Wsteczne obciążenie nerwów, dróg i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi
19 kwietnia 2012
Opisujemy prostą i tanią technikę wprowadzania wysokiego stężenia barwników fluorescencyjnych i wrażliwych na wapń do neuronów lub dowolnego przewodu nerwowego za pomocą polietylenowej pipety ssącej.
Ogólnym celem tej procedury jest wprowadzenie wysokiego stężenia barwnika fluorescencyjnego lub wrażliwego na jony do neuronów lub dowolnego przewodu nerwowego przy użyciu prostej, taniej techniki. Osiąga się to poprzez wyprodukowanie najpierw dwóch typów pipet, typu pierwszego i typu drugiego. Następnie podłącz elastyczną rurkę elastomerową do pipety typu pierwszego i zastosuj nadciśnienie, aby wciągnąć docelowy przewód neuronalny do pipety typu pierwszego, sprawdzając, czy wykonane jest dobre uszczelnienie.
Następnie włóż pipetę typu dwa do pipety typu pierwszego i użyj pipety typu dwa do zassania resztki płynu mózgowo-rdzeniowego A z pipety typu pierwszego. Następnie wprowadź barwnik, ale bez pęcherzyków powietrza, do pipety typu pierwszego. Ostatnim krokiem jest inkubacja neuronów w ciemności od sześciu do 20 godzin.
Ostatecznie, po wyjęciu pipety typu pierwszego, preparat jest gotowy do badań in vitro, elektrofizjologicznych lub morfologicznych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak kąpiel, wstrzyknięcie BOS i elektroporacja, jest to, że D jest dostarczane do określonej populacji neuronów. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii, takie jak aktywność, łączność, morfologia i rozmieszczenie zdefiniowanych neuronów.
Ogólnie rzecz biorąc, technika ta wymaga praktyki, w szczególności upewnienia się, że barwnik nie zostanie rozcieńczony w pipecie typu 1 i nie zostaną do niej wprowadzone pęcherzyki powietrza. Rozpocznij tę procedurę od przeciągnięcia rurki polietylenowej nad płomieniem lampy alkoholowej, aby uzyskać dwie krótkie pipety ze zwężającymi się końcówkami. Najpierw pociągnij krótką pipetę typu One z małą końcówką, która może mocno trzymać docelowy korzeń lub drogę.
Następnie wyciągnij pipetę typu dwa z dłuższym, cieńszym trzonkiem i bardzo cienką końcówką, którą można włożyć do pipety typu 1 aż do jej końcówki. Następnie podłącz pipetę typu dwa do igły o rozmiarze 19 z klipsem EC. Następnie umieść izolowany rdzeń kręgowy w wannie.
Super połącz go ze schłodzonym płynem CSF przez cały proces ładowania. Następnie umieść pipetę typu pierwszego na uchwycie elektrody, tak aby jej tylny otwór można było łatwo podłączyć do strzykawki za pomocą elastycznej rurki. W tej procedurze należy najpierw pobrać płyn mózgowo-rdzeniowy do pipety typu pierwszego za pomocą strzykawki.
Następnie narysuj drogę aksonalną lub korzeń, który ma zostać wypełniony. Następnie wyjmij elastyczną rurkę z tylnego otworu. Następnie podłącz pipetę typu drugiego do innej strzykawki.
Włóż go do pipety typu pierwszego, która trzyma pod mikroskopem przewód aksonalny lub korzeń neuronalny. Użyj strzykawki dołączonej do pipety typu drugiego, aby zassać płyn mózgowo-rdzeniowy A tak, aby pozostałość płynu mózgowo-rdzeniowego A pokryła tylko drogę aksonalną. Następnie wyjmij pipetę typu drugiego z pipety typu pierwszego.
Monitoruj poziom płynu mózgowo-rdzeniowego A przez kilka minut, aby sprawdzić, czy przewód aksonalny lub nerwy są dobrze uszczelnione. Następnie rozpuść barwnik w płynie mózgowo-rdzeniowym A lub 0,2% Triton X 100 w wodzie podwójnie destylowanej. Pobrać go do pipety typu drugiego, przykładając słabe podciśnienie do dołączonej strzykawki, uważając, aby nie wciągnąć żadnych pęcherzyków powietrza.
