Name: Indukcja sygnałów zależnych od adhezji za pomocą ultradźwięków o niskim natężeniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj metodę stymulacji fibroblastów ultradźwiękami o niskim natężeniu w celu indukcji formowania adhezji ogniskowych i aktywacji Rac1. Technika ta pozwala badać mechanizmy molekularne naprawy tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu Wellcome Trust 088419 przyznanego dla MDB oraz dzięki wsparciu firmy Smith &amp; Nephew UK Ltd.

1. Powlekanie powierzchni ligandem macierzy
<ol>
	<li>Ultradźwięki zostaną zastosowane do komórek w dołkach o średnicy 3,5 cm, w formie pojedynczych naczyń lub płytki 6-dołkowej. W przypadku analiz biochemicznych ligand należy nanieść bezpośrednio na plastik. Do immunofluorescencji należy trzykrotnie zagotować szklane zakrycia w wodzie MilliQ i umieścić 4 zakrycia na dnie każdego dołka.</li>
	<li>Powierzchnie szklane muszą zostać poddane drywatyzacji, aby zapewnić efektywne powlekanie ligandem. Rozpuścić ester sulpho-m-maleimidobenzoylo-N-hydroksysukcynymidu w PBS do stężenia 1 mM. Dodać 2 ml do każdego dołka i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć drywatyzowane powierzchnie 3 razy PBS.</li>
	<li>Powlecz drywatyzowane szkło lub niepoddany obróbce plastik ligandem integrynowym. Nanieść 2 ml liganda integrynowego o stężeniu 10 ug/ml, rozpuszczonego w PBS zawierającym Ca2+ i Mg2+, do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować monopartykulowane BSA, podgrzewając 1% BSA rozpuszczone w PBS do 85 °C przez 13 minut. Pozostawić do ostygnięcia, a następnie przefiltrować przez filtr 0,45-μm.</li>
	<li>Przemyć powierzchnie powleczone ligandem 3 razy PBS i blokować monopartykulowanym BSA przez 30 minut.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Aby kontrolować środowisko macierzy w trakcie całego eksperymentu, należy zablokować syntezę białek poprzez dodanie 25 μg/ml cykloheksymidy do fibroblastów o 80% konfluencji na 2 godziny.</li>
	<li>Komórki traktowane cykloheksymidą należy przepłukać PBS i odlepić od kolby hodowlanej, używając 0,5 mg/ml trypsyny/EDTA.</li>
	<li>Odseparowane komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 500x g przez 5 minut.</li>
	<li>Komórki należy resuspendować w DMEM/25 mM HEPES z dodatkiem 25 μg/ml cykloheksymidy.</li>
	<li>Należy ocenić gęstość komórek w zawiesinie za pomocą hemocytometru i rozcieńczyć ją do stężenia 105 ml-1.</li>
	<li>Komórki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut w celu regeneracji integryn powierzchniowych.</li>
	<li>Studzienki pokryte ligandem i zablokowane BSA należy przepłukać 3 razy PBS.</li>
	<li>Do każdej studzienki należy nanieść 2 ml zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Pozostawić komórki do rozprzestrzenienia się na 2 godziny w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2.</li>
</ol>
3. Stymulacja ultradźwiękami
<ol>
	<li>Podgrzać macierz emiterów ultradźwiękowych oraz żel sprzęgający do 37 °C.</li>
	<li>Nanieść niewielką ilość żelu sprzęgającego (wielkości ziarnka grochu) na każdy emiter.</li>
	<li>Sprawdzić funkcjonalność każdego emitera za pomocą detektora w postaci diody wskaźnika ultradźwięków.</li>
	<li>Umieścić dołki na macierzy emiterów. Przenieść macierz do warunków 37 °C i 5% CO2 i odczekać 10 minut aż do wyrównania temperatury.</li>
	<li>Włączyć sygnał ultradźwiękowy.</li>
	<li>Sygnał ultradźwiękowy zostanie wyłączony po 20 minutach, co naśladuje schemat terapeutyczny. W przypadku potrzeby zastosowania krótszego czasu stymulacji, płytki należy wyjąć z macierzy w odpowiednich punktach czasowych. We wszystkich przypadkach należy użyć płytek niestymulowanych jako kontroli negatywnej.</li>
</ol>
4. Analiza adhezji ogniskowych metodą immunofluorescencji
<ol>
	<li>W celu analizy tworzenia adhezji ogniskowych zastosuj 20-minutowy sygnał ultradźwiękowy, a następnie pozwól strukturom rozwijać się przez kolejne 40 minut, utrzymując komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
	<li>Odsaj cały medium i utrwal komórki, dodając 2 ml 4% paraformaldehydu w PBS. Inkubuj przez 14 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsaj paraformaldehyd i wypłucz trzy razy PBS, aplikując go delikatnie po ściance studzienki, aby uniknąć powstania sił ścinających.</li>
	<li>Przenieś każdą szkiełko nakrywkę ze studzienki 3,5 cm do płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia immunofluorescencyjnego barwienia.</li>
	<li>Zneutralizuj pozostałości paraformaldehydu, dodając 0,5 ml 0,1 M glicyny w PBS do każdego z 24 dołków. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsaj glicynę i wypłucz trzy razy PBS.</li>
