Name: Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej in vivo UVR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Poznaj metodę indukcji zaćmy promieniowaniem UV u szczurów i analizę molekularną za pomocą PCR i immunohistochemii. Model ten pozwala badać mechanizmy katarakty oraz apoptozy w soczewce oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez finansowanie KID Karolinska Institutet, Szwedzki Urząd Ochrony Radiologicznej, Fundację Badań nad Okiem Karolinska Institutet, Fundację Gun och Bertil Stohnes, Fundację Badawczą Szpitala Okulistycznego św. Eryka, Ögonfonden oraz Fundację Wolnomularską Króla Gustawa V i Królowej Viktorii.

1. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe
<ol>
	<li>Na 15 min przed naświetlaniem znieczulić samicę szczura Sprague-Dawley za pomocą mieszaniny 90 mg/kg Ketalaru (ketaminy) i 10 mg/kg Rompunu (ksylazyny), podanej w zastrzyku domięśniowym.</li>
	<li>Umieścić zwierzę w stabilizatorze dla szczurów i zaciągnąć pasy do momentu unieruchomienia szczura, tak aby nie doszło do nadmiernego ucisku tułowia 13.</li>
	<li>Podać Mydriacyl (tropikamid), 10 mg/ml, do obu oczu szczura w celu wywołania mydriasis.</li>
	<li>Ustawić zwierzę tak, aby jedno oko znajdowało się w wąskiej wiązce UVR o długości fali 300 nm 14 z szerokością połówkową 10 nm, a oko przeciwległe zasłonić czarną taśmą.</li>
	<li>Poddać szczura jednostronnej ekspozycji na podprogową dawkę 1 kJ/m2 UVR-B o długości fali 300 nm przez 15 min 15.</li>
</ol>
2. Disekcja
<ol>
	<li>Po upływie określonego przedziału czasu po ekspozycji (1, 5, 24 i 120 h), uśmierć sześciotygodniowego szczura (masa &lt; 200 g) poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla i zwichnięcie kręgów szyjnych.</li>
	<li>Wykonaj enukleację gałek ocznych. Następnie ułóż oko rogówką do dołu, a stroną tylną do góry. Wykonaj niewielki otwór za pomocą kaniuli 27G, przesuwając ją stycznie do twardówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki, która znajduje się bardzo blisko twardówki. Następnie, używając nożyczek do chirurgii okulistycznej, wykonaj cięcie okrężne tuż za limbusie, aż do momentu, gdy tylna część twardówki będzie mogła zostać oddzielona. Następnie wyjmij soczewkę za pomocą tępych pęsety zakrzywionej.</li>
	<li>Pod mikroskopem usuń pozostałości ciała rzęsistego z równika soczewki, utrzymując soczewkę w zrównoważonym roztworze soli nie dłużej niż przez 5-10 min.</li>
</ol>
3. Ilościowa RT-PCR
<ol>
	<li>Umieścić soczewkę w mieszaninie 350 μl buforu lizującego RA1 (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II) i 3,5 μl β-merkaptoetanolu w probówce Eppendorfa o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Przechowywać soczewkę w tej mieszaninie przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Homogenizować soczewkę za pomocą igły, aż z soczewki pozostanie jedynie twarde jądro (kora i torebka soczewki ulegają lizie w buforze lizującym). Usunąć jądro z mieszaniny.</li>
	<li>Próbki należy niezwłocznie przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Rozmrozić próbki i postępować zgodnie z protokołem „Oczyszczanie całkowitego RNA z hodowli komórkowych i tkanek” (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II).</li>
	<li>Próbki RNA przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Aby zweryfikować wystarczające usunięcie DNA z każdej próbki, przeprowadzić reakcję PCR w następujących warunkach (krok 1: 95 °C przez 2 min; krok 2 przez 40 cykli: 95 °C przez 20 sec, 55 °C przez 20 sec, 72 °C przez 20 sec; krok 3: 72 °C przez 7 min) z wykorzystaniem specyficznych starterów dla DNA p53, naprzód (forward) 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3' i wstecz (reverse) 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' oraz polimerazy Taq DNA (dNTPack), zgodnie z protokołem producenta. Oczekiwany produkt PCR ma 243 pary zasad.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę na 1,5 % żelu agarozowym w celu wykrycia specyficznego produktu PCR DNA o długości 243 par zasad. Aby przygotować 1,5 % żel agarozowy w buforze TBE, odważyć 3,75 g agarozy i rozpuścić ją w 250 ml buforu TBE. Dodać 500 μl bromku etydium (0,5 mg/ml) do 500 ml roztworu 1,5 % żelu agarozowego. Podgrzać mieszaninę w kuchence mikrofalowej i mieszać do całkowitego rozpuszczenia agarozy.</li>
</ol>
Żadna z próbek nie może wykazywać specyficznych dla DNA produktów PCR w elektroforezie nażelowej na 1,5 % żelu agarozowym.
<ol start="9">
	<li>Zmierz stężenie próbek RNA (1 μl) oraz stosunek absorbancji próbki przy 260 nm (RNA) i 280 nm (białko) w spektrofotometrze NanoDrop ND-1000. Jeśli stosunek absorbancji RNA do białka wynosi 2,0 lub więcej, próbka RNA jest czysta. Jeśli stosunek absorbancji próbki RNA jest niższy niż 2,0, powtórz krok 3.5 oczyszczania RNA.</li>
	<li>Odmij dokładnie objętość próbki RNA odpowiadającą 1 μg i przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z protokołem zestawu 1st Strand cDNA synthesis Kit (1st Strand cDNA synthesis Kit for RT-PCR).</li>
	<li>Próbki cDNA przechowuj w temperaturze -20 °C (w przypadku przechowywania przez rok lub dłużej, przechowuj w temperaturze -70 °C).</li>
	<li>Przeprowadź ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym w systemie detekcji iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR. Na płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla kaspazy 3, zgodnie z instrukcjami producenta. Na kolejną płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla 18s, zgodnie z instrukcjami producenta (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Wykonaj szereg rozcieńczeń cDNA z trzech losowo wybranych soczewek niepoddanych ekspozycji. Rozcieńczenia seryjne przeprowadź razem z cDNA z próbek na jednej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Do ilościowego oznaczenia wyników zastosuj metodę krzywej standardowej. Jako pomiar w oprogramowaniu MyiQ przyjmuje się liczbę cykli w punkcie progowym fluorescencji. Dla rozcieńczeń seryjnych na każdej płytce wyznaczono krzywą standardową opisującą liczbę cykli w punkcie progowym jako funkcję względnego stężenia kalibratora. Do kalibracji wykorzystano cDNA z trzech próbek soczewek niepoddanych działaniu czynnika. Odnieś liczbę cykli progowych dla każdej próbki do krzywej standardowej, aby uzyskać względne stężenie zmierzonego cDNA z próbki. Na koniec oblicz poziom ekspresji genów docelowych, odnosząc względne stężenie cDNA genu docelowego do cDNA wewnętrznej kontroli 18s.</li>
