In ovo elektroporacja śródmózgowia kurczaka w celu badania funkcji genów w rozwoju neuronów dopaminergicznych

Niniejszy eksperyment demonstruje elektroporację in ovo śródmózgowia kurczęt w celu zbadania wpływu egzogennej ekspresji genów na rozwój śródmózgowia oraz różnicowanie neuronów dopaminergicznych. W pierwszej kolejności do śródmózgowia embrionów kurzych w stadium 11 według skali Hamburgera i Hamiltona wstrzykuje się wybrany plazmid DNA, aby specyficznie skierować egzogenne DNA do rozwijającego się pęcherzyka śródmózgowia. Następnie, przy użyciu specjalnie wykonanych małych elektrod, przeprowadza się elektroporację pęcherzyka śródmózgowia, aby dostarczyć egzogenne DNA bezpośrednio do progenitorów neuronów śródmózgowia.

Następnie należy zebrać zarodki w stadium 23 z dobrą ekspresją M cherry w śródmózgowiu i wykonać optymalne przekroje poprzeczne śródmózgowia. Ostatecznie analiza barwienia immunochemicznego w kierunku markerów neuronów dopaminergicznych, takich jak tyrozynowa hydroksylaza, może wykazać różnicowanie progenitorów neuronalnych w dojrzałe neurony dopaminergiczne indukowane ekspresją genów zainteresowania. Główną zaletą tej techniki nad innymi istniejącymi metodami elektroporacji in ovo jest to, że protokół ten umożliwia specyficzną dla błony elektroporację w celu zbadania różnicowania neuronów dopaminergicznych u mirin.

Choć metoda ta pozwala uzyskać wgląd w rozwój śródmózwia, może być ona również zastosowana w innych częściach układu nerwowego do przeprowadzenia analizy mapowania losów komórek oraz badania regulacji ekspresji genów. Aby uzyskać embriony hamburger Hamilton, stadium 11, należy ułożyć każde zapłodnione jajo na boku i zaznaczyć górę krótką kreską ołówka. Następnie tace należy umieścić na kołysce w uprzednio ogrzanym, humidyfikowanym inkubatorze.

Co 24 godziny, w tym w 41. godzinie po zapłodnieniu, sprawdź wilgotność i poziom wody. Wyjmij jaja z inkubatora i przechowuj je w temperaturze pokojowej. Oczyść powierzchnię każdego jaja 70% ethanolem i przetrzyj do sucha.

Następnie przyklej dwa cztero centymetrowe kawałki taśmy klejącej obok siebie na jajku, tworząc duży prostokąt nad zaznaczeniem wykonanym ołówkiem. Wygładź taśmę na powierzchni jajka, aby wyznaczyć okno. Używając strzykawki 10 milliliter z przymocowaną igłą 18 gauge, przebij skorupkę jajka, kierując igłę pod kątem w stronę przeciwną do żółtka, aby nie zakłócić ani nie uszkodzić zarodka.

Pobrać pięć mililitrów albuminy z jaja. Oczyścić igłę 70% etanolem. Osuszyć igłę przed nakłuciem kolejnego jaja.

Wprowadź ustawienia dla wyciągacza mikropipet z podgrzewaniem płomieniowym. Następnie wyciągnij z cienkościennych rurek kapilarnych igły do wstrzykiwania za pomocą pipety P 10. Pobierz od 5 do 10 µL roztworu plazmidu do długiej końcówki kapilarnej pipety.

Następnie powoli napełnij szklaną igłę, tworząc ciągłą kolumnę cieczy bez pęcherzyków powietrza. Umieść napełnioną igłę w uchwycie przymocowanym do mikromanipulatora i mikroinjektora. Następnie pod mikroskopem sekcyjnym, wykorzystując ciemne tło w celu lepszej wizualizacji igły, przytnij ją nożyczkami sprężynowymi w miejscu, w którym kończy się zielony płyn.

W miejscu poprzedniego otworu po igle wytnij okienko o średnicy od 2 do 2,5 cm w celu pobrania albuminy. Podczas wycinania obracaj jajko w dłoni.

Pamiętaj o czyszczeniu nożyczek za pomocą chusteczki Kim wipe nasączonej 70% etanolem pomiędzy kolejnymi jajami. Przystąp do obserwacji embrionu kurczaka pod mikroskopem stereoskopowym. W razie potrzeby zwizualizuj embrion, wstrzykując pod niego 20% tusz indyjski w PBS, przefiltrowany przez filtr 0,22 µm. Ustaw embrion równolegle do toru wprowadzania igły, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do igły.

