Name: Izolacja powstających polipeptydów związanych z rybosomami in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Poznaj metodę izolacji polipeptydów związanych z rybosomami w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej na mRNA. Technika ta wykorzystuje elektroforezę denaturującą SDS-PAGE i autorradiografię.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu RGP0024 programu Human Frontier Science Program.

1. Przygotowanie matrycy DNA i transkrypcja in vitro
<ol>
 <li>Gen docelowy zostaje sklonowany pod promotorem transkrypcyjnym T7 i/lub np. SP6.</li>
 <li>Do transkrypcji in vitro matryca DNA jest linearyzowana odpowiednim enzymem restrykcyjnym tnącym poniżej kodonu stop ORF i/lub końca 3' mRNA. Należy zweryfikować pełną linearyzację DNA plazmidowego, przeprowadzając elektroforezę produktu trawienia restrykcyjnego na żelu agarozowym.</li>
 <li>Zlinearyzowany plazmid jest wykorzystywany do reakcji transkrypcji in vitro. Można przetestować różne stężenia matrycy DNA w celu ustalenia optymalnego stężenia DNA wymaganego do transkrypcji in vitro. Zazwyczaj, przy użyciu zestawu Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY), 1 μg zlinearyzowanego DNA daje 40-60 μg mRNA. Transkrypcję in vitro przeprowadza się zgodnie z instrukcją producenta (Ambion/Life Technologies, Grand Island, NY).</li>
 <li>Po transkrypcji in vitro mRNA jest oczyszczane poprzez wytrącanie chlorkiem litu zgodnie z instrukcją producenta (Ambion's MEGAscript High yield Transcription Kit).</li>
 <li>Integralność mRNA jest następnie weryfikowana za pomocą elektroforezy na żelach akrylamidowych lub agarozowych.</li>
</ol>
2. Translacja bezkomórkowa in vitro
Dla in vitro wykorzystanie tłumaczenia Rkrólik Rlizat retikulocytów, RRL (Promega, Madison, WI), należy postępować zgodnie z poniższymi krokami:
<ol>
 <li>Przygotować 100 μl reakcji translacji in vitro zgodnie z instrukcją producenta. W skrócie: do wody wolnej od nukleaz dodać 2 μl mieszaniny aminokwasów bez metioniny (1 mM), 10 jednostek inhibitora RNazy (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), 20 μCi radioaktywnej [35S]-metioniny (MP Biomedicals, Solon, OH) oraz 70 μl lizatu retikulocytów królika (Promega, Madison, WI).</li>
 <li>Inkubować reakcję w temperaturze 30 °C przez 5 min w celu wstępnego ogrzania mieszaniny translacyjnej. Dodać 2 μg mRNA do reakcji translacji i inkubować w 30 °C przez 5 min.</li>
 <li>Przerwać reakcję, umieszczając mieszaninę translacyjną na lodzie.</li>
</ol>
3. Izolacja nowo powstałych polipeptydów z reakcji translacji in vitro
<ol>
 <li>Aby wyizolować nowo powstały polipeptyd związany z rybosomami (polysom), reakcję translacji nakłada się na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze 10 mM Tris-HCl pH 7,6 zawierającym 100 mM KCl i 10 mM MgCI2, a następnie wiruje przy 100,000 X g w rotorze TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Następnie ostrożnie usuwa się supernatant.</li>
 <li>Osad polysomalny zawierający nowo powstałe polipeptydy resuspendsuje się w małej objętości (10-15 μl) buforu 1 mM Tris-HCl pH 7,6 zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY) i inkubuje przez 30 min w 37 °C. W celu wzmocnienia hydrolizy wiązania estrowego peptydylo-tRNA dodaje się NaOH do stężenia końcowego 10 mM i kontynuuje inkubację przez kolejne 30 min.</li>
</ol>
