygotuj sześć mililitrów porcine pancreatic elastase typu pierwszego (PPE). Dobrze wymieszaj zawiesinę PPE, a następnie rozcieńcz ją w TBS do stężenia około 0,01 jednostek na mililitr.Następnie należy przygotować 0,1 molarny roztwór zapasu substratu kolorymetrycznego SA three NA w DMSO. Roztwór zapasu ten należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20°C, jeśli nie będzie użyty od razu. Przygotuj sześć mililitrów roztworu roboczego dla każdej mikropłytki, rozcieńczając go w stosunku 1:100 w TBS. Na koniec przygotuj roztwór zapasu 10% kumasi brilliant blue R two 50 w TBS i zużyj go natychmiast lub przechowuj w temperaturze -20°C, jeśli nie będzie użyty od razu.Przygotuj sześć mililitrów dla każdej mikropłytki, rozcieńczając roztwór stokowy 1:1000 w buforze TBS. Podczas pracy ze śliną ważne jest zachowanie odpowiednich środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego, przy badanej osobie lub pacjencie w pozycji stojącej. Umieść SGO w jamie ustnej, aby stymulować wysięk surowicy.Rola pacjenta z HIV w tej demonstracji jest odgrywana przez asystenta badawczego. Bezcukrowy cukierek cytrynowy jest wygodny dla pacjentów z HIV, którzy często są bezzębnymi i nie mogą żuć gumy; należy go połykać w razie potrzeby przez pierwsze trzy minuty, a następnie przez kolejne trzy minuty zbierać ślinę z całej jamy ustnej do pojemnika na próbkę. Pozwoli to na uzyskanie około 2 ml śliny.Jeśli ślina nie zostanie wykorzystana niezwłocznie, należy ją zamrozić i przechowywać w temperaturze -80°C; w dniu analizy próbkę należy ogrzać do 37°C. Po rozmrożeniu ślinę można przechowywać w temperaturze od 2 do 4°C przez maksymalnie trzy dni. Każdą próbkę oraz kontrolę należy nanieść w trzech powtórzeniach na 96-dołkową płytkę z płaskim dnem; w celu przygotowania testu do każdego dołka z próbką i kontrolą należy dodać 130 µL buforu TBS.Następnie, unikając kontaktu z mucyną, która jest lepka i nie zawiera wysięku surowiczego, przenieś 20 µL śliny do każdych z trzech dołków testowych oraz trzech dołków kontroli negatywnej. Następnie dodaj 20 µL TBS do dołków kontroli pozytywnej, mieszając za pomocą pipetowania.Na tym etapie ważne jest, aby unikać mieszania w wstrząsarku vortex, które mogłoby spowodować powstanie pęcherzyków podczas pipetowania śliny, a także unikać pipetowania cząstek stałych i śluzu. Następnie należy dobrze wstrząsnąć roztworem roboczym dodatniego kontrolera elastazy trzustkowej (PPE), aby go wymieszać, a następnie dodać 50 µL do studzienek z próbkami i kontrolą dodatnią oraz do studzienek z kontrolą ujemną.Dodaj 50 µL TBS. Mieszanie nie jest konieczne, ponieważ dodana objętość jest wystarczająco duża, aby umożliwić równomierne rozprowadzenie w mieszaninie śliny. Inkubuj płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji dodaj do każdej studzienki 50 µL roztworu roboczego substratu elastazy SA three NA. Następnie inkubuj przez kolejne 45 minut w temperaturze 23 °C. Po upływie 45 minut dodaj do każdej studzienki 50 µL roztworu roboczego Coomassie blue.Następnie odczytaj absorbancję w czytniku mikropłytek przy 405 nm w celu wykrycia rozszczepienia SA trzy NA oraz przy 595 nm w celu wykrycia błękitu kumasi, który reprezentuje całkowitą zawartość białka. Aby obliczyć indeks alpha one PI, najpierw wykorzystaj poniższy wzór, aby uzyskać znormalizowaną absorbancję dla każdej długości fali, dzieląc różnicę między średnią z próbki a średnią z kontroli negatywnej przez różnicę