Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ogólnym celem niniejszej procedury jest identyfikacja i lokalizacja głównych miejsc zatrzymania translacji dla mRNA translacjonowanego w bezkomórkowym systemie translacyjnym. Osiąga się to poprzez uprzednie sklonowanie interesującego genu pod kontrolą promotora transkrypcyjnego T7. Następnie mRNA zostaje poddane transkrypcji i puryfikacji.

Następnie przeprowadza się translację in vitro w obecności mRNA oraz radioaktywnych aminokwasów, aby znakować syntetyzowane białka i powstające polipeptydy. Na koniec polizomy izoluje się za pomocą wirowania w gradiencie gęstości (sedymentacyjnego), a wyizolowane łańcuchy nascentne rozdziela się metodą elektroforezy żelowej. W rezultacie można uzyskać obraz polipeptydów nascentnych o różnych długościach za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z buforem Tristine oraz autoradiografii, co wskazuje na obecność miejsc zatrzymania (pause sites) wzdłuż analizowanego mRNA.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do naszych istniejących metod, takich jak test ochrony jądra mikro-kokalnego, jest to, że jest ona niezwykle prosta, szybka i wydajna, a ponadto pozwala na oznaczenie i identyfikację głównych miejsc translacji wzdłuż dowolnego mRNA w danym systemie ryzyka komórkowego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie translacji i translacyjnego fałdowania białek, takich jak wpływ czynników zdrowotnych, takich jak wykorzystanie kodonów, obfitość tRNA lub wtórna struktura mRNA, na kinetykę translacji. Metoda ta może ponadto wspomóc nasze zrozumienie relacji między kinetyką translacji a kluczowymi etapami w ścieżce fałdowania białek podczas translacji kodu.

Zastosowanie tej techniki rozciąga się na zrozumienie procesu fałdowania białek in vivo, który w przekonaniu wielu badaczy zachodzi kotranslacyjnie podczas translacji na rybosomie, choć niniejsze badanie obejmuje translację bezkomórkową gamma-krystaliny z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego ekstraktu komórkowego. Technikę tę można również zastosować do identyfikacji IDE translacyjnych w potencjalnie dowolnym białku, używając kompetentnego translacyjnie ekstraktu przygotowanego z dowolnego źródła komórkowego. Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę napotykają trudności na dwóch kluczowych etapach protokołu.

Pierwszym z nich jest ustalenie całkowitego czasu wymaganego do przeprowadzenia reakcji translacji, co zapewni, że większość powstających polipeptydów pozostanie związana z rybosomem. Drugim jest znalezienie odpowiedniego układu do rozdzielenia większości powstających polipeptydów; wybór układu zależy od wielkości badanego białka. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas po raz pierwszy w połowie lat osiemdziesiątych, gdy postanowiliśmy zbadać kinetykę translacji cząsteczek globiny w odniesieniu do proponowanego modelu współtranslacyjnego fałdowania globiny.

Niejednorodność translacji globiny została po raz pierwszy zauważona przez PRO i Maurice'a w 1974 roku podczas zastosowania chromatografii CLO z wykluczaniem sterycznym w badaniu łańcuchów NAS globiny. Jednakże ich analiza nie charakteryzowała się pożądaną precyzją, choć Pro i inni zaobserwowali cztery główne miejsca zatrzymania translacji podczas translacji globiny. W następstwie tego nasza analiza pozwoliła na ujawnienie około 10 dodatkowych miejsc zatrzymania i zbudowanie szczegółowego modelu fałdowania globiny podczas translacji. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opisana tutaj technika obejmuje izolację polisomów oraz analizę powstającego polipeptydu przy użyciu żelu SDS-PAGE.

Oba te kroki są krytyczne dla uzyskania wysokiej jakości i powtarzalnych wyników. Demonstrację przeprowadzi doktorant z laboratorium Myelo Sujata. W celu transkrypcji in vitro mRNA, należy rozpocząć od genu zainteresowania, który został sklonowany pod promotorem T7 i/lub SP6. Za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego należy zlinearyzować matrycę DNA poniżej kodonu stop i/lub końca 3' mRNA.

Próbkę trawienia restrykcyjnego poddano elektroforezie żelowej w celu zweryfikowania, czy DNA zostało całkowicie zlinearyzowane. Po wyznaczeniu optymalnego stężenia matrycy DNA, należy wykorzystać zestaw do transkrypcji do transkrypcji mRNA in vitro zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie, w celu oczyszczenia mRNA, należy przeprowadzić wytrącanie chlorkiem litu.

