Name: Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczurów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-10-31T22:24:33.000+00:00
Duration: 18 min 27 s
Description: Naucz się przygotowywać czynnik wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczurów z wykorzystaniem stymulacji concanavaliną A. Ta metoda umożliwia ekspansję antygenowych limfocytów T in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
<li>Pobrać śledziony szczurów linii Lewis (najlepiej od szczurów o masie 160-200g). Rozetrzeć na lodzie w szalce Petriego zawierającej PBS + antybiotyki (PBS-PS) przy użyciu sita do komórek. Przenieść do probówki 50 ml. Dopełnić PBS-PS.</li>
<li>Wirować przez 10 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.</li>
<li>Przemyć komórki dwukrotnie.</li>
<li>Resuspender osad w NH4Cl 0,15 M (5 ml na śledzionę). Mieszać delikatnie i w sposób ciągły pipetą przez 3 min na lodzie w celu lizy erytrocytów. Dopełnić probówkę pożywką.</li>
<li>Wirować przez 10 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.</li>
<li>Przemyć komórki dwukrotnie.</li>
<li>Policzyć komórki. Śledziona szczura dostarcza 200-250 milionów komórek.</li>
<li>Zasiać komórki w zagęszczeniu 2 milionów na ml w pełnej pożywce: 50 ml na kolbę 75 cm2.</li>
<li>Inkubować przez 48 godzin w inkubatorze.</li>
<li>Wirować przez 15 min w temperaturze 4°C, aby otrzymać osad komórkowy.</li>
<li>Zebrać nadsącz; komórki odrzucić.</li>
<li>Dodać do nadsączu α-metylomannozyd w stężeniu 15 mg/ml. Dokładnie wymieszać.</li>
<li>Przefiltrować (0,2 mm).</li>
<li>Rozdzielić na aliquoty i przechowywać w temperaturze -20°C. W razie potrzeby można przechowywać w temperaturze 4°C przez 10 dni.</li>
</ol>

<ol><li>Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blocking+of+voltage-gated+K%2B+channels+treats+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+and+inhibits+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation.</a> J. Immunol. 166, 936-944 (2001).</li>
<li>Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+T+lymphocyte+K%2B+channels+ameliorates+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%2C+a+model+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis.</a> Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).</li>
<li>Mor, F., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+Lewis+rat+encephalitogenic+T+cell+lines%3A+T-cell-growth-factor+is+superior+to+recombinant+IL-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2.</a> J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Przygotowujemy TCGF ze splenocytów szczura szczepu Lewis, ponieważ regularnie uśmiercamy naiwne szczury tego szczepu w celu pozyskania surowicy i grasic do stymulacji linii limfocytów T szczura Lewis in vitro. Ten TCGF może być wykorzystywany do promowania wzrostu i przeżywalności linii limfocytów T z innych szczepów szczurów. TCGF można przygotować również z innych szczepów szczurów.

<table><tbody><tr><td>PBS, 1x, sterylny</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14040-182</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna 100x</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td>Dodać 5 ml roztworu 100x do 500 ml PBS w celu przygotowania PBS-PS</td></tr><tr><td>Sito do komórek, średnica 70 um</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek amonu (NH4Cl)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0171</td><td>Przygotować roztwór 0.15 M w sterylnej wodzie destylowanej, przechowywać w chłodzie</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21870-092</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FCS, FBS)</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16140-071</td><td>Inaktywowana termicznie</td></tr><tr><td>Penicylina / Streptomycyna / L-Glutamina</td><td>Odczynnik</td><td>Cambrex/BioWhittaker</td><td>17-718R</td><td>PSG</td></tr><tr><td>Witaminy RPMI, 100x</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7256</td><td></td></tr><tr><td>Pirowinian sodu, 100x</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy, 100x</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercapt&amp;#8211;anol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>alfa-metylomannozyd</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6882</td><td></td></tr><tr><td>Konkanawalina A</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6882</td><td></td></tr><tr><td colspan="5">Aby przygotować kompletną pożywkę hodowlaną, do butelki 500 ml RPMI 1640 dodać następujące składniki i przefiltrować sterylnie: 10% FCS; 1 butelkę PSG; 5 ml witamin RPMI; 5 ml pirowinianu sodu; 5 ml niezbędnych aminokwasów; 50 uM beta-mercapt&amp;#8211;anolu; 2 ug/ml Konkanawaliny A.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów t ze splenocytów szczura

