Name: Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej in vivo UVR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: Poznaj metodę indukcji zaćmy promieniowaniem UV u szczurów i analizę molekularną za pomocą PCR i immunohistochemii. Model ten pozwala badać mechanizmy katarakty oraz apoptozy w soczewce oka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez finansowanie KID Karolinska Institutet, Szwedzki Urząd Ochrony Radiologicznej, Fundację Badań nad Okiem Karolinska Institutet, Fundację Gun och Bertil Stohnes, Fundację Badawczą Szpitala Okulistycznego św. Eryka, Ögonfonden oraz Fundację Wolnomularską Króla Gustawa V i Królowej Viktorii.

1. Ekspozycja na promieniowanie ultrafioletowe
<ol>
	<li>Na 15 min przed naświetlaniem znieczulić samicę szczura Sprague-Dawley za pomocą mieszaniny 90 mg/kg Ketalaru (ketaminy) i 10 mg/kg Rompunu (ksylazyny), podanej w zastrzyku domięśniowym.</li>
	<li>Umieścić zwierzę w stabilizatorze dla szczurów i zaciągnąć pasy do momentu unieruchomienia szczura, tak aby nie doszło do nadmiernego ucisku tułowia 13.</li>
	<li>Podać Mydriacyl (tropikamid), 10 mg/ml, do obu oczu szczura w celu wywołania mydriasis.</li>
	<li>Ustawić zwierzę tak, aby jedno oko znajdowało się w wąskiej wiązce UVR o długości fali 300 nm 14 z szerokością połówkową 10 nm, a oko przeciwległe zasłonić czarną taśmą.</li>
	<li>Poddać szczura jednostronnej ekspozycji na podprogową dawkę 1 kJ/m2 UVR-B o długości fali 300 nm przez 15 min 15.</li>
</ol>
2. Disekcja
<ol>
	<li>Po upływie określonego przedziału czasu po ekspozycji (1, 5, 24 i 120 h), uśmierć sześciotygodniowego szczura (masa &lt; 200 g) poprzez uduszenie dwutlenkiem węgla i zwichnięcie kręgów szyjnych.</li>
	<li>Wykonaj enukleację gałek ocznych. Następnie ułóż oko rogówką do dołu, a stroną tylną do góry. Wykonaj niewielki otwór za pomocą kaniuli 27G, przesuwając ją stycznie do twardówki, aby uniknąć uszkodzenia soczewki, która znajduje się bardzo blisko twardówki. Następnie, używając nożyczek do chirurgii okulistycznej, wykonaj cięcie okrężne tuż za limbusie, aż do momentu, gdy tylna część twardówki będzie mogła zostać oddzielona. Następnie wyjmij soczewkę za pomocą tępych pęsety zakrzywionej.</li>
	<li>Pod mikroskopem usuń pozostałości ciała rzęsistego z równika soczewki, utrzymując soczewkę w zrównoważonym roztworze soli nie dłużej niż przez 5-10 min.</li>
</ol>
3. Ilościowa RT-PCR
<ol>
	<li>Umieścić soczewkę w mieszaninie 350 μl buforu lizującego RA1 (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II) i 3,5 μl β-merkaptoetanolu w probówce Eppendorfa o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Przechowywać soczewkę w tej mieszaninie przez 30 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Homogenizować soczewkę za pomocą igły, aż z soczewki pozostanie jedynie twarde jądro (kora i torebka soczewki ulegają lizie w buforze lizującym). Usunąć jądro z mieszaniny.</li>
	<li>Próbki należy niezwłocznie przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Rozmrozić próbki i postępować zgodnie z protokołem „Oczyszczanie całkowitego RNA z hodowli komórkowych i tkanek” (zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II).</li>
	<li>Próbki RNA przechowywać w temperaturze -70 °C.</li>
	<li>Aby zweryfikować wystarczające usunięcie DNA z każdej próbki, przeprowadzić reakcję PCR w następujących warunkach (krok 1: 95 °C przez 2 min; krok 2 przez 40 cykli: 95 °C przez 20 sec, 55 °C przez 20 sec, 72 °C przez 20 sec; krok 3: 72 °C przez 7 min) z wykorzystaniem specyficznych starterów dla DNA p53, naprzód (forward) 5'-ACCCTCTGACCTTTTTCCCA-3' i wstecz (reverse) 5'-TGCTGGGATCTTAGGCACTC-3' oraz polimerazy Taq DNA (dNTPack), zgodnie z protokołem producenta. Oczekiwany produkt PCR ma 243 pary zasad.</li>
	<li>Przeprowadzić elektroforezę na 1,5 % żelu agarozowym w celu wykrycia specyficznego produktu PCR DNA o długości 243 par zasad. Aby przygotować 1,5 % żel agarozowy w buforze TBE, odważyć 3,75 g agarozy i rozpuścić ją w 250 ml buforu TBE. Dodać 500 μl bromku etydium (0,5 mg/ml) do 500 ml roztworu 1,5 % żelu agarozowego. Podgrzać mieszaninę w kuchence mikrofalowej i mieszać do całkowitego rozpuszczenia agarozy.</li>
