Name: Oczyszczanie powinowactwa kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek HeLa. Protokół umożliwia analizę składu białkowego i RNA tych struktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Nadzie Naffakh i Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) za udostępnienie wirusa rWSN-PB2-Strep.

Schematyczny przebieg protokołu przedstawiono na Rys. 1, a tabela z odczynnikami znajduje się poniżej.
1. Infekcja (16 - 24 h)
<ol>
 <li>Wysiać komórki HeLa do 5 plastikowych szalek hodowlanych o średnicy 150 mm w pożywce DMEM-high glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose) w taki sposób, aby następnego dnia osiągnęły około 80% konfluencji (około 5 x 108 komórek). Ważne jest, aby komórki nie osiągnęły 100% konfluencji.</li>
 <li>Następnego dnia rozcieńczyć zapas wirusa grypy z tagiem Strep w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 3.</li>
 <li>Usunąć pożywkę wzrostową z komórek, przepłukać raz PBS i dodać do komórek 10 ml PBS zawierającego wirusa. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zastąpić pożywkę do infekcji pożywką DMEM-high glucose i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
Długość inkubacji zależy od fazy infekcji poddawanej badaniu (patrz sekcja Dyskusja).
2. Frakcjonowanie subkomórkowe (3 h)
<ol>
 <li>Przemyć komórki raz zimnym PBS, a następnie zawiesić je w zimnym PBS za pomocą gumowego skrobaka i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Zwirwić komórki w wirówce stołowej przez 5 min przy 1,000 rpm, a następnie odessać PBS.</li>
 <li>Resuspendować osad komórkowy w 10 ml zimnego buforu sacharozowego (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 2 mM Mg Acetate (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% protease inhibitor mix). Po zawieszeniu przepuścić komórki przez końcówkę pipety 200 μl przymocowaną do plastikowej pipety seryjnej 10 ml, aby rozbić skupiska komórek.</li>
 <li>Inkubować przez 10 min na lodzie. Okresowo i delikatnie odwracać probówkę, aby resuspendować komórki.</li>
 <li>Dodać Nonidet P-40 (NP-40) do stężenia końcowego 0.5% i mieszać w vortexie z wysoką prędkością przez 15 sec. Natychmiast wirować przez 10 min przy 3,500 x g w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż pierwotny osad komórkowy. Wszystkie frakcje można przechowywać przez co najmniej 4 h w 4 °C.</li>
 <li>Przemyć osad w 5 ml zimnego buforu sacharozowego, ponownie wirować zgodnie z krokiem 2.5 i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Resuspendować osad (zawierający jądra) w 1.5 ml zimnego buforu do ekstrakcji nukleoplazmatycznej (50 mM HEPES pH 7.9, 150 mM KOAc, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix).</li>
 <li>Przenieść do schłodzonego, w pełni szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 4 ml z dopasowanym tłokiem i homogenizować jądra za pomocą 20 pociągnięć.
 Należy unikać pienienia podczas homogenizacji. Opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Skuteczność homogenizacji można potwierdzić pod mikroskopem fazowo-kontrastowym. 
