Name: Wsteczne obciążenie nerwów, dróg i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Poznaj prostą i niedrogą technikę wstecznego barwienia neuronów fluorescencyjnymi oraz wrażliwymi na wapń barwnikami przy użyciu polietylenowej pipety ssącej. Metoda umożliwia skuteczne wprowadzanie wysokich stężeń barwników do określonych populacji nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez program wewnętrzny Narodowych Instytutów Zaburzeń Neurologicznych i Udaru w ramach Narodowych Instytutów Zdrowia. Chcielibyśmy również podziękować dr. George'owi Mentisowi za jego wcześniejszy wkład w opracowanie metody oraz dane przedstawione na Rysunku 3.

Fluorescencyjne dekstrany były wykorzystywane jako narzędzia anatomiczne oraz do obrazowania aktywności neuronalnej1-4. Fields i in. al., (2009)4 opublikowano protokół dotyczący stosowania barwników czułych na jony i napięcie w obrębie traktów aksonalnych, z uwzględnieniem rdzenia kręgowego jako układu modelowego. Poniżej opisujemy szczegółową procedurę aplikacji barwników fluorescencyjnych i/lub czułych na jony do przeciętych korzeni brzusznych, korzeni grzbietowych lub dowolnego traktu neuronalnego rdzenia kręgowego w celu in vitro badania optofizjologiczne i morfologiczne.
1. Pipety typu I i typu II
Rozpocznij od ogrzania dwóch krótkich odcinków rurek polietylenowych (PE90, marka Clay Adams) nad płomieniem lampy alkoholowej7, aby wytworzyć pipety z zwężającymi się końcówkami. Pierwsza pipeta (typ I) powinna być krótka (3-7 mm) i posiadać małą końcówkę, która może ściśle objąć docelowy korzeń lub szlak (średnica zewnętrzna: 0,2-0,4 mm; średnica wewnętrzna: 0,1-0,3 mm). Następnie wytwór drugą pipetę (typ II) z dłuższą (8-12 cm), cieńszą trzonową częścią i bardzo cienką końcówką (średnica zewnętrzna: 0,2-0,3 mm; średnica wewnętrzna: 0,1-0,2 mm), która może zostać wprowadzona do pipety typu I aż do jej końca. Druga, cieńsza pipeta będzie służyć odpowiednio do aspiracji i wprowadzania sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) oraz roztworu barwnika przez pipetę typu I.
2. Pozycjonowanie pipety typu I
Przeprowadzić sekcję i wyizolować rdzeń kręgowy8,9, a następnie umieścić go w kąpieli z ciągłym przepływem schłodzonego aCSF (~16 °C) podczas całego procesu ładowania. Umieścić pipetę typu I w uchwycie do elektrod (uchwyt do elektrod H1/12, Narishige) w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z strzykawką (strzykawka insulinowa 1ml U-100, Becton Dickenson lub odpowiednik) za pomocą elastycznego przewodu (PharMed BPT, Cole-Parmer, #AY242002; 10 cm) (Rys.1A-B).
 