Następnie włóż pipetę typu drugiego zawierającą barwnik do pozostałego roztworu płynu mózgowo-rdzeniowego A W pipecie typu pierwszego powoli uwolnij barwnik do płynu mózgowo-rdzeniowego A, wywierając delikatne nadciśnienie na strzykawkę. Należy pamiętać, aby nie wprowadzać żadnych pęcherzyków powietrza ani nie powodować przemieszczenia tkanki docelowej z wnętrza końcówki. Jeśli pęcherzyk powietrza zostanie wprowadzony do pipety typu pierwszego podczas wstrzykiwania barwnika, wyciągnij pęcherzyk Przesuwając końcówkę pipety typu drugiego blisko pęcherzyka, a następnie delikatnie przykładając słabe podciśnienie za pomocą dołączonej strzykawki.
Po uwolnieniu wystarczającej ilości barwnika wyjmij pipetę typu drugiego. Następnie inkubuj tkankę w ciemności przez sześć do 20 godzin, w zależności od rodzaju eksperymentu. Po upływie wystarczającej ilości czasu na wypełnienie delikatnie odciągnij elektrodę od tkanki.
Następnie tkanka jest gotowa do obrazowania lub histologii. Oto schemat ideowy, który pokazuje obciążenie trzech różnych zręcznościowych, sprzężonych barwników fluorescencyjnych jednocześnie do neuronów ruchowych, neuronów czuciowych aferentnych i rdzeniowych, neuronów ruchowych i aferentnych czuciowych krzyżowych zostało wypełnionych kaskadowym niebieskim dekstranem i czerwonym deksenem teksańskim odpowiednio przez korzenie brzuszne i grzbietowe. Zielony fluorescencyjny dekstran został załadowany do neuronów rdzeniowych, których aksony wznoszą się przez brzuszną funiculus.
Pokazany tutaj jest konfokalny obraz odcinka z krzyżowego rdzenia kręgowego, w którym neurony zostały ponownie oznaczone. Należy pamiętać, że oznaczone aferenty czuciowe są przede wszystkim ipsilateralne. Przy kilku kontralateralnych projekcjach znakowane neurony ruchowe są ipsilateralne do wypełnionego korzenia brzusznego, podczas gdy znakowane neurony międzyneuronowe są do niego przeciwne, jak wskazuje grot strzałki.
Po tej procedurze można wykonać dodatkową metodę, aby odpowiedzieć na kluczowe pytania, takie jak łączność funkcjonalna, inhibitor pobudzenia, typ zatoki, dystrybucja i produkcja neuroprzekaźników w neuronach pola DI. Technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się neurofizjologią rdzenia kręgowego i pnia mózgu do emitowania określonej populacji neuronów przy użyciu barwników wrażliwych na jony. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stosować barwniki fluorescencyjne i/lub jonowe do neuronów i włókien czuciowych w izolowanym rdzeniu kręgowym.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych oraz barwników wrażliwych na wapń do neuronów lub szlaków neuronalnych. Metoda ta wykorzystuje polietylenową pipetę ssącą w celu skutecznego wprowadzenia barwnika.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Obrazowanie fluorescencyjne
Wstęp
- Barwniki fluorescencyjne i wrażliwe na wapń są niezbędne do badania aktywności neuronalnej.
- Tradycyjne metody mogą być kosztowne lub skomplikowane.
- Niniejsza technika ma na celu uproszczenie tego procesu.
- Zastosowanie polietylenowej pipety ssącej zwiększa dostępność metody dla badaczy.
Cel badania
- Aby skutecznie wprowadzić wysokie stężenia barwników do neuronów.
- Aby zapewnić kosztowo efektywną alternatywę dla istniejących metod.
- Aby ułatwić lepszą wizualizację aktywności neuronalnej.
Zastosowane Metody
- Przygotowanie dwóch rodzajów pipet do procedury.
- Zastosowanie dodatniego ciśnienia w celu wciągnięcia docelowego szlaku neuronalnego do pipety.
- Użycie drugiej pipety do odessania pozostałego płynu mózgowo-rdzeniowego.
- Wprowadzenie barwnika bez pęcherzyków powietrza, a następnie inkubacja w ciemności.
Główne wyniki
- Technika ta umożliwia efektywne wprowadzanie barwników do neuronów.
