Name: Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Poznaj metodę analizy dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc u myszy podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego owalbuminą. Technika ta pozwala badać dynamikę odpowiedzi immunologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantów CIHR oraz CF Canada przyznanych dr. Jimowi Hu, a także ze stypendium doktoranckiego przyznanego Rahulowi Kushwahowi przez CF Canada.

1. Sensybilizacja myszy owalbumimą
<ol>
 <li>Przygotować roztwór OVA (stopień V; Sigma, MO) w sterylnym PBS o stężeniu 1 mg/ml (roztwór można przechowywać w temperaturze -80 °C).</li>
 <li>W celu przygotowania mieszaniny OVA-Alum, umieścić Alum w probówce i dodać roztwór OVA kropla po kropli, w proporcji 1:1, mieszając zawartość w wirówce typu vortex. Mieszać mieszaninę przez 30 minut i użyć niezwłocznie po wymieszaniu.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 1 ml wstrzyknąć 0,2 ml mieszaniny do jamy otrzewnej myszy; iniekcję powtórzyć po 2 tygodniach.</li>
</ol>
2. Donosowe wyzwanie myszy owalbuminą znakowaną FITC
<ol>
 <li>7 dni po drugim wstrzyknięciu OVA-Alum myszy są gotowe do podania wewnątrznosowego OVA-FITC w celu wywołania reakcji.</li>
 <li>Przygotować roztwór OVA-FITC (Sigma) w sterylnym PBS o stężeniu 1 mg/ml i przechowywać w alikwotach w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Umieścić sterylną gazę na dnie probówki typu Falcon o pojemności 50 ml i w dygestorium dodać 5 ml Aerrane na gazę. Aby znieczulić myszy, umieścić zwierzę w probówce na około 5-10 sekund.</li>
 <li>Trzymać znieczulone zwierzę w pozycji pionowej i za pomocą sterylnych końcówek do pipet podawać po kropli 100 μl roztworu OVA-FITC do nozdrzy myszy.</li>
 <li>Powtarzać podanie wewnątrznosowe OVA-FITC przez kolejne dwa dni.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z płuc i drenujących węzłów chłonnych
<ol>
 <li>Uśmierć myszy poprzez wstrzyknięcie Euthanylu drogą dosytnieniową.</li>
 <li>W celu ograniczenia zanieczyszczenia makrofagami, które może utrudnić analizę DC, przeprowadza się przemywanie płuc. Aby wypłukać płuca, krótko odsłania się tchawice myszy i kaniuluje je za pomocą cewnika i strzykawki; przy użyciu lodowatego PBS z 5 mM EDTA dolne drogi oddechowe płucze się 3 razy, aby usunąć komórki z przestrzeni pęcherzykowych.</li>
 <li>Przepłucz płuca 10 ml PBS zawierającego 10 U/ml heparyny poprzez prawą komorę serca, aby usunąć komórki krwi z naczyń krwionośnych płuc. Wykonuj perfuzję do momentu, aż płuca staną się białe, co wskazuje na usunięcie większości komórek krwi. Jest to szczególnie istotne w celu usunięcia zanieczyszczających komórek z krwi obwodowej.</li>
 <li>Wypreparuj płuca, usuń węzły chłonne śródpiersiowe (MLN) i umieść je w osobnej szalce. (Staraj się zminimalizować ekspozycję tkanek na światło, aby zapobiec wygaszaniu fluorescencji FITC).</li>
 <li>Umieść płuca na płytce Petriego i posiekaj je nożyczkami. Następnie traw płuca przez 25 minut w temperaturze 37 °C przy użyciu 250 U/ml kolagenazy D (Roche), a po kolejnych 5 minutach dodaj EDTA (stężenie końcowe 10 mM), aby zatrzymać aktywność kolagenazy.</li>
 <li>Przepuść fragmenty strawionych płuc przez sito komórkowe o oczkach 100 μm i przeprowadź lizę hipotoniczną w celu usunięcia erytrocytów. Jednokomórkowa zawiesina jest gotowa do dalszej analizy DC.</li>
 <li>W celu przygotowania jednokomórkowej zawiesiny z MLN, rozdrobnij MLN za pomocą cienkich igieł i traw kolagenazą zgodnie z opisem powyżej, a następnie przefiltruj przez sito komórkowe.</li>
</ol>
4. Barwienie markerów DC w celu oceny dojrzewania/migracji
<ol>
 <li>W celu identyfikacji komórek dendrytycznych (DCs) w płucach wykonuje się barwienie na CD11c oraz CD11b. Ponadto, aby ocenić stopień dojrzewania, wykonuje się barwienie na CD86 i CD80, których ekspresja wzrasta w miarę dojrzewania komórek dendrytycznych. Komórki CD11c+CD11b+OVA-FITC+ w węzłach chłonnych środowiskowych (MLN) są identyfikowane jako płucne DCs migrujące z płuc do MLN w odpowiedzi na podanie OVA w drogach oddechowych.</li>