In vitro reakcja translacji przeprowadzona bez udziału mRNA i w tych samych warunkach (z następującą po niej izolacją nowo powstałych peptydów zgodnie z opisem) służyłaby jako główna próba kontrolna. Traktowanie reakcji translacji puromycyną przed poddaniem ekstraktu wirowaniu w gradiencie gęstości może służyć jako dodatkowa kontrola.
4. Rozdzielanie nowo powstałego polipeptydu za pomocą elektroforezy Tris-tricine SDS PAGE
<ol>
 <li>Wyizolowane nowo powstałe polipeptydy rozdziela się i analizuje za pomocą elektroforezy Tris-tricine SDS-PAGE. Należy pamiętać, że ilość materiału naniesionego na żel będzie zależna od wydajności znakowania białek, wydajności translacji białek oraz wielu innych parametrów. Ilość naniesionego materiału należy dostosować empirycznie, aby zapewnić najlepszą wizualizację i rozdzielenie poszczególnych łańcuchów polipeptydowych.</li>
 <li>Po elektroforezie żele są utrwalane, suszone w próżniowej suszarce do żeli i poddawane autoradiografii. Rozkład nowo powstałych polipeptydów obserwuje się przy użyciu obrazowania fosforowego.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Wołowia gamma-B krystalina została przetłumaczona w lizacie retikulocytów królika (RRL) oraz w systemach ekstraktu S30 E. coli (Promega, Madison, WI), a następnie dokonano izolacji powstających łańcuchów polipeptydowych. Rysunek 1 przedstawia etapy izolacji powstających łańcuchów związanych z rybosomami. Celem niniejszego badania było sprawdzenie, czy zmiana środowiska translacji, tj. zestawu tRNA (który, jak wiadomo, znacznie różni się w systemach ssaczych (RRL) i prokariotycznych (E. coli) ze względu na różnice w preferencjach kodonów między organizmami), może zmienić ruch rybosomów wzdłuż mRNA i wpłynąć na rozmieszczenie miejsc zatrzymania translacji. Zmieniony ruch rybosomów powinien prowadzić do zmian w rozkładzie wielkości powstających polipeptydów gromadzących się podczas translacji, a także w ich względnej intensywności. Względne intensywności prążków odzwierciedlają czas trwania zatrzymania. Powstające polipeptydy wyizolowano i rozdzielono w technice SDS PAGE na żelu 16.5%T, 6%C Tris-tricine (Rysunek 2). Gamma-B krystalina jest białkiem o masie 20 kDa. Obserwacja powstających polipeptydów o nieidentycznych długościach i intensywnościach w systemach RRL i E. coli wskazuje, że ruch rybosomów wzdłuż mRNA w tych dwóch systemach przebiega według odmiennej kinetyki translacji. Na przykład w lizacie E. coli zaobserwowaliśmy wyraźny prążek o masie 17.7 kDa, którego nie było w systemie RRL, co sugeruje istnienie dodatkowego miejsca zatrzymania translacji w regionie 3'-końca mRNA (kodującym region C-końcowy gamma-B krystaliny), gdy jest on tłumaczony w systemie E. coli. Zauważamy, że gamma-B krystalina zawiera tandemowe kodony Arg (AGG153 i AGA154), które są częste w systemach ssaczych, ale znane są jako niezwykle rzadkie i wolno tłumaczone w E. coli. Nowy powstający peptyd gromadzący się w systemie E. coli (~17.7 kDa Rysunek 2.2) jest prawdopodobnie spowodowany zatrzymaniem rybosomu na tych tandemowych rzadkich kodonach. Należy zauważyć, że wykluczenie mRNA powoduje brak widocznych prążków (Rysunek 2.3), a traktowanie puromycyną usuwa większość powstających łańcuchów z polizomów (Rysunek 2.3). Przedłużona inkubacja z puromycyną (&gt; 15 min) usuwa wszystkie powstające łańcuchy (dane nieprzedstawione). Potwierdza to, że obserwowane produkty polipeptydowe są powstającymi łańcuchami związanymi z rybosomami, a nie mRNP współosadzającymi się z polizomami.