Preparing T Cell Growth Factor from Rat Splenocytes

Utrzymanie w kulturze linii lub klonów limfocytów T swoistych dla antygenu wymaga cykli aktywacji indukowanej antygenem, przedzielonych fazami ekspansji komórek 1,2. Dodanie interleukiny 2 do pożywki hodowlanej w fazie ekspansji jest niezbędne w celu zapobiegania śmierci komórek i wystarczające do utrzymania krótkoterminowych linii limfocytów T, jednak wykazano, że zwiększa ono polaryzację Th1 3. Zastąpienie interleukiny 2 czynnikiem wzrostu limfocytów T (TCGF), który zawiera mieszaninę cytokin, jest skuteczniejsze niż stosowanie interleukiny 2 w utrzymywaniu długoterminowych linii limfocytów T in vitro 3. Co więcej, TCGF można łatwo przygotować w dużych ilościach w laboratorium i jest on znacznie tańszy niż rekombinowana interleukina 2.
W niniejszym materiale pokazujemy, jak przygotować TCGF z nadsączów kultur splenocytów szczura. W tej procedurze pobieramy śledziony od naiwnych szczurów szczepu Lewis, uśpionych w celu pobrania grasicy i krwi. Przygotowujemy zawiesiny pojedynczych komórek ze śledzion, lizujemy erytrocyt poprzez szok osmotyczny i wysiewamy splenocyty w pożywce hodowlanej. Komórki są stymulowane konkanawalina A, mitogenem, który nieselektywnie aktywuje wszystkie limfocyty T szczura, indukując produkcję cytokin. Nadsącz z hodowli jest zbierany po 48 godzinach, a nadmiar konkanawaliny A jest wiązany z alfa-metylomannozydem, aby zapobiec aktywacji linii komórek T, do których dodawany będzie TCGF. Następnie TCGF jest filtrowany sterylnie, rozdzielany na alikwoty i przechowywany w temperaturze -20°C.

Opisujemy przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T, stosowanego do ekspansji in vitro linii limfocytów T szczura specyficznych dla antygenu.

Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura

Utrzymywanie w kulturze linii lub klonów limfocytów T specyficznych dla antygenu wymaga powtarzania cykli aktywacji indukowanej antygenem, przedzielonych fazami ekspansji komórkowej 1,2. ...

Witam, nazywam się Christine Beaton. Jestem pomocnikiem badawczym w laboratorium George'a Chen w Katedrze Fizjologii i Biofizyki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. W ciągu najbliższych dwóch dni pokażę Państwu, jak przygotować TCGF, czyli czynnik wzrostu limfocytów T.Zatem w codziennej hodowli komórkowej, gdy nie potrzebujemy dokładnej wiedzy na temat składu cytokin w pożywce, stosujemy czynnik wzrostu limfocytów T (TCGF), który jest nadsączem z hodowli śledziony zawierającym cytokiny niezbędne do ekspansji limfocytów T. TCGF przygotowujemy w następujący sposób: po uśmierceniu zdrowych szczurów linii Lewis pobieramy ich śledziony, przygotowujemy zawiesinę pojedynczych komórek, usuwamy erytrocyty poprzez ich lizę, a następnie komórki mononuklearne stymulujemy konkanawalną A, co indukuje limfocyty T do produkcji wszystkich cytokin wymaganych do ich wzrostu. Aby uzyskać TCGF, musimy aktywować komórki.Procedura polega na dodaniu do hodowli komórkowej lektyny Con A (skrót od konkanawaliny A). Po dodaniu Con A do hodowli komórkowej, zwiąże się ona z glikozylowanym kompleksem receptora limfocytów T. Dzięki jednoczesnemu wiązaniu się z kilkoma kompleksami dojdzie do procesu zwanego

preparing-t-cell-growth-factor-from-rat-splenocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowywanie czynnika wzrostu limfocytów T z limfocytów śledziony szczura

Opisano wydajny protokół ekspansji ex vivo limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi, izolowanych z węzłów chłonnych drenujących guz lub innych wtórnych tkanek limfatycznych organizmów z nowotworem. Protokół ten pozwala na selektywną ekspansję swoistych dla nowotworu limfocytów T do zastosowania w adoptywnej immunoterapii raka piersi.