 <li>Resuspender komórki do stężenia 10 x 106 komórek/ml w buforze FACS (PBS z 1% FBS i 1mM EDTA) i odmierzyć 150 μl zawiesiny komórkowej na probówkę do barwienia FACS. Do identyfikacji płucnych DCs wymagane są następujące barwienia: kontrola niebarwiona (komórki płuc myszy nieeksponowanych na OVA-FITC), kontrola OVA-FITC, kontrola pojedyncza CD11c, kontrola pojedyncza CD11b, kontrola podwójna CD11b+CD11c+, kontrola podwójna CD11b+OVA-FITC+, kontrola podwójna CD11c+OVA-FITC+, kontrola pojedyncza MHC II, kontrola pojedyncza CD86, kontrola pojedyncza CD80 oraz próbki barwione na OVA-FITC+CD11c+CD11b+MHCII+, OVA-FITC+CD11c+CD11b+CD86+ oraz OVA-FITC+CD11c+CD11b+CD80+.</li>
 <li>Aby ocenić migrację DCs, należy przeprowadzić absolutne liczenie komórek w zawiesinie pojedynczych komórek z MLN, a następnie przygotować następujące probówki: kontrola niebarwiona (komórki MLN od myszy nieeksponowanych na OVA-FITC), kontrola OVA-FITC, kontrola pojedyncza CD11c+, kontrola podwójna CD11b+, kontrola podwójna CD11b+OVA-FITC+, kontrola podwójna CD11c+OVA-FITC+ oraz próbki CD11c+CD11b+OVA-FITC+.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Punkty czasowe wymagane do sensytyzacji domięśniowej w celu wywołania alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych są istotne i powinny być realizowane zgodnie z przedstawionym na Rysunku 1. Po sensytyzacji domięśniowej i prowokacji OVA w drogach oddechowych, w celu potwierdzenia indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, można poświęcić część myszy i przeprowadzić analizy histologiczne przekrojów płuc, jak pokazano na Rysunku 2. Obecność komórek zapalnych można potwierdzić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną (Rysunek 2A), a produkcję śluzu można ocenić za pomocą barwienia kwasem okresowym i Schiffem (Rysunek 2B). Łącznie potwierdzi to indukcję alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych po prowokacji OVA u myszy sensytyzowanych OVA8. W przeciwieństwie do nich, w przekrojach płuc myszy traktowanych solą fizjologiczną oczekuje się braku jakiegokolwiek stanu zapalnego oraz braku produkcji śluzu. Ponadto, po prowokacji OVA, płucne komórki DC ulegają dojrzewaniu i następującej po nim migracji do drenujących węzłów chłonnych. Analiza komórek CD11c+ w węzłach chłonnych śródpiersia (MLN) myszy sensytyzowanych i prowokowanych OVA powinna wykazać wyższą proporcję komórek CD11c+ w porównaniu do myszy traktowanych solą fizjologiczną (Rysunek 3A). Ponadto analiza absolutnej liczby komórek CD11c+CD11b+OVA-FITC+ w MLN myszy sensytyzowanych i prowokowanych OVA powinna wykazać liczbę znacząco wyższą (tzn. kilkukrotnie wyższą) niż w przypadku myszy traktowanych solą fizjologiczną (Rysunek 3B).
<img alt="Sensybilizacja OVA, protokół kontrolny, schemat; myszy, iniekcja ip, proces analizy cytometrycznej." src="/files/ftp_upload/4014/4014fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Protokół eksperymentalny indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych indukowanego owalbuminą (OVA) u myszy wraz z prowokacją dróg oddechowych owalbuminą znakowaną FITC (OVA-FITC).
<img alt="Histologia płuc w barwieniu H&amp;E i PAS, sól fizjologiczna vs sensybilizacja OVA, porównanie mikroskopowe przy 50x, 200x." src="/files/ftp_upload/4014/4014fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Sensybilizacja OVA, a następnie wyzwalanie dróg oddechowych OVA prowadzi do indukcji alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, co zidentyfikowano w barwieniu hematoksyliną i eozyną przekrojów płuc pokazanych w (A), a także prowadzi do produkcji śluzu w drogach oddechowych, co zidentyfikowano w barwieniu kwasem okresowym i Schiffem przekrojów płuc pokazanych w (B).
<img alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej oraz wykres słupkowy przedstawiający liczbę komórek CD11c w grupie z solą fizjologiczną w porównaniu z grupą uczuloną na OVA." src="/files/ftp_upload/4014/4014fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wyzwanie OVA-FITC indukuje migrację komórek DC z płuc do węzłów chłonnych śródpiersia (MLN). (A) Wykresy z cytometrii przepływowej przedstawiające proporcje komórek CD11c+ w MLN myszy kontrolnych lub uczulonych na OVA. (B) Bezwzględna liczba komórek CD11c+CD11b+OVA-FITC+ w MLN myszy poddanych działaniu soli fizjologicznej lub uczulonych na OVA. *p&lt;0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4014/4014fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną figurę</a>.