	<li>Przeprowadź permeabilizację komórek, dodając 0,5 ml 0,5% (w/v) Triton X-100 w PBS. Inkubuj przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Odsaj Triton X-100 i wypłucz trzy razy PBS.</li>
	<li>Zablokuj nieswoiste wiązania, dodając 0,5 ml 3% (w/v) BSA w PBS. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbarw adhezje ogniskowe zawierające winkulinę, stosując przeciwciało hVIN-1 rozcieńczone 1:400 w bloku BSA. Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wypłucz trzy razy PBS.</li>
	<li>Zastosuj przeciwciało wtórne koniugowane z fluorophorem (DyLight 488) (rozcieńczenie 1:200) i zbarw aktynę falloidyną koniugowaną z TRITC (rozcieńczenie 1:200) w bloku BSA. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wypłucz trzy razy PBS i raz wodą.</li>
	<li>Zamontuj próbkę na szkiełku przedmiotowym w pozycji odwróconej, używając medium montażowego Prolong Gold.</li>
</ol>
5. Ilościowe określanie aktywacji Rac1 za pomocą testu pull-down
<ol>
	<li>W celu analizy aktywacji Rac1 poddaj komórki 20-minutowej ekspozycji na sygnał ultradźwiękowy w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Podczas oceny czasów odpowiedzi przekraczających 20 minut, zastosuj sygnał ultradźwiękowy przez 20 minut, a następnie utrzymuj komórki w 37 °C i 5% CO2 przez pozostały czas, aby umożliwić rozwinięcie się odpowiedzi.</li>
	<li>Odsuń medium i umieść studzienki na lodzie. Przepłucz studzienki 2 ml zimnego PBS, a następnie go odessij. Upewnij się, że pozostałości PBS zostały usunięte, pozostawiając studzienki pod kątem przez 1 minutę, po czym dokładnie odessij płyn.</li>
	<li>Zlizuj komórki na lodzie za pomocą 35 μl buforu do lizy (10% glicerolu, 20 mM Hepes pH 7.4, 140 mM NaCl, 1% NP40, 0.5% deoksycholan sodu, 4 mM EGTA, 4 mM EDTA, 1 × inhibitor proteaz cOmplete) na studzienne. W tym przykładzie dla każdego punktu czasowego wykorzystano 6 studzienek, aby uzyskać 210 μl lizatu komórkowego. Można użyć większej lub mniejszej liczby studzienek, jednak całkowita objętość lizatu powinna wynosić ~200 μl.</li>
	<li>Dokładnie zeskrob komórki skrobakiem komórkowym, aby zapewnić pełną lizę, i pozostaw studzienki pod kątem przez 1 minutę, aby lizat mógł się zgromadzić.</li>
	<li>Przenieś lizat do schłodzonej do temperatury lodowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml (łącząc lizaty z tego samego schematu traktowania) i wiruj przy 21000 × g przez 2 minuty w 4 °C, aby wytrącić resztki komórkowe.</li>
	<li>Przenieś 180 μl lizatu do schłodzonych do temperatury lodowej probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 130 μl buforu do lizy i 25 μl kulek agarozowych PAK-glutation10. Pozostały surowy lizat przechowuj w -20 °C do późniejszej separacji żelowej.</li>
	<li>Wychwyć aktywny Rac1 na kulkach agarozowych PAK-glutation, rotując probówkami przez 40 minut w 4 °C.</li>
	<li>Zebierz konjugaty kulek agarozowych poprzez wirowanie przy 2000 × g przez 1 minutę w 4 °C.</li>
	<li>Przemyj konjugaty kulek trzykrotnie 500 μl buforu do lizy, zbierając kulki przez wirowanie przy 2000x g i odrzucając nadsącz po każdym przemyciu. Ostrożnie usuń pozostały bufor do przemywania pipetą 200 μl.</li>
	<li>Eluuj każdą próbkę, dodając 35 μl buforu do ładowania SDS-PAGE, a następnie inkubuj w 85 °C na wstrząsającym bloku grzewczym przez 5 minut. Usuń kulki poprzez wirowanie przy 21000 × g przez 1 minutę.</li>
	<li>Rozdziel eluat z kulek metodą SDS-PAGE, przenieś na błonę nitrocelulozową i przeprowadź detekcję Rac1.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
W niniejszym protokole opisujemy indukcję aktywności Rac1 oraz tworzenia ognisk adhezyjnych barwionych winukulina za pomocą ultradźwięków. W eksperymencie dotyczącym adhezji ogniskowej sytuacją wyjściową jest fakt, że fibroblasty rozprzestrzenione na ligandzie integryny α5β1 nie tworzą adhezji zawierających winukulina (Rys. 3A), chyba że drugi receptor fibronektyny, syndekan-4, zostanie aktywowany poprzez dodanie rozpuszczalnego ligandu (Rys. 3B) 3,4. Jednakże stymulacja ultradźwiękami indukuje tworzenie adhezji ogniskowej w takim samym stopniu, jak aktywacja syndekanu-4 (Rys. 3C), co wskazuje, że stymulacja ultradźwiękami może zastąpić określone komponenty szlaku sygnałowego zależnego od fibronektyny 5. Kluczowym wyzwaniem w tym protokole jest wyeliminowanie tworzenia adhezji ogniskowych w przypadku braku stymulanta. Niepełna inhibicja syntezy białek przez cykloheksymid pozwoli na depozycję macierzy wystarczającą do autostymulacji komórek. Zbyt duże zagęszczenie komórek może również prowadzić do powstawania adhezji ogniskowych na niskim poziomie oraz słabej odpowiedzi na ultradźwięki, ponieważ interferencja między kontaktami komórka-komórka a komórka-macierz utrudni eksperyment zaprojektowany w celu wyizolowania pojedynczego bodźca. Jako rozwinięcie podstawowego testu przedstawiamy ten sam eksperyment powtórzony z użyciem fibroblastów pozbawionych syndekanu-4 (Rys. 4). Fibroblasty te nadal reagują na ultradźwięki (Rys. 4C), ale nie reagują na ligand syndekanu-4 (Rys. 4B). Eksperyment z wykorzystaniem fibroblastów Sdc4 -/- dowodzi, że ultradźwięki mogą rzeczywiście ominąć potrzebę obecności niektórych receptorów fibronektyny i ilustruje, w jaki sposób prosty protokół można rozwinąć, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat szlaku sygnałowego.
