Name: Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek mikronaczyniowego śródbłonka mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj metodę izolacji i unieśmiertelniania komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy. Protokół obejmuje homogenizację, trawienie i hodowlę, umożliwiając badanie bariery krew-mózg oraz ocenę terapii neurozapalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsze badanie zostało sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG w ramach grantu numer FO 315/4-1 oraz DFG SFB 688.

1. Izolacja mikronaczyń mózgowych
<ol>
 <li>Do każdego przygotowania należy wykorzystać od pięciu do dziesięciu noworodków myszy obu płci (w wieku 3-5 dni).</li>
 <li>Mysz należy uśmiercić zgodnie z lokalnymi zaleceniami IACUC/lekarza weterynarii, niezwłocznie wyciąć mózg i przenieść go do szalki Petriego zawierającej następujący roztwór: 15 mM Hepes (pH 7,4), 153 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 2,3 mM CaCl2x 2H2O, 2,6 mM MgCl2x 6H2O, 1% (w/v) BSA (dalej określany jako bufor A).</li>
 <li>O ile nie wskazano inaczej, wszystkie procedury izolacji powinny być przeprowadzane w temperaturze pokojowej (RT) (22-24 °C) pod laminarnym nawiewem. Po usunięciu opon mózgowych i fragmentów naczyń kapilarnych, mózgi (mózgowie bez móżdżku i pnia mózgu) należy pociąć w buforze A za pomocą sterylnego skalpela. Fragmenty tkanki należy pipetować w górę i w dół za pomocą pipety 10 ml, aż do całkowitego rozbicia grudek. Zawiesinę należy przenieść do probówki Falcon 50 ml i wirować przy 250 x g przez 5 min w RT.</li>
</ol>
Uwaga: Ośnie mogą być zidentyfikowane jako cienkie, przezroczyste błony na powierzchni tkanki mózgowej. Można je ostrożnie usunąć za pomocą sterylnej pęsety.
<ol start="4">
 <li>Odciąć supernatant.</li>
 <li>Rozpuścić osad w 4,5 ml Buforu A z dodatkiem 1,5 ml 0,75% (w/v) kolagenazy/dispazy (Roche) i inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w kąpieli wodnej (okazjonalnie wstrząsając).</li>
 <li>W międzyczasie przygotować płytki 12-dołkowe, pokrywając cztery dołki kolagenem IV (0,1 mg/ml rozpuszczonym w 50 mM kwasie octowym). Pozostawić do adsorpcji na 1 h.</li>
 <li>Zatrzymać trawienie poprzez dodanie 15 ml lodowatego buforu A. Dokładnie resuspender osad.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Odciąć supernatant.</li>
 <li>W celu usunięcia mieliny dodać 10 ml 25% (w/v) BSA (Sigma, czystość &gt; 98%) i odwirować przy 1 000 x g przez 20 min w temperaturze 4 °C. 25% BSA powinno być rozpuszczone w 1x PBS (PAA Laboratories) i przefiltrowane przez filtr 0,2 μm).</li>
 <li>Ostrożnie odciąć supernatant, rozpuścić osad w 10 ml Buforu A i przenieść do nowej probówki Falcon.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT). Otrzymany osad zawiera komórki śródbłonka.</li>
 <li>Przemyć dwukrotnie pokrytą kolagenem IV płytkę 12-dołkową za pomocą PBS.</li>
 <li>Resuspender osad w 4 ml pożywki wzrostowej (DMEM zawierającej 10% FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy) i nanieść zawiesinę komórkową do dwóch dołków, po 2 ml do każdego. Dodać puromycynę do stężenia końcowego 4 μg/ml i inkubować przez 45 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych. Krok ten pozwala na usunięcie szybko przylegających komórek. Uwaga: Puromycynę dodaje się na 24 h. Tylko komórki śródbłonka mózgu potrafią ją metabolizować; dla innych typów komórek puromycyna jest toksyczna 14.</li>
 <li>Przenieść 2 ml pożywki zawierającej nieprzylegające komórki z kroku 1.14 do dwóch nowych dołków (te dołki zawierają frakcję komórek śródbłonka). Dopełnić dołki z komórkami przylegającymi z kroku 1.14 za pomocą 2 ml świeżej pożywki (dołki te zawierają inne typy komórek, np. fibroblasty, astrocyty i mogą być hodowane równolegle oraz wykorzystywane do porównania morfologii).</li>
 <li>Wymienić pożywkę następnego dnia.</li>
</ol>
2. Unieśmiertelnianie komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego
<ol>
 <li>Hodować fibroblasty GP + E-86 Neo (GPENeo) 15, wydzielające wirusa z defektem replikacyjnym z onkogenem T środkowym polyoma, w pożywce DMEM zawierającej 10% inaktywowanego ciepłem FCS, 50U/ml penicyliny/streptomycyny oraz 2 mg/ml G418 (PAA Laboratories) w kolbach pokrytych żelatyną. Uwaga: Transfekcja onkogenem T środkowym polyoma powoduje przewagę wzrostu komórek śródbłonka (EC) nad komórkami niebędącymi EC, co prowadzi do powstania jednorodnej monowarstwy komórek o morfologii śródbłonka po 4 do 6 tygodniach hodowli. GPENeo nie są dostępne komercyjnie i mogą być pozyskane jako publiczny materiał udostępniony (proszę odnieść się do oryginalnych publikacji 4,16).</li>
 <li>Aby wykorzystać pożywkę zawierającą wirusa do uniesmiertelnienia, hodować komórki GPENeo w pożywce wolnej od G418 przez 24 h.</li>
 <li>Odlać 10 ml supernatantu GPEneo i dodać Polybrene (bromek heksadymetryny) (Sigma) do stężenia końcowego 8 μg/ml, a następnie wysterylizować przez filtr 0,45 μm w celu usunięcia fragmentów komórkowych.</li>
 <li>Usunąć pożywkę wzrostową z kultur EC przygotowanych w Części 1 i dodać do dołków 2 ml mieszaniny supernatantu GPEneo/Polybrene. Powtórzyć czynność następnego dnia, używając świeżej mieszaniny supernatantu GPEneo/Polybrene. Uwaga: Polybrene jest używany do tworzenia porów w ścianie komórkowej, aby ułatwić infekcję cząstkami wirusowymi.</li>
 <li>Następnego dnia usunąć mieszaninę supernatantu GPEneo/Polybrene, dwukrotnie przemyć komórki PBS i utrzymywać je w pożywce wzrostowej, wymieniając ją co 3 dni. Po osiągnięciu konfluencji przenieść komórki w stosunku 1:2 na płytki pokryte kolagenem IV.</li>
 <li>Zazwyczaj stabilne linie komórek śródbłonka mózgowego (cEND) powinny zostać otrzymane po 4-5 tygodniach.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgowego
<ol>
 <li>Rozmrozić komórki z krioalikwotu w kąpieli wodnej i przenieść do probówki Falcon 15 ml z 10 ml podgrzanej wcześniej pożywki.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę z prędkością 250 x g przez 5 min w RT.</li>
 <li>Usunąć pożywkę, przenieść osad do kolby hodowlanej T25 cm2 powlekanej kolagenem IV z podgrzaną wcześniej pożywką wzrostową (gęstość komórek podczas wysiewania powinna wynosić co najmniej 1x 104 komórek/ml).</li>
 <li>Wymienić pożywkę następnego dnia, a po osiągnięciu przez komórki konfluencji (zazwyczaj po 5 dniach) dokonać pasażowania komórek.</li>
</ol>