<ol><li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+dendritic+cells+in+the+induction+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biosci%22%5BJournal%5D)">Role of dendritic cells in the induction of regulatory T cells.</a> Cell Biosci. 20, (2011).</li>
<li>Kushwah, R., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+of+dendritic+cell+subsets+and+their+function+in+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Complexity of dendritic cell subsets and their function in the host immune system.</a> Immunology. 133, 409-419 (2011).</li>
<li>Lambrecht, B. N., Hammad, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taking+our+breath+away%3A+dendritic+cells+in+the+pathogenesis+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Taking our breath away: dendritic cells in the pathogenesis of asthma.</a> Nat Rev Immunol. 3, 994-1003 (2003).</li>
<li>Hammad, H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+epithelial+cells%3A+linking+innate+and+adaptive+immunity+in+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and epithelial cells: linking innate and adaptive immunity in asthma.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 193-204 (2008).</li>
<li>Lloyd, C. M., Murdoch, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerizing+allergic+responses+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Tolerizing allergic responses in the lung.</a> Mucosal. Immunol. 3, 334-344 (2010).</li>
<li>Herz, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+murine+animal+models+to+study+the+development+of+allergic+bronchial+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The relevance of murine animal models to study the development of allergic bronchial asthma.</a> Immunol. Cell Biol. 74, 209-217 (1038).</li>
<li>Herz, U., Lumpp, U., Daser, A., Gelfand, E. W., Renz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+animal+models+to+study+the+central+role+of+T+cells+in+immediate-type+hypersensitivity+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Murine animal models to study the central role of T cells in immediate-type hypersensitivity responses.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 409, 25-32 (1996).</li>
<li>Nakae, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF+can+contribute+to+multiple+features+of+ovalbumin-induced+allergic+inflammation+of+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TNF can contribute to multiple features of ovalbumin-induced allergic inflammation of the airways in mice.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 119, 680-686 (2007).</li>
<li>Guth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+environment+determines+unique+phenotype+of+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung environment determines unique phenotype of alveolar macrophages.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 296, L936-L946 (2009).</li>
<li>Kushwah, R., Cao, H., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pulmonary+T+cell+response+to+helper-dependent+adenoviral+vectors+following+intranasal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of pulmonary T cell response to helper-dependent adenoviral vectors following intranasal delivery.</a> J. Immunol. 180, 4098-4108 (2008).</li>
<li>Kushwah, R., Oliver, J. R., Zhang, J., Siminovitch, K. A., Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+dendritic+cells+induce+tolerance+in+mice+through+suppression+of+dendritic+cell+maturation+and+induction+of+antigen-specific+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apoptotic dendritic cells induce tolerance in mice through suppression of dendritic cell maturation and induction of antigen-specific regulatory T cells.</a> J. Immunol. 183, 7104-7118 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Metoda przedstawiona w niniejszym opracowaniu oferuje podejście oparte na cytometrii przepływowej do analizy komórek dendrytycznych (DC) płuc, wykorzystujące podanie OVA-FITC w celu wywołania reakcji w drogach oddechowych. Pozwala to na selektywne monitorowanie DC płuc, które pobierają OVA-FITC, dzięki czemu monitorowane populacje DC są de facto tymi, które uczestniczą w odpowiedzi immunologicznej dróg oddechowych podczas przebiegu indukowanego przez OVA alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. U myszy kontrolnych,...