 </li>
 <li>Przenieść zhomogenizowane jądra do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml i inkubować przez 20 min na rotatorze w 4 °C.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja nukleoplazmatyczna.</li>
 <li>Resuspendować osad w 1.5 ml buforu do trawienia (50 mM HEPES pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix, 100 U/ml Benzonase (w przypadku analizy RNA zastąpić 20 U/ml RNase-free DNase I)) uprzednio ogrzanego do 37 °C i inkubować przez 10 min w 37 °C.</li>
 <li>Dodać 42 μl 5 M NaCl (do uzyskania stężenia końcowego 150 mM NaCl) i inkubować przez kolejne 20 min w 4 °C.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch150.</li>
 <li>Resuspendować osad w 1.5 ml zimnego buforu wysokosolnego (50 mM HEPES pH 7.9, 500 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix) i inkubować przez 20 min na lodzie.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch500.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie za pomocą Strep-tagu (2 h)
<ol>
 <li>Do frakcji cytoplazmatycznej dodać 300 μl 5 M NaCl (aby uzyskać stężenie końcowe 150 mM NaCl).</li>
 <li>Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml odmierzyć 100 μl upakowanych kulek Strep-Tactin Sepharose na każdą frakcję.</li>
 <li>Do kulek dodać 10 objętości buforu do przemywania Strep (20 mM HEPES pH 7.9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl dla próbek ch500), 1 mM EDTA), odwrócić probówkę w celu wymieszania i wirować przez 5 min przy 1,000 x g w wirówce nakładkowej.</li>
 <li>Usunąć nadsącz, powtórzyć krok 3.3 dwukrotnie, a następnie resuspendować osad z kulek w równiej objętości buforu do przemywania Strep.</li>
 <li>Do każdej frakcji dodać 200 μl zawiesiny przemytych kulek Strep-Tactin (do probówek mikrowirówkowych 1,5 ml dla frakcji nukleoplazmatycznej, ch150 i ch500 oraz do probówki stożkowej 15 ml dla frakcji cytoplazmatycznej).</li>
 <li>Inkubować probówki przez 1 h w 4 °C na rotatorze.</li>
 <li>Wirować probówki przez 1 min przy 1,000 x g w 4 °C. Usunąć nadsącz.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 1 ml zimnego buforu do przemywania Strep. Przenieść kulki z probówki 15 mL (frakcja cytoplazmatyczna) do probówki 1,5 mL. Przemywać wszystkie probówki przez 1 min w 4 °C, a następnie wirować zgodnie z krokiem 3.7. Powtórzyć ten etap przemywania dwukrotnie.</li>
 <li>Po ostatnim etapie przemywania usunąć wszystkie pozostałości buforu do przemywania za pomocą ściętej końcówki pipety. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (bufor do przemywania Strep zawierający 2,5 mM desthiobiotyny) i delikatnie wymieszać.</li>
 <li>Inkubować przez 15 min na lodzie. Co jakiś czas delikatnie mieszać kulki, opukując dno probówek.</li>
 <li>Wirować probówki przez 1 min przy 1000 x g w 4 °C w mikrowirówce. Zebrać nadsącz zawierający eluowane vRNP z tagiem Strep.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajność frakcjonowania najlepiej ocenia się za pomocą analizy Western blot frakcjonowanych lizatów przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów subkomórkowych (Rys. 2). W szczególności, prawidłowe frakcjonowanie subnuklearne powinno wykazać niewielką ilość lub brak komórkowej polimerazy RNA II (Pol II) we frakcji nukleoplazmatycznej, czyli rozpuszczalnej frakcji jądrowej4, a większość powinna zostać wyekstrahowana za pomocą 150 mM NaCl5. W komórkach zainfekowanych wirusem grypy, w porównaniu z komórkami niezainfekowanymi, powtarzalnie obserwuje się również degradację Pol II, co jest zgodne z literaturą6.
Oczyszczanie vRNP najlepiej oceniać za pomocą barwienia srebrem lub Coomassie, co przedstawiono dla eluatu cytoplazmatycznego na Rys. 3. Z naszego doświadczenia wynika, że większość Strep-PB2 jest oczyszczana jako część w pełni sformowanej vRNP, co oznacza, że wychwytywana jest niewielka ilość rozpuszczalnej polimerazy. Odzwierciedla to wysoki stosunek NP:PA/PB1/PB2 obserwowany w barwieniu srebrem lub Coomassie. Niższy stosunek sugeruje zanieczyszczenie buforu nukleazami RNazami, ponieważ wiadomo, że kilka powszechnie występujących RNaz (takich jak RNaza A) przecina viralne RNA w sposób prowadzący do dysocjacji polimerazy z multimery NP7. Co ciekawe, sama obróbka Benzonazą, choć wystarczająca do strawienia viralnego RNA, wydaje się nie mieć wpływu na stosunki stechiometryczne białek vRNP. Choć nie potrafimy wyjaśnić tego zjawiska, zaobserwowaliśmy rozpad vRNP po trawieniu innymi RNazami (dane nie pokazane), co sugeruje, że Benzonaza może pozostawiać nienaruszone niektóre strukturalnie ważne regiony RNA. Po oczyszczaniu vRNP z cytoplazmy i nukleoplazmy (przeprowadzonym bez trawienia nukleazą), w barwieniu srebrem można zaobserwować 8 słabych, ale wyraźnych prążków o wysokich masach cząsteczkowych, które odpowiadają przewidywanym masom cząsteczkowym 8 segmentów genomu grypy (patrz ref. 3). 