W eksperymencie biochemicznym wykazujemy, że ultradźwięki mogą indukować aktywację Rac1, wykorzystując test pull-down, który jest adaptacją metody opisanej przez Del Pozo et al. 10. Wytrącanie aktywnego Rac1 w 0, 10, 30 i 60 minutach po rozpoczęciu stymulacji ultradźwiękami wykazuje, że aktywność Rac1 osiąga szczyt w 10–30 minutach, a następnie powraca do poziomu bazowego (Ryc. 5). Analiza blotingu surowych lizatów w kierunku winkuliny zapewnia równą ilość naniesionego białka pomiędzy poszczególnymi punktami czasowymi. Wynik ten przypomina aktywację Rac1 wywołaną przez zaangażowanie syndekanu-43, lecz jest nieco bardziej przedłużony niż aktywacja indukowana przez fibronektynę. W związku z tym zazwyczaj wymaganych jest 8–10 powtórzeń, aby uzyskać istotne statystycznie dane. Aktywacja Rac1 odpowiada za skierowanie komórek ku tworzeniu przylegań ogniskowych, a początkowe przylegania ogniskowe zaczynają formować się w 10–30 minutach, co zbiega się z aktywacją Rac1. Po zainicjowaniu przylegania te będą nadal dojrzewać do dużych blaszek przylegania przedstawionych na Ryc. 3 i 4.
<img alt="Diagram sygnału LIPUS; parametry: 1,5 MHz, 1 kHz, 200 ms; moc wyjściowa: 30 mW/cm²." src="/files/ftp_upload/4024/4024fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Kształt fali ultradźwiękowej. Ultradźwięki składają się z przerywanego sygnału 1,5 MHz, który ze względu na niską amplitudę (30 mW/cm2, średnia przestrzenna, średnia czasowa) nie wywołuje efektu cieplnego.
<img alt="Schemat adhezji komórek: inkubacja z cykloheksymidą, stymulacja ultradźwiękami, test aktywacji Rac1." src="/files/ftp_upload/4024/4024fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schematyczny przedstawienie przebiegu prac nad przygotowaniem i stymulacją komórek ultradźwiękami.
<img alt="Mikroskopia immunofluorescencyjna; barwienie na winukulina i aktynę; odpowiedź komórkowa na ligand Syn4, zabieg LIPUS." src="/files/ftp_upload/4024/4024fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Indukcja tworzenia adhezji ogniskowych w fibroblastach za pomocą ultradźwięków. Fibroblasty wysiano na fragment fibonektyny wiążący integryny (A) przed stymulacją fragmentem fibonektyny wiążącym syndekan-4 (B) lub ultradźwiękami (C). Po 60-minutowej stymulacji komórki utrwalono, zabarwiono na winukulina i aktynę, a następnie obrazowano za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej. Pasek skali = 10 μm.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, nakładka winkuliny i aktyny, niepobudzone, ligand Syn4, LIPUS, analiza komórek." src="/files/ftp_upload/4024/4024fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Indukcja tworzenia adhezji ogniskowych w fibroblastach pozbawionych syndekanu-4 za pomocą ultradźwięków. Fibroblasty Sdc4 -/- rozprzestrzeniono na fragmencie fibronektyny wiążącym integryny (A) przed stymulacją fragmentem fibronektyny wiążącym syndekan-4 (B) lub ultradźwiękami (C). Po 60-minutowej stymulacji komórki utrwalono, zabarwiono na obecność winkuliny i aktyny, a następnie obrazowano za pomocą epifluorescencji. Mimo że fibroblasty Sdc4 -/- były niewrażliwe na fibronektynę, ultradźwięki nadal indukowały tworzenie adhezji ogniskowych, co wskazuje, że ultradźwięki omijają proces angażowania receptorów macierzy. Pasek = 10 μm.
<img alt="Western blot i wykres słupkowy przedstawiające zmiany aktywności Rac w czasie pod wpływem stymulacji LIPUS." src="/files/ftp_upload/4024/4024fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Aktywacja Rac1 przez ultradźwięki. Komórki stymulowano przez 0, 10, 30 i 60 minut, wykorzystując 6 dołków dla każdego punktu czasowego. Ilość GTP-Rac1 obecną w próbkach z przebiegu czasowego testu pull-down Rac1 wizualizowano poprzez inkubację z przeciwciałem anty-Rac1 na western blot (górny obraz). Kwantyfikacja intensywności prążków (średnia z 8-10 powtórzeń) wykazuje zwiększoną aktywność Rac1 w wyniku sygnału ultradźwiękowego w 10. i 30. minucie, przed powrotem do poziomów bazowych w 60. minucie (wykres). Słupki błędów reprezentują s.e.m.