</ol>
4. Barwienie immunohistochemiczne
<ol>
	<li>Fiksacja
	<ol>
		<li>Przeprowadzić dysekcję oka w PBS (buforze fosforanowym; pH 7,4).</li>
		<li>Umieścić oko w probówce wypełnionej 4 % paraformaldehydem (PFA) w temperaturze lodowej na 20 min. PFA 4 % przygotować dzień wcześniej. Przechowywać w temperaturze +4 °C do momentu użycia. PFA zachowuje świeżość przez około jeden tydzień.</li>
		<li>Usunąć PFA za pomocą mikropipety. Następnie przemyć lodowatym PBS przez 20 min.</li>
		<li>Umieścić oko w 30 % sacharozie w temperaturze +4 °C przez noc.</li>
		<li>Umieścić oko w naczyniu wypełnionym medium OCT (Optimal Cutting Temperature) (Tissue-Tek). Ułożyć oko w pozycji odpowiedniej do sekcjonowania.</li>
		<li>Zamrozić w medium OCT nad suchym lodem.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcjonowanie
	<ol>
		<li>Ułożyć oko do kriosekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie.</li>
		<li>Wyciąć trzy przekroje strzałkowe o grubości 5 μm z części centralnej każdej soczewki. Odrzucić co najmniej 6 sekcji pomiędzy kolejnymi przekrojami, aby uniknąć barwienia tych samych jąder w różnych sekcjach.</li>
		<li>Po wycięciu sekcji delikatnie położyć na niej szkiełko. Sekcja powinna wówczas przykleić się do szkiełka.</li>
		<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu zapotrzebowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Pozostawić próbki do osiągnięcia temperatury pokojowej (5-10 min).</li>
		<li>Obrysować krawędzie wokół preparatów za pomocą PAP-pen (Invitrogen).</li>
		<li>Pozostawić obramowanie do wyschnięcia (10 min).</li>
		<li>Opisać szkiełka mikroskopowe.</li>
		<li>Rehydratować w 1 × PBS przez 15 min.</li>
		<li>Przeprowadzić permeabilizację w standardowym roztworze blokującym przez 30 min.</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko cleaved caspase-3 Asp175 9661; Cell Signalling Technology, Inc) rozcieńczone 1:3 000 w standardowym roztworze blokującym.</li>
		<li>Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze +4 °C przez noc.</li>
		<li>Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (&gt;15 min, 1-2 wymiany).</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (przeciwkrólicze przeciwciało drugorzędowe o specyficznym widmie absorpcji/emisji) rozcieńczone 1:300 w standardowym roztworze blokującym.</li>
		<li>Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (&gt;15 min, 1-2 wymiany).</li>
		<li>Zetrzeć ślady PAP-pen.</li>
		<li>Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze pokojowej przez 3 h. Unikać ekspozycji na światło.</li>
		<li>Dodać kroplę Vectashield i nałożyć szkiełko cover-slip na preparat. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pozostawić Vectashield do stwardnienia (~20 min).</li>
		<li>Przechowywać sekcje w ciemności do momentu analizy.</li>
		<li>Wszystkie sekcje kontrolne są przetwarzane bez zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
		<li>Analizować wyniki po kilku godzinach pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Policzyć jądra komórek nabłonkowych od jednego łuku jądrowego do drugiego łuku jądrowego każdej soczewki. Zastosować standardowy filtr niebieski, aby uwidocznić wszystkie jądra nabłonka soczewki na niebiesko, oraz standardowy filtr dopasowany do emisji przeciwciała drugorzędowego, aby uwidocznić jądra dodatnie dla caspase-3 na zielono.</li>
		<li>Zarejestrować liczbę wszystkich jąder nabłonkowych soczewki oraz liczbę jąder dodatnich. Przeliczyć komórki trzykrotnie dla każdej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza praca opisuje metody umożliwiające badanie zdarzeń molekularnych zachodzących podczas katarakty indukowanej promieniowaniem UVR-B.
Biorąc pod uwagę, że większość dostępnych informacji na temat zaćmy indukowanej promieniowaniem UV in vivo pochodzi z eksperymentów przeprowadzonych na albinosach szczurów Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, w niniejszym badaniu zdecydowaliśmy się wykorzystać szczury Sprague-Dawley typu albino. Wiek szczurów wynosił sześć tygodni. Wybran...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numer katalogowy&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Uwagi (opcjonalnie)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ketalar</td><td>Pfizer</td><td>150086</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>022545</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Oculentum Simplex</td><td>Apoteket, Szwecja</td><td>336164</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Mydriacyl</td><td>Alcon</td><td>00352</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>Alcon</td><td>0007950055</td><td></td></tr><tr><td>3,5 µL &amp;beta;-merkaptoetanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel GmbH&amp;amp;Co, Duren, Niemcy</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>Specyficzne primery do DNA p53</td><td>biomers.net GmbH</td><td>Zamówienie indywidualne</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq, dNTPack</td><td>Roche</td><td>04 728 866 001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny 0,5 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>E1385</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nano-Drop ND-1000</td><td>NanoDrop Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA pierwszej nici 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; do RT-PCR (AMV)</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11 483 188 001</td><td></td></tr><tr><td>System detekcji Real Time PCR iCycler MyiQ Single Color</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.202</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan Gene Expression dla kaspazy 3</td><td>Applied Biosystems</td><td>Rn00563902_m1</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan Gene Expression dla 18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs99999901_s1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MyiQ</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175)</td><td>Cell signaling technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko króliki IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab6798</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny mikroskop Axioplan 2 Imaging</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE 10x</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem uvr in vivo