Względne ilości vRNP oczyszczonych z każdej frakcji w 9 h po infekcji przedstawiono na Rys. 4. Rozkład vRNP zmienia się w czasie trwania infekcji, przy czym najsilniejsza akumulacja występuje we frakcji ch150 we wczesnych punktach czasowych, a zwiększona akumulacja w nukleoplazmie i cytoplazmie w późnych punktach czasowych.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="Schemat lizy komórek i ekstrakcji chromatyny z opisem krok po kroku ekstrakcji nukleoplazmy i soli." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy frakcjonowania subkomórkowego. Adaptacja z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="Western blot pokazujący poziomy ekspresji białek, próbki: cytoplazma, jądro, traktowania ch150, ch500." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza Western blot frakcji subkomórkowych z komórek zakażonych wirusem grypy. 109 komórek HeLa zakażono szczepem wirusa grypy WSN na 9 h przed frakcjonowaniem subkomórkowym. Na każdą ścieżkę naniesiono równą ilość całkowitego białka i przeanalizowano za pomocą pokazanych przeciwciał. Polimerazę RNA II (Pol II) wykryto za pomocą klonu 8WG16, który rozpoznaje wszystkie formy domeny C-końcowej (najbardziej wyraźny jest prążek hipofosforylowany). Adaptowano z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="Wynik żelu SDS-PAGE wykazujący prążki białek dla PB1, PA/PB2-Strep; masy cząsteczkowe w kDa." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza barwienia srebrem oczyszczonych vRNP. Komórki HeLa zainfekowano rWSN (jako kontrolę negatywną) lub rWSN-PB2-Strep przez 9 h, a następnie przeprowadzono oczyszczanie Strep z frakcji cytoplazmatycznej. Gwiazdka oznacza prążki, które nie są widoczne po trawieniu RNazą. Adaptowano z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="Elektroforeza żelowa białek oczyszczonych za pomocą Strep; prążki białkowe; frakcjonowanie nukleocytoplazmatyczne; marker kDa." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza barwieniem srebrem vRNP oczyszczonych z różnych frakcji komórkowych. 109 komórek HeLa zainfekowano rWSN-PB2-Strep lub rWSN przez 9 h, a następnie przeprowadzono frakcjonowanie subkomórkowe i oczyszczanie za pomocą Strep. Na żel naniesiono równe ilości eluatu z każdej frakcji. Adaptowano z ref. 3.

<ol><li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li>
<li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329(2005).</li>
<li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).</li>
<li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell%3A+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li>
<li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460(2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li>
<li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427(2010).</li>
<li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li>
<li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma%2C+MOPC+315%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).</li>
<li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30(2010).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618(2011).</li>
<li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879(2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Chociaż w wielu niedawnych badaniach zidentyfikowano poszczególne białka lub sieci komórkowe zaangażowane w infekcję wirusem grypy8, znaczenie funkcjonalne większości tych oddziaływań pozostaje niejasne. Biorąc pod uwagę absolutną zależność syntezy RNA wirusa grypy od funkcji opartych na chromatynie oraz złożoną naturę biofizyczną i biochemiczną jądra komórkowego9, niezbędne będą nowe techniki w celu wyjaśnienia tych funkcji. Przedstawione tutaj frakcjonowanie subnuklearne, w połączeniu z oczyszczan...