<ol><li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syndecan-4+hair+trigger+initiates+wound+healing+through+caveolin-+and+RhoG-regulated+integrin+endocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A syndecan-4 hair trigger initiates wound healing through caveolin- and RhoG-regulated integrin endocytosis.</a> Dev. Cell. 21, 681-693 (2011).</li>
<li>Echtermeyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+wound+repair+and+impaired+angiogenesis+in+mice+lacking+syndecan-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Delayed wound repair and impaired angiogenesis in mice lacking syndecan-4.</a> J. Clin. Invest. 107, R9-R14 (2001).</li>
<li>Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-4-dependent+Rac1+regulation+determines+directional+migration+in+response+to+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-4-dependent Rac1 regulation determines directional migration in response to the extracellular matrix.</a> J. Cell Biol. 177, 527-538 (2007).</li>
<li>Woods, A., Couchman, J. R., Johansson, S., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+and+cytoskeletal+organisation+of+fibroblasts+in+response+to+fibronectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion and cytoskeletal organisation of fibroblasts in response to fibronectin fragments.</a> Embo. J. 5, 665-670 (1986).</li>
<li>Mahoney, C. M., Morgan, M. R., Harrison, A., Humphries, M. J., Bass, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+ultrasound+bypasses+canonical+syndecan-4+signaling+to+activate+rac1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Therapeutic ultrasound bypasses canonical syndecan-4 signaling to activate rac1.</a> J. Biol. Chem. 284, 8898-8909 (2009).</li>
<li>Claes, L., Willie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enhancement+of+bone+regeneration+by+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Biophys.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The enhancement of bone regeneration by ultrasound.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 93, 384-398 (2007).</li>
<li>Heckman, J. D., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Kilcoyne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+tibial+fracture-healing+by+non-invasive%2C+low-intensity+pulsed+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Acceleration of tibial fracture-healing by non-invasive, low-intensity pulsed ultrasound.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 76, 26-34 (1994).</li>
<li>Kristiansen, T. K., Ryaby, J. P., McCabe, J., Frey, J. J., Roe, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+healing+of+distal+radial+fractures+with+the+use+of+specific%2C+low-intensity+ultrasound.+A+multicenter%2C+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Joint+Surg.+Am%22%5BJournal%5D)">Accelerated healing of distal radial fractures with the use of specific, low-intensity ultrasound. A multicenter, prospective, randomized, double-blind, placebo-controlled study.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 79, 961-973 (1997).</li>
<li>Danen, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+the+synergy+site+for+cell+adhesion+to+fibronectin+depends+on+the+activation+state+of+integrin+alpha+5+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Requirement for the synergy site for cell adhesion to fibronectin depends on the activation state of integrin alpha 5 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 270, 21612-21618 (1995).</li>
<li>Del Pozo, M. A., Price, L. S., Alderson, N. B., Ren, X. D., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+the+extracellular+matrix+regulates+the+coupling+of+the+small+GTPase+Rac+to+its+effector+PAK%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Adhesion to the extracellular matrix regulates the coupling of the small GTPase Rac to its effector PAK.</a> Embo. J. 19, 2008-2014 (2000).</li>
<li>Makarem, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+binding+of+vascular+cell+adhesion+molecule-1+and+the+HepII%2FIIICS+domain+of+fibronectin+to+the+integrin+alpha+4+beta+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Competitive binding of vascular cell adhesion molecule-1 and the HepII/IIICS domain of fibronectin to the integrin alpha 4 beta 1.</a> J. Biol. Chem. 269, 4005-4011 (1994).</li>
</ol>