4. Pasażowanie komórek cEND (Uwaga: pasażowanie powinno być wykonywane tylko raz w tygodniu, należy unikać rozcieńczeń większych niż 1:4).
<ol>
 <li>Usunąć medium, a następnie przemyć komórki PBS.</li>
 <li>Dodać 3 ml podgrzanego roztworu trypsyny-EDTA (PAA Laboratories) (kolba T75 cm2), inkubować w temperaturze 37 °C i czekać do momentu rozproszenia warstwy komórek (zazwyczaj od 5 do 15 min).</li>
 <li>Dodać 5 ml medium wzrostowego, pipetować w górę i w dół, a następnie przenieść do nowej kolby powlekanej kolagenem IV.</li>
</ol>
5. Zamrażanie komórek cEND
<ol>
 <li>Przygotować zawiesinę komórkową zgodnie z opisem w kroku 4.</li>
 <li>Odwirować zawiesinę przy 250 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Resuspender osad komórkowy (uzyskany z jednej kolby T75 cm2) w 6 ml medium do mrożenia (95% medium wzrostowe, 5% DMSO).</li>
 <li>Podzielić zawiesinę komórkową na cztery krioprzaliki po 1,5 ml. Uwaga: Jeden krioprzalik można zasiać do kolby T25 cm2.</li>
 <li>Przechowywać krioprzaliki w temperaturze par ciekłego azotu.</li>
</ol>
Pożywka wzrostowa cEND: 450 ml DMEM, 10% FCS, 10 ml L-glutaminy, 2% MEM-Kit, 2% NEAA, 10 ml pirogronianu sodu, 50 U/ml penicyliny/streptomycyny
6. Reprezentatywne wyniki
Komórki cEND i cerebEND scharakteryzowano za pomocą immunobarwień markerów śródbłonka i BHE (bariery krew-mózg) oraz poprzez pomiary transepithelialnej oporności elektrycznej (TEER) i przepuszczalności. Komórki cEND i cerebEND wykazywały morfologię podobną do kultur pierwotnych EC (komórek śródbłonka) mózgu, tworząc monowarstwy gęsto upakowanych, wydłużonych komórek, które wykazywały zahamowanie wzrostu po osiągnięciu konfluencji. Komórki wykazywały wyraźnie wykrywalne poziomy białek claudin-5, occludin i VE-cadherin, które lokalizowały się w połączeniach międzykomórkowych, co wykazano w badaniu immunofluorescencji (Rycina 3) 4,5. Hodowla komórek cEND w medium o obniżonej zawartości surowicy prowadziła do wzrostu TEER (z 150 Ωcm2 w obecności 10% surowicy do 500 Ωcm2 w obecności 2% surowicy), co zostało wzmocnione przez dodatek hydrokortyzonu (800 Ωcm2) lub insuliny (1,000 Ωcm2)4. Monowarstwy cEND hodowane w medium o obniżonej zawartości surowicy przez 21 dni osiągnęły wartość TEER wynoszącą 900 Ωcm2 (Rycina 4). TEER mierzono przy użyciu zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia (World Precision Instruments). Dla porównania, w literaturze zgłoszono, że pierwotne EC mikro naczyniowe mózgu mają wartości TEER w zakresie 200-600 Ωcm2, a komercyjnie dostępna mysia linia komórkowa bEnd.3 wykazuje wartości TEER rzędu 100-140 Ωcm2 (nowszy przegląd: Abbot 2005 oraz Toth et al., 2011 17,18). Ponadto, przenikanie makrocząsteczek, takich jak nieładowane FITC-dekstrany o masach cząsteczkowych 4, 10, 70 i 500 kDa lub fluoresceina (300 Da), przez monowarstwę cEND w medium różnicującym z 2% FCS w ciągu 4 h było mniejsze w porównaniu z komórkami kontrolnymi utrzymywanymi w medium wzrostowym zawierającym 10% FCS: przepływ parakomórkowy został zredukowany do 30% w stosunku do komórek kontrolnych dla fluoresceiny, do 26% dla FITC-dekstranów 10 i 70 kDa oraz do 4,5% dla FITC-dekstranu 500 kDa. Podobnie jak w przypadku wartości TEER, przepuszczalność była najniższa w komórkach hodowanych w obecności glikokortykosteroidów (GC) 4. W dalszych badaniach zidentyfikowano geny docelowe glikokortykosteroidów: occludin, claudin-5 i VE-cadherin w śródbłonku naczyniowym mózgu 4,7,9. Leczenie GC prowadziło do zwiększenia ekspresji tych białek oraz do reorganizacji VE-cadherin względem cytoszkieletu. Bezpośrednia regulacja białek połączeń ścisłych occludin i claudin-5 przez GC odbywa się poprzez elementy odpowiedzi na GC w ich regionach promotorowych 4,7,19. Dodatkowo claudin-5 został zidentyfikowany jako nowy cel estrogenowy w śródbłonku naczyniowym 10.
Dysfunkcja śródbłonka leży u podstaw wielu różnych chorób. Hodowaliśmy komórki cEND w warunkach deprywacji tlenu i glukozy (OGD). OGD doprowadziła do zaburzenia funkcji BBB, która mogła zostać przywrócona po zastosowaniu łącznej terapii GC oraz inhibitora proteasomów bortezomibu 12. Warunki OGD doprowadziły do silnego wzrostu poboru glukozy oraz ekspresji transporterów glukozy w komórkach cerebEND, co mogło zostać złagodzone poprzez dodanie MK801, niekonkurencyjnego inhibitora receptora NMDA 13.
<img alt="Proces różnicowania komórek; obraz mikroskopowy; tworzenie kolonii komórek macierzystych; zmiana morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/4022/4022fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Morfologia komórek śródbłonka naczyń mózgowych (cEND) tydzień po izolacji. Zdjęcia mikroskopowe wykonano przy powiększeniu 6x (A) i 15x (B). Widoczne są tworzące wyspy kolonie komórek śródbłonka.
<img alt="Obraz mikroskopowy hodowli komórkowej; morfologia komórkowa; badania biologiczne; inżynieria tkankowa." src="/files/ftp_upload/4022/4022fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Morfologia komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu (cEND) miesiąc po izolacji i unieśmiertelnieniu. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopii świetlnej przy 15-krotnym powiększeniu. Można zaobserwować konfluencyjną, jednorodną monowarstwę komórek śródbłonka.
<img alt="Struktura włókna mięśniowego w mikroskopii fluorescencyjnej; schemat przedstawiający wyrównane sarkomery i filamenty." src="/files/ftp_upload/4022/4022fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Unieśmiertelnione komórki śródbłonka mikro naczyniowego mózgu wykazują ekspresję claudin-5, occludin i VE-cadherin.Komórki CEND hodowano na szkiełkach podstawkowych pokrytych kolagenem IV i barwiono przeciwciałami przeciwko claudin-5 (A), occludin (B) oraz VE-cadherin (C). Obrazy wykonano przy użyciu mikroskopu Zeiss Axioscop2 z powiększeniem 40x.
<img alt="Wykres transepitelialnego oporu elektrycznego (TEER) w ciągu 21 dni; pomiar szczelności bariery, Ωcm²." src="/files/ftp_upload/4022/4022fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Pomiar transendotelialnego oporu elektrycznego (TEER) monowarstwy cEND. Komórki cEND hodowano na filtrach transwell pokrytych kolagenem IV (wielkość porów 0,4 μm). Po osiągnięciu konfluencji komórki utrzymywano w pożywce zawierającej 2% FCS. TEER mierzono po 7, 14 i 21 dniach przy użyciu układu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia.