Jak wspomniano powyżej, preferencja kodonów (codon bias) jest specyficzna zarówno dla organizmu, jak i dla tkanki. Przedstawiony tutaj reprezentatywny przykład wyraźnie wskazuje, że zmiana środowiska translacji, tj. zestawu tRNAs/preferencji kodonów, może prowadzić do zmiany ruchu rybosomu wzdłuż mRNA. Ewidentnie ta prosta technika pozwala nie tylko na identyfikację miejsc zatrzymania translacji wzdłuż mRNA, ale umożliwia również szybkie porównanie miejsc zatrzymania translacji pomiędzy różnymi układami.
<img alt="Schemat transkrypcji i translacji in vitro, ekstrakcja mRNA, proces izolacji polipeptydów." src="/files/ftp_upload/4026/4026fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat wyjaśniający etapy izolacji nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomami. Sekwencja ORF białka Gamma-B krystaliny bydlęcej (528 par zasad) została sklonowana za promotorem T7 w wektorze pBSKS+. Do transkrypcji in vitro wykorzystano matrycę DNA zlinearyzowaną za pomocą EcoRI. Zlinearyzowana matryca posłużyła do przeprowadzenia transkrypcji in vitro. Promotor T7 w matrycy DNA jest rozpoznawany przez polimerazę RNA T7, która transkrybuje znajdujący się za nim gen Gamma-B krystaliny. mRNA jest oczyszczane metodą wytrącania chlorkiem litu. Oczyszczone mRNA jest wykorzystywane do translacji in vitro. Po inkubacji mieszaninę reakcyjną translacji naniesiono na 30% roztwór glicerolu i wirowano przez 1 hr w temperaturze 4 °C przy 100,000 X g w celu izolacji nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomami.
<img alt="Elektroforeza żelowa SDS-PAGE analizująca ekspresję krystaliny Gamma-B. Prążki białkowe, RRL, lizat E.coli." src="/files/ftp_upload/4026/4026fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Izolacja nowo powstałych polipeptydów bydlęcej krystaliny Gamma-B przetłumaczonych w lizacie retikulocytów królika (RRL) oraz lizacie E. coli. 2 μg mRNA zmieszano w 100 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej RRL lub system ekstraktu S30 z E. coli (Promega, Madison, WI) zgodnie z instrukcją producenta z 20 μCi [35S]-metioniną i inkubowano w 30 °C przez 5 min. Po inkubacji mieszaninę reakcji translacji nałożono na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze 10 mM Tris-HCl pH 7.6, zawierającym 100 mM KCl i 10 mM MgCI2, a następnie wirowano przez 1 h w 4 °C przy 100,000 X g w rotorze TLA-110 (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA). Izolowany osad polirybosomów resuspendowano w 20 μl 1 mM Tris-HCl pH 7.6, zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A (Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY), a następnie poddano działaniu NaOH (jak opisano w sekcji protokołu). Nowo powstałe polipeptydy rozdzielono na żelu SDS-PAGE Tris-Tricine 16,5% T, 6% C. Żel wysuszono i naświetlono do autoradiografii. Po naświetleniu żel przeskanowano za pomocą skanera obrazującego Typhoon firmy GE Healthcare. Rycina 2.1 przedstawia żel z nowo powstałymi polipeptydami izolowanymi i rozdzielonymi po reakcjach translacji przeprowadzonych w dwóch różnych systemach (RRL i E. coli). Rycina 2.2 Żel przeanalizowano za pomocą oprogramowania Image Quant TL, v2005 i wykorzystano go tutaj jako przykład, aby pokazać, że masę cząsteczkową i intensywność nowo powstałych polipeptydów gromadzących się w obu systemach można łatwo analizować i porównywać. Rycina 2.3 przedstawia dwa zestawy kontroli: nowo powstałe polipeptydy izolowane i rozdzielone na SDS-PAGE po reakcjach translacji przeprowadzonych bez mRNA i/lub po potraktowaniu reakcji translacji puromycyną (5 min, stężenie końcowe 1 mM) przed poddaniem reakcji wirowaniu.