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie 1. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje kataraktę jako zmętnienie soczewki oka, które utrudnia przenikanie światła. Katarakta jest chorobą wieloczynnikową, powiązaną z cukrzycą, paleniem tytoniu, promieniowaniem ultrafioletowym (UVR), spożyciem alkoholu, promieniowaniem jonizującym, stosowaniem steroidów oraz nadciśnieniem tętniczym. Istnieją silne dowody eksperymentalne 2-4 oraz epidemiologiczne 5,6 wskazujące na to, że UVR wywołuje kataraktę. Opracowaliśmy model zwierzęcy katarakty indukowanej promieniowaniem UVR B zarówno u zwierząt znieczulonych 7, jak i nieznieszyczulonych 8.
Jedyną metodą leczenia zaćmy jest operacja, jednak nie każda osoba ma do niej dostęp. Szacuje się, że opóźnienie wystąpienia zaćmy o 10 lat mogłoby zredukować zapotrzebowanie na operacje zaćmy o 50% 9. Aby opóźnić występowanie zaćmy, konieczne jest zrozumienie mechanizmów jej powstawania oraz znalezienie skutecznych strategii zapobiegawczych. Wśród mechanizmów rozwoju zaćmy apoptoza odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu tego procesu u ludzi i zwierząt 10. W naszych ostatnich badaniach skupiliśmy się na apoptozie w soczewce jako mechanizmie rozwoju zaćmy 8,11,12. Przewiduje się, że lepsze zrozumienie wpływu UVR na szlak apoptozy otworzy możliwości odkrycia nowych produktów farmaceutycznych zapobiegających zaćmie.
W niniejszym artykule opisujemy, w jaki sposób można eksperymentalnie wywołać zaćmę poprzez ekspozycję in vivo na promieniowanie UVR-B. Ponadto przedstawiamy metodę RT-PCR oraz immunohistochemię jako narzędzia do badania molekularnych mechanizmów zaćmy wywołanej przez UVR-B.