<table><tbody><tr><td>DMEM z wysoką zawartością glukozy</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina inhibitorów proteaz G</td><td>Elektroforeza SERVA</td><td>39101</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71206</td><td>25 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>DNaza I, wolna od RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>EN0523</td><td>50 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>homogenizator Dounce'a</td><td>Wheaton</td><td>432-1271</td><td>Typ zastosowania &quot;B&quot; tłuczek</td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1201-025</td><td>Można również zastosować format kolumny z 50% zawiesiną</td></tr><tr><td>Desthiobiotyna</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1000-002</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Podobnie jak wszystkie wirusy RNA o ujemnej polarności nici, genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których jednoniciowy genom jest enkapsydowany przez nukleoproteinę (NP) i powiązany z trymerycznym kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Jednak w przeciwieństwie do większości wirusów RNA, wirusy grypy przeprowadzają syntezę wirusowego RNA w jądrach zakażonych komórek. Co ciekawe, synteza wirusowego mRNA wykorzystuje komórkowe pre-mRNA jako primery i zasugerowano, że proces ten zachodzi na chromatynie1. Scharakteryzowano również oddziaływania między polimerazą wirusową a komórkową polimerazą RNA II, a także między NP a komórkowymi nukleosomami1,2.
Niedawno opisano generowanie rekombinowanych wirusów grypy kodujących One-Strep-Tag genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB2 polimerazy wirusowej (rWSN-PB2-Strep3). Rekombinowane wirusy te umożliwiają oczyszczanie kompleksów zawierających PB2, w tym vRNP, z zainfekowanych komórek. Aby uzyskać oczyszczone vRNP, infekuje się kultury komórkowe, a następnie vRNP są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa z lizatów otrzymanych z tych komórek. Jednakże procedury lizy stosowane do tej pory opierały się na jednostopniowej lizie detergentowej, która, mimo obecności ogólnej nukleazy, często mało efektywnie ekstrahuje materiał związany z chromatyną.
Nasze wstępne badania sugerowały, że znaczna część jądrowych vRNP nie została wyekstrahowana podczas tradycyjnej lizy komórek, a w konsekwencji nie mogła zostać poddana oczyszczaniu powinowactwem. Aby zwiększyć wydajność tej ekstrakcji oraz oddzielić jądrowe vRNP związane z chromatyną od tych niezwiązanych, dostosowaliśmy protokół stopniowej ekstrakcji subkomórkowej do komórek zakażonych wirusem grypy. W skrócie, procedura ta najpierw oddziela jądra od komórek, a następnie ekstrahuje rozpuszczalne białka jądrowe (tutaj określone jako frakcja „nukleoplazmatyczna”). Pozostały nierozpuszczalny materiał jądrowy jest następnie trawiony Benzonazą, nieswoistą nukleazą DNA/RNA, po czym następują dwa etapy ekstrakcji solnej: najpierw z użyciem 150 mM NaCl (określone jako „ch150”), a następnie 500 mM NaCl („ch500”) (Rys. 1). Etapy ekstrakcji solnej wybrano na podstawie naszej obserwacji, że 500 mM NaCl było wystarczające do solubilizacji ponad 85% jądrowych vRNP, a jednocześnie pozwalało na wiązanie znakowanych vRNP z macierzą powinowactwa.
Po frakcjonowaniu subkomórkowym zainfekowanych komórek możliwe jest oczyszczenie za pomocą powinowactwa vRNP znakowanych PB2 z każdej poszczególnej frakcji oraz analiza ich komponentów białkowych i RNA odpowiednio za pomocą Western Blot i metody przedłużania starterów. Niedawno wykorzystaliśmy tę metodę, aby odkryć, że kompleksy eksportowe vRNP tworzą się w późnych punktach po infekcji w frakcji chromatyny ekstrahowanej za pomocą 500 mM NaCl (ch500)3.