- Możliwe jest uzyskanie wysokich stężeń barwników przy minimalnych kosztach.
- Czas inkubacji dla uzyskania optymalnych wyników wynosi od sześciu do dwudziestu godzin.
- Metoda jest powtarzalna i dostępna dla badaczy.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodny sposób wprowadzania barwników do układów neuronalnych.
- Usprawnia ona możliwość badania dynamiki i funkcji neuronów.
- Podejście to jest korzystne zarówno do celów badawczych, jak i edukacyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Technika ta umożliwia precyzyjne dostarczenie barwników fluorescencyjnych i jonoselektywnych do określonych populacji neuronalnych, co wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów i analizie szlaków sygnałowych. Poprzez utrzymanie wysokiego stężenia barwnika podczas procesu ładowania, metoda ta poprawia niezawodność sygnału w późniejszych analizach funkcjonalnych i morfologicznych. To niskokosztowe i powtarzalne podejście zwiększa standaryzację i skalowalność testów w początkowych etapach procesów odkrywania leków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie konkretnych szlaków neuronalnych w celu wyjaśnienia łączności oraz hipotez funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zdefiniowaną populację neuronów do spójnych badań nad angażowaniem celu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych odczytów fluorescencji w celu oceny poboru barwnika i wydajności znakowania neuronów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia gotowość do analizy dzięki standaryzowanemu, wolnemu od pęcherzyków powietrza dostarczaniu barwnika oraz powtarzalnym protokołom inkubacji.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia modelowanie systemów istotnych dla przebiegu chorób poprzez umożliwienie wizualizacji populacji neuronów ruchowych, czuciowych i pośredniczących w preparatach rdzenia kręgowego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki niezawodnemu znakowaniu neuronów na potrzeby elektrofizjologii i obrazowania.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z biologią odkrywczą, umożliwiając ukierunkowane znakowanie neuronów, co wspiera testowanie hipotez oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych. Przechodzi ona na etap screeningu, zapewniając preparaty gotowe do analizy z ilościowymi wynikami zależnymi od barwnika. Technika ta wnosi wkład w analitykę poprzez mierzalną intensywność fluorescencji oraz metryki rozkładu. Wspiera badania translacyjne, zachowując integralność neuronów na potrzeby przedklinicznych badań ciągłości. Ponowne wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa jest możliwe dzięki taniemu, adaptacyjnemu systemowi opartemu na pipetowaniu, który można zastosować w wielu traktach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez precyzyjne znakowanie traktów neuronalnych.
- Screening: Zapewnia gotowość do przeprowadzania testów dzięki standaryzowanemu wprowadzaniu barwnika o wysokim stężeniu bez rozcieńczania.
- Analityka: Umożliwia ilościowe pomiary intensywności fluorescencji i rozkładu neuronów w celu analizy porównawczej różnych warunków.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość badań przedklinicznych poprzez zachowanie morfologii i funkcji neuronów po znakowaniu.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Oferuje wielokrotnego użytku, niskokosztową platformę do spójnego znakowania neuronów w różnych modelach eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w badaniach nad łącznością i aktywnością neuronów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki zestandaryzowanemu przygotowaniu pipet oraz dostarczaniu barwnika.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie wiarygodnych danych na temat zaangażowania celów neuronalnych i modulacji szlaków.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki spójnemu, wysokiej wierności znakowaniu neuronów na wszystkich etapach odkrywania.
Kwestie wdrożeniowe
- Wymaga doświadczenia w mikrochirurgii i wizualizacji mikroskopowej w celu prawidłowego manipulowania pipetami i obchodzenia się z tkankami.
- Zależy od dostępu do rurek polietylenowych, systemów strzykawkowych oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu wprowadzania i detekcji barwnika.
- Konieczna jest standaryzacja technik wyciągania pipet oraz warunków inkubacji pomiędzy zespołami, aby zapewnić spójność znakowania.
- Wymaga rozważenia adaptacji metody przy zastosowaniu jej do różnych traktów neuronalnych lub systemów modelowych o zróżnicowanych średnicach aksonów.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność unikania wprowadzania pęcherzyków powietrza i utrzymania szczelności podczas wprowadzania barwnika.