3. Aplikacja barwnika
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki należy najpierw nabrać aCSF do pipety typu I (Rys. 1B; 2A), a następnie do wypełnianego traktu aksonalnego lub korzenia (Rys. 2B). Następnie należy usunąć elastyczną rurkę z tylnego otworu. Pipetę typu II podłącza się do drugiej strzykawki i wprowadza do pipety typu I utrzymującej trakt aksonalny lub korzeń. Używając strzykawki podłączonej do pipety typu II, należy odessać aCSF w taki sposób, aby pozostały płyn jedynie pokrywał trakt aksonalny (Rys. 1C; 2C-D). Następnie należy wyciągnąć pipetę typu II z pipety typu I. Poziom aCSF należy monitorować przez kilka minut, aby zweryfikować szczelność zamknięcia traktu aksonalnego lub nerwów (patrz sekcja 3 w Rozwiązywaniu problemów pod hasłem „szczelność”).</li>
	<li>Barwnik należy rozpuścić w aCSF lub 0,2% triton X-100 w wodzie dwukrotnie destylowanej i nabrać go do pipety typu II, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Pipetę typu II zawierającą barwnik należy wprowadzić do pipety typu I oraz do pozostałego roztworu aCSF (Rys. 2E). Barwnik należy powoli uwalniać do aCSF, stosując delikatne ciśnienie dodatnie (Rys. 2F). Należy uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza i nie spowodować przemieszczenia tkanki docelowej wewnątrz końcówki. Pipetę typu II należy wycofać po uwolnieniu odpowiedniej ilości barwnika (3-5 μL roztworu barwnika).</li>
</ol>
4. Inkubacja
Inkubuj tkankę w ciemności od 6 do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie czasu wystarczającego do wypełnienia, delikatnie wyciągnij elektrodę z tkanki, pozostawiając ją w stanie gotowym do obrazowania lub analizy histologicznej.
Rozwiązywanie problemów
<ol>
	<li>Jeśli tkanka docelowa nie wchodzi łatwo do końcówki pipety typu I lub jest luźna po wprowadzeniu, oznacza to, że średnica końcówki jest niewłaściwa. W takim przypadku wyciągnij ją i użyj innej pipety.</li>
	<li>Przed dodaniem barwnika do aCSF w pipecie typu I upewnij się, że pozostało wystarczająco dużo aCSF, aby można go było dosięgnąć końcówką pipety typu II (Rys. 2D). W przeciwnym razie po dodaniu barwnika powstanie przerwa powietrzna. Jeśli tak się stanie, nie dodawaj barwnika, wyjmij wiązkę aksonalną z pipety, a następnie ponownie ją wprowadź z wystarczającą ilością aCSF, aby była dostępna dla pipety typu II.</li>
	<li>Jeśli poziom aCSF w pipecie typu I wzrośnie po aspiracji pipetą typu II, oznacza to, że uszczelnienie z tkanką jest niedostateczne. Użyj innej elektrody, w przeciwnym razie barwnik zostanie rozcieńczony podczas procedury znakowania.</li>
	<li>Jeśli podczas wstrzykiwania barwnika do pipety typu I zostanie wprowadzony pęcherzyk powietrza, usuń go, przesuwając końcówkę pipety typu II blisko pęcherzyka i delikatnie przykładając słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Aby zilustrować zastosowanie tej metody, jednocześnie wprowadziliśmy do neuronów ruchowych, aferentnych neuronów sensorycznych i interneuronów rdzeniowych trzy różne barwniki fluorescencyjne sprzężone z dekstranem (Ryc. 3A). Jak pokazano na Ryc. 3B, oznakowano trzy klasy neuronów: aferentne neurony sensoryczne (czerwone), interneurony rzutujące do sznura brzusznego (zielone) oraz neurony ruchowe (niebieskie).
<img alt="Schemat układu do mikrowstrzykiwania z wykorzystaniem pipety; elastyczna rurka elastomerowa; połączenie ze strzykawką." src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat przedstawiający montaż pipet typu I i typu II. (A) Pipeta typu I (jasnoniebieska) jest umieszczona w uchwycie elektrody w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z elastyczną rurką elastomerową (B), w którą można włożyć pipetę typu II (C).
<img alt="Schemat dostarczania leku do nerwu rdzeniowego, układ rurek elastomerowych, proces aplikacji barwnika." src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Schemat przedstawiający proces ładowania motoneuronów barwnikami fluorescencyjnymi. (A) Pipeta typu I zostaje umieszczona w pobliżu korzenia brzusznego, który ma zostać wypełniony. (B) Do pipety przyłożone zostaje podciśnienie, aby wciągnąć aCSF do pipety, a następnie korzeń. (C-D) Odłącz elastyczną rurkę elastomerową z tylnej części pipety typu I i zmniejsz ilość aCSF, przykładając podciśnienie do pipety typu II. (E) Wprowadź końcówkę pipety typu II zawierającej rozpuszczony barwnik do pozostałego w pipecie typu I roztworu aCSF. (E-F) Powoli wypełnij pipetę typu I barwnikiem, a następnie wyjmij pipetę typu II.
<img alt="Schemat rdzenia kręgowego z fluorescencyjnymi znacznikami dekstranowymi; wizualizacja szlaku nerwowego na poziomie rostralnym S4." src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Zastosowanie procedury wypełniania w izolowanym rdzeniu kręgowym myszy. (A) Schemat przedstawiający trzy pipety typu I użyte do wypełnienia różnych klas neuronów w rdzeniu kręgowym. Motoneurony (niebieskie; Cascade Blue dextran) oraz sakralne aferentne neurony sensoryczne (czerwone; Texas-Red dextran) zostały wypełnione metodą wsteczną odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Dekstran z fluoresceiną zastosowano do obciążenia interneuronów rdzeniowych (zielone), których aksony biegną wstępująco przez sznur brzuszny (VF). 1 mg każdego barwnika dekstranowego (10 000MW; Molecular Probes) rozpuszczono w 6 μL wody destylowanej zawierającej 0,2% Triton X-100 (B). Obraz konfokalny przekroju rdzenia sakralnego, w którym neurony zostały znakowane wstecznie zgodnie z opisem w punkcie A. Należy zauważyć, że znakowane aferenty sensoryczne są głównie ipsilateralne z nielicznymi projekcjami kontralateralnymi. Znakowane motoneurony znajdują się po stronie ipsilateralnej w stosunku do wypełnionego korzenia brzusznego, natomiast znakowane interneurony znajdują się po stronie kontralateralnej względem strony wypełnienia (grot strzałki). Pasek kalibracyjny 200 μm.