między średnią z kontroli pozytywnej a średnią z kontroli negatywnej. Następnie, aby uzyskać indeks alpha one PI, podziel znormalizowaną absorbancję przy 405 nm przez znormalizowaną absorbancję przy 595 nm, jak pokazano tutaj, aby określić, czy test alpha może być odpowiedni do zastosowania jako test przesiewowy w punkcie opieki (point-of-care) do monitorowania liczby komórek CD4 w endemicznych regionach o ograniczonych zasobach.Stymulowana ślina została pobrana od 20 kobiet i 11 mężczyzn z HIV 1, którzy zgłosili się na rutynową opiekę do kliniki w Kamerunie; zgodnie z wstępnymi obserwacjami podczas opracowywania testu alfa z użyciem śliny pobranej w Nowym Jorku, indeks alpha one PI oraz ślina pobrana w Kamerunie korelowały z liczbą CD4 z wartością R squared wynoszącą 0,91 i wartością P mniejszą niż 0,0001. Zależność tę określono za pomocą trójparametrowej krzywej sigmoidalnej, co jest zgodne z relacją dawka-odpowiedź. 95% przedziały ufności i predykcji przedstawiono odpowiednio liniami niebieskimi i czerwonymi.W poprzednim badaniu ustaliliśmy, że limfocyty T CD4+ wykazują cykl sinusoidalny o periodyczności 23 ± 3,5 dnia u osób z HIV-1 oraz u osób z dziedzicznym wariantem niedoboru alfa-1-antytrypsyny (PIZZ). Przedstawiony tutaj przykład jest reprezentatywną analizą krzywej sinusoidalnej generowanej komputerowo dla cyklu CD4+ u zdrowej kontroli niezakażonej HIV, wykazującej periodyczność 27-dniową. Analiza krzywej sinusoidalnej generowanej komputerowo zmian limfocytów T CD4+ u sześciu badanych dostarczyła oczekiwanych wartości dla amplitudy szczyt-szczyt oraz osi oscylacji. Oś oscylacji korelowała z amplitudą przy wartości R-kwadrat wynoszącej 0,96 i wartości p równej 0,009.U pacjentów z niską liczbą limfocytów T CD4+ zmiany cykliczne w liczbie tych komórek były niewielkie, natomiast u pacjentów z wysoką liczbą limfocytów T CD4+ zmiany cykliczne były znaczne, ponieważ przedstawiona tutaj linia regresji szacuje oś oscylacji, a oś oscylacji jest skorelowana z amplitudą. Amplitudę dla linii regresji można obliczyć, aby oszacować, o ile powyżej i poniżej linii regresji spodziewane są wahania liczby limfocytów T CD4+ wynikające z cykliczności; po nałożeniu obliczonej amplitudy oraz przedziału ufności stwierdzono, że amplituda zaznaczona zieloną linią mieści się w 95% przedziale ufności zaznaczonym niebieską linią.Po opanowaniu tej techniki, czas od momentu pobrania śliny do przekazania pacjentowi liczby komórek CD4 może wynieść 90 minut. Procedura ta jest przeznaczona do stosowania jako test przesiewowy do monitorowania liczby komórek CD4. Jeśli u pacjenta wystąpią istotne zmiany w liczbie komórek CD4, należy przeprowadzić dalszą diagnostykę z użyciem cytometrii przepływowej, aby potwierdzić poprawność pomiarów liczby komórek CD4 i pomóc w podjęciu decyzji terapeutycznych.W kolejnym etapie rozwoju test z mikro płytki zostanie przekształcony w technologię pasków testowych, co umożliwi przeprowadzanie badań bez użycia aparatury lub energii elektrycznej. Przeniesienie HIV poprzez ślinę jest mało prawdopodobne, jednak pacjenci z HIV często cierpią na inne choroby zakaźne, takie jak gruźlica i wirusowe zapalenie wątroby typu C, dlatego należy pamiętać, że praca ze śliną – podobnie jak z krwią – może być niezwykle niebezpieczna ze względu na nieznane cząstki zakaźne. Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak noszenie rękawiczek i innego osobistego sprzętu ochrony indywidualnej.