<ol><li>Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurobiol.+Exp+%28Wars%29%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier.</a> Acta Neurobiol. Exp (Wars). 71, 113(2011).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+hydrocortisone+and+TNFalpha+on+tight+junction+proteins+in+an+in+vitro+model+of+the+human+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of hydrocortisone and TNFalpha on tight junction proteins in an in vitro model of the human blood-brain barrier.</a> J. Physiol. 586, 1937(2008).</li>
<li>Weksler, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB.+J%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB. J. 19, 1872(2005).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occludin+as+direct+target+for+glucocorticoid-induced+improvement+of+blood-brain+barrier+properties+in+a+murine+in+vitro+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system.</a> J. Physiol. 565 (Pt 2), 475(2005).</li>
<li>Silwedel, C., Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+cerebral+and+cerebellar+murine+brain+microvascular+endothelial+cells+to+loss+of+barrier+properties+in+response+to+inflammatory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli.</a> J. Neuroimmunol. 179, 37(2006).</li>
<li>Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+mouse+microvascular+endothelial+barrier+permeability+are+brain+specific%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on mouse microvascular endothelial barrier permeability are brain specific.</a> J. Physiol. 573 (Pt 2), 413(2006).</li>
<li>Burek, M., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+murine+claudin-5+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the murine claudin-5 promoter.</a> Mol. Cell Endocrinol. 298, 19(2009).</li>
<li>Forster, C., Kahles, T., Kietz, S., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+induces+the+expression+of+metalloproteinase+inhibitor+TIMP-1+in+the+murine+cerebral+vascular+endothelial+cell+line+cEND%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone induces the expression of metalloproteinase inhibitor TIMP-1 in the murine cerebral vascular endothelial cell line cEND.</a> J. Physiol. 580 (Pt.3), 937(2007).</li>
<li>Blecharz, K. G., Drenckhahn, D., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+increase+VE-cadherin+expression+and+cause+cytoskeletal+rearrangements+in+murine+brain+endothelial+cEND+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids increase VE-cadherin expression and cause cytoskeletal rearrangements in murine brain endothelial cEND cells.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 28, 1139(2008).</li>
<li>Burek, M., Arias-Loza, P. A., Roewer, N., Forster, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+as+a+novel+estrogen+target+in+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 as a novel estrogen target in vascular endothelium.</a> Arterioscler. Thromb Vasc. Biol. 30, 298(2010).</li>
<li>Blecharz, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+effects+on+endothelial+barrier+function+in+the+murine+brain+endothelial+cell+line+cEND+incubated+with+sera+from+patients+with+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid effects on endothelial barrier function in the murine brain endothelial cell line cEND incubated with sera from patients with multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 16, 293(2010).</li>
<li>Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+insensitivity+at+the+hypoxic+blood-brain+barrier+can+be+reversed+by+inhibition+of+the+proteasome%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid insensitivity at the hypoxic blood-brain barrier can be reversed by inhibition of the proteasome.</a> Stroke. 42, 1081(2011).</li>
<li>Neuhaus, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Addition+of+NMDA-receptor+antagonist+MK801+during+oxygen%2Fglucose+deprivation+moderately+attenuates+the+upregulation+of+glucose+uptake+after+subsequent+reoxygenation+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells.</a> Neurosci. Lett. 506, 44(2012).</li>
<li>Perriere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-based+purification+of+rat+brain+capillary+endothelial+cell+cultures.+Effect+on+the+expression+of+blood-brain+barrier-specific+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties.</a> J. Neurochem. 93, 279(2005).</li>
<li>Golenhofen, N., Ness, W., Wawrousek, E. F., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+induction+of+the+stress+protein+alpha-B-crystallin+in+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and induction of the stress protein alpha-B-crystallin in vascular endothelial cells.</a> Histochem Cell Biol. 117, 203(2002).</li>
<li>Risau, W., Engelhardt, B., Wekerle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+function+of+the+blood-brain+barrier%3A+incomplete+presentation+of+protein+%28auto-%29antigens+by+rat+brain+microvascular+endothelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Immune function of the blood-brain barrier: incomplete presentation of protein (auto-)antigens by rat brain microvascular endothelium in vitro.</a> J. Cell Biol. 110, 1757(1990).</li>
<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+CNS+barriers%3A+evolution%2C+differentiation%2C+and+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of CNS barriers: evolution, differentiation, and modulation.</a> Cell Mol. Neurobiol. 25, 5(2005).</li>
<li>Toth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patented+in+vitro+blood-brain+barrier+models+in+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat.+CNS+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Patented in vitro blood-brain barrier models in CNS drug discovery.</a> Recent Pat. CNS Drug Discov. 6, 107(2011).</li>
<li>Harke, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoids+regulate+the+human+occludin+gene+through+a+single+imperfect+palindromic+glucocorticoid+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoids regulate the human occludin gene through a single imperfect palindromic glucocorticoid response element.</a> Mol. Cell Endocrinol. 295, 39(2008).</li>
<li>Kiefer, F., Courtneidge, S. A., Wagner, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+properties+of+the+middle+T+antigens+of+polyomaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Oncogenic properties of the middle T antigens of polyomaviruses.</a> Adv. Cancer Res. 64, 125(1994).</li>