<ol><li>Nance, D. M., Burns, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextrans+as+sensitive+anterograde+neuroanatomical+tracers%3A+applications+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls.</a> Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).</li>
<li>Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+dextran-amines+used+as+axonal+tracers+in+the+nervous+system+of+the+chicken+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo.</a> J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).</li>
<li>McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+neuronal+activity+in+tissue+labeled+by+retrograde+transport+of+Calcium+Green+Dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran.</a> Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).</li>
<li>Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+nervous+system+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Imaging nervous system activity.</a> Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3(2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+neurons+retrogradely+and+anterogradely+labelled+with+calcium-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes.</a> J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).</li>
<li>Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-sensitive+dye+recording+using+retrogradely+transported+dye+in+the+chicken+spinal+cord%3A+staining+and+signal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).</li>
<li>Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology+II%3A+Extracellular+Suction+Electrode+Fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication.</a> J. Vis. Exp. (48), e2580(2011).</li>
<li>Smith, J. C., Feldman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+brainstem-spinal+cord+preparations+for+study+of+motor+systems+for+mammalian+respiration+and+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion.</a> J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).</li>
<li>Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+Cord+Electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spinal Cord Electrophysiology.</a> J. Vis. Exp. (35), e1660(2010).</li>
<li>Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+reduced+sensorimotor+connections+form+with+normal+specificity+despite+abnormal+muscle+spindle+development%3A+the+role+of+spindle-derived+neurotrophin+3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3.</a> J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).</li>
<li>Mentis, G. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+functional+impairment+of+sensory-motor+connectivity+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neuron. 69, 453-467 (2011).</li>
<li>Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+sacral+neurons+involved+in+activation+of+the+lumbar+central+pattern+generator+for+locomotion+in+the+neonatal+rodent+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Soc.+Neurosci.+Abstr%22%5BJournal%5D)">Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord.</a> Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).</li>
<li>O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+spatiotemporal+organization+of+neural+activity+in+the+developing+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord.</a> Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).</li>
<li>Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+patterns+of+vestibular-mediated+synaptic+inputs+to+axial+and+limb+motoneurons+in+the+neonatal+mouse+assessed+by+optical+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording.</a> J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).</li>
<li>Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj prosty i tani protokół wprowadzania barwników do neuronów, nerwów i szlaków rdzeniowych. Metoda ta polega na wystawieniu zidentyfikowanych dróg anatomicznych na działanie wysoce stężonego roztworu barwnika przez cały czas trwania procesu obciążania. Skutkuje to znakowaniem wstecznym miejsca docelowego przy niewielkim poziomie tła w porównaniu do mikroiniekcji, aplikacji kąpielowej oraz technik elektroporacji. Metoda ta jest jednak ograniczona do miejsc w układzie nerwowym, w których można wyizolować pęcz...

retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Retrogradne znakowanie neuronów jest standardową metodą anatomiczną1,2, która była wykorzystywana również do wprowadzania do neuronów barwników wrażliwych na wapń i napięcie3-6. Zazwyczaj barwniki te aplikuje się w postaci stałych kryształów lub poprzez lokalne wstrzyknięcie pod ciśnieniem za pomocą pipet szklanych. Może to jednak prowadzić do rozcieńczenia barwnika i zmniejszenia intensywności znakowania, szczególnie gdy dyfuzja barwnika wymaga kilku godzin. W niniejszej pracy prezentujemy prostą i niedrogą technikę wprowadzania barwników fluorescencyjnych i jonowo-wrażliwych do neuronów z użyciem polietylenowej pipety ssącej wypełnionej roztworem barwnika. Metoda ta stanowi niezawodny sposób utrzymania wysokiego stężenia barwnika w kontakcie z aksonami przez cały czas trwania procedury wprowadzania.

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Retrogradne znakowanie neuronów jest standardową metodą anatomiczną1,2, która była również wykorzystywana do wprowadzania do neuronów barwników wrażliwych na wapń i napięcie3-6. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wprowadzenie wysokiego stężenia barwnika fluorescencyjnego lub czułego na jony do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego przy użyciu prostej i taniej techniki. Osiąga się to poprzez wstępne wykonanie dwóch rodzajów pipet: typu pierwszego i typu drugiego. Następnie do pipety typu pierwszego podłącza się elastyczną rurkę elastomerową i przykłada nadciśnienie, aby zassać docelowy szlak neuronalny do wnętrza pipety typu pierwszego, upewniając się przy tym, że uzyskano szczelne połączenie.Następnie włożyć pipetę typu dwa do pipety typu jeden i za pomocą pipety typu dwa odessać pozostały A CSF z pipety typu jeden. Następnie wprowadzić barwnik do pipety typu jeden, dbając o to, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Ostatnim krokiem jest inkubacja neuronów w ciemności przez okres od 6 do 20 godzin.Ostatecznie, po usunięciu pipety typu pierwszego, preparat jest gotowy do badań in vitro, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak aplikacja kąpielowa, wstrzykiwanie BOS i elektroporacja, jest dostarczenie D do określonej populacji neuronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuronauki, dotyczące m.in. aktywności, łączności, morfologii i rozmieszczenia określonych neuronów.Zasadniczo technika ta wymaga wprawy, w szczególności w zakresie zapewnienia, aby barwnik nie uległ rozcieńczeniu w pipecie typu pierwszego i aby do jej wnętrza nie dostały się pęcherzyki powietrza. Należy rozpocząć tę procedurę od wyciągnięcia rurki polietylenowej nad płomieniem lampy alkoholowej, aby uzyskać dwie krótkie pipety o zwężonych końcach. W pierwszej kolejności należy wyciągnąć krótką pipetę typu pierwszego z małą końcówką, która będzie w stanie ściśle utrzymać docelowy korzeń lub trakt.Następnie należy pobrać pipetę typu dwa z dłuższym, cieńszym trzoniem i bardzo cienką końcówką, którą można wsunąć do pipety typu jeden aż do jej wierzchołka. Następnie pipetę typu dwa należy połączyć z igłą 19 gauge zamocowaną do EC. Po tym czasie wyizolowany rdzeń kręgowy należy umieścić w kąpieli.Przez cały proces ładowania należy przemywać go schłodzonym A CSF. Następnie należy umieścić pipetę typu jeden w uchwycie do elektrod w taki sposób, aby jej tylny otwór można było łatwo połączyć z strzykawką za pomocą elastycznego przewodu. W tej procedurze najpierw