Owarektomia i suplementacja 17β-estradiolu u szczurów i myszy: demonstracja wizualna

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie ścisłej kontroli nad fluktuującymi stężeniami estrogenów w surowicy samic szczurów i myszy. Osiąga się to najpierw poprzez usunięcie jajników drogą przez grzbiet. Następnie przygotowuje się elastyczne kapsułki celulozowe oraz mieszaninę Nutella.

Na koniec kapsułkę wprowadza się podskórnie lub mieszankę Nutelli podaje się doustnie. Ostatecznie wyniki można uzyskać za pomocą radioimmunologicznego testu przeciwciał, który wykazuje stabilne lub fluktuujące stężenia 17 beta estradiolu w surowicy odpowiednio dla metody z kapsułką i mieszanki Nutelli. Główną zaletą tych technik w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak granulki o powolnym uwalnianiu, jest udowodnione zapewnienie fizjologicznych stężeń estradiolu przez dłuższy czas.

Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad estrogenami, takie jak różnice w efektach w zależności od sposobu podania, dróg podania i dawek. Po znieczuleniu zwierzęcia należy ułożyć je w pozycji brzusznej na płycie grzewczej połączonej z termometrem rektalnym. Podać IGEL oraz lek przeciwbólowy w okresie pooperacyjnym podskórnie w boczną część szyi zwierzęcia.

Podaj IL w dawce 5 mg/kg w soli fizjologicznej w obszarze 4 x 4 cm przedniostronnie od grzebienia biodrowego. Następnie zdezynfekuj ten obszar środkiem antyseptycznym przed przykryciem zwierzęcia prześcieradłem chirurgicznym z otworem o wymiarach 4 x 4 cm. Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 2–3 cm i rozszerz je tępym rozcięciem, oddzielając skórę od leżącej pod nią powięzi w odległości 1 cm bocznie od linii środkowej.

Wykonaj kolejne nacięcie przez powięź. Następnie, tak powierzchownie jak to możliwe, przeprowadź rozwarstwienie tępe w kierunku bocznym pod powięzią, aż do momentu dotarcia do jamy brzusznej. Za pomocą pęsety chwyć tkankę tłuszczową otaczającą jajnik w jamie brzusznej i delikatnie ją wyciągnij.

Zidentyfikuj jajnik i podwiąż rogi macicy oraz naczynia krwionośne w odległości od 0,5 do 1 cm proksymalnie od tej struktury. Wycięty jajnik wraz z podwiązaną tkanką tłuszczową usuń, a pozostałą tkankę umieść z powrotem w jamie brzusznej.

Wykonaj kolejne nacięcie w powięzi przeciwległej strony i usuń drugi jajnik. Zamknij rany i, jeśli 17 beta estradiol nie jest podawany natychmiast, pozwól zwierzęciu obudzić się z narkozy.

Umieść zwierzę w ogrzewanej klatce na co najmniej dwie godziny po operacji. Przez pierwsze kilka dni po zabiegu utrzymuj szczura w osobnej klatce. 24 godziny po operacji podskórnie.

Wstrzyknij zwierzętom kolejną dawkę 5 mg/kg IL, aby podać 17 beta estradiol za pomocą kapsułek scholastic. Dokładnie wymieszaj pożądaną ilość w oleju sezamowym. Za pomocą pęsety odetnij odcinki rurek scholastic o długości 3 cm oraz drewniane patyczki aplikacyjne o długości 5 mm do zatykania.

Wciśnij jeden drewniany korek do kapsuły szkoleniowej przed wstrzyknięciem roztworu 17 beta estradiol w oleju sezamowym. Aby wypełnić całą długość, delikatnie zakryj otwarty koniec kapsuły szkoleniowej drugim drewnianym korkiem. Inkubuj kapsuły w pozostałym roztworze 17 beta estradiol przez noc przed implantacją.

Po zamknięciu nacięć po ektomii, ogolić i zdezynfekować obszar o wymiarach dwóch na dwa centymetry na grzbietowej stronie szyi szczura. Wykonać nacięcie o długości jednego centymetra, a następnie rozszerzyć je bocznie metodą rozłapywania. Wypreparować kieszeń podskórną, tworząc odpowiednio dużo miejsca na kapsułę.

Przetrzyj kapsułkę szkolną i delikatnie wprowadź ją przez nacięcie. Następnie zamknij nacięcie za pomocą szwu. Upewnij się, że kapsułka w jak najmniejszym stopniu napina skórę, szczególnie w okolicy rany.

Aby wykorzystać krem orzechowy Nutella jako nośnik do podawania estrogenu, należy całkowicie rozpuścić 17 beta estradiol w oleju sezamowym, a następnie wymieszać olej sezamowy z kremem orzechowym. Na pięć dni przed eksperymentem należy przygotować krem orzechowy będący placebo, bez dodatku 17 beta estradiol. W dniach od pierwszego do trzeciego należy przyuczyć szczury do spożywania kremu orzechowego wolnego od hormonów.

W czwartym i piątym dniu trenuj zwierzęta w grupach. Przez cały czas trwania eksperymentów podawaj im krem z orzechów w oddzielnych klatkach. Umieść zwierzęta w osobnych klatkach podczas podawania im surowicy fizjologicznej z kremem z orzechów.

Stężenia 17 beta estradiolu, które obecne metody mają na celu odtworzyć, wynoszą w przybliżeniu od 5 do 140 picogramów na mililitr dla szczurów oraz od 5 do 35 picogramów na mililitr dla myszy. Jak pokazano tutaj. W przypadku podania samicom szczurów rasy Sprague Dawley o masie 300 gramów.

Podskórne kapsułki elastyczne zapewniają powoli spadające stężenia 17 beta estradiol w surowicy, od około 40 picograms per milliliter w drugim dniu do 10 picograms per milliliter do 35. dnia. Jednakże, bezpośrednio po podaniu, można spodziewać się szczytowego stężenia w surowicy wynoszącego około 1000 picogram per milliliter, które w ciągu ośmiu godzin spada do zakresu fizjologicznego, w przypadku podania kapsułek samicom myszy C 57 black six o masie 25 gram.

Stężenie w surowicy powoli spadało z około 90 pg/mL w drugim dniu do 25 pg/mL w 35. dniu podawania za pomocą kremu do nosa szczurom o masie 300 g. Fizjologiczne poziomy 17 beta estradiol u myszy wahały się codziennie w granicach od 10 do 70 pg/mL.

Poziomy 17 beta estradiolu wahały się od 20 do 120 pg/ml. Po opanowaniu techniki, procedura ektomii i implantacji kapsułki może zostać wykonana w ciągu 10 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ścisłym przestrzeganiu zasad higieny.