Analiza dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc podczas alergicznego zapalenia dróg oddechowych

Celem tej procedury jest ocena dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc lub DC w przebiegu alergicznego zapalenia dróg oddechowych wywołanego Val Boomin u myszy. Osiąga się to poprzez uczulenie myszy najpierw za pomocą Val Boomin, a następnie prowokację dróg oddechowych za pomocą fitsy oznaczonego Val Boomin. Następnie pobiera się płuca i węzły chłonne śródpiersia.

Na koniec przygotowuje się zawiesinę jednokomórkową z tkanek płuc i węzłów chłonnych. Ostatecznie stan dojrzewania i bezwzględna liczba komórek dendrytycznych odczytanych przez Pullmana znalezionych w węźle chłonnym śródpiersia po prowokacji FITC Val Boomin można ocenić za pomocą analizy cytometrii przepływowej. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące odpowiedzi immunologicznej płuc, takie jak to, czy komórki dendretyczne ulegają dojrzewaniu, spadającej ekspozycji na antygen i czy migrują do węzłów chłonnych oceny.

A jeśli już migrują, to jaki jest ich tempo. Zacznij od dodania świeżo przygotowanego roztworu Val Boomin Dropwise w proporcji jeden do jednego w tubce ałunu podczas wirowania. Mieszaj mieszaninę przez 30 minut, a następnie napełnij strzykawkę o pojemności jednego mililitra 0,2 mililitra mieszanki.

Używając kciuka na palcu wskazującym jednej ręki, chwyć mysz, która ma zostać wstrzyknięta przez skrawek szyi w pobliżu podstawy czaszki. Następnie drugą ręką wstrzyknąć roztwór ałunu Val Boomin do jamy otrzewnowej myszy. Siedem dni po drugim wstrzyknięciu Val w ałun należy przytrzymać znieczulony val w uczulonym zwierzęciu w pozycji pionowej, a następnie za pomocą sterylnych końcówek do pipet przetrzeć pipetą 100 mikrolitrów i świeżo przygotowanym roztworem val w fxi na NAS myszy w sposób kroplowy.

Zacznij od podłączenia cewnika o rozmiarze 20 do jednego mililitra strzykawki. Następnie, po potwierdzeniu eutanazji myszy, otwórz klatkę piersiową zwierzęcia aż do szyi, aby odsłonić i kaniulować tchawicę myszy. Absolutnie konieczne jest płukanie płuc i obfite płukanie serca, aby upewnić się, że wszystkie zanieczyszczające makrofagi pęcherzykowe i komórki jednojądrzaste, które są obecne we krwi obwodowej, zostały usunięte.

I upewnij się, że wykonujesz te dwa kolejne kroki ostrożnie i oczywiście pewną ręką. Teraz podaj lodowaty PBS z EDTA trzy razy przez cewnik, aby przepłukać dolne drogi oddechowe i usunąć komórki z przestrzeni pęcherzykowych. Następnie, po założeniu 10-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 20, należy wykonać perfuzję płuc 10 mililitrami PBS zawierającego heparynę przez prawą komorę serca.

Usunięcie wszelkich pozostałych komórek krwi z układu naczyniowego płuc uważa się za zakończone, gdy płuca stają się białe. Następnie usuń węzły chłonne śródpiersia, umieszczając je w osobnym naczyniu. Zapobiegaj wygaszaniu pasowania, minimalizując ekspozycję tkanki na światło.

Następnie wypreparuj perfundowane płuca i umieść je na szalce Petriego za pomocą nożyczek, rozdrobnij płuca. Następnie trawić tkankę płucną w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 250 jednostkach na mililitr kolagenazy D. Po 25 minutach inkubacji dodaj EDTA do mieszaniny na pięć minut, aby zatrzymać aktywność kolagenazy. Na koniec przepuść fragmenty strawionych płuc przez sitko do komórek o wielkości 100 mikronów i połóż erytrocyty z hipotonicznym buforem.

Rozdzielić węzły chłonne śródpiersia za pomocą cienkich igieł i trawić je kolagenazą, jak właśnie wykazano dla płuc, a następnie przecedzić tkankę przez sitko komórkowe po dootrzewnie, uczuleniu i drogach oddechowych. Val w wyzwaniu. Obecność komórek zapalnych można ocenić za pomocą barwienia hematów, toin i eozyny w reprezentatywnych odcinkach płuc z kontroli.

Zwierzęta leczone solą fizjologiczną, tkanki są pozbawione stanu zapalnego, jak pokazano na górnej grafice. W przeciwieństwie do tego, komórki zapalne są wszechobecne w odcinkach płuc od Val u zwierząt uczulonych i prowokowanych, co można zobaczyć na dole. Graficzne, okresowe barwienie kwasem może być użyte do oceny produkcji śluzu, jak pokazano na tej dolnej grafice.

Indukcja alergicznego zapalenia dróg oddechowych po val in prowokacji w Val u uczulonych myszy jest potwierdzona obecnością śluzu. I odwrotnie, całkowity brak produkcji śluzu objawia się kontrolą. Myszy leczone solą fizjologiczną, jak pokazano na górnej grafice po val w prowokacyjnym płucnym dcs, przechodzą dojrzewanie, a następnie migrację do drenujących węzłów chłonnych.

Tutaj reprezentatywna analiza węzłów chłonnych śródpiersia myszy pokazuje, że skromny, ale konsekwentny wzrost odsetka komórek CD 11 C dodatnich wykrywa się u zwierząt uczulonych i prowokowanych Val Boomin w porównaniu z myszami leczonymi solą fizjologiczną. Co więcej, analiza bezwzględnej liczby komórek CD 11 C dodatnich CD 11 B dodatnich Val Boomin dopasowuje C dodatnie komórki z śródpiersia węzłów chłonnych Val u myszy uczulonych i prowokowanych pokazuje, że u myszy z prowokacją występuje kilkukrotnie wyższy wzrost liczby DC w porównaniu ze zwierzętami leczonymi solą fizjologiczną. Po obejrzeniu tego filmu powinniśmy mieć naprawdę dobre zrozumienie naszej techniki analizy dojrzewania i migracji komórek dendrytycznych płuc.

A kiedy naprawdę zrozumiesz tę technikę, możesz przejść do jej modyfikacji, aby ocenić reakcje komórek dendrytycznych płuc na inne patogeny, a także inne czynniki eksperymentalne.