<ol><li>Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pause+for+thought+along+the+co-translational+folding+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">A pause for thought along the co-translational folding pathway.</a> Trends Biochem. Sci. 34, 16-24 (2009).</li>
<li>Sharp, P. M., Cowe, E., Higgins, D. G., Shields, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+patterns+in+Escherichia+coli%2C+Bacillus+subtilis%2C+Saccharomyces+cerevisiae%2C+Schizosaccharomyces+pombe%2C+Drosophila+melanogaster+and+Homo+sapiens%3B+a+review+of+the+considerable+within-species+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Codon usage patterns in Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Drosophila melanogaster and Homo sapiens; a review of the considerable within-species diversity.</a> Nucleic Acids Res. 16, 8207-8210 (1988).</li>
<li>Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+differences+in+human+transfer+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific differences in human transfer RNA expression.</a> PLoS Genet. 2, e221(2006).</li>
<li>Ikemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Codon+usage+and+tRNA+content+in+unicellular+and+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Evol%22%5BJournal%5D)">Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms.</a> Mol. Biol. Evol. 2, 13-34 (1985).</li>
<li>Wolin, S. L., Walter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+pausing+and+stacking+during+translation+of+a+eukaryotic+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA.</a> EMBO J. 7, 3559-3569 (1998).</li>
<li>Krasheninnikov, I. A., Komar, A. A., Adzhubei, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonuniform+size+distribution+of+nascent+globin+peptides%2C+evidence+for+pause+localization+sites%2C+and+a+cotranslational+protein-folding+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Protein+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonuniform size distribution of nascent globin peptides, evidence for pause localization sites, and a cotranslational protein-folding model.</a> J. Protein Chem. 10, 445-454 (1991).</li>
<li>Komar, A. A., Lesnik, T., Reiss, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synonymous+codon+substitutions+affect+ribosome+traffic+and+protein+folding+during+in+vitro+translation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Synonymous codon substitutions affect ribosome traffic and protein folding during in vitro translation.</a> FEBS Lett. 462, 387-391 (1999).</li>
<li>Komar, A. A., Jaenicke, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+translation+of+%CE%B3+B+crystallin+and+its+circularly+permutated+variant+in+an+in+vitro+cell-free+system%3A+possible+relations+to+codon+distribution+and+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Kinetics of translation of γ B crystallin and its circularly permutated variant in an in vitro cell-free system: possible relations to codon distribution and protein folding.</a> FEBS Lett. 376, 195-198 (1995).</li>
<li>Jha, S., Komar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Birth%2C+life+and+death+of+nascent+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Birth, life and death of nascent polypeptide chains.</a> Biotechnol. J. 6, 623-640 (2011).</li>
<li>Thanaraj, T. A., Argos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-mediated+translational+pause+and+protein+domain+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Ribosome-mediated translational pause and protein domain organization.</a> Protein Sci. 5, 1594-1612 (1996).</li>
<li>Kimchi-Sarfaty, C., Oh, J. M., Kim, I. W., Sauna, Z. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%22silent%22+polymorphism+in+the+MDR1+gene+changes+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.</a> Science. 315, 525-528 (2007).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricine-sodium+dodecyl+sulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+proteins+in+the+range+from+1+to+100+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.</a> Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).</li>
<li>Shirole, N., Balasubramanian, S., Yanofsky, C., Cruz-Vera, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Translating+Ribosomes+Containing+Peptidyl-tRNAs+for+Functional+and+Structural+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses.</a> J. Vis. Exp. (48), e2498(2011).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324, 218-223 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Dla uzyskania powtarzalnych wyników krytyczne znaczenie mają jakość i stężenie komponentów wykorzystywanych w reakcjach transkrypcji i translacji in vitro. W niniejszym badaniu zastosowano dostępne komercyjnie zestawy i ekstrakty, które przy ostrożnym obchodzeniu się z nimi dostarczają wysoce powtarzalnych danych. Niemniej jednak, w razie potrzeby, ekstrakty zdolne do translacji można przygotować z wybranych komórek. Jakość mRNA może wpływać na translację, dlatego niezwykle ważne jest sprawdzenie integralności m...