</ol>
Żadna z próbek nie może wykazywać specyficznych dla DNA produktów PCR w elektroforezie nażelowej na 1,5 % żelu agarozowym.
<ol start="9">
	<li>Zmierz stężenie próbek RNA (1 μl) oraz stosunek absorbancji próbki przy 260 nm (RNA) i 280 nm (białko) w spektrofotometrze NanoDrop ND-1000. Jeśli stosunek absorbancji RNA do białka wynosi 2,0 lub więcej, próbka RNA jest czysta. Jeśli stosunek absorbancji próbki RNA jest niższy niż 2,0, powtórz krok 3.5 oczyszczania RNA.</li>
	<li>Odmij dokładnie objętość próbki RNA odpowiadającą 1 μg i przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z protokołem zestawu 1st Strand cDNA synthesis Kit (1st Strand cDNA synthesis Kit for RT-PCR).</li>
	<li>Próbki cDNA przechowuj w temperaturze -20 °C (w przypadku przechowywania przez rok lub dłużej, przechowuj w temperaturze -70 °C).</li>
	<li>Przeprowadź ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym w systemie detekcji iCycler MyiQ Single Color Real Time PCR. Na płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla kaspazy 3, zgodnie z instrukcjami producenta. Na kolejną płytkę 96-dołkową nanieś po trzech powtórzeniach 1 μl próbki cDNA, TaqMan Gene Expression Master Mix oraz TaqMan Gene Expression Assay dla 18s, zgodnie z instrukcjami producenta (TaqMan Gene Expression Assay Protocol). Wykonaj szereg rozcieńczeń cDNA z trzech losowo wybranych soczewek niepoddanych ekspozycji. Rozcieńczenia seryjne przeprowadź razem z cDNA z próbek na jednej płytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Do ilościowego oznaczenia wyników zastosuj metodę krzywej standardowej. Jako pomiar w oprogramowaniu MyiQ przyjmuje się liczbę cykli w punkcie progowym fluorescencji. Dla rozcieńczeń seryjnych na każdej płytce wyznaczono krzywą standardową opisującą liczbę cykli w punkcie progowym jako funkcję względnego stężenia kalibratora. Do kalibracji wykorzystano cDNA z trzech próbek soczewek niepoddanych działaniu czynnika. Odnieś liczbę cykli progowych dla każdej próbki do krzywej standardowej, aby uzyskać względne stężenie zmierzonego cDNA z próbki. Na koniec oblicz poziom ekspresji genów docelowych, odnosząc względne stężenie cDNA genu docelowego do cDNA wewnętrznej kontroli 18s.</li>
</ol>
4. Barwienie immunohistochemiczne
<ol>
	<li>Fiksacja
	<ol>
		<li>Przeprowadzić dysekcję oka w PBS (buforze fosforanowym; pH 7,4).</li>
		<li>Umieścić oko w probówce wypełnionej 4 % paraformaldehydem (PFA) w temperaturze lodowej na 20 min. PFA 4 % przygotować dzień wcześniej. Przechowywać w temperaturze +4 °C do momentu użycia. PFA zachowuje świeżość przez około jeden tydzień.</li>
		<li>Usunąć PFA za pomocą mikropipety. Następnie przemyć lodowatym PBS przez 20 min.</li>
		<li>Umieścić oko w 30 % sacharozie w temperaturze +4 °C przez noc.</li>
		<li>Umieścić oko w naczyniu wypełnionym medium OCT (Optimal Cutting Temperature) (Tissue-Tek). Ułożyć oko w pozycji odpowiedniej do sekcjonowania.</li>
		<li>Zamrozić w medium OCT nad suchym lodem.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze -70 °C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sekcjonowanie
	<ol>
		<li>Ułożyć oko do kriosekcjonowania w odpowiedniej płaszczyźnie.</li>
		<li>Wyciąć trzy przekroje strzałkowe o grubości 5 μm z części centralnej każdej soczewki. Odrzucić co najmniej 6 sekcji pomiędzy kolejnymi przekrojami, aby uniknąć barwienia tych samych jąder w różnych sekcjach.</li>
		<li>Po wycięciu sekcji delikatnie położyć na niej szkiełko. Sekcja powinna wówczas przykleić się do szkiełka.</li>
		<li>Pozostawić szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przed użyciem. Szkiełka można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu zapotrzebowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemia fluorescencyjna
	<ol>
		<li>Pozostawić próbki do osiągnięcia temperatury pokojowej (5-10 min).</li>
		<li>Obrysować krawędzie wokół preparatów za pomocą PAP-pen (Invitrogen).</li>