<li>Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+transformation+by+polyomavirus+middle+T+antigen+in+mice+lacking+Src-related+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell transformation by polyomavirus middle T antigen in mice lacking Src-related kinases.</a> Curr. Biol. 4, 100(1994).</li>
<li>Ong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ShcA+and+Grb2+mediate+polyoma+middle+T+antigen-induced+endothelial+transformation+and+Gab1+tyrosine+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">ShcA and Grb2 mediate polyoma middle T antigen-induced endothelial transformation and Gab1 tyrosine phosphorylation.</a> EMBO J. 20, 6327(2001).</li>
<li>O'Connell, K. A., Edidin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+lymphoid+endothelial+cell+line+immortalized+by+simian+virus+40+binds+lymphocytes+and+retains+functional+characteristics+of+normal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A mouse lymphoid endothelial cell line immortalized by simian virus 40 binds lymphocytes and retains functional characteristics of normal endothelial cells.</a> J. Immunol. 144, 521(1990).</li>
<li>Roux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+gamma-glutamyl+transpeptidase+and+alkaline+phosphatase+activities+in+immortalized+rat+brain+microvessel+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells.</a> J. Cell Physiol. 159, 101(1994).</li>
<li>Montesano, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+proteolytic+activity+is+responsible+for+the+aberrant+morphogenetic+behavior+of+endothelial+cells+expressing+the+middle+T+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Increased proteolytic activity is responsible for the aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T oncogene.</a> Cell. 62, 435(1990).</li>
<li>Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+immortalized+bEnd5+and+primary+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells+as+in+vitro+blood-brain+barrier+models+for+the+study+of+T+cell+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 31, 315(2010).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkaper%2C+SD+%22Methods+in+Neurosciences%22">Methods in Neurosciences</a>. Conn, M. 2, 1303(1990).</li>
<li>Ishii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin%2C+an+endothelial+anticoagulant+protein%2C+is+absent+from+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin, an endothelial anticoagulant protein, is absent from the human brain.</a> Blood. 67, 362(1986).</li>
<li>Minagar, A., Alexander, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+disruption+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mult.+Scler%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis.</a> Mult. Scler. 9, 540(2003).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana procedura może być wykorzystywana do izolacji mikro naczyniowych komórek śródbłonka (EC) z różnych szczepów myszy, jak również z różnych szczepów myszy z nokautem genów, w celu badania specyficznych zmian w funkcji śródbłonka naczyniowego. Jako metodę unieśmiertelnienia zastosowano transformację onkoproteiną mysiego polyomavirusa, antygenem Polyoma middle T. Przekształca on szybko niedojrzałe komórki śródbłonka in vivo oraz in vitro 20,21,22. Inne metody unieśmiertelniania komórek EC opisane w literaturze obejmują na przykład unieśmiertelnianie antygenem SV40 large T wirusa Simian Vacuolating Virus 40 23, produktem genu E1A adenowirusa 24 lub nadekspresję podjednostki katalitycznej ludzkiej telomerazy 3. Unieśmiertelnianie za pomocą PymT jest specyficzne dla niedojrzałych mysich komórek EC, co pozwala na szybkie uzyskanie homogennej hodowli komórek EC z noworodków myszy. Unieśmiertelnienie zmienia właściwości komórek, a wyniki uzyskane z unieśmiertelnionych linii komórkowych powinny być porównywane albo z komórkami pierwotnymi, albo z eksperymentami in vivo na myszach. Opisano, że unieśmiertelnione PymT komórki EC wykazują wysoką aktywność fibrinolityczną, wynikającą ze zwiększonej produkcji aktywatora plazminogenu typu urokinazy oraz zmniejszonej produkcji inhibitorów aktywatora plazminogenu 25. Bezpośrednie porównanie unieśmiertelnionej PymT linii komórek bEND5 z pierwotnymi komórkami EC wykazało, że oba modele BWE in vitro są dobrze dostosowane do badań adhezji limfocytów T 26.
Linie komórkowe ustanowione zgodnie z opisaną procedurą można stosować przy niskim numerze pasażu, aby zachować właściwości barierowe dzięki wysokiej ekspresji białek połączeń BBB i EC, ponieważ komórki tracą te właściwości wraz z wiekiem. W związku z tym, po utracie właściwości barierowych, należy rozważyć przygotowanie nowej linii komórkowej. Gęstość wysiewu komórek EC powinna być wysoka, ponieważ jest to kluczowe dla proliferacji komórek. Należy to uwzględnić zarówno podczas procedury izolacji, jak i w trakcie hodowli unieśmiertelnionych EC. Każda nowa linia komórkowa powinna zostać przetestowana pod kątem właściwości barierowych oraz ewentualnych zanieczyszczeń innymi typami komórek. Monowarstwy EC można barwić przeciwciałami anty-galaktocerebrosydowymi, anty-gliofibrylarnym białkiem kwaśnym oraz anty-antygenem mięśni gładkich jako przeciwciałami pierwszorzędowymi, aby wykluczyć zanieczyszczenie oligodendrocytami, astrocytami i perycytami 4,27. Aby wykluczyć zanieczyszczenie naczyniami oponowymi, można zbadać ekspresję trombomoduliny, która jest wyrażana we wszystkich łożach naczyniowych z wyjątkiem mózgu 28.
Interesujące jest to, że unieśmiertelnione linie mikrovascularnych komórek śródbłonka izolowane z różnych obszarów mózgu różnią się właściwościami barierowymi i podatnością na bodźce prozapalne. Jako przykład można przywołać linie komórkowe cEND z mózgowia oraz cerebEND z móżdżku 4,5. W porównaniu z cEND, linia cerebEND wykazała niższe poziomy ekspresji głównych składników połączeń ścisłych: claudin-1 i occludin. Jednakże poziomy claudin-3 i -12 były wyższe w cerebEND. Funkcja barierowa komórek cerebEND uległa znacznie większemu pogorszeniu pod wpływem mediatora zapalnego TNFα niż właściwości barierowe komórek cEND 5. Wyższą podatność móżdżku na bodźce zapalne można zaobserwować in vivo u pacjentów z stwardnieniem rozsianym oraz w jego modelu zwierzęcym — eksperymentalnym autoimmunologicznym zapaleniuu mózgu i rdzenia 29. Te interesujące wyniki wskazują na konieczność tworzenia i charakteryzowania oddzielnych modeli in vitro dla różnych obszarów mózgu, aby w przyszłości usprawnić dostarczanie leków do mózgu.

