Generowanie unieśmiertelnionej linii komórek śródbłonka mikrokrążenia mózgu myszy jako modelu bariery krew-mózg in vitro

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie homogenicznej hodowli unieśmiertelnionych komórek śródbłonka mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez wyizolowanie mózgów z myszy noworodkowych i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek. Drugim krokiem jest unieśmiertelnienie komórek za pomocą antygenu T średniego wirusa polyoma.

Następnie komórki rosną przez około cztery tygodnie, aż do utworzenia jednorodnej warstwy endotelialnej. Ostatnim krokiem jest charakterystyka nowej linii komórkowej przy użyciu takich technik jak barwienie immunocytochemiczne, Western blot oraz Q-Q-P-C-R. Zastosowania tej techniki obejmują terapię neurozapalnych lub niedokrwiennych schorzeń mózgu, ponieważ umożliwia ona wstępną ocenę terapii oraz uzyskanie wglądu w patofizjologię.

Procedurę zademonstruje dr Elaine Salvador, stażystka podoktorska z mojego laboratorium. Po wyjęciu mózgu noworodka myszy w wieku od trzech do pięciu dni i przeniesieniu go do szalki Petriego zawierającej bufor A, do każdej preparacji wymagane są mózgi od 5 do 10 myszy; prace należy prowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Z każdego mózgu należy usunąć móżdżek, pień mózgu, oponu mózgowe oraz fragmenty naczyń włosowatych.

Następnie przenieś mózgowia do drugiej szalki Petriego zawierającej bufor A. Używając sterylnego skalpela, podziel mózgowia na małe kawałki, a następnie za pomocą pipety 10 ml aspiruj i wypuszczaj tkankę wraz z buforem, aż do całkowitego rozbicia grudek. W tym momencie przenieś zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml po odwirowaniu tkanki mózgowej z prędkością 250 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odlej nadsącz i rozpuść osad w 4,5 ml buforu A z dodatkiem 1,5 ml roztworu 0,75% w/v.

Dodaj kolagenazę. Inkubuj tkankę i roztwór kolagenazy przez 45 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C, okazjonalnie mieszając. W międzyczasie przygotuj płytki do hodowli tkankowej, pokrywając cztery dołki płytki 12-dołkowej sterylnym roztworem o stężeniu 0.1 mg/mL.

Kolagen oraz 50 mM kwas octowy umożliwiają przyleganie kolagenu do dołków w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po upływie 45-minutowego okresu inkubacji należy przerwać trawienie tkanki mózgowej, dodając 15 ml buforu A, a następnie dokładnie zawiesić osad w tym roztworze. Następnie odwiruj próbkę z prędkością 250 ×g przez 10 minut i odlej nadsącz.

Aby usunąć mielinę z preparatu, należy dodać do tkanki 10 ml sterylnego, 25% (masowych) roztworu B, s, A oraz PBS, a następnie wirować z prędkością 1000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu należy ostrożnie odlać nadsącz, rozpuścić osad w 15 ml buforu A i przenieść go do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, a następnie ponownie wirować z prędkością 250 ×g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W międzyczasie płytkę powleczoną kolagenem typu IV należy dwukrotnie przemyć PBS.

Po drugim przemyciu pozostaw dwa dołki puste, a do pozostałych dwóch dodaj dwa mililitry pożywki wzrostowej. Po odlaniu nadsączu resuspenduj osad komórkowy, składający się głównie z komórek śródbłonka, w czterech mililitrach pożywki wzrostowej zawierającej cztery mikrogramy na mililitr puramycyny, a następnie nanieś dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego z dwóch pustych dołków powlekonych kolagenem i inkubuj w temperaturze 37°C przez 45 minut, aby zabić szybko przylegające komórki nieśródbłonkowe. Następnie odessij pożywkę wzrostową z dwóch dołków, które nie zawierają komórek, i ją usuń.

Następnie przenieś pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki, w tym frakcję komórek śródbłonka, do tych dwóch studzienek. Uzupełnij poprzednie studzienki dwiema mililitrami świeżej pożywki. Studzienki te zawierają inne typy komórek, takie jak fibroblasty i astrocyty; można je hodować równolegle i wykorzystać do porównania morfologii.

Inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli tkankowych. Następnego dnia wymień pożywkę na świeżą. Hoduj fibroblasty GPE neo, które wydzielają wirusa z onkogenem T środkowym poliomy i są hodowane w kolbach pokrytych żelatyną zawierających pożywkę GPE neo. Transfekcja onkogenem T środkowym poliomy powoduje przewagę wzrostu komórek śródbłonka nad komórkami nieśródbłonkowymi, co prowadzi do powstania jednorodnej warstwy komórek o morfologii śródbłonkowej. Po czterech do sześciu tygodniach hodowli, komórki GPE neo, które nie są dostępne komercyjnie, mogą zostać pozyskane jako udostępniony materiał publiczny.