Powoli przebij rurkę neuralną pod kątem 45 stopni w miejscu połączenia śródmózgowia z rombencephalonem. Rozpocznij wstrzykiwanie za pomocą mikroinjektorów pico spritzer, ustawiając czas trwania impulsu na 25 milisekund. Dostosuj czas w zależności od przycięcia igły; wypełnij wyłącznie pęcherzyk neuralny odpowiadający śródmózgowiu plazmidowym DNA zawierającym barwnik fast green.

Po wyjęciu igły wstrzykującej, nanieś trzy krople roztworu penstrepty na embrion. Zweryfikuj ustawienia elektroporatora B-T-X-E-M-C eight 30 w celu zapewnienia wydajnej elektroporacji. W pozycji brzusznej śródmózwia umieść małe, wykonane na zamówienie platynowe elektrody w kształcie litery L na tym samym poziomie poziomym co dno rurki neuralnej, tak aby śródmózgie embrionalne znajdowało się centralnie pomiędzy dwiema elektrodami.

Naciśnij raz przełącznik nożny BTX i zauważ pęcherzyki powietrza powstające wokół elektrod. Po każdej udanej elektroporacji ostrożnie wyjmij elektrody z jaja i przetrzyj je. Za pomocą chusteczki chemicznej nasączonej 70% etanolem nanieś kolejne trzy krople roztworu penstrep na embrion.

Następnie zaklej okienko kawałkiem przezroczystej taśmy pakowej o wymiarach 5 cm na 5 cm. Bez dotykania zawartości szczelnie zamknij jajko, a następnie umieść jajka z powrotem w inkubatorze z wyłączonymi obrotowymi podstawkami. Po osiągnięciu pożądanego stadium przenieś żywe embriony do wspólnej szalki Petriego wypełnionej PBS dla każdego wariantu badawczego.

Następnie należy użyć fluorescencyjnego mikroskopu do sekcji. Przesiewowo sprawdzono pobrane embriony pod kątem ekspresji m cherry, a embriony pozytywne przeniesiono do poszczególnych studzienek płytki 24-dołkowej. Każdą studzienkę wypełniono jednym mililitrem świeżo przygotowanego 2% paraformaldehydu i inkubowano przez trzy godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Umyj utrwalone zarodki w PBS 3 razy, a następnie umieść zarodki w 15% sacharozie aż do momentu ich wyrównania osmotycznego. Powtórz proces wyrównywania w 30% sacharozie, po czym zatop każdy zarodek w OCT, orientując je odpowiednio, aby uzyskać optymalne przekroje poprzeczne śródmózgowia do dalszych analiz.

Przygotować przekroje śródmózgowia o grubości 18 µm za pomocą kriotomu do dalszych analiz w teście elektroporacji in ovo śródmózgowia zarodka kury. Zarodki kury w stadium 11 zostają wstrzyknięte koktajlem plazmidowym zawierającym fluorescencyjny marker m cherry oraz geny zainteresowania, a także barwnik fast green służący do monitorowania procesu wstrzykiwania. Po elektroporacji śródmózgowia zarodki są dalej inkubowane, a następnie zarodki wykazujące ekspresję m cherry są pobierane, utrwalane i zatapiane w medium.

Następnie przygotowuje się krioprzekroje mózgu średniego. Próbki z embrionów kurzych, w których pomyślnie przeprowadzono wstrzyknięcie i elektroporację, analizuje się metodą barwienia immunohistorycznego z zastosowaniem markerów mózgu średniego, takich jak tyrozynowa hydroksylaza. Ekspresja mCherry jest zazwyczaj widoczna w obszarze mózgu średniego po dalszym rozwoju, przy czym ekspresja mCherry służy jako marker wstrzyknięcia.

Zarodki wykazujące prawidłową ekspresję m cherry są następnie utrwalane, zatapiane i orientowane w celu przygotowania krciosieci przez środomózgowie. W tej części badana jest specyfikacja losu dopaminergicznego w elektroporowanych progenitorach neuronalnych poprzez kolokalizację m cherry i genu z tagiem flag z markerem neuronów dopaminergicznych – tyrozynową hydroksylazą. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak regionalnie ograniczyć ekspresję genu do embrionalnych progenitorów neuronów dopaminergicznych środomózgowia, w tym jak wstrzykiwać konstrukty DNA specyficznie do obszaru środomózgowia oraz jak precyzyjnie przeprowadzić elektroporację przy użyciu małych, wykonanych na zamówienie elektrod zgodnie z tą procedurą.

Inne metody, takie jak blokada za pośrednictwem RNI lub ekspresja enhancerów powiązanych z genami reporterowymi, mogą być wykorzystywane do badania funkcji genów i regulacji genów w określonych regionach i typach komórek układu nerwowego.