Andrew Harrison jest pracownikiem firmy Smith &amp; Nephew UK Limited.

W niniejszym protokole opisujemy metodę, dzięki której zabieg normalnie stosowany u pacjentów może zostać wykorzystany w eksperymentach na liniach komórkowych. Ostatecznym celem jest zrozumienie molekularnego mechanizmu działania ultradźwięków, aby umożliwić udoskonalenie tej terapii. W tym protokole wykorzystujemy embrionalne fibroblasty mysie (MEFs) jako modelowy system komórkowy, jednak wykazano, że ultradźwięki są skuteczne również w przypadku pierwotnych ludzkich fibroblastów napierstka 5, mezenchymalnych komórek macierzystych, osteoblastów oraz chondrocytów 6. Jako przykład analizy biochemicznej stosujemy aktywację Rac1, lecz metoda ta mogłaby zostać w równym stopniu wykorzystana do badania regulacji fosforylacji białek lub tworzenia kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji. W przykładzie z zastosowaniem immunofluorescencji demonstrujemy wpływ ultradźwięków na tworzenie adhezji ogniskowej, jednak zbadana może zostać redystrybucja dowolnej cząsteczki. Na przykład można by sprawdzić rekrutację czynników cytozolowych do błony plazmatycznej, kolokalizację białek w pęcherzykach transportowych lub zbadać wpływ ultradźwięków na organizację wrzeciona mitotycznego. Do tej pory ograniczyliśmy się do testowania szlaków zależnych od fibronektyny; wpływ ultradźwięków na komórki na kolagenie lub w obecności czynników wzrostu mógłby zostać zbadany w celu stworzenia pełnego obrazu tego, jak ultradźwięki wpływają na zachowanie komórek w złożonym środowisku, które bardziej przypomina sytuację in vivo. Większym wyzwaniem będzie zbadanie efektu ultradźwięków przy użyciu obrazowania time-lapse, gdzie obecność emitera blokującego drogę światła oraz wibracje pochodzące z ultradźwięków stanowią dodatkowe przeszkody techniczne. Jednak fakt, że zastosowanie terapeutyczne wymaga jedynie 20 minut stymulacji na dobę, sugeruje, że analiza zachowania komórek po serii stymulacji może być bardzo owocna.