		<li>Pozostawić obramowanie do wyschnięcia (10 min).</li>
		<li>Opisać szkiełka mikroskopowe.</li>
		<li>Rehydratować w 1 × PBS przez 15 min.</li>
		<li>Przeprowadzić permeabilizację w standardowym roztworze blokującym przez 30 min.</li>
		<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (królicze poliklonalne przeciwciało przeciwko cleaved caspase-3 Asp175 9661; Cell Signalling Technology, Inc) rozcieńczone 1:3 000 w standardowym roztworze blokującym.</li>
		<li>Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze +4 °C przez noc.</li>
		<li>Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (&gt;15 min, 1-2 wymiany).</li>
		<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (przeciwkrólicze przeciwciało drugorzędowe o specyficznym widmie absorpcji/emisji) rozcieńczone 1:300 w standardowym roztworze blokującym.</li>
		<li>Przemyć w PBS za pomocą pipety (3 × 5 min) lub poprzez zanurzenie w dużej kąpieli (&gt;15 min, 1-2 wymiany).</li>
		<li>Zetrzeć ślady PAP-pen.</li>
		<li>Przechowywać w komorze nawilżonej w temperaturze pokojowej przez 3 h. Unikać ekspozycji na światło.</li>
		<li>Dodać kroplę Vectashield i nałożyć szkiełko cover-slip na preparat. Unikać powstawania pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pozostawić Vectashield do stwardnienia (~20 min).</li>
		<li>Przechowywać sekcje w ciemności do momentu analizy.</li>
		<li>Wszystkie sekcje kontrolne są przetwarzane bez zastosowania przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
		<li>Analizować wyniki po kilku godzinach pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
		<li>Policzyć jądra komórek nabłonkowych od jednego łuku jądrowego do drugiego łuku jądrowego każdej soczewki. Zastosować standardowy filtr niebieski, aby uwidocznić wszystkie jądra nabłonka soczewki na niebiesko, oraz standardowy filtr dopasowany do emisji przeciwciała drugorzędowego, aby uwidocznić jądra dodatnie dla caspase-3 na zielono.</li>
		<li>Zarejestrować liczbę wszystkich jąder nabłonkowych soczewki oraz liczbę jąder dodatnich. Przeliczyć komórki trzykrotnie dla każdej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brian, G., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cataract+blindness%3A+challenge+for+the+21+st+century%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Cataract blindness: challenge for the 21 st century.</a> Bulletin of the World Health Organization. 79, 249-256 (2001).</li>
<li>Jose, J. G., Pitts, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength+dependency+of+cataracts+in+albino+mice+following+chronic+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Wavelength dependency of cataracts in albino mice following chronic exposure.</a> Experimental Eye Research. 41, 545-563 (1985).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cataract+in+the+rat+after+exposure+to+radiation+in+the+300+nm+wavelength+region.+A+study+of+the+macro-%2C+micro-+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%29%22%5BJournal%5D)">Acute cataract in the rat after exposure to radiation in the 300 nm wavelength region. A study of the macro-, micro- and ultrastructure.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh). 66, 141-152 (1988).</li>
<li>Meyer, L., Dong, X., Wegener, A., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+dependent+cataractogenesis+and+Maximum+Tolerable+Dose+%28MTD+2.3%3A16%29+for+UVR+-+B+induced+cataract+in+C57BL%2F6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Dose dependent cataractogenesis and Maximum Tolerable Dose (MTD 2.3:16) for UVR - B induced cataract in C57BL/6J mice.</a> Experimental Eye Research. 86, 282-289 (2008).</li>
<li>McCarty, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lifetime+ocular+exposure+to+UV-B%3A+the+Melbourne+visual+impairment+project%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lifetime ocular exposure to UV-B: the Melbourne visual impairment project.</a> Developments in Ophthalmology. 27, 9-13 (1997).</li>
