Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych w płucach podczas alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych

Celem niniejszej procedury jest ocena dojrzewania i migracji płucnych komórek dendrytycznych (DC) w przebiegu alergicznego stanu zapalnego dróg oddechowych indukowanego Val Boomin u myszy. Jest to realizowane poprzez uprzednią sensytyzację myszy Val Boomin, a następnie prowokację dróg oddechowych Val Boomin znakowanym fitsy. Następnie pobierane są płuca oraz węzły chłonne śródpiersia.

Na koniec z tkanek płuc i węzłów chłonnych przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek. W końcowym etapie, za pomocą analizy cytometrycznej, można ocenić stopień dojrzałości oraz absolutną liczbę komórek dendrytycznych w węzłach chłonnych śródpiersia po wyzwaniu FITC Val Boomin. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące odpowiedzi immunologicznej płuc, takie jak to, czy komórki dendrytyczne ulegają dojrzewaniu po ekspozycji na antygen oraz czy migrują one do drenujących węzłów chłonnych.

A jeśli migrują, to z jaką prędkością zachodzi ta migracja. Rozpocznij od dodawania kroplami świeżo przygotowanego roztworu Val Boomin w stosunku jeden do jednego do probówki z ałunem podczas wirowania w vorteksie. Mieszaj mieszaninę przez 30 minut, a następnie nabierz do strzykawki o pojemności 1 ml 0,2 ml mieszaniny.

Chwytając mysz kciukiem i palcem wskazującym jednej ręki za kark, blisko podstawy czaszki, wstrzyknij drugą ręką roztwór ałunu Val Boomin do jamy otrzewnej zwierzęcia. Siedem dni po drugim wstrzyknięciu Val w ałunie, utrzymaj znieczulone zwierzę uwrażliwione na Val w ałunie w pozycji pionowej, a następnie za pomocą sterylnych końcówek do pipet nanieś kroplowo 100 µL świeżo przygotowanego roztworu val in fxi na NAS myszy.

Zacznij od przymocowania kaniuli o rozmiarze 20 G do strzykawki o pojemności 1 ml. Następnie, po potwierdzeniu uśmiercenia myszy, otwórz jamę klatki piersiowej zwierzęcia aż do szyi, aby odsłonić i zakanulować tchawicę myszy. Jest to absolutnie krytyczne, aby przeprowadzić laważ płuc oraz perfuzję serca, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczające makrofagi pęcherzykowe oraz komórki mononuklearne obecne we krwi obwodowej zostały usunięte.

Kolejne dwa kroki należy wykonać ostrożnie i oczywiście z pewną ręką. Teraz należy podać lodowaty PBS z EDTA trzy razy przez cewnik, aby wypłukać dolne drogi oddechowe i usunąć komórki z przestrzeni pęcherzykowatych. Następnie, po wyposażeniu strzykawki o pojemności 10 ml w igłę o rozmiarze 20 G, należy przeprowadzić perfuzję płuc przy użyciu 10 ml PBS z heparyną poprzez prawą komorę serca.

Usuwanie pozostałych komórek krwi z naczyń krwionośnych płuc uznaje się za zakończone, gdy płuca staną się białe. Następnie należy usunąć węzły chłonne śródpiersia, umieszczając je w oddzielnym naczyniu. Aby zapobiec gaszeniu fluorescencji, należy zminimalizować ekspozycję tkanki na światło.

Następnie należy wypreparować perfundowane płuca i umieścić je w szalce Petriego, a następnie rozdrobnić płuca za pomocą nożyczek. Kolejnym krokiem jest trawienie tkanki płucnej w temperaturze 37°C w roztworze kolagenazy D o stężeniu 250 units/mL. Po 25 minutach inkubacji do mieszaniny należy dodać EDTA na pięć minut, aby zatrzymać aktywność kolagenazy. Na koniec fragmenty strawionych płuc należy przepuścić przez sito komórkowe o oczkach 100 µm i poddać erytrocyty lizie za pomocą buforu hipotonicznego.

Oddziel węzły chłonne śródpiersia za pomocą cienkich igieł i poddaj je trawieniu kolagenazą, tak jak zademonstrowano wcześniej dla płuc, a następnie przefiltruj tkankę przez sitko komórkowe po podaniu domięśniowym, sensytyzacji i wyzwoleniu w drogach oddechowych. Obecność komórek zapalnych można ocenić za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną w reprezentatywnych przekrojach płuc z grupy kontrolnej.

W przypadku zwierząt traktowanych solą fizjologiczną tkanki są pozbawione stanu zapalnego, co obrazuje górna grafika. W przeciwieństwie do nich, w przekrojach płuc zwierząt uczulonych i poddanych prowokacji, traktowanych Val, komórki zapalne występują powszechnie, co widać na dolnej grafice. Do oceny produkcji śluzu można wykorzystać barwienie kwasem okresowym, co przedstawiono na tej dolnej grafice.

Indukcja alergicznego zapalenia dróg oddechowych po wyzwoleniu wal w myszach uczulonych na wal jest potwierdzona obecnością śluzu. Przeciwnie, całkowity brak produkcji śluzu wykazują myszy kontrolne traktowane solą fizjologiczną, jak pokazano na górnej grafice; po wyzwoleniu wal płucne dcs przechodzą dojrzewanie i następującą po nim migrację do drenujących węzłów chłonnych.

Przedstawiona tutaj reprezentatywna analiza węzłów chłonnych śródpiersia myszy wykazuje, że umiarkowany, lecz spójny wzrost proporcji komórek CD 11 C pozytywnych jest wykrywalny u zwierząt uczulonych i wystawionych na działanie Val Boomin w porównaniu z myszami traktowanymi solą fizjologiczną. Ponadto analiza bezwzględnej liczby komórek CD 11 C pozytywnych, CD 11 B pozytywnych i Val Boomin fits pozytywnych z węzłów chłonnych śródpiersia myszy uczulonych i wystawionych na działanie antygenu wykazuje, że u myszy po ekspozycji następuje kilkukrotnie większy wzrost liczby DC w porównaniu z zwierzętami traktowanymi solą fizjologiczną. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć bardzo dobrą wiedzę na temat naszej techniki analizy dojrzewania oraz migracji komórek dendrytycznych płuc.

Po pełnym opanowaniu tej techniki będzie można zmodyfikować ją w celu oceny odpowiedzi komórek dendrytycznych płuc na inne patogeny, a także na inne czynniki eksperymentalne.