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów RNA o nici ujemnej, genom wirusów grypy jest zapakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których...

Wirusy RNA o ujemnej polarności nici. Genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych, lub VRNP, w których jednoniciowy genom jest otoczony białkiem nukleowym i związany z kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Aby oczyścić nienaruszone kompleksy z zainfekowanych komórek ssaków, komórki HeLa inkubuje się z rekombinowanym wirusem grypy z tagiem strept.Po wniknięciu wirusa do komórek i syntezie wirusowego RNA w jądrach po infekcji, komórki poddaje się lizie z użyciem detergentu, a następnie frakcjonuje na frakcje cytoplazmatyczną, jądrową i chromatynową, wykorzystując wirowanie oraz protokół frakcjonowania chromatyny oparty na soli. Na koniec białka VRP z tagiem strept są oczyszczane metodą powinowactwa z każdej frakcji. Analiza składu białkowego i RNA oczyszczonych vRNPs za pomocą barwienia srebrem wykazuje, że stosując ten protokół, można wyizolować nawet silnie związane z chromatyną VRP w stanie nienaruszonym. Zatem jedną z głównych zalet naszego protokołu w porównaniu do standardowych metod powinowactwa do oczyszczania kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy jest możliwość oczyszczenia vRNPs z chromatyny zainfekowanych komórek, która jest znanym miejscem syntezy mRNA wirusa grypy.Zatem nasza metoda może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania dotyczące regulacji replikacji i transkrypcji wirusowej, na przykład do ustalenia, które czynniki wirusowe lub komórkowe, a także które modyfikacje potranslacyjne są niezbędne dla syntezy wirusowego mRNA lub syntezy wirusowego RNA genomicznego. Badacze rozpoczynający pracę z tą metodą mogą napotkać pewne trudności, ponieważ frakcjonowanie subnuklearne jest bardzo wrażliwe na warunki biochemiczne i może się znacznie różnić w zależności od linii komórkowej. Rozpocznij ten protokół, wykorzystując komórki A549 zakażone wirusem grypy RWSN PB2-Strep, który posiada znacznik Strep genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB2, przy wielokrotności zakażenia (MOI) wynoszącej 3.Przemyj komórki raz zimnym PBS, następnie dodaj 12 ml zimnego PBS i usuń je z naczynia, używając gumowej skrobaczki. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwiruj je w celu uzyskania osadu.Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest protokół frakcjonowania komórek. Jądra komórkowe są bardzo wrażliwe na procedury homogenizacji i mieszania, a ich nieprawidłowe przeprowadzenie może łatwo zniszczyć ekstrakt chromatyny. Dlatego bardzo ważne jest przestrzeganie nie tylko technik homogenizacji, ale także ogólnych zasad obchodzenia się z lizatami, które prezentujemy w tym materiale.Po odwirowaniu, odessaniu nadsączu, PBS oraz roztworu resuspendującego, pellet komórkowy zawiesić w 10 mililitrach zimnego buforu sacharozowego. Do plastikowej pipety seryjnej o pojemności 10 mililitrów przymocować końcówkę do pipety o pojemności 200 mikrolitrów i przepuścić przez nią komórki, aby rozbić skupiska komórkowe. Zawiesinę inkubować na lodzie przez 10 minut.Okresowo i delikatnie odwracaj probówki z komórkami, aby je resuspenderować. Następnie dodaj non IET P 40 do stężenia końcowego 0,5% i mieszaj w wirówce vortex z wysoką prędkością przez 15 sekund; niezwłocznie odwiruj przez 10 minut przy 3 500 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce naktowej. Po wirowaniu usuń nadosad i przenieś go do stożkowatej probówki o pojemności 15 ml.Przechowywać nadnadfiltr w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż pierwotny osad komórkowy, jak pokazano tutaj.Jeśli protokół zostanie ukończony w późniejszym terminie, należy przechowywać pellet komórkowy w temperaturze 4 °C. W przeciwnym razie należy