Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczurów

Cześć, nazywam się Christine Beaton. Jestem asystentem naukowym w laboratorium George'a Chena na Wydziale Fizjologii i Biofizyki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Irvine. A w ciągu najbliższych dwóch dni pokażę wam, jak przygotować TCGF, co oznacza czynnik wzrostu limfocytów T.

Tak więc w naszej codziennej hodowli komórkowej, kiedy nie potrzebujemy dokładnej wiedzy na temat składu cytokin w pożywce hodowlanej, używamy czynnika wzrostu komórek T, który jest supernatantem S z hodowli spl CY, który zawiera wymagane cytokiny, aby pomóc limfocytom T w ekspansji. Tak więc sposób, w jaki przygotowujemy TCGF, polega na tym, że zabijamy zdrowe szczury rasy Louis, bierzemy ich śledziony, przygotowujemy zawiesinę pojedynczych komórek, pozbywamy się czerwonych krwinek przez nie, a następnie komórki jednojądrowe, które zamierzamy stymulować za pomocą con carnavalu w a, co indukuje limfocyty T do produkcji wszystkich cytokin wymaganych do ich wzrostu. Aby wygenerować TCGF, musimy aktywować komórki.

Więc sposób, w jaki to robimy, polega na tym, że dodamy konwalecję lektyny w skrócie korona A do naszej hodowli komórkowej. Więc kiedy dodamy conc in a do naszej hodowli komórkowej, zwiąże się on z glikozylowanym kompleksem receptora komórek T i zwiąże się z kilkoma kompleksami w tym samym czasie, zrobi to, co nazywamy cappingiem. To się zagreguje, utworzy skupisko wszystkich receptorów na powierzchni komórki, a to wywoła sygnał aktywacyjny w limfocytach T.

Więc po tym, jak komórki zostaną aktywowane, wybuchną. Powiększą się, a potem zaczną wydzielać cytokiny. Początkowo myśleliśmy, że TCGF to głównie interleukina druga, ale teraz wiemy, że tak nie jest.

Zawiera również interferon gamma, TNF, alfa i prawdopodobnie także cytokiny w bardzo małych ilościach, które są po prostu niezbędne do utrzymania komórek przy życiu po 48 godzinach W hodowli komórki wytworzyły wszystkie potrzebne nam cytokiny. Usuniemy więc komórki, a kiedy usuniemy komórki i będziemy mieli tylko supernatant, nadal mamy trochę wolnego stożka w a w snat. I to będzie problem, ponieważ naprawdę chcemy użyć naszego czynnika wzrostu komórek T, aby utrzymać wzrost linii komórek T.

A jeśli zostawimy konwalację w wolnym miejscu, aktywuje ona komórki, kiedy nie chcemy, aby się aktywowały. Aby obejść ten problem, dodamy nadmiar cukru, który zwiąże się z całym wolnym składnikiem w jedzeniu. Zostanie więc całkowicie dezaktywowany i nie zwiąże się z innymi glikozylowanymi receptorami na komórkach, gdy dodamy TCGF do hodowli.

Więc zacznijmy. Pierwszym krokiem w tym eksperymencie jest usunięcie śledziony od szczura zaraz po eutanazji. To właśnie zamierzam zrobić od razu, używając sterylnych narzędzi.

A kiedy już usunę śledziony, zamierzam umieścić je w PBS uzupełnionym antybiotykami, a jako antybiotyki używam penicyliny i streptomycyny. Więc zacznijmy. Spryskuję więc szczura 70% etanolem, aby upewnić się, że nie mam zbyt dużego zanieczyszczenia mojej kultury.

A potem, używając moich instrumentów, zrobię małe nacięcie w skórze. Następnie usuwam warstwę mięśniową i właśnie w tym miejscu pojawia się śledziona. Więc biorę inną pęsetę, delikatnie wyciągam śledzionę, nie uszkadzając jej.

Usuwam tkankę łączną w ten sposób. Więc teraz mam śledzionę. Oczywiście jestem bardzo ostrożny, aby nie uszkodzić niczego innego w jamie brzusznej, ponieważ każde uszkodzenie jelita doprowadzi do natychmiastowego zanieczyszczenia mojej śledziony.

A potem zamierzam przenieść śledzionę do rurki zawierającej PBS i antybiotyki. A tę rurkę trzymam na lodzie. Więc teraz zebrałem śledziony od trzech szczurów.

Jesteśmy więc gotowi do przygotowania zawiesiny jednokomórkowej z tych śledzion. Teraz, gdy mam już swoje śledziony, przeniosłem je do hodowli tkankowej, aby przygotować z nich zawiesinę pojedynczej komórki za pomocą trenażerów komórkowych o wielkości 70 mikronów. Będę więc potrzebował kilku rzeczy, aby zrobić jednokomórkową zawiesinę ze śledziony.