należy zaciągnąć A CSF do pipety typu jeden za pomocą strzykawki.Następnie narysuj trakt aksonalny lub korzeń, który ma zostać wypełniony. Potem usuń elastyczny przewód z tylnego otworu. Po tym kroku podłącz pipetę typu dwa do kolejnej strzykawki.Wprowadź ją do pipety typu jeden, która utrzymuje trakt aksonalny lub korzeń neuronowy pod mikroskopem. Użyj strzykawki przymocowanej do pipety typu dwa, aby odessać A CSF w taki sposób, by pozostałe A CSF ledwo pokrywało trakt aksonalny. Następnie wycofaj pipetę typu dwa z pipety typu jeden.Monitoruj poziom A CSF przez kilka minut, aby zweryfikować szczelność drogi aksonalnej lub nerwów. Następnie rozpuść barwnik w A CSF lub 0,2% Triton X 100 w wodzie dwukrotnie destylowanej. Pobierz go do pipety typu dwa, wywierając słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki, uważając przy tym, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.Następnie wprowadź pipetę typu dwa zawierającą barwnik do pozostałego roztworu A CSF. W pipecie typu jeden powoli uwolnij barwnik do A CSF, stosując delikatne dodatnie ciśnienie za pomocą strzykawki. Należy upewnić się, że do środka nie dostały się pęcherzyki powietrza i że tkanka docelowa nie została przesunięta z wnętrza końcówki. Jeśli podczas wstrzykiwania barwnika do pipety typu jeden dostanie się pęcherzyk powietrza, należy go usunąć, zbliżając końcówkę pipety typu dwa do pęcherzyka, a następnie delikatnie przykładając słabe ciśnienie ujemne za pomocą dołączonej strzykawki.Po uwolnieniu odpowiedniej ilości barwnika wyciągnij pipetę typu dwa. Następnie inkubuj tkankę w ciemności od 6 do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie czasu niezbędnego do wypełnienia, ostrożnie odsuń elektrodę od tkanki.Następnie tkanka jest gotowa do obrazowania lub badania histologicznego. Poniżej znajduje się schemat przedstawiający jednoczesne wprowadzanie trzech różnych koniugowanych fluorescencyjnych barwników dekstranowych do neuronów ruchowych, aferentnych sensorycznych oraz interneuronów rdzeniowych; neurony ruchowe oraz sakralne aferentne sensoryczne zostały wypełnione wstecznie barwnikami Cascade blue Dextran i Texas red dextran odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Zielony fluorescencyjny dekstran został wprowadzony do interneuronów rdzeniowych, których aksony biegną w górę przez sznur brzuszny.Przedstawiono tutaj obraz konfokalny przekroju sakralnego rdzenia kręgowego, w którym neurony zostały oznakowane wstecznie. Należy zauważyć, że oznakowane włókna sensoryczne doprowadzające są głównie ipsilateralne. Poza nielicznymi projekcjami kontralateralnymi, oznakowane motoneurony znajdują się ipsilateralnie względem wypełnionego korzenia brzusznego, podczas gdy oznakowane interneurony są względem niego kontralateralne, co wskazuje grot strzałki.Po wykonaniu tej procedury można zastosować dodatkowe metody w celu udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące m.in. łączności funkcjonalnej, równowagi pobudzającej i hamującej, typu zatoki, rozmieszczenia oraz produkcji neuroprzekaźników w neuronach pola DI. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu neurofizjologii rdzenia kręgowego i pnia mózgu do wyodrębniania specyficznych populacji neuronalnych przy użyciu barwników wrażliwych na jony. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu wprowadzania barwników fluorescencyjnych i/lub wrażliwych na jony do neuronów i włókien sensorycznych w izolowanym rdzeniu kręgowym.

