Name: Oczyszczanie powinowactwa kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek HeLa. Protokół umożliwia analizę składu białkowego i RNA tych struktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Nadzie Naffakh i Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) za udostępnienie wirusa rWSN-PB2-Strep.

Schematyczny przebieg protokołu przedstawiono na Rys. 1, a tabela z odczynnikami znajduje się poniżej.
1. Infekcja (16 - 24 h)
<ol>
 <li>Wysiać komórki HeLa do 5 plastikowych szalek hodowlanych o średnicy 150 mm w pożywce DMEM-high glucose (Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose) w taki sposób, aby następnego dnia osiągnęły około 80% konfluencji (około 5 x 108 komórek). Ważne jest, aby komórki nie osiągnęły 100% konfluencji.</li>
 <li>Następnego dnia rozcieńczyć zapas wirusa grypy z tagiem Strep w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającej 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), aby uzyskać wielokrotność infekcji (MOI) równą 3.</li>
 <li>Usunąć pożywkę wzrostową z komórek, przepłukać raz PBS i dodać do komórek 10 ml PBS zawierającego wirusa. Inkubować przez 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Zastąpić pożywkę do infekcji pożywką DMEM-high glucose i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
Długość inkubacji zależy od fazy infekcji poddawanej badaniu (patrz sekcja Dyskusja).
2. Frakcjonowanie subkomórkowe (3 h)
<ol>
 <li>Przemyć komórki raz zimnym PBS, a następnie zawiesić je w zimnym PBS za pomocą gumowego skrobaka i przenieść do probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Zwirwić komórki w wirówce stołowej przez 5 min przy 1,000 rpm, a następnie odessać PBS.</li>
 <li>Resuspendować osad komórkowy w 10 ml zimnego buforu sacharozowego (10 mM HEPES pH 7.9, 10 mM KCl, 2 mM Mg Acetate (MgOAc), 3 mM CaCl2, 340 mM sucrose, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1% protease inhibitor mix). Po zawieszeniu przepuścić komórki przez końcówkę pipety 200 μl przymocowaną do plastikowej pipety seryjnej 10 ml, aby rozbić skupiska komórek.</li>
 <li>Inkubować przez 10 min na lodzie. Okresowo i delikatnie odwracać probówkę, aby resuspendować komórki.</li>
 <li>Dodać Nonidet P-40 (NP-40) do stężenia końcowego 0.5% i mieszać w vortexie z wysoką prędkością przez 15 sec. Natychmiast wirować przez 10 min przy 3,500 x g w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż pierwotny osad komórkowy. Wszystkie frakcje można przechowywać przez co najmniej 4 h w 4 °C.</li>
 <li>Przemyć osad w 5 ml zimnego buforu sacharozowego, ponownie wirować zgodnie z krokiem 2.5 i odrzucić nadsącz.</li>
 <li>Resuspendować osad (zawierający jądra) w 1.5 ml zimnego buforu do ekstrakcji nukleoplazmatycznej (50 mM HEPES pH 7.9, 150 mM KOAc, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix).</li>
 <li>Przenieść do schłodzonego, w pełni szklanego homogenizatora Dounce o pojemności 4 ml z dopasowanym tłokiem i homogenizować jądra za pomocą 20 pociągnięć.
 Należy unikać pienienia podczas homogenizacji. Opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Skuteczność homogenizacji można potwierdzić pod mikroskopem fazowo-kontrastowym. 
 </li>
 <li>Przenieść zhomogenizowane jądra do probówki do mikrowirówki o pojemności 1.5 ml i inkubować przez 20 min na rotatorze w 4 °C.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja nukleoplazmatyczna.</li>