Ex vivo ekspansja limfocytów T reaktywnych przeciwko nowotworowi za pomocą bryostatyny 1/ionomycyny oraz formulacji cytokin wspólnego łańcucha gamma

Ten film pokazuje badanie przesiewowe związków immunomodulujących za pomocą testu fluorescencyjnego. Transgeniczne limfocyty T pochodzące od myszy z kasetami ekspresji białek zielonej fluorescencji są traktowane tymi związkami. Wzmocnione i zredukowane sygnały GFP umożliwiają identyfikację odpowiednio stymulującego i hamującego działania związków.

Test oparty na fluorescencji z wykorzystaniem zmodyfikowanych limfocytów do badań przesiewowych związków immunomodulujących

Film prezentuje test oparty na cytometrii przepływowej do oznaczania dominacji immunologicznej w cytotoksycznych limfocytach T lub odpowiedziach CTL. Wstrzyknięte fluorescencyjne komórki docelowe wykazują różną fluorescencję odpowiadającą epitopom immunogennym. Pobranie i sortowanie po śledzionie ujawnia zmniejszenie liczby komórek fluorescencyjnych o wysokiej intensywności, co potwierdza dominację immunologiczną w odpowiedziach CTL.

Test do oceny immunodominacji w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T

Limfodepletywne i immunomodulacyjne efekty standardu leczenia chemioterapią i radioterapią mogą być wykorzystane do zwiększenia skuteczności przeciwnowotworowej immunoterapii limfocytami T. Przedstawiamy metodę generowania limfocytów T receptora antygenu chimerycznego (CAR) specyficznych dla EGFRvIII i podawania ich w kontekście standardowej opieki nad glejakiem.

Wytwarzanie limfocytów CAR T do terapii adoptywnej w kontekście standardu opieki nad glejakiem

Tutaj prezentujemy protokół indukcji tolerancji w transplantacji i oceniamy in vitro i in vivo zdolność tłumienia różnych podzbiorów komórek od biorcy oraz status immunologiczny biorcy wobec dawcy lub egzogennych antygenów.

Ocena in vitro i in vivo aktywności supresyjnej komórek T, B i mieloidalnych oraz odpowiedzi humoralnych u biorców przeszczepów

Tutaj prezentujemy protokół szybkiego i powtarzalnego generowania biologicznie inspirowanych, biodegradowalnych komórek prezentujących antygen sztuczny (aAPC) o regulowanym rozmiarze, kształcie i prezentacji białka powierzchniowego do ekspansji limfocytów T ex vivo lub in vivo.

Wytwarzanie anizotropowych polimerowych sztucznych komórek prezentujących antygen do aktywacji limfocytów T CD8 +

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Celem tego protokołu jest pokazanie, jak używać mikroskopii świetlnej do czterowymiarowej wizualizacji dynamiki receptorów powierzchniowych w żywych komórkach. Tutaj pokazano receptory limfocytów T na pierwotnych limfocytach T CD4 +.

Czterowymiarowa wizualizacja dynamiki powierzchniowego receptora limfocytów T przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej

Ten protokół zapewnia in vitro strategię współhodowli do badania wpływu komórek T regulatorowych na proliferację i różnicowanie komórek T efektorowych.

In Vitro analiza funkcjonalna komórek T regulatorowych: skupienie na proliferacji i różnicowaniu

W niniejszym filmie zaprezentowano dwie metody przygotowania i umieszczania kuleczek pokrytych czynnikiem wzrostu na eksplantach rozwijającej się kory mózgu. Kuleczki te mogą być wykorzystywane do indukcji przestrzennie ograniczonej ekspresji genów w rozwijającej się tkance nerwowej, takiej jak eksplanty przedmózgowia. Przedstawiono metody wykorzystujące zarówno kuleczki Affi-Gel, jak i akrylowe kuleczki heparynowe.

Umieszczanie kuleczek pokrytych czynnikami wzrostu w eksplantach grzbietowej części przedmózgowia

Naucz się przygotowywać czynnik wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczurów z wykorzystaniem stymulacji concanavaliną A. Ta metoda umożliwia ekspansję antygenowych limfocytów T in vitro.

Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura

Przeglądaj więcej filmów