<li>Sasaki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+cortical+cataract+in+subjects+of+diverse+races+and+latitude%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Ophthalmol.+Vis.+Sci%22%5BJournal%5D)">Localization of cortical cataract in subjects of diverse races and latitude.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 44, 4210-4214 (2003).</li>
<li>Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol.+%28Copenh%22%5BJournal%5D)">Experimental cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Acta Ophthalmol. (Copenh. 68, Suppl 196. 1-77 (1990).</li>
<li>Galichanin, K., Löfgren, S., Bergmanson, J., Söderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+damage+in+the+lens+after+in+vivo+close+to+threshold+exposure+to+UV-B+radiation%3A+cytomorphological+study+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Evolution of damage in the lens after in vivo close to threshold exposure to UV-B radiation: cytomorphological study of apoptosis.</a> Exp. Eye Res. 91, 369-377 (2010).</li>
<li>McCarty, C. A., Taylor, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+epidemiologic+evidence+linking+ultraviolet+radiation+and+cataracts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A review of the epidemiologic evidence linking ultraviolet radiation and cataracts.</a> Dev. Ophthalmol. 35, 21-31 (2002).</li>
<li>Li, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+appears+to+be+a+common+cellular+basis+for+non-congenital+cataract+development+in+humans+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis appears to be a common cellular basis for non-congenital cataract development in humans and animals.</a> Journal of Cell Biology. 130, 169-181 (1995).</li>
<li>Michael, R., Vrensen, G., van Marle, J., Gan, L., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+the+rat+lens+after+in+vivo+threshold+dose+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in the rat lens after in vivo threshold dose ultraviolet irradiation.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 13, 2681-2687 (1998).</li>
<li>Ayala, M. N., Strid, H., Jacobsson, U., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+Expression+and+Apoptosis+In+The+Lens+After+Ultraviolet+Radiation+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+of+visual+science%22%5BJournal%5D)">p53 Expression and Apoptosis In The Lens After Ultraviolet Radiation Exposure.</a> Investigative ophthalmology of visual science. 48, 4187-4191 (2007).</li>
<li>Galichanin, K., Wang, J., Lofgren, S., Soderberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+universal+rat+restrainer+for+ophthalmic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A new universal rat restrainer for ophthalmic research.</a> Acta Ophthalmol. 89 (1), (2011).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cataract+after+repeated+exposure+to+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">In vivo cataract after repeated exposure to ultraviolet radiation.</a> Experimental Eye Research. 70, 451-456 (2000).</li>
<li>Söderberg, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+of+ultraviolet+radiation+exposure+to+the+lens+expressed+by+maximum+tolerable+dose+%28MTD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Developments+in+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Toxicity of ultraviolet radiation exposure to the lens expressed by maximum tolerable dose (MTD).</a> Developments in Ophthalmology. 35, 70-75 (2002).</li>
<li>Michael, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+repair+of+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Development and repair of cataract induced by ultraviolet radiation.</a> Ophthalmic Research. 32, 1-45 (2000).</li>
<li>Löfgren, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cataract+from+ultraviolet+radiation%22">Cataract from ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2001).</li>