Następnie należy przeprowadzić elektroforezę w żelu akrylamidowym lub żelu agarosezowym w celu weryfikacji czystości preparatu. Przygotować 100 µL mieszaniny do reakcji translacji in vitro w wodzie wolnej od nukleaz, dodając 1 mM mieszaninę aminokwasów bez metioniny, 10 jednostek inhibitora RNA, 20 µCi radioaktywnej 35S metioniny oraz lizat retikulocytów króliczych. Następnie należy podgrzać mieszaninę reakcyjną, inkubując ją w temperaturze 30 °C przez 5 minut.

Następnie dodaj 2 µg mRNA i inkubuj w temperaturze 30 °C przez pięć minut, aby zatrzymać reakcję, a następnie umieść próbkę na lodzie w celu wyizolowania nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomami. Nanieś odczynnik z reakcji translacji na warstwę 4,5 mL 30% glicerolu w buforze Tris-HCl pH 7,6 z chlorkiem potasu i chlorkiem magnezu, a następnie wiruj w wirówce z rotorem TLA 110 z prędkością 100 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie ostrożnie usuń nadsącz, a pellet polisomalny zawierający nowo powstałe polipeptydy resuspenduj w niewielkiej objętości 1 mM buforu Tris-HCl pH 7,6 zawierającego 0,5 mg/mL rybonukleazy A i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Aby zwiększyć hydrolizę wiązania estrowego tRNA w peptydzie, dodaj do reakcji wodorotlenek sodu do stężenia końcowego 10 millimolar i inkubuj przez dodatkowe 30 minut. Rozdziel powstałe polipeptydy za pomocą elektroforezy SDS-PAGE w buforze Tris-Tris, a następnie utrwal i wysusz żele. Poddaj żele autoradiografii, a następnie obrazowaniu fosforowemu w celu detekcji nowo powstałych polipeptydów.

Zmieniony ruch rybosomów indukowany zmianami w puli tRNA powinien prowadzić do zmian w rozkładzie wielkości nascentnych polipeptydów gromadzących się podczas translacji, a także do zmian ich względnych intensywności, które odzwierciedlają czas trwania pauzy w danym miejscu. Nascentne polipeptydy białka kryształowego gamma B zostały wyizolowane i rozdzielone za pomocą elektroforezy SDS-PAGE z buforem Tris-Tricine. Nieidentyczne długości i intensywności polipeptydów w układach RRL oraz E. coli wskazują, że ruch rybosomów wzdłuż mRNA w tych dwóch systemach przebiega zgodnie z różną kinetyką translacji.

Na przykład należy zwrócić uwagę na wyraźny prążek 17,7 kilodaltona w lizacie e coli, który nie występuje w systemie lizatu retikulocytów królika. Gamma B crystalline zawiera tandemowe kodony argininy, które są częste w systemach ssaków, ale wiadomo, że są niezwykle rzadkie i powoli translacyjne w e coli, co sugeruje, że prążek ten jest spowodowany zatrzymaniem rybosomu na tych tandemowych rzadkich kodonach, jak pokazano tutaj.

W przypadku braku mRNA nie obserwuje się żadnych prążków, a traktowanie purmycyną usuwa większość łańcuchów powstających z polisomów. Ponadto przedłużone traktowanie purmycyną usuwa wszystkie łańcuchy powstające, co potwierdza, że obserwowane produkty polipeptydowe są łańcuchami powstającymi związanymi z rybosomami, a nie MRPs współosadzającymi się z polisomami. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu jednego do dwóch dni. Czas trwania procedury zależy głównie od czasu trwania etapu wirowania oraz etapu elektroforezy żelowej peptydów powstających.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest natychmiastowe zatrzymanie reakcji translacji po upływie czasu inkubacji. Aby uniknąć uwolnienia powstającego polipeptydu z rybosomu, kluczowe jest całkowite wyeliminowanie obecności RNA na każdym etapie. Zanieczyszczenie RNA może wpłynąć na wydajność translacji ekstraktu i doprowadzić do uwolnienia powstającego polipeptydu z rybosomu podczas stosowania tej procedury.

Po opracowaniu tej metody można ją również wykorzystać do badania innych celów, takich jak na przykład wpływ białek wiążących mRNA na wydajność ruchu rybosomów w obrębie danej matrycy. Technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się fałdowaniem białek do zgłębienia roli pauz translacyjnych wynikających z obecności rzadkich kodonów w procesie translacyjnego fałdowania białek. Metoda ta była wcześniej stosowana do badania roli substytucji kodonów w ruchu rybosomów na matrycy oraz w translacyjnym fałdowaniu białek.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak identyfikować miejsca mocy translacyjnej w prezentowanym mRNA poprzez izolację nowo powstałego polipeptydu związanego z rybosomem. Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład ³⁵S-metionina, wymaga szczególnych środków ostrożności, które zawsze muszą być uwzględnione podczas wykonywania tej procedury.