Różne źródła zmienności w pomiarach oszacowano za pomocą analizy wariancji, stwierdzając, że przy trzech pomiarach na zwierzę wariancja pomiarowa wynosiła około 15% wariancji między zwierzętami. Zatem w przypadku analizy całego soczewki zwiększenie precyzji nie jest możliwe. Testy ortogonalne wykazały statystycznie istotny kontrast dla poziomu mRNA kaspazy-3 pomiędzy 120 h odstępu utajenia a krótszymi odstępami utajenia.
In vivo ekspozycja na UVR indukuje ekspresję kaspazy-3.
<p c...

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie. Promieniowanie ultrafioletowe (UVR) pochodzące ze słońca stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju katarakty. Opracowano model zwierzęcy katarakty indukowanej dalekim UVR-B. W niniejszym artykule opisujemy metody badania powstawania katarakty: ekspozycję na UVR, ilościową RT-PCR oraz immunohistochemię.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Zaćma jest główną przyczyną ślepoty na świecie 1. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje zaćmę jako zmętnienie soczewki oka, które ...

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę indukowania katarakty u szczura przy użyciu promieniowania ultrafioletowego. Mechanizmy molekularne zaangażowane w rozwój katarakty są następnie badane z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym oraz immunocytochemii. W pierwszej kolejności oko szczura jest poddawane działaniu promieniowania ultrafioletowego w celu wywołania powstania katarakty.Drugie oko służy jako kontrola. Następnie soczewki są wycinane i przetwarzane w celu uzyskania RNA do oceny poziomów ekspresji CAS B za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym lub barwione z użyciem przeciwciała przeciwko rozszczepionej kaspazie 3 w celu oceny ekspresji i lokalizacji aktywnego białka.Ostatecznie wyniki tych analiz potwierdzają wzrost poziomu mRNA kazpazy 3 oraz ekspresji aktywnego białka w jądrach komórek soczewki po ekspozycji na UVR. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami jest zastosowanie unikalnego wąskopasmowego źródła UVR oraz uniwersalnego stabilizatora szczurów, co pozwala na bezpieczne i precyzyjne naświetlanie zwierząt przy ściśle określonym spektrum i dawce UV. Ponadto zastosowaliśmy nowoczesne techniki biologiczne, ilościowe RT-PCR oraz immunohistochemię w celu zbadania apoptozy w soczewce; opisana metoda może dostarczyć informacji o mechanizmach molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem ultrafioletowym.Można go również zastosować w innych modelach eksperymentalnych, takich jak nowotwory skóry indukowane promieniowaniem ultrafioletowym, neuronauka behawioralna szczurów oraz eksperymentalne badania oka z koncentracją na apoptozie. Rozpocznij procedurę, umieszczając znieczuloną samicę szczura rasy Sprague-Dawley w stabilizatorze dla szczurów i, nie uciskając tułowia, zaciśnij pasy, aż szczur zostanie unieruchomiony. Aby wywołać midriazę lub rozszerzenie źrenic, zakropl do każdego oka od jednej do dwóch kropli roztworu tropicamidu w stężeniu 10 mg/ml.Następnie nałóż maść na oko nieeksponowane i zabezpiecz je czarną taśmą, aby zablokować promieniowanie UV. Potem umieść zwierzę w stabilizatorze w taki sposób, aby odsłonięte oko znajdowało się w pozycji umożliwiającej odebranie wąskiej wiązki promieniowania ultrafioletowego o długości fali 300 nanometrów z pełną szerokością połówki maksymalnej wynoszącą 10 nanometrów, generowanej przez lampę rtęciową wysokociśnieniową. Poddaj szczura jednostronnej ekspozycji na dawkę podprogową 1 kilodżul na metr kwadratowy UVRB przez 15 minut po naświetlaniu.Zdejmij taśmę z oka nieeksponowanego i nałóż maść do obu oczu. Umieść zwierzę z powrotem w klatce i przykryj je miękkim papierem, aby utrzymać ciepłotę ciała. Monitoruj zwierzę, dopóki nie odzyska wystarczającej świadomości, aby utrzymać pozycję leżenia na brzuchu.Następnie umieść wybudzonego szczura z powrotem w klatce z pozostałymi osobnikami. 