<table><tbody><tr><td>Zestaw do transkrypcji o wysokiej wydajności MEGAscript T7</td><td>Ambion</td><td>AM1333</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor rybonukleazy</td><td>Invitrogen</td><td>15518012</td><td></td></tr><tr><td>Znacznik Trans [&lt;sup&gt;35&lt;/sup&gt;S]-Label</td><td>MP Biomedicals</td><td>0151006</td><td></td></tr><tr><td>Rybonukleaza-A</td><td>Invitrogen</td><td>12091</td><td></td></tr><tr><td>System lizatu retikulocytów królika, traktowany nukleazą</td><td>Promega</td><td>L4960</td><td></td></tr><tr><td>System ekstraktu S30 z &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; do matryc liniowych</td><td>Promega</td><td>L1030</td><td></td></tr><tr><td>Wirowanie</td><td>Beckman Coulter</td><td>Ultrawirowka Optima TLX</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiografia na fosforowych płytach pamięci</td><td>GE Healthcare</td><td>Obrazownik Typhoon 9410 w trybie zmiennym</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy powstających polipeptydów</td><td>GE Healthcare</td><td>Image Quant TL, v2005</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mrna

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Szybkość elongacji translacyjnej nie jest jednorodna. Struktura drugorzędowa mRNA, wykorzystanie kodonów oraz białka związane z mRNA mogą zmieniać ruch rybosomów w obrębie matrycyw celu zapoznania się z przeglądem patrz 1. Obecnie powszechnie przyjmuje się jednak, że wykorzystanie kodonów synonimicznych jest główną przyczyną niejednorodnych szybkości elongacji translacyjnej1. Kodony synonimiczne nie są wykorzystywane z taką samą częstotliwością. Istnieje stronniczość w użyciu kodonów synonimicznych, przy czym niektóre kodony są wykorzystywane częściej niż inne2. Stronniczość kodonowa jest specyficzna zarówno dla organizmu, jak i dla tkanki2,3. Co więcej, częstotliwość wykorzystania kodonów jest wprost proporcjonalna do stężeń odpowiadających im tRNA4. Zatem kodon często wykorzystywany będzie posiadał większą liczbę odpowiadających mu tRNA, co dalej sugeruje, że kodon częsty będzie translacyjny szybciej niż kodon rzadki. W konsekwencji regiony mRNA wzbogacone w rzadkie kodony (potencjalne miejsca pauzy) co do zasady spowalniają ruch rybosomów na matrycy i powodują akumulację powstających peptydów odpowiednich wielkości5-8. Miejsca pauzy te mogą mieć funkcjonalny wpływ na ekspresję białek, stabilność mRNA i fałdowanie białekw celu zapoznania się z przeglądem patrz 9. Rzeczywiście wykazano, że zniesienie takich miejsc pauzy może zmienić ruch rybosomów na mRNA, a w konsekwencji wpłynąć na wydajność kotranslacyjnego (in vivo) fałdowania białek1,7,10,11. Aby zrozumieć proces fałdowania białek in vivo w komórce, który jest ostatecznie sprzężony z procesem syntezy białek, niezbędne jest uzyskanie kompleksowej wiedzy na temat wpływu wykorzystania kodonów/zawartości tRNA na ruch rybosomów wzdłuż mRNA podczas elongacji translacyjnej.
W niniejszym pracy opisujemy prostą technikę, którą można wykorzystać do lokalizacji głównych miejsc pauzy translacyjnej dla danego mRNA translacjonowanego w różnych systemach bezkomórkowych6-8. Procedura ta opiera się na izolacji nascentnych polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA. Podstawą teoretyczną jest założenie, że w przypadku kodonów o niskiej częstotliwości występowania, wydłużenie czasu przebywania rybosomów prowadzi do zwiększenia ilości nascentnych peptydów o odpowiadających im rozmiarach. mRNA transkrybowane in vitro jest wykorzystywane do reakcji translacyjnych in vitro w obecności radioaktywnie znakowanych aminokwasów, co umożliwia detekcję nascentnych łańcuchów. W celu izolacji kompleksów nascentnych polipeptydów związanych z rybosomami, reakcję translacyjną nanosi się warstwowo na 30% roztwór glicerolu, a następnie poddaje wirowaniu. Nascentne polipeptydy w osadzie polisomalnym są następnie traktowane rybonukleazą A i rozdzielane za pomocą SDS PAGE. Technika ta może być potencjalnie zastosowana do każdego białka i pozwala na analizę ruchu rybosomów wzdłuż mRNA oraz detekcję głównych miejsc pauzy. Dodatkowo protokół ten można dostosować do badania czynników i warunków, które mogą zmieniać ruch rybosomów, a tym samym potencjalnie wpływać na funkcję lub konformację białka.