 <li>Resuspendować osad w 1.5 ml buforu do trawienia (50 mM HEPES pH 7.9, 10 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix, 100 U/ml Benzonase (w przypadku analizy RNA zastąpić 20 U/ml RNase-free DNase I)) uprzednio ogrzanego do 37 °C i inkubować przez 10 min w 37 °C.</li>
 <li>Dodać 42 μl 5 M NaCl (do uzyskania stężenia końcowego 150 mM NaCl) i inkubować przez kolejne 20 min w 4 °C.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch150.</li>
 <li>Resuspendować osad w 1.5 ml zimnego buforu wysokosolnego (50 mM HEPES pH 7.9, 500 mM NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.1% NP-40, 1 mM DTT, 1% protease inhibitor mix) i inkubować przez 20 min na lodzie.</li>
 <li>Wirować przy 16,000 x g w mikrowirówce w 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Oddzielić nadsącz i przechowywać w 4 °C. Jest to frakcja ch500.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie za pomocą Strep-tagu (2 h)
<ol>
 <li>Do frakcji cytoplazmatycznej dodać 300 μl 5 M NaCl (aby uzyskać stężenie końcowe 150 mM NaCl).</li>
 <li>Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml odmierzyć 100 μl upakowanych kulek Strep-Tactin Sepharose na każdą frakcję.</li>
 <li>Do kulek dodać 10 objętości buforu do przemywania Strep (20 mM HEPES pH 7.9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl dla próbek ch500), 1 mM EDTA), odwrócić probówkę w celu wymieszania i wirować przez 5 min przy 1,000 x g w wirówce nakładkowej.</li>
 <li>Usunąć nadsącz, powtórzyć krok 3.3 dwukrotnie, a następnie resuspendować osad z kulek w równiej objętości buforu do przemywania Strep.</li>
 <li>Do każdej frakcji dodać 200 μl zawiesiny przemytych kulek Strep-Tactin (do probówek mikrowirówkowych 1,5 ml dla frakcji nukleoplazmatycznej, ch150 i ch500 oraz do probówki stożkowej 15 ml dla frakcji cytoplazmatycznej).</li>
 <li>Inkubować probówki przez 1 h w 4 °C na rotatorze.</li>
 <li>Wirować probówki przez 1 min przy 1,000 x g w 4 °C. Usunąć nadsącz.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 1 ml zimnego buforu do przemywania Strep. Przenieść kulki z probówki 15 mL (frakcja cytoplazmatyczna) do probówki 1,5 mL. Przemywać wszystkie probówki przez 1 min w 4 °C, a następnie wirować zgodnie z krokiem 3.7. Powtórzyć ten etap przemywania dwukrotnie.</li>
 <li>Po ostatnim etapie przemywania usunąć wszystkie pozostałości buforu do przemywania za pomocą ściętej końcówki pipety. Dodać 100 μl buforu elucyjnego (bufor do przemywania Strep zawierający 2,5 mM desthiobiotyny) i delikatnie wymieszać.</li>
 <li>Inkubować przez 15 min na lodzie. Co jakiś czas delikatnie mieszać kulki, opukując dno probówek.</li>
 <li>Wirować probówki przez 1 min przy 1000 x g w 4 °C w mikrowirówce. Zebrać nadsącz zawierający eluowane vRNP z tagiem Strep.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wydajność frakcjonowania najlepiej ocenia się za pomocą analizy Western blot frakcjonowanych lizatów przy użyciu przeciwciał specyficznych dla markerów subkomórkowych (Rys. 2). W szczególności, prawidłowe frakcjonowanie subnuklearne powinno wykazać niewielką ilość lub brak komórkowej polimerazy RNA II (Pol II) we frakcji nukleoplazmatycznej, czyli rozpuszczalnej frakcji jądrowej4, a większość powinna zostać wyekstrahowana za pomocą 150 mM NaCl5. W komórkach zainfekowanych wirusem grypy, w porównaniu z komórkami niezainfekowanymi, powtarzalnie obserwuje się również degradację Pol II, co jest zgodne z literaturą6.