<li>Ayala, M. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Influence+of+exposure+patterns+and+oxidation+in+UVR+induced+Cataract%22">Influence of exposure patterns and oxidation in UVR induced Cataract</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Dong, X. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Safety+limit+estimation+for+cataract+induced+by+ultraviolet+radiation%22">Safety limit estimation for cataract induced by ultraviolet radiation</a>. , Karolinska Institutet. Stockholm. (2005).</li>
<li>Löfgren, S., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+age+and+sex+in+ultraviolet+radiation+cataract+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Impact of age and sex in ultraviolet radiation cataract in the rat.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 44, 1629-1633 (2003).</li>
<li>Ayala, M. N., Michael, R., Söderberg, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+exposure+time+for+UV+radiation-induced+cataract%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Influence of exposure time for UV radiation-induced cataract.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 41, 3539-3543 (2000).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza praca opisuje metody umożliwiające badanie zdarzeń molekularnych zachodzących podczas katarakty indukowanej promieniowaniem UVR-B.
Biorąc pod uwagę, że większość dostępnych informacji na temat zaćmy indukowanej promieniowaniem UV in vivo pochodzi z eksperymentów przeprowadzonych na albinosach szczurów Sprague-Dawley 7, 16, 17, 18, 19, w niniejszym badaniu zdecydowaliśmy się wykorzystać szczury Sprague-Dawley typu albino. Wiek szczurów wynosił sześć tygodni. Wybran...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Firma&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Numer katalogowy&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Uwagi (opcjonalnie)&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Ketalar</td><td>Pfizer</td><td>150086</td><td>50 mg/ml</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>022545</td><td>20 mg/ml</td></tr><tr><td>Oculentum Simplex</td><td>Apoteket, Szwecja</td><td>336164</td><td>5 g</td></tr><tr><td>Mydriacyl</td><td>Alcon</td><td>00352</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli</td><td>Alcon</td><td>0007950055</td><td></td></tr><tr><td>3,5 µL &amp;beta;-merkaptoetanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji całkowitego RNA NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel GmbH&amp;amp;Co, Duren, Niemcy</td><td>740955.50</td><td></td></tr><tr><td>Specyficzne primery do DNA p53</td><td>biomers.net GmbH</td><td>Zamówienie indywidualne</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA Taq, dNTPack</td><td>Roche</td><td>04 728 866 001</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma</td><td>A5093</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny 0,5 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>E1385</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Nano-Drop ND-1000</td><td>NanoDrop Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy cDNA pierwszej nici 1&lt;sup&gt;st&lt;/sup&gt; do RT-PCR (AMV)</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11 483 188 001</td><td></td></tr><tr><td>System detekcji Real Time PCR iCycler MyiQ Single Color</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.202</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan Gene Expression dla kaspazy 3</td><td>Applied Biosystems</td><td>Rn00563902_m1</td><td></td></tr><tr><td>Test TaqMan Gene Expression dla 18s</td><td>Applied Biosystems</td><td>Hs99999901_s1</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MyiQ</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rozszczepiona kaspaza-3 (Asp175)</td><td>Cell signaling technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko króliki IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab6798</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny mikroskop Axioplan 2 Imaging</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Sigma Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Bufor TBE 10x</td><td>Promega</td><td>V4251</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem uvr in vivo