Potrzebuję sterylnych narzędzi, jednej pary kleszczy i jednej pary nożyczek. Następnie mam tłok sterylnej strzykawki o średnicy jednego miliona mil na szalce Petriego. Zamierzam umieścić moje śledziony w PBS plus antybiotyki.

A na innej szalce Petriego umieściłem sitko o wielkości 70 mikronów w 10 mililitrach PBS plus antybiotyki. Pierwszym krokiem jest upewnienie się, że śledziony są czyste, ponieważ, jak widać tutaj, nadal są małe kawałki tkanki łączącej i zamierzam je usunąć, ponieważ bardzo szybko zatkają sitko komórkowe. W tym celu po prostu odcinam to, czego nie chcę i wrzucam to do pokrywki szalki Petriego.

Więc teraz moje śledziony są w większości czyste, więc wezmę śledziony jeden po drugim, włożę je do trenażera komórkowego i pokroję na małe kawałki i wymieszam wszystkie trzy plamy. Następnym krokiem jest wykonanie zawiesiny pojedynczej komórki. Więc oczywiście, ponieważ chcę mieć wszystko w sterze, w ogóle nie dotykam trenażera komórkowego i używam tłoka sterylnej strzykawki o średnicy jednego mili, aby przecisnąć moje kawałki śledziony przez trenator komórkowy.

I jak widać na zewnątrz trenażera komórkowego, mam w trakcie produkcji zawiesinę jednokomórkową. Tak więc za pierwszym razem mam jeszcze kilka małych kawałków śledziony, ale już zamierzam usunąć zawiesinę jednokomórkową. Mam już przelać go do rurki o długości 50 mil, którą przechowywałem na lodzie.

Zamierzam napełnić sitko do komórek jeszcze 10 mililitrami PBS i antybiotyków. Więc biorę jeszcze 10 mili mojego PBS z antybiotykami w przybliżeniu, nie musi to być bardzo dokładnie 10 minut, po prostu się myjemy. Wkładam go do sitka do komórek, a następnie stosuję tę samą procedurę.

Wracam do tłoka strzykawki i jeszcze trochę przeciskam ocid. Więc oczywiście nigdy nie uda ci się wszystkiego przejść, ponieważ jest tkanka spojówkowa i małe kawałki tłuszczu, których nie byłem w stanie usunąć, a które pozostaną w sitku komórkowym. Ale powinieneś dostać większość śledziony na sitko komórkowe.

A potem powtarzam dokładnie to, co zrobiłem wcześniej. Zamierzam zebrać moją zawiesinę jednokomórkową i dodać ją do tego samego zęba. Do tej pory prawie nic nie pozostało z ekranu w przesiewaczu komórek, a PBS, który wychodzi, jest znacznie wyraźniejszy. Zamierzam po prostu umyć się jeszcze raz i powinniśmy już mieć większość komórek na zewnątrz.

Więc teraz mam moją jednokomórkową zawiesinę cytów PLE i zamierzam je rozkręcić po prostu po to, aby je zgrupować. Wystarczy więc wirowanie przez osiem do 10 minut. Więc teraz rozkręciliśmy nasze cyty PLE i mamy ładną paletę.

Pozbędę się supernatantu, a następnie zajmę się czerwonymi krwinkami. Więc zamierzam zawiesić miocyty i przejdę na chlorek amonu. Więc to jest SU, roztwór oh punkt 15 molowego chlorku amonu i zamierzam użyć pięciu mililitrów na śledzionę.

Skoro więc mam trzy śledziony, zamierzam użyć 15 mililitrów chlorku amonu i zrobię to na lodzie. Tak więc, aby ułożyć erytrocyty, zamierzam delikatnie przeczesywać je w górę iw dół przez trzy minuty. Okej, użyjemy tutaj tego ujęcia z większą ekspozycją.

Analizowałem elektrocyty przez trzy minuty. Zamierzam napełnić moją tubę PBS lub możesz również użyć pożywki. Ma to na celu przywrócenie osmolarności roztworu do normalnego zakresu dla komórek.

Zamierzam rozkręcić komórki, tak jak robiłem to wcześniej, przez 8 do 10 minut, aby je ogarnąć. A potem umyję je dwa razy, używając tego samego PBS z antybiotykami. Więc teraz rozciągamy komórki w dół po zizowaniu elektrocytów i nie martw się, nigdy nie uzyskamy stuprocentowego uwolnienia elektrocytów.

Tak więc paleta będzie nadal czerwona, ale supernatant będzie bardziej przejrzysty. A teraz zamierzam opróżnić supernatant, rozbić paletę, dodać trochę PBS do 50 mil, odwirować i powtórzyć ten krok jeszcze raz, aby mieć dwa prania A potem będę mógł się policzyć. Dwukrotnie umyłem miocyty, a następnie zawiesiłem je w pożywce hodowlanej i policzyłem za pomocą cytometru.