1, 5, 24 i 120 godzin po ekspozycji.Umieść enukleowane oko uśpionego szczura rogówką do dołu i stroną tylną do góry na miękkiej chusteczce papierowej. Następnie, pracując pod mikroskopem operacyjnym, użyj kaniuli o rozmiarze 27G, aby wykonać niewielki otwór, naciskając stycznie do twardówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki, która znajduje się bardzo blisko twardówki.Następnie, używając nożyczek do chirurgii okulistycznej, wykonaj cięcie okrężne tuż za limbusie, aż tylna część twardówki zostanie oddzielona. Następnie za pomocą tępych pęset zakrzywionych unieś soczewkę, umieść ją w zrównoważonym roztworze soli i usuń z soczewki pozostałości ciała rzęskowego. Soczewka nie powinna pozostawać w zrównoważonym roztworze soli przez więcej niż 10 minut.Po przeprowadzeniu sekcji umieść soczewkę w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 2 ml zawierającej 350 µl buforu do lizy RA1 z zestawu do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II oraz 3,5 µl β-merkaptoetanolu. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji użyj igły do mechanicznego homogenizowania soczewki, aż pozostanie jedynie twarde jądro. Kora i torebka soczewki zostaną poddane lizie w buforze do lizy.Usuń jądro z mieszaniny i zutylizuj je. Próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -70 °C. Próbki można przechowywać do jednego roku do momentu dalszego procedowania.Przesiewaj próbki i oczyszczaj RNA zgodnie z protokołem oczyszczania całkowitego RNA z hodowli komórkowych i tkanek zawartym w zestawie. Próbki RNA przechowuj w temperaturze -70 °C. Aby zweryfikować stopień usunięcia DNA z każdej próbki, przeprowadź amplifikację DNA przy użyciu specyficznych starterów dla DNA p53 w następujących warunkach.Krok 1: 95°C przez dwie minuty. Krok 2: przez 40 cykli: 95°C przez 20 sekund, 55°C przez 20 sekund.72°C przez 20 sekund. Krok 3: 72°C przez siedem minut. Po zakończeniu procesu produkty należy rozdzielić na żelu AROS 1,5%.Aby wykryć specyficzny dla PCR produkt DNA o długości 243 par zasad, należy koniecznie uwzględnić próbkę kontrolną pozytywną i negatywną. Jeśli DNA zostało pomyślnie usunięte, produkty PCR nie będą widoczne. Prążek powinien pojawić się wyłącznie w ścieżce kontroli pozytywnej; należy użyć spektrofotometru NanoDrop do pomiaru stężenia próbek RNA i określenia stosunku RNA do białka.Jeśli stosunek absorbancji próbki RNA przy 260 nm do 280 nm wynosi 2,0 lub więcej, oznacza to, że próbka RNA jest czysta. Następnie, wykorzystując 1 µg RNA, przeprowadza się syntezę cDNA za pomocą zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA dla RT-PCR; próbki cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. W celu wykonania ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym próbki nanosi się w trzech powtórzeniach na płytkę 96-dołkową.Każda studzienka powinna zawierać 1 µL próbki cDNA połączonej z TAC man gene expression, master mix tac man gene expression assay dla kaspazy 3 na oddzielnej płytce. Należy zastosować te same próbki, lecz wykorzystując TAC man gene expression assay dla 18 s. Następnie, aby wygenerować krzywą standardową do analizy, należy wykonać rozcieńczenia seryjne 1 µL cDNA z trzech losowo wybranych soczewek niepoddanych ekspozycji.Przygotuj rozcieńczenia seryjne wraz z cDNA z próbek. Użyj płytki 96-dołkowej, wykonując tę procedurę na każdej płytce. Odwiruj płytkę, a następnie przeprowadź reakcję w systemie do detekcji PCR w czasie rzeczywistym iCycler iQ, jednobarwnym.Po zakończeniu analizy, przy użyciu oprogramowania iQ, wyznacz krzywą wzorcową przedstawiającą liczbę cykli do osiągnięcia progu (Ct) jako funkcję względnego stężenia kalibratora dla rozcieńczeń seryjnych na każdej płytce. Wykorzystaj krzywą wzorcową do określenia względnego stężenia cDNA w próbce na podstawie liczby cykli do osiągnięcia progu dla każdej