kontynuować, przemywając pellet w 5 mL zimnego buforu sacharozowego i wirując go w taki sam sposób jak poprzednio. Po zakończeniu wirowania należy odrzucić nadsącz i resuspender pellet zawierający jądra w 1,5 mL zimnego buforu do ekstrakcji plazmy jądrowej.Przenieś resuspendowany osad do schłodzonego, w pełni szklanego homogenizatora o pojemności czterech mililitrów z dopasowanym tłokiem i homogenizuj jądra za pomocą 20 pociągnięć. Należy unikać tworzenia piany; opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Aby potwierdzić efektywność homogenizacji, zbadaj próbkę pod mikroskopem fazokontrastowym.Jądra nie powinny być już okrągłe, lecz mieć nieregularne kształty i wyglądać tak, jakby pękły. Po homogenizacji jąder przenieś je do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Inkubuj homogenat na wirówce rotacyjnej w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.Następnie odwiruj próbkę w mikrocentryfudze przy 16 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu przenieś supernatant, który stanowi frakcję plazmy jądrowej, do probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj go w temperaturze 4 °C. Następnie ponownie zawieś osad w 1,5 ml buforu trawiennego, uprzednio ogrzanego do 37 °C.Następnie inkubuj frakcję przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Dalej dodaj 42 µL pięciomolarnego chlorku sodu, aby uzyskać końcowe stężenie chlorku sodu wynoszące 150 mM, a następnie inkubuj przez 20 minut na lodzie. Wirowarkuj przy 16 000 ×g w mikrocentryfużce w temperaturze 4 °C przez 10 minut.Po wirowaniu oddziel supernatant i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to frakcja CH one 50. Osad ponownie zawiesić w 1,5 milliliters zimnego buforu z wysoką zawartością soli i inkubować przez 20 minut na lodzie.Wiruj w mikrowirówce przy 16 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Po wirowaniu usuń nadosad i przechowuj go w temperaturze 4 °C. Jest to frakcja CH 500.Wyjmij frakcje zabezpieczone podczas protokołu frakcjonowania i umieść je w lodzie. Następnie do frakcji cytoplazmatycznej dodaj 300 µL 5 M NaCl. Potem przenieś 100 µL upakowanych kulek strep T w Sphero na frakcję do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.Dodaj 10 objętości buforu do płukania strep do kulek. Odwróć probówkę, aby wymieszać zawartość, a następnie wiruj przez pięć minut przy 1000 ×g w wirówce stołowej i odlej nadsącz.Powtórz płukanie buforem dwukrotnie, a następnie resuspenduj osad w równym объеме buforu do płukania streptawydyny, dodając 200 µL zawiesiny kulek strep-actin do każdej frakcji. Rotuj probówki przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie odwiruj probówki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C i odlej nadsącz.Następnie do kulek inkubowanych z frakcją cytoplazmatyczną w probówce o pojemności 15 ml należy dodać jeden mililitr buforu do płukania. Po dodaniu buforu do płukania przenieś kulki do probówki o pojemności 1,5 ml. Płucz kulki przez jedną minutę, a następnie wiruj probówki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C.Powtórz dwukrotnie po ostatnim etapie płukania. Usuń wszystkie ślady buforu do płukania za pomocą płaskiej końcówki pipety. Następnie dodaj 100 µL buforu do elucji, delikatnie wymieszaj i umieść probówki na lodzie na 15 minut.Podczas inkubacji okresowo mieszaj kuleczki, delikatnie stukając w dno probówek. Po upływie 15 minut odwiruj próbki przez jedną minutę przy 1000 ×g w temperaturze 4 °C. Zbierz nadst નad osadem zawierający eluowane strep-tagowane VRP.Komórki zostały zainfekowane szczepem wirusa grypy WSN przez dziewięć godzin, a frakcjonowane lizaty przeanalizowano metodą western blotting, jak pokazano tutaj. Delikatna izolacja jąder pozwala na efektywne wydzielenie białek cytoplazmatycznych, takich jak tubulina, przy jednoczesnym uniknięciu uwalniania