<table><tbody><tr><td>ester N-hydroksy-sukcynimidowy sulfo-m-maleimidobenzoilowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>PN22312</td><td>Roztwory stokowe 25 mM w wodzie można przechowywać w temperaturze -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>płytka do hodowli tkanek z 6 dołkami</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Tworzywa sztuczne innych firm mogą zapewniać słabsze pokrycie</td></tr><tr><td>szklana lamella 13-mm</td><td>Scientific Laboratory Supplies LTD</td><td>MIC3336</td><td>Szkło innych firm może zapewniać słabsze pokrycie</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>PBS, Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>ligand integryny 50K (fragment fibronektyny)</td><td></td><td></td><td>Opis konstrukcji i przygotowanie w &lt;sup&gt;9&lt;/sup&gt;, &lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;. Do badania innych szlaków można użyć alternatywnych ligandów macierzy</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>cykloheksymida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7698</td><td>Można przechowywać jako roztwór stokowy 10mg/ml w wodzie</td></tr><tr><td>DMEM/25 mM HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>Exogen 4000+</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>żel do sprzęgania ultradźwięków</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wskaźnik SAFHS</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>hVIN-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V9264</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie sprzężone z DyLight 488</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>715-485-150</td><td></td></tr><tr><td>faloidyna znakowana TRITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>odczyn anty-fadingowy Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor proteaz cOmplete (wolny od EDTA)</td><td>Roche Group</td><td>056 489 001</td><td>Roztwór stokowy 100&amp;#215; przygotowany z tabletki, przechowywany w temperaturze -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>kulkowe nośniki agarozowe PAK-glutationian</td><td></td><td></td><td>Opis konstrukcji i przygotowanie w &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Apollo Scientific</td><td>BI8181</td><td>Przygotować roztwór stokowy 1M i dostosować pH do 7,4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/0160/65</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td></td></tr><tr><td>deoksycholan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr></tbody></table>

indukcja sygnałów zależnych od adhezji przy użyciu ultradźwięków o niskiej intensywności

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

W organizmach wielokomórkowych zachowanie komórek jest determinowane przez oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową. Skutki kontaktu z macierzą obejmują regulację migracji i proliferacji komórek, sekrecję, a nawet różnicowanie. Sygnały leżące u podstaw każdego z tych złożonych procesów wynikają z oddziaływań molekularnych receptorów macierzy zewnątrzkomórkowej na powierzchni komórki. Integryny są receptorami prototypowymi i zapewniają mechaniczne połączenie między macierzą zewnątrzkomórkową a cytoszkieletem, inicjując jednocześnie niektóre kaskady sygnalizacyjne zależne od adhezji. Staje się jednak coraz bardziej oczywiste, że obok integryn funkcjonują dodatkowe receptory transbłonowe, które regulują zarówno samą integrynę, jak i sygnały w dół szlaku. Najbardziej reprezentatywnym przykładem jest transbłonowy proteoglikan, syndekan-4, który współpracuje z integryną α5β1 podczas adhezji do fibronektyny. Modele in vivo wykazują znaczenie sygnalizacji syndekanu-4, ponieważ myszy z knockoutem syndekanu-4 wykazują opóźnienie gojenia wynikające z nieefektywnej migracji fibroblastów1,2. U zwierząt typu dzikiego migracja fibroblastów w kierunku rany jest wyzwalana przez pojawienie się fibronektyny, która wycieka z uszkodzonych naczyń włosowatych i jest deponowana przez makrofagi w uszkodzonej tkance. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie odkryciem strategii wzmacniających sygnalizację zależną od fibronektyny, co mogłoby przyspieszyć procesy naprawcze.
Komponenty sygnalizacji zależnej od fibronektyny, pośredniczone przez integryny i syndekan-4, można rozdzielić poprzez stymulację komórek rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Chociaż angażowanie integryn jest niezbędne do adhezji komórek, niektóre sygnały zależne od fibronektyny są regulowane przez syndekan-4. Syndekan-4 aktywuje sygnał protrusywny Rac13, powoduje redystrybucję integryn1, wyzwala rekrutację cząsteczek cytoszkieletu, takich jak winkulina, do adhezji ogniskowych4, a tym samym indukuje migrację kierunkową3. Poszukiwaliśmy alternatywnych strategii aktywacji takich sygnałów i odkryliśmy, że niskointensywny impulsowy ultradźwięk (LIPUS) może naśladować efekty angażowania syndekanu-45. W niniejszym protokole opisujemy metodę, w której ultradźwięki o mocy 30 mW/cm2, częstotliwości 1,5 MHz, impulsowane z częstotliwością 1 kHz (Rys. 1), mogą być stosowane w odniesieniu do fibroblastów w hodowli (Rys. 2) w celu indukcji aktywacji Rac1 i tworzenia adhezji ogniskowych. Stymulacja ultradźwiękami jest stosowana przez maksymalnie 20 minut, ponieważ ustalono, że ta kombinacja parametrów jest najskuteczniejsza w przyspieszaniu klinicznej naprawy złamań6. Metoda ta wykorzystuje rekombinowane fragmenty fibronektyny do angażowania integryny α5β1, bez angażowania syndekanu-4, i wymaga hamowania syntezy białek przez cykloheksymid, aby zablokować odkładanie dodatkowej macierzy przez fibroblasty. Pozytywny wpływ ultradźwięków na mechanizmy naprawcze jest dobrze udokumentowany7,8, a zrozumienie molekularnego efektu ultradźwięków w hodowli powinno pozwolić na udoskonalenie techniki terapeutycznej w celu poprawy wyników klinicznych.