<table><tbody><tr><td>Ovalbumina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ałun</td><td>Thermo Scientific</td><td>77161</td><td></td></tr><tr><td>OVA-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9771</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała</td><td>e-Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Analysis of Pulmonary Dendritic Cell Maturation and Migration during Allergic Airway Inflammation

Komórki dendrytyczne (DCs) są kluczowymi elementami uczestniczącymi w inicjowaniu adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację swoistych dla antygenu limfocytów T. W stanie spoczynku komórki DC występują w tkankach obwodowych; jednak w odpowiedzi na stymulację antygenem, komórki DC pochłaniają antygen i szybko migrują do drenujących węzłów chłonnych, gdzie inicjują odpowiedź limfocytów T przeciwko temu antygenowi1,2. Ponadto komórki DC odgrywają również kluczową rolę w inicjowaniu odpowiedzi autoimmunologicznej, jak i alergicznej3.
Komórki dendrytyczne (DCs) odgrywają istotną rolę zarówno w inicjacji odpowiedzi immunologicznej, jak i w indukcji tolerancji w środowisku płuc4. Środowisko płuc jest w dużej mierze tolerogenne ze względu na ekspozycję na szeroki wachlarz antygenów środowiskowych5. Jednak u niektórych osób dochodzi do przełamania tolerancji, co prowadzi do indukcji alergii i astmy. W niniejszym badaniu opisujemy strategię, która może być wykorzystana do monitorowania dojrzewania i migracji DCs w drogach oddechowych w odpowiedzi na antygen użyty do uczulenia. Pomiar dojrzewania i migracji DCs w drogach oddechowych pozwala na ocenę kinetyki odpowiedzi immunologicznej podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych, a także pomaga w zrozumieniu nasilenia następującej po nim odpowiedzi immunologicznej oraz leżących u jej podstaw mechanizmów.
Nasza strategia opiera się na wykorzystaniu owalbuminy jako czynnika uczulającego. Astma alergiczna indukowana owalbuminą jest powszechnie stosowanym modelem służącym do odtworzenia eozynofilii dróg oddechowych, stanu zapalnego płuc oraz podwyższonego poziomu IgE występujących podczas astmy6,7. Po uczuleniu myszy poddawane są ekspozycji poprzez donosowe podanie owalbuminy znakowanej FITC, co pozwala na specyficzne znakowanie komórek dendrytycznych (DC) dróg oddechowych, które pochłaniają owalbuminę. Następnie, wykorzystując kilka swoistych markerów DC, możemy ocenić dojrzewanie tych komórek, a także analizować ich migrację do drenujących węzłów chłonnych za pomocą cytometrii przepływowej.

Opisujemy strategię monitorowania dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w odpowiedzi na owalbuminę w warunkach wywołanego owalbuminą alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych. Strategię tę można zmodyfikować w celu oceny migracji komórek dendrytycznych płuc w warunkach infekcji.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Komórki dendrytyczne (DCs) odgrywają kluczową rolę w inicjowaniu adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej poprzez aktywację swoistych dla antygenu limfocytów T. Komórki dendrytyczne występują w ...