licznych białek jądrowych. Należy zauważyć, że frakcja chromatyny wyekstrahowana w niskim zasoleniu jest wzbogacona w białka istotne dla transkrypcji.Podczas gdy frakcja o wysokim zasoleniu zawiera głównie nukleosomy, w celu określenia składu białkowego eluowanej frakcji cytoplazmatycznej przeanalizowano vRNP z komórek R zainfekowanych przez dziewięć godzin wirusem nieoznaczonym, RWSN lub RWSN PB2-strep, stosując barwienie srebrem, jak pokazano dla eluatu cytoplazmatycznego. Widoczny jest tutaj wysoki stosunek NP do PA, PB1 i PB2, o czym świadczy główny prążek powyżej 55 kilodaltonów w porównaniu do prążków między 95 a 100 kilodaltonów, co sugeruje, że większość białka strep PB2 jest oczyszczana jako część w pełni uformowanego vRNP, innymi słowy, wychwycono niewielką ilość rozpuszczalnej polimerazy w celu porównania względnych wydajności. vRNP oczyszczone po dziewięciu godzinach infekcji szczepami RWSN PB2-strep lub RWSN poddano barwieniu srebrem, jak pokazano na tym żelu z barwieniem srebrem; vRNP mogą być oczyszczone ze wszystkich czterech frakcji komórkowych po dziewięciu godzinach infekcji.Najwyższe stężenie vRMP znajduje się w plazmie jądrowej, choć znaczne ilości można również oczyścić z cytoplazmy i chromatyny. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak oczyścić wysokie wydajności nienaruszonych kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z jąder zainfekowanych komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu czystych buforów i unikaniu niepotrzebnego wystawiania próbek na temperaturę pokojową, co pozwoli zapobiec degradacji zarówno RNA, jak i białek, a także uniknąć rozpadu kompleksów białkowych.Należy pamiętać, że praca z zakaźnym wirusem grypy może być niebezpieczna. Wszystkie etapy powinny być przeprowadzane na stanowisku pracy o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2) aż do momentu dodania NP 40 do lizatów.

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Uzyskanie czystych kompleksów ribonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Projektowanie leków w oparciu o strukturę odgrywa istotną rolę w opracowywaniu nowych preparatów terapeutycznych. Równoległe dążenie do uzyskania wielu celów znacznie zwiększa szanse na sukces w odkrywaniu związków wiodących. Poniższy artykuł przedstawia, w jaki sposób Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease wykorzystuje podejście wielocelowe w procesie wyznaczania struktury na podstawie genu dla podjednostki PB2 wirusa grypy typu A.

Podejście z zastosowaniem równoległego przetwarzania wielu celów w wyznaczaniu struktury na podstawie sekwencji genu podjednostki PB2 polimerazy wirusa grypy

Źródło: Becker, B. i inni. Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych niezbędnych do transportu łańcucha toksyny rycyny A (RTA) w drożdżach. J. Vis. Exp. (2017).Ten film demonstruje oczyszczanie rekombinowanego białka oznaczonego polisystydyną za pomocą chromatografii powinowactwa na bazie niklu. Określa kluczowe kroki, w tym lizę bakteryjną przez sonikację, klarowanie i filtrację lizatu oraz selektywne wiązanie i eluację docelowego białka za pomocą...

 Technika chromatografii powinowactwa do oczyszczania rekombinowanego białka bakteryjnego

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Ten protokół koimmunoprecypitacji pozwala badać interakcję między nukleoproteiną wirusa grypy A a przeciwwirusowym białkiem Mx1 w komórkach ludzkich. W protokole podkreślono znaczenie N-etylomaleimidu dla skutecznego koimmunoprecypitacji nukleoproteiny Mx1 i wirusa grypy A.

Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Poznaj metodę oczyszczania kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek HeLa. Protokół umożliwia analizę składu białkowego i RNA tych struktur.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Przeglądaj więcej filmów