Oczyszczanie vRNP najlepiej oceniać za pomocą barwienia srebrem lub Coomassie, co przedstawiono dla eluatu cytoplazmatycznego na Rys. 3. Z naszego doświadczenia wynika, że większość Strep-PB2 jest oczyszczana jako część w pełni sformowanej vRNP, co oznacza, że wychwytywana jest niewielka ilość rozpuszczalnej polimerazy. Odzwierciedla to wysoki stosunek NP:PA/PB1/PB2 obserwowany w barwieniu srebrem lub Coomassie. Niższy stosunek sugeruje zanieczyszczenie buforu nukleazami RNazami, ponieważ wiadomo, że kilka powszechnie występujących RNaz (takich jak RNaza A) przecina viralne RNA w sposób prowadzący do dysocjacji polimerazy z multimery NP7. Co ciekawe, sama obróbka Benzonazą, choć wystarczająca do strawienia viralnego RNA, wydaje się nie mieć wpływu na stosunki stechiometryczne białek vRNP. Choć nie potrafimy wyjaśnić tego zjawiska, zaobserwowaliśmy rozpad vRNP po trawieniu innymi RNazami (dane nie pokazane), co sugeruje, że Benzonaza może pozostawiać nienaruszone niektóre strukturalnie ważne regiony RNA. Po oczyszczaniu vRNP z cytoplazmy i nukleoplazmy (przeprowadzonym bez trawienia nukleazą), w barwieniu srebrem można zaobserwować 8 słabych, ale wyraźnych prążków o wysokich masach cząsteczkowych, które odpowiadają przewidywanym masom cząsteczkowym 8 segmentów genomu grypy (patrz ref. 3). 
Względne ilości vRNP oczyszczonych z każdej frakcji w 9 h po infekcji przedstawiono na Rys. 4. Rozkład vRNP zmienia się w czasie trwania infekcji, przy czym najsilniejsza akumulacja występuje we frakcji ch150 we wczesnych punktach czasowych, a zwiększona akumulacja w nukleoplazmie i cytoplazmie w późnych punktach czasowych.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="Schemat lizy komórek i ekstrakcji chromatyny z opisem krok po kroku ekstrakcji nukleoplazmy i soli." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat blokowy frakcjonowania subkomórkowego. Adaptacja z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="Western blot pokazujący poziomy ekspresji białek, próbki: cytoplazma, jądro, traktowania ch150, ch500." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Analiza Western blot frakcji subkomórkowych z komórek zakażonych wirusem grypy. 109 komórek HeLa zakażono szczepem wirusa grypy WSN na 9 h przed frakcjonowaniem subkomórkowym. Na każdą ścieżkę naniesiono równą ilość całkowitego białka i przeanalizowano za pomocą pokazanych przeciwciał. Polimerazę RNA II (Pol II) wykryto za pomocą klonu 8WG16, który rozpoznaje wszystkie formy domeny C-końcowej (najbardziej wyraźny jest prążek hipofosforylowany). Adaptowano z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="Wynik żelu SDS-PAGE wykazujący prążki białek dla PB1, PA/PB2-Strep; masy cząsteczkowe w kDa." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Analiza barwienia srebrem oczyszczonych vRNP. Komórki HeLa zainfekowano rWSN (jako kontrolę negatywną) lub rWSN-PB2-Strep przez 9 h, a następnie przeprowadzono oczyszczanie Strep z frakcji cytoplazmatycznej. Gwiazdka oznacza prążki, które nie są widoczne po trawieniu RNazą. Adaptowano z ref. 3.
<img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="Elektroforeza żelowa białek oczyszczonych za pomocą Strep; prążki białkowe; frakcjonowanie nukleocytoplazmatyczne; marker kDa." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Analiza barwieniem srebrem vRNP oczyszczonych z różnych frakcji komórkowych. 109 komórek HeLa zainfekowano rWSN-PB2-Strep lub rWSN przez 9 h, a następnie przeprowadzono frakcjonowanie subkomórkowe i oczyszczanie za pomocą Strep. Na żel naniesiono równe ilości eluatu z każdej frakcji. Adaptowano z ref. 3.