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Szybkość elongacji translacji nie jest jednorodna. Drugorzędowa struktura mRNA, dobór kodonów oraz białka związane z mRNA mogą zmieniać ruch rybosomu na...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zidentyfikowanie i zlokalizowanie głównych miejsc pauzy translacyjnej dla mRNA translacyjnego w bezkomórkowym systemie translacji. Osiąga się to najpierw poprzez sklonowanie interesującego genu pod kontrolą promotora transkrypcyjnego T7. Następnie mRNA zostaje poddane transkrypcji i oczyszczeniu.Następnie przeprowadza się translację in vitro w obecności mRNA i radioaktywnych aminokwasów w celu znakowania syntetyzowanego białka i nowo powstających polipeptydów. Na koniec polisomy są izolowane za pomocą wirowania w gradiencie gęstości (sedymentacji), a wyizolowane łańcuchy nascentne są rozdzielane metodą elektroforezy żelowej. W rezultacie, dzięki zastosowaniu elektroforezy SDS-PAGE w buforze Tristine oraz autoradiografii, można uzyskać wyniki wykazujące polipeptydy nascentne o różnych długościach, co wskazuje na obecność miejsc zatrzymania (pause sites) wzdłuż analizowanego mRNA.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z naszymi istniejącymi metodami, takimi jak mikrokokalowy test ochrony jądra, jest to, że jest ona niezwykle prosta, szybka i wydajna, a także pozwala na wyznaczenie i identyfikację głównych miejsc translacji wzdłuż dowolnego mRNA w danym systemie komórkowym. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań w dziedzinie translacji i translacyjnego fałdowania białek, takich jak wpływ czynników komórkowych, np. wykorzystania kodonów, obfitości tRNA lub struktury drugorzędowej mRNA, na kinetykę translacji. Metoda ta może ponadto pomóc w zrozumieniu zależności między kinetyką translacji a kluczowymi etapami w ścieżce translacyjnego fałdowania białek.Zastosowanie tej techniki rozciąga się na zrozumienie procesu fałdowania białek in vivo, który w przeważającej mierze uważa się za zachodzący kotranslacyjnie podczas translacji na rybosomach, choć niniejsze badanie obejmuje translację bezkomórkową gamma-krystaliny z wykorzystaniem komercyjnie dostępnego ekstraktu komórkowego. Technikę tę można również zastosować do identyfikacji elementów IDE translacyjnych w potencjalnie dowolnym białku, używając ekstraktu zdolnego do translacji, przygotowanego z dowolnego źródła komórkowego. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności na dwóch kluczowych etapach protokołu.Pierwszym krokiem jest ustalenie całkowitego czasu wymaganego do przeprowadzenia reakcji translacji, co zapewni, że większość powstających polipeptydów pozostanie związana z rybosomem. Drugim krokiem jest znalezienie odpowiedniego układu do rozdzielenia większości powstających polipeptydów; wybór układu zależy od wielkości badanego białka. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy w połowie lat osiemdziesiątych postanowiliśmy zbadać kinetykę translacji cząsteczek globiny w odniesieniu do proponowanego modelu kotranslacyjnego fałdowania globiny.Niejednorodność translacji globiny została po raz pierwszy zauważona przez PRO i Maurice'a w 1974 roku podczas zastosowania chromatografii CLO z wykluczaniem wielkości w celu analizy NAS i łańcuchów globiny. Jednakże ich analiza nie charakteryzowała się pożądaną precyzją; Pro i more zaobserwowali cztery główne miejsca zatrzymania translacji podczas procesu translacji globiny. Następnie nasza analiza pozwoliła na ujawnienie około 10 dodatkowych miejsc zatrzymania i zbudowanie szczegółowego modelu fałdowania globiny podczas translacji. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ opisana tutaj technika obejmuje izolację polisomów oraz analizę powstających polipeptydów przy użyciu żelu SDS-PAGE w buforze Tris.Oba te kroki są kluczowe dla uzyskania wysokiej jakości i powtarzalnych wyników. Procedurę zaprezentuje student studiów doktoranckich z laboratorium Myelo, Sujata, w celu przeprowadzenia transkrypcji in vitro mRNA. Należy rozpocząć od genu docelowego, który został sklonowany pod promotorem T7 i/lub SP6; za pomocą odpowiedniego enzymu restrykcyjnego należy zlinearyzować matrycę DNA poniżej kodonu stop i/lub 3' końca mRNA.Próbkę po trawieniu enzymami restrykcyjnymi poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym, aby zweryfikować, czy DNA zostało całkowicie zlinearyzowane. Po ustaleniu optymalnego stężenia matrycy DNA należy wykorzystać zestaw do transkrypcji w celu przeprowadzenia transkrypcji in vitro mRNA zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie w celu oczyszczenia mRNA należy zastosować wytrącanie chlorkiem litu.Następnie należy wykorzystać elektroforezę w żelu akryloamidowym lub żelu agarosem w celu potwierdzenia czystości produktu. Przygotować 100 µL reakcji translacji in vitro w wodzie wolnej od nukleaz, dodając 1 mM mieszaninę aminokwasów bez metioniny, 10 jednostek inhibitora RNA, 20 µCi radioaktywnej 35 S metioniny oraz lizat retikulocytów królika. Następnie należy ogrzać reakcję, inkubując ją w temperaturze 30 °C przez pięć minut.Następnie należy dodać 2 µg mRNA i inkubować w temperaturze 30 °C przez 5 minut w celu zatrzymania reakcji, a następnie umieścić próbkę na lodzie, aby wyizolować nowo powstałe polipeptydy związane z rybosomami. Mieszaninę reakcyjną translacji należy nanieść na 4,5 ml 30% glicerolu w buforze Tris-HCl pH 7,6 z dodatkiem chlorku potasu i chlorku magnezu, a następnie wirować w wirówce z rotorem TLA 110 przy 100 000 ×g przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie należy ostrożnie usunąć nadsącz i resuspender osad polisomalny zawierający nowo powstałe polipeptydy w niewielkiej objętości 1 mM buforu Tris-HCl pH 7,6 zawierającego 0,5 mg/ml rybonukleazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.Aby przyspieszyć hydrolizę wiązania estrowego tRNA w peptydzie, należy dodać do reakcji wodorotlenek sodu do stężenia końcowego 10 millimolar i inkubować przez dodatkowe 30 minut. Nowo powstałe polipeptydy należy rozdzielić za pomocą żelu SDS-PAGE w buforze Tris-Tricine, a następnie utrwalić i wysuszyć żele. Żele należy poddać autoradiografii, a następnie obrazowaniu fosforowemu w celu detekcji nowo powstałych polipeptydów.Zmiana ruchu rybosomów wywołana zmianami w puli tRNA powinna prowadzić do zmian w rozkładzie wielkości nascentnych polipeptydów gromadzących się podczas translacji, a także w ich względnych intensywnościach, które odzwierciedlają czas trwania pauzy w danym miejscu. Nascentne polipeptydy białka krystaliny gamma B zostały wyizolowane i rozdzielone za pomocą elektroforezy Tristine SDS-PAGE. Nieidentyczne długości i intensywności polipeptydów w systemach RRL oraz e coli wskazują, że ruch rybosomów wzdłuż mRNA w tych dwóch systemach przebiega zgodnie z różną kinetyką translacji.Na przykład należy zwrócić uwagę na wyraźny prążek 17,7 kilodalton w lizacie e coli, który nie występuje w systemie lizatu retikulocytów królika. Krystalina gamma B posiada tandemowe kodony argininy, które są częste w systemach ssaków, ale wiadomo, że są niezwykle rzadkie i powolnie translacyjne w e coli, co sugeruje, że prążek ten jest spowodowany pauzą rybosomu na tych tandemowych rzadkich kodonach, jak pokazano tutaj.W przypadku braku mRNA nie obserwuje się żadnych prążków, a traktowanie puromycyną usuwa większość łańcuchów powstających z polisomów. Ponadto przedłużone traktowanie puromycyną usuwa wszystkie łańcuchy powstające, co potwierdza, że obserwowane produkty polipeptydowe są łańcuchami powstającymi związanymi z rybosomami, a nie białkami MRP współosadzającymi się z polisomami. Po opanowaniu technika ta może być wykonana w ciągu jednego do dwóch dni. Czas trwania procedury zależy głównie od czasu trwania etapu wirowania oraz etapu elektroforezy żelowej peptydów powstających.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest natychmiastowe przerwanie reakcji translacji po upływie czasu inkubacji. Aby zapobiec uwolnieniu powstającego polipeptydu z rybosomu, kluczowe jest unikanie kontaktu z RNA na każdym etapie. Zanieczyszczenie RNA może wpłynąć na wydajność translacji ekstraktu i prowadzić do uwolnienia powstającego polipeptydu z rybosomu podczas stosowania tej procedury.Inne cele, takie jak na przykład wpływ białek wiążących mRNA na wydajność ruchu rybosomu na danej matrycy, mogą zostać przetestowane po opracowaniu tej metody. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie fałdowania białek do zbadania roli pauzy translacyjnej wynikającej z obecności rzadkich kodonów w procesie translacyjnego fałdowania białek. Metoda ta została wcześniej wykorzystana do zbadania roli substytucji kodonów w ruchu rybosomu na matrycy oraz w translacyjnym fałdowaniu białek.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak identyfikować miejsca translacyjne w mRNA poprzez izolację nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomem. Należy pamiętać, że praca z izotopami promieniotwórczymi i znakowanymi aminokwasami, takimi jak na przykład ³⁵S-metionina, wymaga szczególnych środków ostrożności, co zawsze powinno być uwzględnione podczas wykonywania tej procedury.