retrograde-loading-nerves-tracts-spinal-roots-with-fluorescent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wsteczne Ładowanie Nerwów, Dróg i Korzeni Kręgowych Fluorescencyjnymi Barwnikami

Wapń jest powszechnie występującym przekaźnikiem w układzie nerwowym, niezbędnym do wyzwalania uwalniania neuroprzekaźników oraz zmian w sile synaptycznej. W niniejszym materiale prezentujemy technikę wprowadzania wskaźników Ca2+ do zakończeń nerwowych Drosophila. Przedstawiamy również sposób wykonania niezbędnej aparatury i podkreślamy kwestie kluczowe dla sukcesu tej techniki.

Obciążanie zakończeń nerwowych Drosophila wskaźnikami wapnia

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Opisano protokół obrazowania in vivo służący do monitorowania pierwotnych aksonów sensorycznych po zmiażdżeniu korzenia grzbietowego. Procedury te wykorzystują fluorescencyjną mikroskopię szerokopolową oraz myszy transgeniczne thy1-YFP i umożliwiają wielokrotne obrazowanie regeneracji aksonów na odcinku 4 cm w obwodowym układzie nerwowym (PNS) oraz oddziaływań aksonów z granicą ośrodkowego układu nerwowego (CNS).

Obrazowanie na żywo aksonów korzeni grzbietowych po ryzotomii

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Źródło: Wang, J., et al. Wizualizacja immunoreaktywnego unerwienia peptydu związanego z genem kalcytoniny opony twardej czaszki szczura z immunofluorescencją i śledzeniem neuronalnym. J. Vis. Exp. (2021).  Ten film demonstruje metodę śledzenia pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Znacznik wsteczny jest wprowadzany do odsłoniętej opony twardej znieczulonego szczura. Znacznik jest pobierany przez czuciowe aksony neuronów i przemieszcza się...

Badanie pochodzenia neuronów czuciowych w oponie twardej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Prezentujemy protokół wykorzystujący mikroskopię poklatkową z wzbudzeniem dwufotonowym do jednoczesnej wizualizacji dynamiki uszkodzeń aksonów i mielin w czasie rzeczywistym. Ten proponowany protokół pozwala na badanie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych czynników, które mogą wpływać na los centralnego mielinizowanego aksonu po urazie i przyczyniać się do trwałej niepełnosprawności klinicznej.

Model uszkodzenia rdzenia kręgowego indukowany laserem ex vivo do oceny mechanizmów zwyrodnienia aksonów w czasie rzeczywistym

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Tutaj opisujemy metodę ładowania barwnika wrażliwego na wapń przez pień nerwu żaby do zakończeń nerwowych. Przedstawiamy również protokół rejestracji i analizy szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych.

Ładowanie barwnika wapniowego do zakończeń nerwowych żaby przez kikut nerwowy: przejściowa rejestracja wapnia w połączeniu nerwowo-mięśniowym żaby

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Opisujemy metody fotoaktywacji fluorescencji do analizy transportu aksonalnego neurofilamentów w pojedynczych mielinizowanych aksonach nerwów obwodowych od transgenicznych myszy, które wyrażają fotoaktywowane białko neurofilamentu.

Obrazowanie i analiza transportu neurofilamentów w wyciętym nerwie piszczelowym myszy

Poznaj prostą i niedrogą technikę wstecznego barwienia neuronów fluorescencyjnymi oraz wrażliwymi na wapń barwnikami przy użyciu polietylenowej pipety ssącej. Metoda umożliwia skuteczne wprowadzanie wysokich stężeń barwników do określonych populacji nerwowych.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Przeglądaj więcej filmów