<table><tbody><tr><td>Siarczan albuminy wołowej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Czystość &amp;gt; 98%</td></tr><tr><td>kolagen IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td>50 &amp;mu;g/ml w 50 mM kwasie octowym</td></tr><tr><td>Kolagenaza/Dyspaza</td><td>Roche</td><td>10269638001</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Płódka surowica cielęca (FCS)</td><td>PAA Laboratories</td><td>A15110-1333</td><td>stężenie końcowe 10%, inaktywowana termicznie (30 min w 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Biochrom AG</td><td>K0282</td><td>Przechowywanie: &amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Witaminy MEM</td><td>Biochrom AG</td><td>K0373</td><td>Przechowywanie: &amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pirowinian sodu</td><td>Biochrom AG</td><td>L0473</td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna (G418)</td><td>PAA Laboratories</td><td>P11-012</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy (NEA)</td><td>Biochrom AG</td><td>K0293</td><td>Przechowywanie w 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Biochrom AG</td><td>A2212</td><td>Przechowywanie: &amp;#8804; -15 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (bromek heksadymetryny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689</td><td>0,8 mg/ml w PBS, przechowywanie w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Puromycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna/EDTA</td><td>Biochrom AG</td><td>L1825</td><td>0,05%, 0,02% EDTA w PBS</td></tr></tbody></table>

generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Komórki nabłonkowe i śródbłonkowe (EC) tworzą bariery parakomórkowe, które chronią tkankę przed środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. Bariera krew-mózg (BBB), składająca się z EC, stóp końcowych astrocytów, pericytów i błony podstawnej, odpowiada za ochronę i homeostazę miąższu mózgu. Modele BBB in vitro są powszechnymi narzędziami służącymi do badania struktury i funkcji BBB na poziomie komórkowym. Do tej pory w różnych laboratoriach opracowano znaczną liczbę odmiennych modeli BBB in vitro. Zazwyczaj komórki pozyskuje się z tkanki mózgowej bydła, świni, szczura lub myszy (szczegółowo omówione w przeglądzie Wilhelma et al. 1). Próbki ludzkich tkanek są dostępne tylko w ograniczonej liczbie laboratoriów lub firm 2,3. Ponieważ przygotowanie pierwotnych hodowli komórkowych jest czasochłonne, a hodowle EC mogą różnić się między partiami, przedmiotem zainteresowania naukowego jest tworzenie unieśmiertelnionych linii EC.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę tworzenia unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka (EC) mikroznaczyniowych mózgu z mózgu noworodka myszy. Opisujemy procedurę krok po kroku, wymieniając zastosowane odczynniki i roztwory. Metoda opracowana w naszym laboratorium pozwala na izolację homogenicznej, unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka w ciągu czterech do pięciu tygodni. Linie komórek śródbłonka mikroznaczyniowych mózgu nazwane cEND 4 (z kory mózgu) oraz cerebEND 5 (z kory móżdżku) zostały wyizolowane zgodnie z tą procedurą w laboratorium Förstera i były skutecznie wykorzystywane do wyjaśniania różnych procesów fizjologicznych i patologicznych w obrębie barier krew-mózg (BBB). Wykorzystując cEND i cerebEND wykazaliśmy, że komórki te reagują na leczenie glikokortykosterydami 4,6-9 i estrogenami 10, a także na mediatory prozapalne, takie jak TNFalpha 5,8. Ponadto zbadaliśmy patologię stwardnienia rozsianego 11 oraz hipoksji 12,13 na poziomie komórek śródbłonka. Linie cEND i cerebEND mogą być uznane za wartościowe narzędzie do badania struktury i funkcji BBB, reakcji komórkowych EC na różne bodźce lub oddziaływania EC z limfocytami bądź komórkami nowotworowymi.