Characterization of Molecular Mechanisms of In vivo UVR Induced Cataract

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie 1. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje kataraktę jako zmętnienie soczewki oka, które utrudnia przenikanie światła. Katarakta jest chorobą wieloczynnikową, powiązaną z cukrzycą, paleniem tytoniu, promieniowaniem ultrafioletowym (UVR), spożyciem alkoholu, promieniowaniem jonizującym, stosowaniem steroidów oraz nadciśnieniem tętniczym. Istnieją silne dowody eksperymentalne 2-4 oraz epidemiologiczne 5,6 wskazujące na to, że UVR wywołuje kataraktę. Opracowaliśmy model zwierzęcy katarakty indukowanej promieniowaniem UVR B zarówno u zwierząt znieczulonych 7, jak i nieznieszyczulonych 8.
Jedyną metodą leczenia zaćmy jest operacja, jednak nie każda osoba ma do niej dostęp. Szacuje się, że opóźnienie wystąpienia zaćmy o 10 lat mogłoby zredukować zapotrzebowanie na operacje zaćmy o 50% 9. Aby opóźnić występowanie zaćmy, konieczne jest zrozumienie mechanizmów jej powstawania oraz znalezienie skutecznych strategii zapobiegawczych. Wśród mechanizmów rozwoju zaćmy apoptoza odgrywa kluczową rolę w inicjowaniu tego procesu u ludzi i zwierząt 10. W naszych ostatnich badaniach skupiliśmy się na apoptozie w soczewce jako mechanizmie rozwoju zaćmy 8,11,12. Przewiduje się, że lepsze zrozumienie wpływu UVR na szlak apoptozy otworzy możliwości odkrycia nowych produktów farmaceutycznych zapobiegających zaćmie.
W niniejszym artykule opisujemy, w jaki sposób można eksperymentalnie wywołać zaćmę poprzez ekspozycję in vivo na promieniowanie UVR-B. Ponadto przedstawiamy metodę RT-PCR oraz immunohistochemię jako narzędzia do badania molekularnych mechanizmów zaćmy wywołanej przez UVR-B.

Różne źródła zmienności w pomiarach oszacowano za pomocą analizy wariancji, stwierdzając, że przy trzech pomiarach na zwierzę wariancja pomiarowa wynosiła około 15% wariancji między zwierzętami. Zatem w przypadku analizy całego soczewki zwiększenie precyzji nie jest możliwe. Testy ortogonalne wykazały statystycznie istotny kontrast dla poziomu mRNA kaspazy-3 pomiędzy 120 h odstępu utajenia a krótszymi odstępami utajenia.
In vivo ekspozycja na UVR indukuje ekspresję kaspazy-3.
<p c...

Katarakta jest główną przyczyną ślepoty na świecie. Promieniowanie ultrafioletowe (UVR) pochodzące ze słońca stanowi główny czynnik ryzyka rozwoju katarakty. Opracowano model zwierzęcy katarakty indukowanej dalekim UVR-B. W niniejszym artykule opisujemy metody badania powstawania katarakty: ekspozycję na UVR, ilościową RT-PCR oraz immunohistochemię.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Zaćma jest główną przyczyną ślepoty na świecie 1. Światowa Organizacja Zdrowia definiuje zaćmę jako zmętnienie soczewki oka, które ...

W niniejszym filmie zaprezentowano metodę indukowania katarakty u szczura przy użyciu promieniowania ultrafioletowego. Mechanizmy molekularne zaangażowane w rozwój katarakty są następnie badane z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym oraz immunocytochemii. W pierwszej kolejności oko szczura jest poddawane działaniu promieniowania ultrafioletowego w celu wywołania powstania katarakty.Drugie oko służy jako kontrola. Następnie soczewki są wycinane i przetwarzane w celu uzyskania RNA do oceny poziomów ekspresji CAS B za pomocą ilościowej PCR w czasie rzeczywistym lub barwione z użyciem przeciwciała przeciwko rozszczepionej kaspazie 3 w celu oceny ekspresji i lokalizacji aktywnego białka.Ostatecznie wyniki tych analiz potwierdzają wzrost poziomu mRNA kazpazy 3 oraz ekspresji aktywnego białka w jądrach komórek soczewki po ekspozycji na UVR. Główną zaletą tego protokołu w porównaniu z istniejącymi metodami jest zastosowanie unikalnego wąskopasmowego źródła UVR oraz uniwersalnego stabilizatora szczurów, co pozwala na bezpieczne i precyzyjne naświetlanie zwierząt przy ściśle określonym spektrum i dawce UV. Ponadto zastosowaliśmy nowoczesne techniki biologiczne, ilościo

characterization-molecular-mechanisms-vivo-uvr-induced

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Charakterystyka mechanizmów molekularnych in vivo związanych z kataraktą wywołaną promieniowaniem UV

Formalna prezentacja sekcji oka myszy, prowadząca do uzyskania preparatu całego nabłonka barwnikowego siatkówki.