<ol><li>Engelhardt, O. G., Smith, M., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+the+influenza+A+virus+RNA-dependent+RNA+polymerase+with+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of the influenza A virus RNA-dependent RNA polymerase with cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 79, 5812-5812 (2005).</li>
<li>Garcia-Robles, I., Akarsu, H., Müller, C. W., Ruigrok, R., Baudin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+influenza+virus+proteins+with+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Interaction of influenza virus proteins with nucleosomes.</a> Virology. 332, 329(2005).</li>
<li>Chase, G. P., Rameix-Welti, M. A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187(2011).</li>
<li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+RNA+polymerase+II+and+its+transcription+factors+in+an+HeLa+cell%3A+little+soluble+holoenzyme+but+significant+amounts+of+polymerases+attached+to+the+nuclear+substructure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of RNA polymerase II and its transcription factors in an HeLa cell: little soluble holoenzyme but significant amounts of polymerases attached to the nuclear substructure.</a> Mol. Cell. Biol. 19, 5383-5383 (1999).</li>
<li>Henikoff, S., Henikoff, J. G., Sakai, A., Loeb, G. B., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiling+of+salt+fractions+maps+physical+properties+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiling of salt fractions maps physical properties of chromatin.</a> Genome Res. 19, 460(2009).</li>
<li>Rodriguez, A., Perez-Gonzalez, A., Nieto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+virus+infection+causes+specific+degradation+of+the+largest+subunit+of+cellular+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Influenza virus infection causes specific degradation of the largest subunit of cellular RNA polymerase II.</a> J. Virol. 81, 5315-5315 (2007).</li>
<li>Ye, Z., Liu, T., Offringa, D. P., McInnis, J., Levandowski, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+influenza+virus+matrix+protein+with+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Association of influenza virus matrix protein with ribonucleoproteins.</a> J. Virol. 73, 7467-7467 (1999).</li>
<li>Watanabe, T., Watanabe, S., Kawaoka, T., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+networks+involved+in+the+influenza+virus+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Cellular networks involved in the influenza virus life cycle.</a> Cell Host Microbe. 7, 427(2010).</li>
<li>Engelhardt, O. G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Med.+Virol%22%5BJournal%5D)">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li>
<li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma%2C+MOPC+315%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889(1974).</li>
<li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biosyst%22%5BJournal%5D)">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30(2010).</li>
<li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618(2011).</li>
<li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879(2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Chociaż w wielu niedawnych badaniach zidentyfikowano poszczególne białka lub sieci komórkowe zaangażowane w infekcję wirusem grypy8, znaczenie funkcjonalne większości tych oddziaływań pozostaje niejasne. Biorąc pod uwagę absolutną zależność syntezy RNA wirusa grypy od funkcji opartych na chromatynie oraz złożoną naturę biofizyczną i biochemiczną jądra komórkowego9, niezbędne będą nowe techniki w celu wyjaśnienia tych funkcji. Przedstawione tutaj frakcjonowanie subnuklearne, w połączeniu z oczyszczan...