Niniejsza metoda opisuje sposób izolacji i unieśmiertelniania mikro naczyniowych komórek śródbłonka z mózgu myszy. Przedstawiamy szczegółowy protokół, obejmujący kolejno homogenizację tkanki mózgowej, etapy trawienia, wysiew oraz unieśmiertelnianie komórek. Uzyskanie homogennej, unieśmiertelnionej linii mikro naczyniowych komórek śródbłonka zajmuje zazwyczaj około pięciu tygodni.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Komórki nabłonka i komórki śródbłonka (EC) tworzą bariery parakomórkowe, które chronią tkankę przed środowiskiem zewnętrznym i wewnętrznym. ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie homogenicznej hodowli unieśmiertelnionych komórek śródbłonka mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie mózgów z myszy noworodkowych i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Drugim krokiem jest unieśmiertelnienie komórek za pomocą antygenu T średniego wirusa polyoma.Następnie komórki rosną przez około cztery tygodnie, aż do utworzenia jednorodnej warstwy endotelialnej. Ostatnim krokiem jest charakterystyka nowej linii komórkowej przy użyciu takich technik jak barwienie immunocytochemiczne, Western blot oraz Q-Q-P-C-R. Zastosowania tej techniki obejmują terapię neurozapalnych lub niedokrwiennych schorzeń mózgu, ponieważ umożliwia ona wstępną ocenę terapii oraz uzyskanie wglądu w patofizjologię.Procedurę zademonstruje dr Elaine Salvador, stażystka podoktorska z mojego laboratorium. Po wyjęciu mózgu noworodka myszy w wieku od trzech do pięciu dni i przeniesieniu go do szalki Petriego zawierającej bufor A, do każdej preparacji wymagane są mózgi od 5 do 10 myszy; prace należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Z każdego mózgu należy usunąć móżdżek, pień mózgu, oponu mózgowe oraz fragmenty naczyń włosowatych.Następnie przenieś mózgowia do drugiej szalki Petriego zawierającej bufor A. Używając sterylnego skalpela, podziel mózgowia na małe kawałki, a następnie za pomocą pipety 10 ml aspiruj i wypuszczaj tkankę wraz z buforem, aż do całkowitego rozbicia grudek. W tym momencie przenieś zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml po odwirowaniu tkanki mózgowej z prędkością 250 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odlej nadsącz i rozpuść osad w 4,5 ml buforu A z dodatkiem 1,5 ml roztworu 0,75% w/v.Dodaj kolagenazę. Inkubuj tkankę i roztwór kolagenazy przez 45 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, okazjonalnie mieszając. W międzyczasie przygotuj płytki do hodowli tkankowej, pokrywając cztery dołki płytki 12-dołkowej sterylnym roztworem o stężeniu 0.1 mg/mL.Kolagen oraz 50 mM kwas octowy umożliwiają przyleganie kolagenu do dołków w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po upływie 45-minutowego okresu inkubacji należy przerwać trawienie tkanki mózgowej, dodając 15 ml buforu A, a następnie dokładnie zawiesić osad w tym roztworze. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 250 ×g przez 10 minut i odlej nadsącz.Aby usunąć mielinę z preparatu, należy dodać do tkanki 10 ml sterylnego, 25% (masowych) roztworu B, s, A oraz PBS, a następnie wirować z prędkością 1000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu należy ostrożnie odlać nadsącz, rozpuścić osad w 15 ml buforu A i przenieść go do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie ponownie wirować z prędkością 250 ×g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie płytkę powleczoną kolagenem typu IV należy dwukrotnie przemyć PBS.Po drugim przemyciu pozostaw dwa dołki puste, a do pozostałych dwóch dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej. Po odlaniu nadsączu resuspenduj osad komórkowy, składający się głównie z komórek śródbłonka, w czterech mililitrach pożywki wzrostowej zawierającej cztery mikrogramy na mililitr puramycyny, a następnie nanieś dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego z dwóch pustych dołków powlekonych kolagenem i inkubuj w temperaturze 37°C przez 45 minut, aby zabić szybko przylegające komórki nieśródbłonkowe. Następnie odessij pożywkę wzrostową z dwóch dołków, które nie zawierają komórek, i ją usuń.Następnie przenieś pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki, w tym frakcję komórek śródbłonka, do tych dwóch studzienek. Uzupełnij poprzednie studzienki dwiema mililitrami świeżej pożywki. Studzienki te zawierają inne typy komórek, takie jak fibroblasty i astrocyty; można je hodować równolegle i wykorzystać do porównania morfologii.Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnego dnia wymień pożywkę na świeżą. Hoduj fibroblasty GPE neo, które wydzielają wirusa z onkogenem T środkowym poliomy i są hodowane w kolbach pokrytych żelatyną zawierających pożywkę GPE neo. Transfekcja onkogenem T środkowym poliomy powoduje przewagę wzrostu komórek śródbłonka nad komórkami nieśródbłonkowymi, co prowadzi do powstania jednorodnej warstwy komórek o morfologii śródbłonkowej. Po czterech do sześciu tygodniach hodowli, komórki GPE neo, które nie są dostępne komercyjnie, mogą zostać pozyskane jako udostępniony materiał publiczny.Po 24-godzinnej hodowli komórek GPE Neo Fiberblast, należy odessać 10 ml pożywki i dodać sterylny roztwór poly brain do stężenia końcowego 8 µg/ml. Mieszaninę nadsączu należy przepuścić przez filtr 0,45 µm w celu usunięcia fragmentów komórkowych. Następnie należy odessać pożywkę z kultur komórek śródbłonka i po inkubacji przez noc dodać do dołków 2 ml mieszaniny nadsączu poly brain.Powtórz tę procedurę następnego dnia, używając świeżej alikwoty mieszaniny nadsączu i poly brain. Usuń mieszaninę nadsączu i poly brain. Przemyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj świeżą pożywkę wzrostową.Należy kontynuować wymianę pożywki co trzy dni. Gdy komórki osiągną konfluencję, należy przenieść je (pasaż 1-2) na płytki pokryte kolagenem typu IV. Stabilne linie komórek śródbłonka mózgowego uzyskuje się zazwyczaj po czterech do pięciu tygodniach kolejnych hodowli.Gdy jednorodna monowarstwa śródbłonka wypełni całą studzienkę. Po uzyskaniu stabilnych linii komórkowych przenieść je do flakonów hodowlanych pokrytych kolagenem typu IV; pasażować komórki nie częściej niż raz w tygodniu za pomocą trypsyny, używając 3 ml trypsyny z EDTA i inkubując w temperaturze 37°C przez 5 do 15 minut, aż warstwa komórek ulegnie rozproszeniu. Po dodaniu 5 ml pożywki wysiać komórki do nowych flakonów, unikając rozcieńczeń większych niż 1:4.Gdy liczba komórek będzie wystarczająca do uzyskania konfluencji w kolbie T 75, można przygotować krioalikwoty komórek do późniejszego wykorzystania. W tym celu zebrać komórki za pomocą trypsyny jak wcześniej, a następnie odwirować zawiesinę komórkową przy 250 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej zawiesić osad komórkowy w sześciu mililitrach medium do mrożenia, a następnie pipetować 1,5 ml zawiesiny komórkowej do czterech krio probówek.Umieść probówki kriogeniczne w pojemniku mrożącym Nalgene wypełnionym izopropanolem i przechowuj je przez jedną dobę w temperaturze -80 °C. Następnie przechowuj probówki kriogeniczne w ciekłym azocie. Rozmroź krioprezwaty komórek w łaźni wodnej, a następnie przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki wzrostowej.Pożywkę należy podgrzać do 37 °C, a probówkę odwirować z prędkością 250 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu pożywki osad należy resuspender w odpowiedniej objętości pożywki wzrostowej. Zawiesinę komórkową przenieść do kolby hodowlanej T 25 pokrytej kolagenem typu IV z uprzednio podgrzaną pożywką wzrostową.Gęstość komórek do wysiewu powinna wynosić co najmniej 1 × 10⁴ komórek na ml. Następnego dnia należy wymienić medium i kontynuować pasażowanie komórek w dotychczasowy sposób; gdy komórki osiągną konfluencję (około pięciu dni później), należy wysiać je z gęstością pożądaną dla kolejnych eksperymentów. Komórki C-end scharakteryzowano za pomocą immunobarwienia markerów śródbłonka oraz bariery krew-mózg.Na tym obrazie przedstawiono morfologię komórek C and poddanych immunobarwienia na clain five. Komórki C and wykazują morfologię podobną do kultur pierwotnych ECS mózgu, z monowarstwami gęsto upakowanych, wydłużonych komórek wykazujących zahamowanie wzrostu. Przy pełnej konfluencji komórki wykazywały wykrywalne poziomy clain.Tutaj komórki C CN zostały poddane immunobarwieniu przeciwciałem przeciwko okludynie. Tutaj widzimy ekspresję białek VE-kadheryny, które są zlokalizowane w połączeniach międzykomórkowych, co ponownie wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Transendotelialna oporność elektryczna została zmierzona przy użyciu zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia.Z powyższej ryciny wynika, że transendotelialna oporność elektryczna komórek C end rośnie wraz z czasem hodowli po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania zaburzeń naczyniowo-mózgowych w modelu mysim.