Celem niniejszej procedury jest ocena dojrzewania i migracji płucnych komórek dendrytycznych (DC) w przebiegu alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych indukowanego Val Boomin u myszy. Jest to realizowane poprzez uprzednią sensytyzację myszy Val Boomin, a następnie prowokację dróg oddechowych Val Boomin znakowanym fitsy. Następnie pobierane są płuca oraz węzły chłonne śródpiersia.Na koniec z tkanek płuc i węzłów chłonnych przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek. W końcowym etapie, za pomocą analizy cytometrycznej, można ocenić stopień dojrzałości oraz absolutną liczbę komórek dendrytycznych w węzłach chłonnych śródpiersia po wyzwaniu FITC Val Boomin. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące odpowiedzi immunologicznej płuc, takie jak to, czy komórki dendrytyczne ulegają dojrzewaniu po ekspozycji na antygen oraz czy migrują one do drenujących węzłów chłonnych.A jeśli migrują, to z jaką prędkością zachodzi ta migracja. Rozpocznij od dodawania kroplami świeżo przygotowanego roztworu Val Boomin w stosunku jeden do jednego do probówki z ałunem podczas wirowania w vorteksie. Mieszaj mieszaninę przez 30 minut, a następnie nabierz do strzykawki o pojemności 1 ml 0,2 ml mieszaniny.Chwytając mysz kciukiem i palcem wskazującym jednej ręki za kark, blisko podstawy czaszki, wstrzyknij drugą ręką roztwór ałunu Val Boomin do jamy otrzewnej zwierzęcia. Siedem dni po drugim wstrzyknięciu Val w ałunie, utrzymaj znieczulone zwierzę uwrażliwione na Val w ałunie w pozycji pionowej, a następnie za pomocą sterylnych końcówek do pipet nanieś kroplowo 100 µL świeżo przygotowanego roztworu val in fxi na NAS myszy.Zacznij od przymocowania kaniuli o rozmiarze 20 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Następnie, po potwierdzeniu uśmiercenia myszy, otwórz jamę klatki piersiowej zwierzęcia aż do szyi, aby odsłonić i zakanulować tchawicę myszy. Jest to absolutnie krytyczne, aby przeprowadzić laważ płuc oraz perfuzję serca, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczające makrofagi pęcherzykowe oraz komórki mononuklearne obecne we krwi obwodowej zostały usunięte.Kolejne dwa kroki należy wykonać ostrożnie i oczywiście z pewną ręką. Teraz należy podać lodowaty PBS z EDTA trzy razy przez cewnik, aby wypłukać dolne drogi oddechowe i usunąć komórki z przestrzeni pęcherzykowatych. Następnie, po wyposażeniu strzykawki o pojemności 10 ml w igłę o rozmiarze 20 G, należy przeprowadzić perfuzję płuc przy użyciu 10 ml PBS z heparyną poprzez prawą komorę serca.Usuwanie pozostałych komórek krwi z naczyń krwionośnych płuc uznaje się za zakończone, gdy płuca staną się białe. Następnie należy usunąć węzły chłonne śródpiersia, umieszczając je w oddzielnym naczyniu. Aby zapobiec gaszeniu fluorescencji, należy zminimalizować ekspozycję tkanki na światło.Następnie należy wypreparować perfundowane płuca i umieścić je w szalce Petriego, a następnie rozdrobnić płuca za pomocą nożyczek. Kolejnym krokiem jest trawienie tkanki płucnej w temperaturze 37°C w roztworze kolagenazy D o stężeniu 250 units/mL. Po 25 minutach inkubacji do mieszaniny należy dodać EDTA na pięć minut, aby zatrzymać aktywność kolagenazy. Na koniec fragmenty strawionych płuc należy przepuścić przez sito komórkowe o oczkach 100 µm i poddać erytrocyty lizie za pomocą buforu hipotonicznego.Oddziel węzły chłonne śródpiersia za pomocą cienkich igieł i poddaj je trawieniu kolagenazą, tak jak zademonstrowano wcześniej dla płuc, a następnie przefiltruj tkankę przez sitko komórkowe po podaniu domięśniowym, sensytyzacji i wyzwoleniu w drogach oddechowych. Obecność komórek zapalnych można ocenić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną w reprezentatywnych przekrojach płuc z grupy kontrolnej.W przypadku zwierząt traktowanych solą fizjologiczną tkanki są pozbawione stanu zapalnego, co obrazuje górna grafika. W przeciwieństwie do nich, w przekrojach płuc zwierząt uczulonych i poddanych prowokacji, traktowanych Val, komórki zapalne występują powszechnie, co widać na dolnej grafice. Do oceny produkcji śluzu można wykorzystać barwienie kwasem okresowym, co przedstawiono na tej dolnej grafice.Indukcja alergicznego zapalenia dróg oddechowych po wyzwoleniu wal w myszach uczulonych na wal jest potwierdzona obecnością śluzu. Przeciwnie, całkowity brak produkcji śluzu wykazują myszy kontrolne traktowane solą fizjologiczną, jak pokazano na górnej grafice; po wyzwoleniu wal płucne dcs przechodzą dojrzewanie i następującą po nim migrację do drenujących węzłów chłonnych.Przedstawiona tutaj reprezentatywna analiza węzłów chłonnych śródpiersia myszy wykazuje, że umiarkowany, lecz spójny wzrost proporcji komórek CD 11 C pozytywnych jest wykrywalny u zwierząt uczulonych i wystawionych na działanie Val Boomin w porównaniu z myszami traktowanymi solą fizjologiczną. Ponadto analiza bezwzględnej liczby komórek CD 11 C pozytywnych, CD 11 B pozytywnych i Val Boomin fits pozytywnych z węzłów chłonnych śródpiersia myszy uczulonych i wystawionych na działanie antygenu wykazuje, że u myszy po ekspozycji następuje kilkukrotnie większy wzrost liczby DC w porównaniu z zwierzętami traktowanymi solą fizjologiczną. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć bardzo dobrą wiedzę na temat naszej techniki analizy dojrzewania oraz migracji komórek dendrytycznych płuc.Po pełnym opanowaniu tej techniki będzie można zmodyfikować ją w celu oceny odpowiedzi komórek dendrytycznych płuc na inne patogeny, a także na inne czynniki eksperymentalne.