isolation-ribosome-bound-nascent-polypeptides-vitro-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja nowo powstałych polipeptydów związanych z rybosomem in vitro w celu zidentyfikowania miejsc przerw translacyjnych wzdłuż mRNA

Główną przeszkodą w analizach biochemicznych rybosomów zawierających powstające peptydylo-tRNA była obecność innych rybosomów w tych samych próbkach — rybosomów niezaangażowanych w translację konkretnej analizowanej sekwencji mRNA. Opracowaliśmy prostą metodologię pozwalającą na wyłączną puryfikację rybosomów zawierających interesujące nas powstające peptydylo-tRNA.

Izolacja rybosomów translacyjnych zawierających peptydylo-tRNA do analiz funkcjonalnych i strukturalnych

Opisujemy tutaj technikę, która jest obecnie rutynowo stosowana do izolacji stabilnie związanych kompleksów powstającego łańcucha rybosomalnego (RNCs). Technika ta wykorzystuje odkrycie, że sekwencja „zatrzymująca” SecM o długości 17 aminokwasów może wstrzymać elongację translacji w systemie prokariotycznym (E. coli), gdy zostanie wstawiona do niemal każdego białka (lub połączona z jego końcem C).

Wykorzystanie sekwencji zatrzymującej SecM jako narzędzia do izolacji polipeptydów związanych z rybosomami

Tutaj opisujemy metodę analizy zmian w inicjacji translacji mRNA komórek eukariotycznych w odpowiedzi na warunki stresu. Metoda ta opiera się na rozdzielaniu prędkości na gradientach sacharozy rybosomów translujących z rybosomów nietranslujących.

Analiza inicjacji translacji w warunkach stresowych za pomocą profilowania polisomów

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Ten manuskrypt opisuje metodę wizualizacji i ilościowego określania zlokalizowanych zdarzeń translacji w subkomórkowych przedziałach. Podejście zaproponowane w tym manuskrypcie wymaga podstawowego systemu obrazowania konfokalnego i odczynników oraz jest szybkie i opłacalne.

Immunofluorescencja ilościowa do pomiaru globalnej translacji zlokalizowanej

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

AviTag-specific Location-restricted Illumination-enhanced Biotinylation (ALIBi) to nowoczesna optogenetycznie aktywowana metoda opracowana w celu znakowania i oczyszczania powinowaczo-afinicznego subkomórkowych populacji rybosomów dla sekwencjonowania i analizy proteomicznej w dalszym biegu.

Izolacja subpopulacji rybosomów subkomórkowych na podstawie rekombinowanego oznaczenia peptydowego tag-specyficznej lokalizacji ograniczonej iluminacji zwiększonej biotynilacją

Poznaj metodę izolacji polipeptydów związanych z rybosomami w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej na mRNA. Technika ta wykorzystuje elektroforezę denaturującą SDS-PAGE i autorradiografię.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Przeglądaj więcej filmów