Izolacja powstających polipeptydów związanych z rybosomami in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie i zlokalizowanie głównych miejsc pauzy translacyjnej dla mRNA translowanego w bezkomórkowym systemie translacji. Osiąga się to poprzez najpierw sklonowanie interesującego genu pod kontrolą promotora transkrypcji T 7. Następnie mRNA jest transkrybowane i oczyszczane.

Następnie przeprowadza się translację in vitro w obecności mRNA i radioaktywnych aminokwasów w celu znakowania zsyntetyzowanego białka i powstających polipeptydów. Na koniec polisom izoluje się za pomocą wirowania z prędkością sedymentacji, a izolowane powstające łańcuchy są rozwiązywane przez elektroforezę żelową. Ostatecznie wyniki można uzyskać, które pokazują powstające polipeptydy o różnej długości za pomocą strony Tristine SDS i automatycznej radiografii, wskazując w ten sposób na obecność miejsc pauzy wzdłuż interesującego mRNA.