analysis-pulmonary-dendritic-cell-maturation-migration-during

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc w trakcie alergicznego zapalenia dróg oddechowych

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Komórki odpornościowe rezydujące w płucach, w tym komórki dendrytyczne (DC) u ludzi, są kluczowe dla obrony przed wziewnymi patogenami i alergenami. Jednak ze względu na niedobór ludzkiej tkanki płucnej badania są ograniczone. W pracy przedstawiono protokoły przetwarzania biopsji wewnątrzoskrzelowych błony śluzowej człowieka do badania DC płuc z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej.

Ludzkie komórki dendrytyczne płuc: dystrybucja przestrzenna i identyfikacja fenotypowa w biopsjach wewnątrzoskrzelowych z wykorzystaniem immunohistochemii i cytometrii przepływowej

Opisujemy metodę generowania precyzyjnie wycinanych plastrów płuc (PCLS) i ich barwienia immunologicznego, aby zobrazować lokalizację różnych typów komórek odpornościowych w płucach. Nasz protokół można rozszerzyć w celu wizualizacji lokalizacji i funkcji wielu różnych typów komórek w różnych warunkach.

Precyzyjnie wycięte plastry płuc myszy do wizualizacji żywych komórek dendrytycznych płuc

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i charakterystyki tolerogennych komórek dendrytycznych (TolDCs) oraz oceny ich immunoterapeutycznej użyteczności.

Rozwój i charakterystyka funkcjonalna mysich tolerogennych komórek dendrytycznych

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu zalecanych procedur oceny funkcji oddechowych u świadomych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii.

Ocena funkcji oddechowych u przytomnych myszy za pomocą dwukomorowej pletyzmografii

Wprowadzony tutaj protokół pozwala na scharakteryzowanie zdolności naprowadzania płuc pierwotnych ludzkich limfocytów w warunkach zapalnych in vivo. Naciek płucny adoptywnie przeniesionych ludzkich komórek odpornościowych w mysim modelu alergicznego zapalenia można zobrazować i określić ilościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej arkusza świetlnego chemicznie oczyszczonej tkanki płucnej.

Zaawansowane obrazowanie ludzkich limfocytów naprowadzających płuca w eksperymentalnym modelu zapalenia alergicznego in vivo opartym na mikroskopii arkuszowej światła

W tym protokole, limfocyty są umieszczane w górnej komorze systemu transmigracyjnego, oddzielone od dolnej komory porowatą błoną. Do dolnej komory dodaje się chemokinę, która indukuje aktywną migrację wzdłuż gradientu chemokin. Po 48 godzinach limfocyty są liczone w obu komorach w celu ilościowego określenia transmigracji.

Ocena migracji limfocytów w systemie transmigracji ex vivo

Ten protokół opisuje użycie cytometrii przepływowej do identyfikacji zmian w składzie komórek odpornościowych, profilu cytokin i profilu chemokiny w środowisku płucnym po przejściowym zamknięciu tętnicy środkowej mózgu, mysim modelu udaru niedokrwiennego.

Charakterystyka komórek odpornościowych i mediatorów prozapalnych w środowisku płucnym

Tutaj udostępniamy protokół do badania potencjalnych czynników transkrypcyjnych zaangażowanych w rozwój komórek dendrytycznych (DC) za pomocą lentiwirusowej transdukcji shRNA w celu uzyskania stabilnych linii komórkowych knockdown do różnicowania DC in vitro.

Badanie rozwoju komórek dendrytycznych przez knockdown genów za pośrednictwem krótkiej spinki do włosów za pośrednictwem RNA w linii komórek hematopoetycznych i progenitorowych in vitro

W tym badaniu prezentujemy skuteczny i powtarzalny protokół izolowania populacji immunologicznych mysiego układu oddechowego. Zapewniamy również metodę identyfikacji wszystkich wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych, które znajdują się w płucach zdrowych myszy, przy użyciu 9-kolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Poznaj metodę analizy dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc u myszy podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego owalbuminą. Technika ta pozwala badać dynamikę odpowiedzi immunologicznej.

Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Przeglądaj więcej filmów