Zgodnie z oczekiwaniami. Z trzech śledzion uzyskałem około 600 milionów komórek, co jest oczekiwane, ponieważ jedna śledziona zwykle daje nam od 200 do 250 milionów komórek. Więc to, co zamierzam teraz zrobić, to zamierzam wysiać moje komórki w ilości 2 milionów na promil w moim pożywce, która została uzupełniona 10% płodową surowicą kaliczną.

Do tego podłoża dodam dwa mikrogramy na promil skontu A, aby stymulować komórki. A potem po prostu umieszczę komórki w inkubatorze na 48 godzin. Komórki są teraz w inkubatorze od 48 godzin i jak wam pokażę, rosną całkiem dobrze.

Podłoże zmieniło kolor na pomarańczowy. Jesteśmy więc gotowi do zakończenia przygotowań do TCGF. Jak pamiętasz, dodałem con carnaval w zawiesinie w mojej komórce, aby aktywować komórki.

Tak więc kon carnaval w a jest lektyną. Zwiąże cukry ze wszystkimi receptorami limfocytu T i sztucznie aktywuje wszystkie te komórki. Problem polega na tym, że nadal mamy część kon carnavalu w a, w supernatancie komórki S.

A ponieważ zamierzamy użyć snat w innych hodowlach komórek T, aby rozszerzyć komórki, nie chcemy, aby w tych hodowlach komórkowych doszło do kon carnavalu. Więc aby się go pozbyć, zamierzam dodać nadmiar cukru, do którego związuje się con navly, a to jest cyt metylu alfa D pokazany tutaj. A ja zamierzam dodać nadmiar tego cukru, całkowicie go rozpuścić.

Zamierza związać wszystkie pozostałe składniki marynarki wojennej w A kiedy to zrobię, zamierzam sterylnie przefiltrować moje supernatanty komórkowe i zamierzam zamrozić płyny Ali do użycia w ciągu najbliższych kilku tygodni lub miesięcy. Zacznijmy więc od tego ostatniego kroku. Więc dodaję mój supernatant do hodowli komórkowej do probówek o średnicy 50 mil, aby móc je obrócić i pozbyć się komórek.

Więc po prostu napełniam tyle probówek, ile to konieczne i nie robię tego w kapturze hodowlanym, mogłem, ale ponieważ potrzebuję jakiegokolwiek sposobu, aby przefiltrować mój, mój roztwór w końcu, ponieważ dodaję cukier, który nie jest sterylny, po prostu robię to na stole. Tak jest łatwiej. Teraz wlałem wszystkie moje komórki i supernatant do moich 50-milicalowych probówek Falcon.

Więc zamierzam przynieść je do wirówki i wirować przez około 10 minut. A jedynym powodem ich wirowania jest granulowanie komórek, aby uzyskać przezroczyste supernatanty. Komórki zostały teraz rozciągnięte w dół, więc supernatant jest klarowny i to właśnie chciałem zebrać.

Zamierzam więc zebrać cały supernatant do czystej kolby o powierzchni 150 centymetrów kwadratowych. I do tej piersiówki dodam cukier. Tak więc, podczas gdy komórki wirowały w dół, zważyłem wystarczająco dużo cukru, aby dodać 15 miligramów na ml supernatantu.

Zamierzam całkowicie pozwolić, pozwolić mu się rozpuścić, a następnie zamierzam sterylnie przefiltrować mój supernatant. Więc teraz dodam cukier 15 miligramów na ml supernatantu. Zakładam nakrętkę z powrotem, a ponieważ nie pracuję w sterylnych warunkach, nie ma znaczenia, czy zjedzone trafi do nakrętki, więc mieszam, aż cały cukier się rozpuści.

To powinno być dość szybkie. Tak, cały cukier jest teraz rozpuszczony. Więc wszystko, co muszę zrobić, to sterylny filtr to supernatant, a następnie zamierzam go podzielić.

Więc zwykle robię 10 do 15 mil porcji, które przechowuję w minus 20 stopniach. Takie porcje mogą być przechowywane przez kilka miesięcy. Możesz również przechowywać TCGF w lodówce, ale wtedy użyję go w ciągu najbliższych 10 do 15 dni.

Przez ostatnie dwa dni pokazywałem Wam, jak przygotować czynnik wzrostu limfocytów T, a ten supernatant jest bardzo prosty w wykonaniu i bardzo tani w przygotowaniu. Dlatego używamy go bardzo często w laboratorium, aby utrzymać nasze linie komórek T w hodowli bez konieczności kupowania drogich koktajli cytokin. Więc powodzenia w twoich eksperymentach.