Disekcja oka myszy w celu wykonania preparatu całego zamontowania nabłonka pigmentowego siatkówki

Melanina naskórkowa jest indukowana przez miejscowe stosowanie forskoliny w mysim modelu człowieka o jasnej karnacji, wrażliwego na promieniowanie UV.    Farmakologiczna manipulacja poziomami cAMP w skórze i ciemnienie naskórka silnie chronią przed stanem zapalnym o podłożu UV (oparzenia słoneczne), mierzonym za pomocą testu minimalnej dawki rumieniowej (MED).

Farmakologiczna indukcja melaniny naskórka i ochrona przed oparzeniami słonecznymi w humanizowanym modelu myszy

Opisujemy szczegółowy protokół testu mutacji Lambda Select cII w hodowanych komórkach transgenicznych gryzoni lub odpowiadających im zwierząt potraktowanych chemicznie/fizycznym środkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Podejście to jest szeroko stosowane do badania mutagenności czynników rakotwórczych w komórkach ssaków.

System detekcji mutacji Lambda Select cII

Ten protokół demonstruje jednoczesne wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS), żywych komórek i martwych komórek w żywych hodowlach pierwotnych z komórek powierzchni oka myszy. 2',7'-Dichlorofluoresceindiacetat, jodek propidyny i barwienie Hoechst są używane do oceny ROS, martwych komórek i żywych komórek, odpowiednio, a następnie obrazowania i analizy.

Ocena uszkodzeń oksydacyjnych w pierwotnych komórkach powierzchni oka/komórkach macierzystych myszy w odpowiedzi na uszkodzenie ultrafioletem-C (UV-C)

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Ten artykuł opisuje procedury używane do oceny toksyczności promieniowania UV i toksyn chemicznych na pierwotnej i nieśmiertelnej linii komórkowej.

Określanie toksyczności promieniowania UV i substancji chemicznych na pierwotne i nieśmiertelne ludzkie komórki nabłonka rogówki

Modele myszy mogą być użytecznymi narzędziami do badania biologii nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Ustalono, że u myszy może rozwinąć się szereg patologii RPE. W tym miejscu opisujemy protokół fenotypowania w celu wyjaśnienia i ilościowego określenia patologii RPE u myszy za pomocą światła, elektronów transmisyjnych i mikroskopii konfokalnej.

Protokół oceny i ilościowego określenia patologii barwnikowego nabłonka siatkówki w mysich modelach zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wiekiem

Ta metoda modeluje operację zaćmy in vivo, usuwając komórki włókna soczewki od dorosłych myszy i pozostawiając torebkę z dołączonymi komórkami nabłonka soczewki (LEC). Reakcja na uraz jest następnie oceniana w różnych momentach po operacji przy użyciu kryteriów molekularnych i morfologicznych.

Modelowanie operacji zaćmy u myszy

Protokół opisuje badanie ogólnoustrojowych i miejscowych skutków skórnych ekspozycji na promieniowanie ultrafioletowe B u myszy.

Badanie przewlekłej ekspozycji myszy na promieniowanie ultrafioletowe B

Szczegółowo opisujemy nowy cewnik do fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF), służący do dwuwymiarowego wewnątrznaczyniowego obrazowania molekularnego biologii blaszki miażdżycowej in vivo. Cewnik NIRF umożliwia wizualizację kluczowych procesów biologicznych, takich jak zapalenie, poprzez wykrywanie obecności aktywowalnych i celowanych fluorochromów NIR wykazujących powinowactwo do blaszki miażdżycowej. Cewnik spełnia wymogi inżynieryjne i energetyczne stosowane w klinice i jest...

In vivo wewnątrznaczyniowe obrazowanie molekularne blaszek zapalnych z wykorzystaniem fluorescencji w bliskiej podczerwieni (NIRF) – multimodalne podejście do obrazowania miażdżycy

Poznaj metodę indukcji zaćmy promieniowaniem UV u szczurów i analizę molekularną za pomocą PCR i immunohistochemii. Model ten pozwala badać mechanizmy katarakty oraz apoptozy w soczewce oka.

Charakterystyka mechanizmów molekularnych zaćmy indukowanej promieniowaniem UVR in vivo

Przeglądaj więcej filmów