próbki.Na koniec określ poziom ekspresji genów docelowych, odnosząc względne stężenie cDNA genów docelowych do wewnętrznej kontroli cDNA 18 s. W celu wykonania barwienia immunohistochemicznego, wypreparuj oko i po wypreparowaniu umieść je w PBS. Przenieś oko do probówki wypełnionej 4%paraformaldehydem i inkubuj na lodzie przez 20 minut.Za pomocą mikropipety usuń paraformaldehyd. Następnie przenieś gałkę oczną do probówki typu Eppendorf o pojemności 2 ml zawierającej 1 ml schłodzonego do temperatury lodowej PBS i inkubuj przez 20 minut w lodzie. Następnie przenieś gałkę oczną do probówki typu Eppendorf zawierającej 30% sacharozy.Inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia za pomocą pęsety przenieść oko do pojemnika wypełnionego medium OCT (optimal cutting temperature). Ułożyć oko w pozycji prostej w celu wykonania przekrojów.Następnie umieść probówkę na suchem lodzie, aby zamrozić i przechowywać ją w temperaturze -70 °C do czasu wykonania skrawków oka do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Rozpocznij od umieszczenia oka zatopionego w OCT na uchwycie w kriostacie w celu wykonania krioskrawków. Postaraj się ustawić płaską stronę soczewki oka równolegle do krawędzi noża.Wyciąć trzy seryjne przekroje strzałkowe o grubości 5 µm z centralnej części każdej soczewki. Odrzucić co najmniej sześć przekrojów pomiędzy kolejnymi sekcjami, aby uniknąć barwienia tych samych jąder w różnych przekrojach. Po wycięciu przekroju ostrożnie położyć na nim szkiełko.Przekrój powinien wówczas przylegać do szkiełka. Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu barwienia.Pozostawić preparaty do momentu osiągnięcia temperatury pokojowej. Następnie przeprowadzić barwienie przeciwciałami w celu identyfikacji rozszczepionego CAS fazy trzeciej zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; po kilku godzinach zbadać preparaty pod mikroskopem fluorescencyjnym. Policzyć wszystkie jądra komórek nabłonkowych soczewki.Zarejestruj liczbę wszystkich jąder komórek nabłonkowych soczewki poprzez policzenie komórek barwionych DAPI oraz liczbę jąder dodatnich pod kątem kaspazy-3 poprzez policzenie komórek znakowanych aktywną kaspazą-3. Policz komórki trzykrotnie dla każdego przekroju.Kaspaza 3 jest główną proteazą w etapie wykonawczym apoptozy. Mikroskopia elektronowa w transmitowanym wiązce elektronów. Badania potwierdzają, że UVR indukuje apoptozę w soczewce.Badania eksperymentalne nad apoptozą potwierdzają, że kaspaza 3 jest wiarygodnym markerem apoptozy. Aby ustalić, czy ekspozycja na UVR in vivo indukuje ekspresję kaspazy 3, zmierzono ekspresję mRNA w soczewce oka za pomocą QPCR w czasie 1, 5, 24 i 120 godzin po ekspozycji in vivo na dawkę 1 kJ/m² UVR o długości fali 300 nm. Następnie dla każdego punktu czasowego wykreślono średni stosunek mRNA CASP3 do 18S rRNA pomiędzy soczewką eksponowaną a przeciwstawną soczewką nieeksponowaną.Rycina ta przedstawia ekspresję mRNA kazapy 3 w czasie i obrazuje transkrypcję apoptozy. Analiza markera kazapy 3 w soczewce in vivo po ekspozycji na dalekie UVR w ramach testów ortogonalnych wykazała statystycznie istotną różnicę w sygnale mRNA kazapy 3 pomiędzy przedziałem latencji wynoszącym 120 godzin a krótszymi przedziałami latencji. Ekspresję kazapy 3 w soczewce eksponowanej i nieeksponowanej porównano również za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, co pokazano na obrazach wykonanych 24 godziny po ekspozycji; jądra komórkowe są oznakowane, co wskazuje na obecność aktywnej kazapy 3.Ta metoda immunobarwienia dostarcza cennych informacji na temat rozmieszczenia przestrzennego komórek nabłonkowych w soczewce, znakowanych markerem apoptozy kaspazą 3. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak eksperymentalnie indukować zaćmę wywołaną UVR oraz jak badać mechanizm molekularny zaćmy indukowanej UVR przy użyciu ilościowej RT-PCR i immunohistochemii.

