Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę indukowania katarakty u szczura przy użyciu promieniowania ultrafioletowego. Mechanizmy molekularne zaangażowane w rozwój katarakty są następnie badane z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym oraz immunocytochemii. W pierwszej kolejności oko szczura jest poddawane działaniu promieniowania ultrafioletowego w celu wywołania powstania katarakty.

Drugie oko służy jako kontrola. Następnie soczewki są wycinane i przetwarzane w celu uzyskania RNA do oceny poziomów ekspresji CAS B za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym lub barwione z użyciem przeciwciała przeciwko rozszczepionej kaspazie 3 w celu oceny ekspresji i lokalizacji aktywnego białka.

Ostatecznie wyniki tych analiz potwierdzają wzrost poziomu mRNA kazpazy 3 oraz ekspresji aktywnego białka w jądrach komórek soczewki po ekspozycji na UVR. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami jest zastosowanie unikalnego wąskopasmowego źródła UVR oraz uniwersalnego stabilizatora szczurów, co pozwala na bezpieczne i precyzyjne naświetlanie zwierząt przy ściśle określonym spektrum i dawce UV. Ponadto zastosowaliśmy nowoczesne techniki biologiczne, ilościowe RT-PCR oraz immunohistochemię w celu zbadania apoptozy w soczewce; opisana metoda może dostarczyć informacji o mechanizmach molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem ultrafioletowym.

Można go również zastosować w innych modelach eksperymentalnych, takich jak nowotwory skóry indukowane promieniowaniem ultrafioletowym, neuronauka behawioralna szczurów oraz eksperymentalne badania oka z koncentracją na apoptozie. Rozpocznij procedurę, umieszczając znieczuloną samicę szczura rasy Sprague-Dawley w stabilizatorze dla szczurów i, nie uciskając tułowia, zaciśnij pasy, aż szczur zostanie unieruchomiony. Aby wywołać midriazę lub rozszerzenie źrenic, zakropl do każdego oka od jednej do dwóch kropli roztworu tropicamidu w stężeniu 10 mg/ml.

Następnie nałóż maść na oko nieeksponowane i zabezpiecz je czarną taśmą, aby zablokować promieniowanie UV. Potem umieść zwierzę w stabilizatorze w taki sposób, aby odsłonięte oko znajdowało się w pozycji umożliwiającej odebranie wąskiej wiązki promieniowania ultrafioletowego o długości fali 300 nanometrów z pełną szerokością połówki maksymalnej wynoszącą 10 nanometrów, generowanej przez lampę rtęciową wysokociśnieniową. Poddaj szczura jednostronnej ekspozycji na dawkę podprogową 1 kilodżul na metr kwadratowy UVRB przez 15 minut po naświetlaniu.

Zdejmij taśmę z oka nieeksponowanego i nałóż maść do obu oczu. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i przykryj je miękkim papierem, aby utrzymać ciepłotę ciała. Monitoruj zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżenia na brzuchu.

Następnie umieść wybudzonego szczura z powrotem w klatce z pozostałymi osobnikami. 1, 5, 24 i 120 godzin po ekspozycji.

Umieść enukleowane oko uśpionego szczura rogówką do dołu i stroną tylną do góry na miękkiej chusteczce papierowej. Następnie, pracując pod mikroskopem operacyjnym, użyj kaniuli o rozmiarze 27G, aby wykonać niewielki otwór, naciskając stycznie do twardówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki, która znajduje się bardzo blisko twardówki.

Następnie, używając nożyczek do chirurgii okulistycznej, wykonaj cięcie okrężne tuż za limbusie, aż tylna część twardówki zostanie oddzielona. Następnie za pomocą tępych pęset zakrzywionych unieś soczewkę, umieść ją w zrównoważonym roztworze soli i usuń z soczewki pozostałości ciała rzęskowego. Soczewka nie powinna pozostawać w zrównoważonym roztworze soli przez więcej niż 10 minut.

Po przeprowadzeniu sekcji umieść soczewkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml zawierającej 350 µl buforu do lizy RA1 z zestawu do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II oraz 3,5 µl β-merkaptoetanolu. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji użyj igły do mechanicznego homogenizowania soczewki, aż pozostanie jedynie twarde jądro. Kora i torebka soczewki zostaną poddane lizie w buforze do lizy.

Usuń jądro z mieszaniny i zutylizuj je. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -70 °C. Próbki można przechowywać do jednego roku do momentu dalszego procedowania.

Przesiewaj próbki i oczyszczaj RNA zgodnie z protokołem oczyszczania całkowitego RNA z hodowli komórkowych i tkanek zawartym w zestawie. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -70 °C. Aby zweryfikować stopień usunięcia DNA z każdej próbki, przeprowadź amplifikację DNA przy użyciu specyficznych starterów dla DNA p53 w następujących warunkach.

Krok 1: 95°C przez dwie minuty. Krok 2: przez 40 cykli: 95°C przez 20 sekund, 55°C przez 20 sekund.

72°C przez 20 sekund. Krok 3: 72°C przez siedem minut. Po zakończeniu procesu produkty należy rozdzielić na żelu AROS 1,5%.

Aby wykryć specyficzny dla PCR produkt DNA o długości 243 par zasad, należy koniecznie uwzględnić próbkę kontrolną pozytywną i negatywną. Jeśli DNA zostało pomyślnie usunięte, produkty PCR nie będą widoczne. Prążek powinien pojawić się wyłącznie w ścieżce kontroli pozytywnej; należy użyć spektrofotometru NanoDrop do pomiaru stężenia próbek RNA i określenia stosunku RNA do białka.