Po 24-godzinnej hodowli komórek GPE Neo Fiberblast, należy odessać 10 ml pożywki i dodać sterylny roztwór poly brain do stężenia końcowego 8 µg/ml. Mieszaninę nadsączu należy przepuścić przez filtr 0,45 µm w celu usunięcia fragmentów komórkowych. Następnie należy odessać pożywkę z kultur komórek śródbłonka i po inkubacji przez noc dodać do dołków 2 ml mieszaniny nadsączu poly brain.

Powtórz tę procedurę następnego dnia, używając świeżej alikwoty mieszaniny nadsączu i poly brain. Usuń mieszaninę nadsączu i poly brain. Przemyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie dodaj świeżą pożywkę wzrostową.

Należy kontynuować wymianę pożywki co trzy dni. Gdy komórki osiągną konfluencję, należy przenieść je (pasaż 1-2) na płytki pokryte kolagenem typu IV. Stabilne linie komórek śródbłonka mózgowego uzyskuje się zazwyczaj po czterech do pięciu tygodniach kolejnych hodowli.

Gdy jednorodna monowarstwa śródbłonka wypełni całą studzienkę. Po uzyskaniu stabilnych linii komórkowych przenieść je do flakonów hodowlanych pokrytych kolagenem typu IV; pasażować komórki nie częściej niż raz w tygodniu za pomocą trypsyny, używając 3 ml trypsyny z EDTA i inkubując w temperaturze 37°C przez 5 do 15 minut, aż warstwa komórek ulegnie rozproszeniu. Po dodaniu 5 ml pożywki wysiać komórki do nowych flakonów, unikając rozcieńczeń większych niż 1:4.

Gdy liczba komórek będzie wystarczająca do uzyskania konfluencji w kolbie T 75, można przygotować krioalikwoty komórek do późniejszego wykorzystania. W tym celu zebrać komórki za pomocą trypsyny jak wcześniej, a następnie odwirować zawiesinę komórkową przy 250 ×g przez pięć minut. W temperaturze pokojowej zawiesić osad komórkowy w sześciu mililitrach medium do mrożenia, a następnie pipetować 1,5 ml zawiesiny komórkowej do czterech krio probówek.

Umieść probówki kriogeniczne w pojemniku mrożącym Nalgene wypełnionym izopropanolem i przechowuj je przez jedną dobę w temperaturze -80 °C. Następnie przechowuj probówki kriogeniczne w ciekłym azocie. Rozmroź krioprezwaty komórek w łaźni wodnej, a następnie przenieś je do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki wzrostowej.

Pożywkę należy podgrzać do 37 °C, a probówkę odwirować z prędkością 250 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po odessaniu pożywki osad należy resuspender w odpowiedniej objętości pożywki wzrostowej. Zawiesinę komórkową przenieść do kolby hodowlanej T 25 pokrytej kolagenem typu IV z uprzednio podgrzaną pożywką wzrostową.

Gęstość komórek do wysiewu powinna wynosić co najmniej 1 × 10⁴ komórek na ml. Następnego dnia należy wymienić medium i kontynuować pasażowanie komórek w dotychczasowy sposób; gdy komórki osiągną konfluencję (około pięciu dni później), należy wysiać je z gęstością pożądaną dla kolejnych eksperymentów. Komórki C-end scharakteryzowano za pomocą immunobarwienia markerów śródbłonka oraz bariery krew-mózg.

Na tym obrazie przedstawiono morfologię komórek C and poddanych immunobarwienia na clain five. Komórki C and wykazują morfologię podobną do kultur pierwotnych ECS mózgu, z monowarstwami gęsto upakowanych, wydłużonych komórek wykazujących zahamowanie wzrostu. Przy pełnej konfluencji komórki wykazywały wykrywalne poziomy clain.

Tutaj komórki C CN zostały poddane immunobarwieniu przeciwciałem przeciwko okludynie. Tutaj widzimy ekspresję białek VE-kadheryny, które są zlokalizowane w połączeniach międzykomórkowych, co ponownie wykazano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Transendotelialna oporność elektryczna została zmierzona przy użyciu zestawu zawierającego elektrody do przepływu prądu i pomiaru napięcia.

Z powyższej ryciny wynika, że transendotelialna oporność elektryczna komórek C end rośnie wraz z czasem hodowli po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny neuronauki do zgłębiania zaburzeń naczyniowo-mózgowych w modelu mysim.