Niniejszy protokół opisuje stymulację hodowanych fibroblastów za pomocą impulsowego ultradźwięku o niskiej intensywności, co indukuje tworzenie adhezji ogniskowych oraz aktywację Rac1 poprzez naśladowanie zaangażowania transmembranecznego receptora macierzy, syndekanu-4. Podejście to umożliwia badanie skutecznej techniki klinicznej na poziomie komórkowym, stwarzając tym samym możliwości udoskonalenia tej terapii.

Indukcja sygnałów zależnych od adhezji przy użyciu ultradźwięków o niskiej intensywności

W organizmach wielokomórkowych zachowanie komórek jest determinowane przez oddziaływania z macierzą zewnątrzkomórkową. Skutki kontaktu z macierzą obejmują zakres od...

Ogólnym celem tej procedury jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, poprzez które ultradźwięki impulsowe o niskiej intensywności lub lipo wpływają na migrację komórek, a tym samym przyspieszają naprawę tkanek. Osiąga się to poprzez wstępne traktowanie komórek cykloheksymidem przez dwie godziny w celu zapobiegania ekspresji białek de novo, a tym samym autostymulacji komórek. Drugim krokiem procedury jest wysianie odszczepionych komórek na dwie godziny na powierzchnie pokryte dokładnie zdefiniowanym ligandem macierzy.Trzecim krokiem jest stymulacja komórek ultradźwiękami poprzez połączenie płytek z hodowlą komórkową z emiterami ultradźwięków za pomocą żelu sprzęgającego. Wyniki mogą wykazać zmiany w tworzeniu adhezji ogniskowych wywołane stymulacją ultradźwiękową poprzez barwienie komórek na cullin i aktynę oraz zmiany czasowe w aktywacji Rac1 za pomocą testu pull-down dla aktywnego Rac1 i następującego po nim western blossomingu. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny sygnalizacji adhezyjnej, takie jak to, czy fizyczna manipulacja komórkami może zastąpić bodźce chemiczne, takie jak czynniki wzrostu lub fibronektyna?A w jaki sposób ta manipulacja fizyczna inicjuje migrację komórek? Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię ran przewlekłych, ponieważ dzięki zrozumieniu, w jaki sposób ultradźwięki mogą wpływać na zachowanie komórek, być może będziemy w stanie udoskonalić metody leczenia w celu przyspieszenia gojenia ran u osób z zaburzeniami procesu gojenia, takich jak pacjenci w podeszłym wieku lub chorujący na cukrzycę. W przypadku analiz biochemicznych należy bezpośrednio pokryć dołki plastikowych płytek o średnicy 3,5 cm ligandem integryny.W celu przeprowadzenia immunofluorescence, szkiełka nakrywowe gotowano trzykrotnie w wodzie milli Q. Następnie umieszczono cztery szkiełka nakrywowe w każdej płytce o średnicy 3,5 centymetra i przeprowadzono derywatyzację szkiełek szklanych w celu zapewnienia wydajnego powlekania ligandem, dodając do każdej studni 2 ml 1 mM sulfo-MBS. Odczynnik pozostawiono na 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie zderywatyzowane powierzchnie przemyto trzykrotnie PBS. Na koniec zderywatyzowane szkło pokryto 2 ml liganda integryny.Dodaj ligand do każdej dołki i inkubuj płytki przez noc w temperaturze 4°C. Następnego dnia przygotuj monodispersyjną BSA, podgrzewając 1% BSA rozpuszczoną w PBS do 85°C przez 13 minut. Pozostaw do ochłodzenia, a następnie przefiltruj przez filtr o średnicy 0,45 mikrona. Najpierw przemyj powierzchnie pokryte ligandem trzykrotnie przy użyciu PBS, a następnie zablokuj powierzchnie przygotowaną monodispersyjną BSA przez 30 minut.Aby kontrolować środowisko macierzy podczas całego eksperymentu, należy zablokować syntezę białek poprzez dodanie 25 µg/mL cykloheksymidy do fibroblastów o 80% konfluencji na dwie godziny. Przepłukać komórki traktowane cykloheksymidą za pomocą PBS, zlać nadsącz i odwirować komórki. Resuspender komórki w roztworze A-D-M-E-M do końcowej stężenia 10 000 komórek/mL przy użyciu hemocytometru.Następnie inkubuj resuspenderowane komórki w temperaturze 37°C przez 20 minut. Potem wypłucz płytki trzykrotnie za pomocą PBS przed naniesieniem dwóch mililitrów zawiesiny komórkowej do każdego dołka. Pozostaw komórki na dwie godziny w temperaturze 37°C i 5% CO₂ w celu ich rozprzestrzenienia się, rozpoczynając od ogrzania macierzy emitera ultradźwiękowego oraz żelu sprzęgającego.Po rozgrzaniu nałóż niewielką ilość (wielkości ziarna grochu) żelu sprzęgającego na każdy emiter, aby sprawdzić, czy są one sprawne. Używając detektora diodowego do wskaźników ultradźwiękowych, pozwól żelowi sprzęgnąć emiter z detektorem. Jeśli emiter jest sprawny, dioda DDE się zaświeci.Urządzenie posiada stałe ustawienia i generuje ultradźwięki o częstotliwości 1,5 megahertz, impulsowane z częstotliwością jednego kilohertz, przy intensywności 30 milliwatts na centymetr kwadratowy. Urządzenie wyłączy się automatycznie po 20 minutach. Umieść dołki na matrycy emitera, wprowadź matrycę do inkubatora i odczekaj 10 minut w celu wyrównania temperatury, a następnie włącz sygnał ultradźwiękowy w zasilaczu.Sygnał ultradźwiękowy zostanie dezaktywowany po 20 minutach. W przypadku konieczności zastosowania krótszego czasu stymulacji należy dostosować go do schematu terapeutycznego. Płytki można usunąć z układu w odpowiednim czasie.W przypadku dłuższych czasów stymulacji płytki powinny pozostać na macierzy w celu umożliwienia rozwoju reakcji. Można ponownie uruchomić emiter, jednak w naszych obserwacjach nie przyniosło to dodatkowych korzyści. W każdym przypadku jako kontrolę negatywną należy wykorzystać płytki niestymulowane.W celu analizy tworzenia adhezji ogniskowych, poddaj szkiełka nakrywkowe powlekane S sygnałowi ultradźwiękowemu przez 20 minut, a następnie inkubuj je przez dodatkowe 40 minut w temperaturze 37 °C. Pozwala to na wykształcenie się adhezji ogniskowych. Następnie odessij pożywkę.Nanieś dwa mililitry utrwalacza i odczekaj 14 minut. Usuń utrwalacz poprzez aspirację, a następnie ostrożnie przemyj komórki trzy razy buforem PBS. Nanieś PBS wzdłuż krawędzi dołka i delikatnie rozprowadź roztwór.Po dokładnym wypłukaniu przenieś każde szkiełko nakrywkowe z dołka o średnicy 3,5 centymetra do płytki 24-dołkowej w celu przeprowadzenia późniejszego barwienia immunofluorescencyjnego. Po pożądanym czasie stymulacji odessij pożywkę i wypłucz komórki w PBS w temperaturze 0°C, a następnie poddaj komórki lizie w odpowiednim buforze do lizy, dostosowanym do preferowanego testu biochemicznego. Zazwyczaj analizujemy aktywację za pomocą testu pull-down efektorów.Metodę tę można zastosować w szczególności do analizy biochemicznej dowolnego szlaku sygnalizacyjnego. W niniejszym protokole opisujemy indukcję vinky i barwienie adhezji ogniskowych oraz aktywności RAC1 za pomocą ultradźwięków na potrzeby eksperymentów nad adhezją ogniskową. Stanem wyjściowym jest fakt, że fibroblasty rozprzestrzenione na ligandzie integryny alfa pięć beta jeden nie tworzą adhezji zawierających finkel, chyba że drugi receptor łączący fibroiny, syndicate cztery, zostanie zaangażowany poprzez dodanie rozpuszczalnego ligandu.Jednakże stymulacja ultradźwiękami indukuje tworzenie adhezji ogniskowych w takim samym stopniu, jak zaangażowanie syncom four, co wskazuje, że stymulacja ultradźwiękami może zastąpić określone komponenty szlaku sygnałowego fibrin neck independence. Jako rozwinięcie podstawowego testu przedstawiamy ten sam eksperyment powtórzony z fibroblastami pozbawionymi INDICUM four. Fibroblasty te nadal reagują na ultradźwięki, lecz nie reagują na ligand INDICUM four.To pokazuje, że ultradźwięki mogą w rzeczywistości pominąć potrzebę angażowania niektórych receptorów włókien i adum. W eksperymencie biochemicznym wykazujemy, że ultradźwięki mogą indukować aktywację RAC 1 za pomocą testu pull-down; wytrącanie aktywnego RAC 1 w 0, 10, 30 i 60 minutach po rozpoczęciu stymulacji ultradźwiękowej ujawnia, że aktywność RAC 1 osiąga szczyt między 10 a 30 minutą, przed powrotem do poziomu bazowego. Wykorzystanie lizatów surowych dla kulliny zapewnia równoważne obciążenie między punktami czasowymi.Wynik przypomina aktywację RAC1 pod wpływem syndekanu 4, lecz jest nieco bardziej przedłużony niż w przypadku aktywacji przez fibronektynę. W związku z tym zazwyczaj wymagane jest od 8 do 10 powtórzeń w celu uzyskania istotnych danych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o wyeliminowaniu dodatkowych bodźców poprzez całkowite zablokowanie syntezy białek za pomocą cykloheksymidu, unikaniu zanieczyszczenia pożywek w trakcie eksperymentu oraz unikaniu nadmiernego zagęszczenia komórek, co prowadziłoby do kontaktów międzykomórkowych po zastosowaniu tej procedury.Inne metody, takie jak testy gojenia rany (scratch wound assays), mogą być wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, na przykład: w jaki sposób ultradźwięki inicjują migrację komórek?

induction-of-adhesion-dependent-signals-using-low-intensity-ultrasound

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Wywołanie sygnałów zależnych od adhezji za pomocą ultradźwięków o niskiej intensywności

Insonacja mikropęcherzyków jest obiecującą strategią ablacji guzów przy zredukowanej średniej mocy akustycznej, a także ukierunkowanego dostarczania leków. Celem niniejszego badania jest opracowanie strategii impulsowania ultradźwiękami o niskim cyklu pracy oraz nanonośników w celu maksymalizacji nietermicznej ablacji mikro naczyniowej i dostarczania ładunku do podskórnych glejaków C6.