<table><tbody><tr><td>DMEM z wysoką zawartością glukozy</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina inhibitorów proteaz G</td><td>Elektroforeza SERVA</td><td>39101</td><td></td></tr><tr><td>Nukleaza Benzonase</td><td>Novagen, EMD Millipore</td><td>71206</td><td>25 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>DNaza I, wolna od RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>EN0523</td><td>50 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>homogenizator Dounce'a</td><td>Wheaton</td><td>432-1271</td><td>Typ zastosowania &quot;B&quot; tłuczek</td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1201-025</td><td>Można również zastosować format kolumny z 50% zawiesiną</td></tr><tr><td>Desthiobiotyna</td><td>IBA GmbH</td><td>2-1000-002</td><td></td></tr></tbody></table>

oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Podobnie jak wszystkie wirusy RNA o ujemnej polarności nici, genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których jednoniciowy genom jest enkapsydowany przez nukleoproteinę (NP) i powiązany z trymerycznym kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Jednak w przeciwieństwie do większości wirusów RNA, wirusy grypy przeprowadzają syntezę wirusowego RNA w jądrach zakażonych komórek. Co ciekawe, synteza wirusowego mRNA wykorzystuje komórkowe pre-mRNA jako primery i zasugerowano, że proces ten zachodzi na chromatynie1. Scharakteryzowano również oddziaływania między polimerazą wirusową a komórkową polimerazą RNA II, a także między NP a komórkowymi nukleosomami1,2.
Niedawno opisano generowanie rekombinowanych wirusów grypy kodujących One-Strep-Tag genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB2 polimerazy wirusowej (rWSN-PB2-Strep3). Rekombinowane wirusy te umożliwiają oczyszczanie kompleksów zawierających PB2, w tym vRNP, z zainfekowanych komórek. Aby uzyskać oczyszczone vRNP, infekuje się kultury komórkowe, a następnie vRNP są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa z lizatów otrzymanych z tych komórek. Jednakże procedury lizy stosowane do tej pory opierały się na jednostopniowej lizie detergentowej, która, mimo obecności ogólnej nukleazy, często mało efektywnie ekstrahuje materiał związany z chromatyną.
Nasze wstępne badania sugerowały, że znaczna część jądrowych vRNP nie została wyekstrahowana podczas tradycyjnej lizy komórek, a w konsekwencji nie mogła zostać poddana oczyszczaniu powinowactwem. Aby zwiększyć wydajność tej ekstrakcji oraz oddzielić jądrowe vRNP związane z chromatyną od tych niezwiązanych, dostosowaliśmy protokół stopniowej ekstrakcji subkomórkowej do komórek zakażonych wirusem grypy. W skrócie, procedura ta najpierw oddziela jądra od komórek, a następnie ekstrahuje rozpuszczalne białka jądrowe (tutaj określone jako frakcja „nukleoplazmatyczna”). Pozostały nierozpuszczalny materiał jądrowy jest następnie trawiony Benzonazą, nieswoistą nukleazą DNA/RNA, po czym następują dwa etapy ekstrakcji solnej: najpierw z użyciem 150 mM NaCl (określone jako „ch150”), a następnie 500 mM NaCl („ch500”) (Rys. 1). Etapy ekstrakcji solnej wybrano na podstawie naszej obserwacji, że 500 mM NaCl było wystarczające do solubilizacji ponad 85% jądrowych vRNP, a jednocześnie pozwalało na wiązanie znakowanych vRNP z macierzą powinowactwa.
Po frakcjonowaniu subkomórkowym zainfekowanych komórek możliwe jest oczyszczenie za pomocą powinowactwa vRNP znakowanych PB2 z każdej poszczególnej frakcji oraz analiza ich komponentów białkowych i RNA odpowiednio za pomocą Western Blot i metody przedłużania starterów. Niedawno wykorzystaliśmy tę metodę, aby odkryć, że kompleksy eksportowe vRNP tworzą się w późnych punktach po infekcji w frakcji chromatyny ekstrahowanej za pomocą 500 mM NaCl (ch500)3.

Wirusy grypy replikują swój genom RNA w powiązaniu z chromatyną komórki gospodarza. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę oczyszczania nienaruszonych kompleksów wirusowych rybonukleoprotein z chromatyny zainfekowanych komórek. Oczyszczone kompleksy wirusowe można analizować zarówno za pomocą techniki Western blot, jak i metody przedłużania starterów w celu oceny zawartości białek i RNA.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Podobnie jak w przypadku wszystkich wirusów RNA o nici ujemnej, genom wirusów grypy jest zapakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych (vRNP), w których...

Wirusy RNA o ujemnej polarności nici. Genom wirusów grypy jest pakowany w formie wirusowych kompleksów rybonukleoproteinowych, lub VRNP, w których jednoniciowy genom jest otoczony białkiem nukleowym i związany z kompleksem polimerazy składającym się z podjednostek PA, PB1 i PB2. Aby oczyścić nienaruszone kompleksy z zainfekowanych komórek ssaków, komórki HeLa inkubuje się z rekombinowanym wirusem grypy z tagiem strept.Po wniknięciu wirusa do komórek i syntezie wirusowego RNA w jądrach po infekcji, komórki poddaje się lizie z użyciem detergentu, a następnie frakcjonuje na frakcje cytoplazmatyczną, jądrową i chromatynową, wykorzystując wirowanie oraz protokół frakcjonowania chromatyny oparty na soli. Na koniec białka VRP z tagiem strept są oczyszczane metodą powinowactwa z każdej frakcji. Analiza składu białkowego i RNA oczyszczonych vRNPs za pomocą barwienia srebrem wykazuje, że stosując ten protokół, można wyizolować nawet silnie związane z chromatyną VRP w stanie nienaruszonym. Zatem jedną z głównych zalet naszego protokołu w porównaniu do standardowych metod powinowactwa do oczyszczania kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy jest możliwość oczyszczenia vRNPs z chromatyny zainf

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Uzyskanie czystych kompleksów ribonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Odzyskiwanie wirusów grypy typu A z plazmidowego DNA jest podstawową i niezbędną techniką eksperymentalną, która pozwala badaczom grypy na generowanie wirusów rekombinowanych w celu badania wielu aspektów biologii wirusa grypy, a także do wykorzystania ich jako potencjalnych wektorów lub szczepionek.