Jeśli stosunek absorbancji próbki RNA przy 260 nm do 280 nm wynosi 2,0 lub więcej, oznacza to, że próbka RNA jest czysta. Następnie, wykorzystując 1 µg RNA, przeprowadza się syntezę cDNA za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA dla RT-PCR; próbki cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W celu wykonania ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym próbki nanosi się w trzech powtórzeniach na płytkę 96-dołkową.

Każda studzienka powinna zawierać 1 µL próbki cDNA połączonej z TAC man gene expression, master mix tac man gene expression assay dla kaspazy 3 na oddzielnej płytce. Należy zastosować te same próbki, lecz wykorzystując TAC man gene expression assay dla 18 s. Następnie, aby wygenerować krzywą standardową do analizy, należy wykonać rozcieńczenia seryjne 1 µL cDNA z trzech losowo wybranych soczewek niepoddanych ekspozycji.

Przygotuj rozcieńczenia seryjne wraz z cDNA z próbek. Użyj płytki 96-dołkowej, wykonując tę procedurę na każdej płytce. Odwiruj płytkę, a następnie przeprowadź reakcję w systemie do detekcji PCR w czasie rzeczywistym iCycler iQ, jednobarwnym.

Po zakończeniu analizy, przy użyciu oprogramowania iQ, wyznacz krzywą wzorcową przedstawiającą liczbę cykli do osiągnięcia progu (Ct) jako funkcję względnego stężenia kalibratora dla rozcieńczeń seryjnych na każdej płytce. Wykorzystaj krzywą wzorcową do określenia względnego stężenia cDNA w próbce na podstawie liczby cykli do osiągnięcia progu dla każdej próbki.

Na koniec określ poziom ekspresji genów docelowych, odnosząc względne stężenie cDNA genów docelowych do wewnętrznej kontroli cDNA 18 s. W celu wykonania barwienia immunohistochemicznego, wypreparuj oko i po wypreparowaniu umieść je w PBS. Przenieś oko do probówki wypełnionej 4%paraformaldehydem i inkubuj na lodzie przez 20 minut.

Za pomocą mikropipety usuń paraformaldehyd. Następnie przenieś gałkę oczną do probówki typu Eppendorf o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS i inkubuj przez 20 minut w lodzie. Następnie przenieś gałkę oczną do probówki typu Eppendorf zawierającej 30% sacharozy.

Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia za pomocą pęsety przenieść oko do pojemnika wypełnionego medium OCT (optimal cutting temperature). Ułożyć oko w pozycji prostej w celu wykonania przekrojów.

Następnie umieść probówkę na suchem lodzie, aby zamrozić i przechowywać ją w temperaturze -70 °C do czasu wykonania skrawków oka do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rozpocznij od umieszczenia oka zatopionego w OCT na uchwycie w kriostacie w celu wykonania krioskrawków. Postaraj się ustawić płaską stronę soczewki oka równolegle do krawędzi noża.

Wyciąć trzy seryjne przekroje strzałkowe o grubości 5 µm z centralnej części każdej soczewki. Odrzucić co najmniej sześć przekrojów pomiędzy kolejnymi sekcjami, aby uniknąć barwienia tych samych jąder w różnych przekrojach. Po wycięciu przekroju ostrożnie położyć na nim szkiełko.

Przekrój powinien wówczas przylegać do szkiełka. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu barwienia.

Pozostawić preparaty do momentu osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie przeprowadzić barwienie przeciwciałami w celu identyfikacji rozszczepionego CAS fazy trzeciej zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; po kilku godzinach zbadać preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym. Policzyć wszystkie jądra komórek nabłonkowych soczewki.

Zarejestruj liczbę wszystkich jąder komórek nabłonkowych soczewki poprzez policzenie komórek barwionych DAPI oraz liczbę jąder dodatnich pod kątem kaspazy-3 poprzez policzenie komórek znakowanych aktywną kaspazą-3. Policz komórki trzykrotnie dla każdego przekroju.

Kaspaza 3 jest główną proteazą w etapie wykonawczym apoptozy. Mikroskopia elektronowa w transmitowanym wiązce elektronów. Badania potwierdzają, że UVR indukuje apoptozę w soczewce.

Badania eksperymentalne nad apoptozą potwierdzają, że kaspaza 3 jest wiarygodnym markerem apoptozy. Aby ustalić, czy ekspozycja na UVR in vivo indukuje ekspresję kaspazy 3, zmierzono ekspresję mRNA w soczewce oka za pomocą QPCR w czasie 1, 5, 24 i 120 godzin po ekspozycji in vivo na dawkę 1 kJ/m² UVR o długości fali 300 nm. Następnie dla każdego punktu czasowego wykreślono średni stosunek mRNA CASP3 do 18S rRNA pomiędzy soczewką eksponowaną a przeciwstawną soczewką nieeksponowaną.

Rycina ta przedstawia ekspresję mRNA kazapy 3 w czasie i obrazuje transkrypcję apoptozy. Analiza markera kazapy 3 w soczewce in vivo po ekspozycji na dalekie UVR w ramach testów ortogonalnych wykazała statystycznie istotną różnicę w sygnale mRNA kazapy 3 pomiędzy przedziałem latencji wynoszącym 120 godzin a krótszymi przedziałami latencji. Ekspresję kazapy 3 w soczewce eksponowanej i nieeksponowanej porównano również za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, co pokazano na obrazach wykonanych 24 godziny po ekspozycji; jądra komórkowe są oznakowane, co wskazuje na obecność aktywnej kazapy 3.

Ta metoda immunobarwienia dostarcza cennych informacji na temat rozmieszczenia przestrzennego komórek nabłonkowych w soczewce, znakowanych markerem apoptozy kaspazą 3. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak eksperymentalnie indukować zaćmę wywołaną UVR oraz jak badać mechanizm molekularny zaćmy indukowanej UVR przy użyciu ilościowej RT-PCR i immunohistochemii.