the-test-rapid-cell-free-cd4-enumeration-using-whole-saliva

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test α: Szybkie oznaczanie liczby komórek CD4 bezkomórkowych z wykorzystaniem całej śliny

Test tworzenia kolonii (CFC) to badanie in vitro, w którym komórki progenitorowe krwiotwórcze tworzą kolonie w podłożu półstałym. Do oceny zdolności progenitorów do proliferacji i różnicowania się wzdłuż różnych linii krwiotwórczych wykorzystuje się kombinację analizy morfologii kolonii, morfologii komórek oraz cytometrii przepływowej.

Test tworzenia kolonii (CFC) dla ludzkich komórek krwiotwórczych

Terapia antyretrowirusowa w leczeniu HIV/AIDS jest monitorowana na szeroką skalę w RPA. Cytometria przepływowa jest łączona z badaniami hematologicznymi (CD45), immunologicznymi (CD4) oraz analizą CD38 powiązaną z wiremią. Metody te, zarejestrowane w laboratoriach NHLS-SA w Johannesburgu, są nowoczesne, kostu-efektywne i charakteryzują się wzmocnioną lokalną kontrolą jakości, stanowiąc wzór dla diagnostyki w warunkach ograniczonych zasobów.

Kompleksowy i efektywny kosztowo monitoring laboratoryjny HIV/AIDS: afrykański wzór do naśladowania

Ilościowe oznaczenie poziomu RNA HIV-1 w osoczu oraz sekwencjonowanie pojedynczych genomów HIV-1 u osób z wiremią poniżej granicy wykrywalności (50-75 kopii/ml) jest trudne. W niniejszym materiale opisujemy sposób izolacji i oznaczania ilościowego wirusowego RNA z osocza przy użyciu testu real-time PCR, który wiarygodnie mierzy poziom RNA HIV-1 aż do 0,3 kopii/ml, a także metodę amplifikacji genomów wirusowych poprzez sekwencjonowanie pojedynczych genomów z próbek o bardzo niskiej ładunku...

Amplifikacja i kwantyfikacja RNA HIV-1 u osób zakażonych HIV z ładunkiem wirusowym poniżej granicy wykrywalności standardowych testów klinicznych

Komórki Treg są potężnymi supresorami układu odpornościowego. Brakuje unikalnych markerów powierzchniowych pozwalających na ich zdefiniowanie, dlatego definicje Treg opierają się przede wszystkim na ich funkcji. W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany test in vitro, który umożliwia identyfikację zaburzeń równowagi immunologicznej u osób zagrożonych rozwojem cukrzycy typu 1 (T1D).

Supresja ludzkich komórek in vitro jako narzędzie przesiewowe do rozpoznawania wczesnego stanu niezrównoważenia immunologicznego

W niniejszym raporcie przedstawiamy etapy barwienia i analizy w badaniu fenotypowania przeprowadzonym na świeżej krwi pełnej w celu zliczenia głównych populacji leukocytów wrodzonych i adaptacyjnych. Kładziemy szczególny nacisk na kwestie związane z wykonywaniem tych procedur w kontekście wieloośrodkowego badania klinicznego.

Wyliczanie głównych populacji leukocytów krwi obwodowej w wieloośrodkowych badaniach klinicznych z wykorzystaniem analizy fenotypowej krwi pełnej

Ten film pokazuje obrazowanie żywych komórek do analizy aktywności przeciwgrzybiczej u ludzkich neutrofili przy użyciu fluorescencyjnych konidiów reporterowych Aspergillus. Początkowo w neutrofilach wykrywana jest zarówno czerwona, jak i purpurowa fluorescencja, podczas gdy czerwona fluorescencja zmniejsza się z czasem, co wskazuje na degradację konidiów i potwierdza aktywność przeciwgrzybiczą neutrofili.

Ocena w czasie rzeczywistym aktywności przeciwgrzybiczej pierwotnych ludzkich komórek odpornościowych

Opracowaliśmy test in vitro, aby zbadać rolę szlaków immunoregulacyjnych w regulacji wydzielania cytokin przez limfocyty T CD4 specyficzne dla HIV.

In vitro Test do oceny wpływu szlaków immunoregulacyjnych na funkcję efektora limfocytów T CD4 specyficznych dla HIV

W przeciwieństwie do bezkomórkowych cząsteczek HIV-1, zakażone limfocyty T CD4+ są skutecznie wykrywane przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne (pDC). Niniejszy manuskrypt opisuje metodę, w której jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) lub izolowane pDC są hodowane wspólnie z limfocytami T zakażonymi wirusem HIV-1 w celu oceny wrodzonego wykrywania przez pDC, oceniane przez uwalnianie IFN typu I.

Ocena wrodzonego wyczuwania limfocytów T CD4 + zakażonych wirusem HIV-1 przez plazmocytoidalne komórki dendrytyczne przy użyciu systemu kohodowli ex vivo.

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Prezentowany tutaj jest protokół pomiaru proliferacji limfocytów T CD4+ w odpowiedzi na antygenowe białka lub peptydy za pomocą rozcieńczenia barwnika. Test ten jest szczególnie czuły w przypadku rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu i może być modyfikowany w celu ułatwienia klonowania komórek specyficznych dla antygenu.

Kwantyfikacja proliferujących ludzkich limfocytów T CD4 + specyficznych dla antygenu przy użyciu estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny

Mleko matki przenosi ludzkiego wirusa niedoboru odporności (HIV), chociaż tylko ~15% niemowląt karmionych piersią przez matki zakażone wirusem HIV ulega zakażeniu. Niemowlęta karmione piersią spożywają ~105−108 leukocytów matki dziennie, chociaż komórki te są niedostatecznie zbadane. Tutaj opisujemy izolację leukocytów mleka matki i analizę ich zdolności fagocytarnej.

Izolacja leukocytów z mleka matki do stosowania w zależnym od przeciwciał teście fagocytozy komórkowej celów HIV

Poznaj metodę α-test do szybkiego liczenia CD4 z użyciem całej śliny bez pobierania krwi. Ta technika umożliwia niedrogie monitorowanie HIV w warunkach polowych.

Test α: Szybkie bezkomórkowe oznaczanie liczby limfocytów CD4 z wykorzystaniem całej śliny

Przeglądaj więcej filmów