Porównanie ukierunkowanego leczenia glejaków u myszy z wykorzystaniem ultradźwięków poprzez dostarczanie nanocząsteczek z lekiem oraz ablację mikro naczyniową

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Selektywne uszkodzenie ludzkich komórek białaczkowych można osiągnąć dzięki nowatorskiemu podejściu polegającemu na stosowaniu ultradźwięków o niskiej częstotliwości, zarówno z chemioterapeutycznym leczeniem białaczkowym i prawidłowymi komórkami krwiotwórczymi, jak i bez niego.

Generowanie i analiza ilościowa pulsacyjnych ultradźwięków o niskiej częstotliwości w celu określenia wrażliwości sonicznej nieleczonych i leczonych komórek nowotworowych

Ten protokół demonstruje kontrolowane zarodkowanie kawitacji w fantomach żelowych, poprzez jednoczesną ekspozycję zarówno na pulsacyjne światło laserowe bliskiej podczerwieni, jak i skoncentrowane ultradźwięki o wysokiej intensywności (HIFU). Aktywność kawitacyjna może być następnie wykorzystana do poprawy obrazowania i/lub zastosowań terapeutycznych HIFU.

Kontrolowane zarodkowanie kawitacji z nanocząstek plazmonicznego złota w celu wzmocnienia zastosowań ultradźwięków o wysokiej intensywności

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Niskointensywna pulsacyjna stymulacja ultradźwiękowa (LIPUS) to metoda nieinwazyjnej mechanicznej stymulacji komórek endogennych lub inżynieryjnych o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym artykule opisano, jak wdrożyć LIPUS do mikroskopu epifluorescencyjnego i jak zminimalizować niedopasowanie impedancji akustycznej wzdłuż ścieżki ultradźwięków, aby zapobiec niepożądanym artefaktom mechanicznym.

Multipleksowa zogniskowana stymulacja ultradźwiękowa z mikroskopią fluorescencyjną

Prezentowany protokół eksperymentalny może być wykorzystany do wykonywania pomiarów aktywności kawitacyjnej w czasie rzeczywistym w urządzeniu do hodowli komórkowej w celu umożliwienia zbadania warunków wymaganych do skutecznego dostarczania leku i/lub innych efektów biologicznych.

Studiowanie terapii wzmocnionej kawitacją

Zaproponowano szybką i niezawodną technikę kontrolowania oscylacji kształtu pojedynczej, uwięzionej bańki akustycznej, która opiera się na technice koalescencji między dwoma bąbelkami. Oscylacje kształtu pęcherzyków w stanie ustalonym, kontrolowane symetrią umożliwiają analizę przepływu płynu generowanego w pobliżu granicy faz pęcherzyków.

Indukcja mikrostrumieniowania przez niesferyczne oscylacje pęcherzykowe w systemie lewitacji akustycznej

Litografia w bliskim UV i mikroskopia siły trakcyjnej są połączone w celu pomiaru sił komórkowych na mikrowzorzystych hydrożelach. Ukierunkowane uwalnianie pojedynczych komórek pod wpływem światła umożliwia dużą liczbę pomiarów na tej samej próbce.

Kontrola adhezji komórek za pomocą technik modelowania hydrożelu do zastosowań w mikroskopii sił trakcyjnych

Zakłócenie bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB) można z powodzeniem osiągnąć poprzez dożylne podawanie mikropęcherzyków i zastosowanie ultradźwięków o niskiej intensywności (LIFU). Protokół ten szczegółowo opisuje otwieranie BSCB za pomocą LIFU w modelu gryzoni, w tym konfigurację sprzętu, wstrzykiwanie mikropęcherzyków, lokalizację celu i wizualizację zakłóceń BSCB.

Przerwanie bariery krew-rdzeń kręgowy za pomocą zogniskowanych ultradźwięków o niskiej intensywności w modelu szczurzym

Protokół ten opisuje system mocowania głowicy ultradźwiękowej specjalnie zaprojektowany do stymulacji ultradźwiękowej rdzenia kręgowego u obudzonych myszy. Metoda wykorzystuje system fiksacji, aby zapewnić dokładne ustawienie przetwornika ultradźwiękowego, jednocześnie umożliwiając uczestnikom eksperymentu swobodne poruszanie się bez uszczerbku dla precyzji stymulacji.

Mocowanie przetworników ultradźwiękowych do neuromodulacji rdzenia kręgowego u myszy

Poznaj metodę stymulacji fibroblastów ultradźwiękami o niskim natężeniu w celu indukcji formowania adhezji ogniskowych i aktywacji Rac1. Technika ta pozwala badać mechanizmy molekularne naprawy tkanek.

Indukcja sygnałów zależnych od adhezji przy użyciu ultradźwięków o niskiej intensywności

Przeglądaj więcej filmów