characterization-molecular-mechanisms-vivo-uvr-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Charakterystyka mechanizmów molekularnych in vivo związanych z kataraktą wywołaną promieniowaniem UV

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Aktywacja mikrogleju i mikroglejoza są kluczowymi odpowiedziami na przewlekłą neurodegenerację. W tym miejscu przedstawiamy metody długoterminowej wizualizacji in vivo komórek mikrogleju CX3CR1-GFP+ siatkówki za pomocą oftalmoskopii konfokalnej oraz analiz progowych i morfometrycznych w celu identyfikacji i ilościowego określenia ich aktywacji. Monitorujemy zmiany mikrogleju we wczesnych stadiach jaskry związanej z wiekiem.

In vivo (in vivo)Dynamika aktywacji mikrogleju siatkówki podczas neurodegeneracji: konfokalne obrazowanie oftalmoskopowe i morfometria komórkowa w jaskrze myszy

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

System detekcji mutacji Lambda Select cII

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Zapalenie powierzchni oka uszkadza tkanki powierzchni oka i zagraża funkcjom życiowym oka. Niniejszy protokół opisuje metodę wywoływania zapalenia oka i zbierania uszkodzonych tkanek w mysim modelu dysfunkcji gruczołów Meiboma (MGD).

Indukcja stanu zapalnego powierzchni oka i gromadzenie zajętych tkanek

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Ta metoda modeluje operację zaćmy in vivo, usuwając komórki włókna soczewki od dorosłych myszy i pozostawiając torebkę z dołączonymi komórkami nabłonka soczewki (LEC). Reakcja na uraz jest następnie oceniana w różnych momentach po operacji przy użyciu kryteriów molekularnych i morfologicznych.

Modelowanie operacji zaćmy u myszy

Szczegółowo opisujemy nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), służący do dwuwymiarowego wewnątrznaczyniowego obrazowania molekularnego biologii blaszki miażdżycowej in vivo. Cewnik NIRF umożliwia wizualizację kluczowych procesów biologicznych, takich jak zapalenie, poprzez wykrywanie obecności aktywowalnych i celowanych fluorochromów NIR wykazujących powinowactwo do blaszki miażdżycowej. Cewnik spełnia wymogi inżynieryjne i energetyczne stosowane w klinice i jest...

In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Opisano model zwierzęcy urazu in vivo. Metoda wykorzystuje podskórne położenie nerwu strzałkowego. Prędkość, czas aktywacji mięśni oraz łuk ruchu są wcześniej określone i zsynchronizowane przy użyciu komercyjnego oprogramowania. Zmiany po urazie są monitorowane in vivo za pomocą obrazowania/spektroskopii MR.

Model gryzoni in vivo w urazie wywołanym przykurczem i nieinwazyjne monitorowanie powrotu do sprawności

Poznaj metodę indukcji zaćmy promieniowaniem UV u szczurów i analizę molekularną za pomocą PCR i immunohistochemii. Model ten pozwala badać mechanizmy katarakty oraz apoptozy w soczewce oka.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Przeglądaj więcej filmów