generation-an-immortalized-murine-brain-microvascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Generacja uśmierczonej linii komórek endotelialnych naczyń krwionośnych mózgowych mysich jako in vitro model bariery krew-mózg

Stworzenie ludzkich modeli bariery krew-mózg (BBB) może przynieść korzyści badaniom nad chorobami mózgu związanymi z niewydolnością bariery krew-mózg. Opisujemy tutaj ulepszoną technikę przygotowania kontaktowego modelu BBB, która umożliwia kokulturację ludzkich astrocytów i komórek śródbłonka mózgu po przeciwnych stronach porowatej błony.

Ulepszona metoda przygotowania opartego na komórkach ludzkich, kontaktowego modelu bariery krew-mózg

Celem niniejszego badania było sprawdzenie odtwarzalności modelu BBB in vitro z udziałem syngenicznej kohodowli komórek śródbłonka i astrocytów na szczurach. Monowarstwa komórek śródbłonka charakteryzowała się wysoką przepuszczalnością TEER i niską przepuszczalnością LY. Oceniano ekspresję specyficznych białek TJ, funkcjonalne odpowiedzi na stan zapalny oraz funkcjonalność transporterów i receptorów.

Tworzenie modelu in vitro bariery krew-mózg szczura (BBB): skupienie się na nieprzepuszczalności bariery krew-mózg i transporcie za pośrednictwem receptorów

Komórki śródbłonka mikronaczyniowego mózgu (BMEC) są połączone specyficznymi białkami połączeniowymi, tworząc wysoce regulowaną barierę oddzielającą krew od ośrodkowego układu nerwowego (OUN), tak zwaną barierę krew-mózg (BBB). Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu, jak omówiono w tym protokole, umożliwia szczegółowe badania in vitro bariery krew-mózg.

Izolacja pierwotnych mysich komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu

Tutaj opisujemy mysi model bariery krew-mózg in vitro, który wykorzystuje impedancję spektroskopii komórek, koncentrując się na konsekwencjach dla integralności i przepuszczalności komórek śródbłonka po interakcji z aktywowanymi limfocytami T.

Model in vitro bariery krew-mózg przy użyciu spektroskopii impedancyjnej: skupienie się na interakcji limfocytów T z komórkami śródbłonka

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Celem protokołu jest przedstawienie zoptymalizowanej procedury tworzenia modelu bariery krew-mózg (BBB) in vitro opartego na pierwotnych komórkach śródbłonka mózgu świni (pBECs). Model wykazuje wysoką odtwarzalność, wysoką szczelność i nadaje się do badań nad transportem i transportem wewnątrzkomórkowym w odkrywaniu leków.

Ulepszona metoda tworzenia modelu bariery krew-mózg in vitro na podstawie komórek śródbłonka mózgu świni

Ludzka bariera krew-mózg selektywnie zapobiega przenikaniu hydrofilowych cząsteczek i patogenów do mózgu. Kilka patologii, w tym zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych i majaczenie pooperacyjne, wiąże się ze zwiększoną przepuszczalnością bariery krew-mózg. W tym miejscu opisujemy model hodowli komórek śródbłonka w celu zbadania przepuszczalności bariery przez przenikanie drobnoustrojów.

Analiza przepuszczalności bariery krew-mózg przez przenikanie drobnoustrojów przez komórki śródbłonka mikronaczyniowego

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół szczegółowo opisuje dostosowaną metodę pozyskiwania, rozszerzania i kriokonserwacji mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu uzyskanych przez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, oraz badania właściwości bariery krew-mózg w modelu ex vivo.

Wyprowadzanie, ekspansja, kriokonserwacja i charakterystyka mikronaczyniowych komórek śródbłonka mózgu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Przedstawiono protokół do izolacji i pierwotnej kultury komórek endotelialnych drobnych naczyń krwionośnych mózgu (BMEC) z mózgu mysiego noworodka w celu stworzenia solidnego modelu in vitro do badania funkcji bariery krew-mózg w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Izolacja i hodowla komórek endoteliowych mikrokrążenia mózgu myszy

Poznaj metodę izolacji i unieśmiertelniania komórek śródbłonka mikronaczyniowego mózgu myszy. Protokół obejmuje homogenizację, trawienie i hodowlę, umożliwiając badanie bariery krew-mózg oraz ocenę terapii neurozapalnych.

Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Przeglądaj więcej filmów