Generowanie rekombinowanego wirusa grypy z plazmidowego DNA

W niniejszym artykule przedstawiono prosty ilościowy test wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej. Jest to niezawodna technika oparta na oddziaływaniu między kulkami magnetycznymi a białkami z markerem (np. nanociałami) z jednej strony oraz na powinowactwie między białkiem z markerem a drugim, znakowanym białkiem (np. poliovirus) z drugiej strony.

Analiza wychwytu powinowactwa w fazie ciekłej z użyciem kulek magnetycznych do badania oddziaływań białko-białko: przykład poliwirusa i nanoprzeciwciała

Oczyszczanie integrazu wirusowego za pomocą chromatografii powinowactwa

Źródło: Gao, Y., et al. Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus. J. Vis. Exp. (2021)Film prezentuje montaż in vitro swoistych dla wirusa nukleokapsydów z oczyszczonego kompleksu nukleoproteiny i fosfoproteiny pozbawionego RNA, ich oczyszczanie za pomocą chromatografii wykluczania molekularnego oraz walidację pełnowymiarowego wirusowego RNA wewnątrz zmontowanych cząsteczek.

Rekonstytucja in vitro i oczyszczanie wirusowych cząstek przypominających nukleokapsyd

Ten protokół opisuje procedurę generowania i oczyszczania dzikich i zmutowanych wersji ludzkiego kompleksu przebudowującego chromatynę INO80. Oznakowane epitopami wersje podjednostek INO80 ulegają stabilnej ekspresji w komórkach HEK293, a kompletne kompleksy i kompleksy pozbawione określonych zestawów podjednostek są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa immunologicznego.

Wytwarzanie i oczyszczanie ludzkich kompleksów i podkompleksów remodelujących chromatynę INO80

Ten protokół koimmunoprecypitacji pozwala badać interakcję między nukleoproteiną wirusa grypy A a przeciwwirusowym białkiem Mx1 w komórkach ludzkich. W protokole podkreślono znaczenie N-etylomaleimidu dla skutecznego koimmunoprecypitacji nukleoproteiny Mx1 i wirusa grypy A.

Koimmunoprecypitacja mysiego białka Mx1 z nukleoproteiną wirusa grypy A

Oferujemy nowatorską strategię izolowania przedziałów replikacyjnych wirusa (RC) od komórek ludzkich zakażonych adenowirusem (Ad). Podejście to reprezentuje system bezkomórkowy, który może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych regulujących replikację i ekspresję genomu wirusa, a także regulację interakcji wirus-gospodarz ustalonych w RC.

Izolacja frakcji subjądrowych wzbogaconych w przedziały replikacji wirusa z normalnych komórek ludzkich zakażonych adenowirusem

Korzystając z drukowanej strategii mikromacierzy glikanowej, konwencjonalny test na 96-dołkowej płytce został zminiaturyzowany do analizy awidności hemaglutyniny wirusa grypy A i swoistości dla receptorów zawierających kwas sjalowy.

Zminiaturyzowany test mikromacierzy glikanów do oceny awidności i swoistości hemaglutynin wirusa grypy A

Demontaż rdzeni wirusa grypy A podczas wnikania wirusa do komórek gospodarza jest procesem wieloetapowym. Opisujemy metodę in vitro do analizy wczesnych etapów odsłaniania się wirusa. W tym podejściu wirowanie w gradionym tempie służy do biochemicznej analizy etapów, które inicjują odwarstwianie w określonych warunkach.

In vitro Demontaż kapsydów wirusa grypy A przez wirowanie gradientowe

Ten manuskrypt opisuje podejście do izolacji wybranych pokrewnych RNP powstałych w komórkach eukariotycznych poprzez specyficzne wzbogacenie ukierunkowane na oligonukleotydy. Wykazujemy możliwość zastosowania tego podejścia poprzez wyizolowanie pokrewnego RNP związanego z retrowirusowym regionem 5' bez translacji, który składa się z helikazy DHX9 / RNA A.

Izolacja pokrewnych kompleksów RNA-białko z komórek za pomocą elucji kierowanej oligonukleotydami

Poznaj metodę oczyszczania kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek HeLa. Protokół umożliwia analizę składu białkowego i RNA tych struktur.

Oczyszczanie powinowactwem kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Przeglądaj więcej filmów