Oczyszczanie powinowactwa kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z chromatyny zakażonych komórek

Nić Lyco ujemna, wirusy RNA. Genom wirusów grypy jest upakowany w postaci kompleksów białkowych jądrowych żeber wirusa lub NPS VR, w których jednoniciowy genom jest otoczony białkiem jądrowym i związany z kompleksem polimerazy kurkumy składającym się z jednej i dwóch podjednostek PB PA w celu oczyszczenia nienaruszonych kompleksów z zakażonych komórek ssaków. Komórki Hela są inkubowane z rekombinowanym wirusem grypy znakowanym streptem.

Gdy wirus dostanie się do komórek, wirusowe RNA jest syntetyzowane w jądrach po zakażeniu, komórki są okłamywane za pomocą detergentu i frakcjonowane na cytoplazmatyczne frakcje jądrowe i chromatynę przy użyciu protokołu frakcji chromatyny opartej na wirowaniu i ataku. Wreszcie, VRP znakowane streptem są oczyszczane z powinowactwa z każdej frakcji analiza składu białka i RNA oczyszczonego VR NPS przez barwienie srebrem pokazuje, że przy użyciu tego protokołu nawet ściślej można wyizolować VRP związane z chromatyną. Nienaruszony. Tak więc jedną z głównych zalet naszego protokołu w porównaniu ze standardowymi metodami oczyszczania kompleksów białkowych żeber wirusa grypy jest to, że przy użyciu naszej metody możliwe jest oczyszczenie VR NPS z chromatyny zakażonych komórek, o której wiadomo, że jest miejscem syntezy mRNA wirusa grypy.

Tak więc nasza metoda może być wykorzystana do odpowiedzi na pytania dotyczące regulacji replikacji i transkrypcji wirusa, takie jak na przykład, jakie czynniki wirusowe lub komórkowe, ale także jakie modyfikacje potranslacyjne są wymagane, na przykład do syntezy mRNA wirusa lub syntezy genomowego RNA wirusa. Tak więc naukowcy nowi w tej metodzie mogą napotkać pewne trudności, ponieważ frakcjonowanie subjądrowe jest bardzo wrażliwe na warunki biochemiczne i może się również znacznie różnić między różnymi liniami komórkowymi. Rozpocznij ten protokół od uzdrowienia naszych komórek, które zostały zakażone wirusem grypy, RWSN PB two strep, który ma znacznik paciorkowca genetycznie połączony z końcem C podjednostki PB dwa przy wielokrotności infekcji trzech.

Umyj komórki raz zimnym PBS, a następnie dodaj 12 mililitrów zimnego PBS i wyjmij je z naczynia. Za pomocą gumowego skrobaka. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i osadź je przez odwirowanie.

Najtrudniejszym aspektem tej procedury jest protokół frakcjonowania komórek. Jądra komórkowe są bardzo wrażliwe na procedury homogenizacji i mieszania, a jeśli zostaną wykonane nieprawidłowo, mogą łatwo zniszczyć ekstrakt z chromatyny. Dlatego bardzo ważne jest, aby przestrzegać nie tylko technik homogenizacji, ale także ogólnego obchodzenia się z lizatami, jak pokazujemy tutaj.

Po spirycie wirowym, PBS i Resus zawieszają osad komórkowy w 10 mililitrach zimnego buforu sacharozy. Przymocuj końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do 10-mililitrowej plastikowej pipety do surowicy i przepuść przez nią komórki, aby rozbić grudki komórek. Inkubować zawiesinę na lodzie przez 10 minut.

Okresowe delikatne odwracanie komórek w celu ich ponownego zawieszenia. Następnie dodać inny niż IET P 40 do końcowego stężenia 0,5% i wirować z dużą prędkością przez 15 sekund, natychmiast odwirować przez 10 minut w temperaturze 3 500 razy G w czterech stopniach Celsjusza w wirówce stołowej. Po wirowaniu usuń supinat i przenieś go do 15 mililitrów do stożkowej rurki.

Przechowywać supinat w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Jest to frakcja cytoplazmatyczna. Osad powinien być mniejszy i bielszy niż oryginalny osad komórkowy, jak pokazano tutaj.

Jeśli protokół zostanie zakończony w późniejszym czasie, przechowuj osad z ogniw w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W przeciwnym razie kontynuuj, myjąc osad w pięciu mililitrach zimnej sacharozy, buforując i odwirowując jak poprzednio. Po zakończeniu wirowania odrzuć supinat i ponownie zawieś osad, który zawiera jądra w 1,5 mililitra zimnego buforu do ekstrakcji plazmowej z zimnymi jądrami.

Przenieś zawieszony osad do schłodzonego, całkowicie szklanego, czteromililitrowego homogenizatora tanecznego za pomocą ciasno dopasowanego tłuczka i homogenizuj jądra za pomocą 20 uderzeń. Unikając pienienia, opór powinien wzrosnąć po około 10 pociągnięciach. Aby potwierdzić skuteczną homogenizację, zbadaj próbkę pod mikroskopem z kontrastem fazowym.

Jądra nie powinny być już okrągłe, ale mają nieregularne kształty i wyglądają, jakby pękły. Po homogenizacji jąder przenieś je do 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Inkubować homogenat na obracającym się kole w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie odwirować w temperaturze 16 000 razy G w mikrowirówce przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu przenieś supinat, który jest jądrową frakcją plazmową, do 1,5 mililitrowej probówki i przechowuj ją w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie Reese zawiesił osad w 1,5 mililitra trawienia, buforując wstępnie rozgrzany do 37 stopni Celsjusza.

Następnie inkubuj frakcję przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodaj 42 mikrolitry pięciomolowego chlorku sodu, aby doprowadzić końcowe stężenie chlorku sodu do 150 milimolowych, a następnie inkubować przez 20 minut na lodzie. Odwirować 16 000 razy, G w mikrowirówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po odwirowaniu usuń supinat i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. To jest frakcja CH one 50. Reeses zgina granulat w 1,5 mililitra zimnego buforu o wysokiej zawartości soli i inkubuje przez 20 minut na lodzie.

Odwirować 16 000 razy, G w mikrowirówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 10 minut. Po odwirowaniu wyjmij natynt sup i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza. To jest frakcja CH 500.

Wyjmij frakcje zapisane podczas protokołu frakcjonowania i umieść je na lodzie. Następnie do frakcji cytoplazmatycznej dodaj 300 mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu. Następnie przenieś 100 mikrolitrów upakowanego paciorkowca T w kulkach Sphero na frakcję do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodaj 10 objętości buforu do płukania paciorkowca do kulek. Odwróć probówkę, aby wymieszać i odwirować przez pięć minut po 1000 razy. G w wirówce stołowej wyrzuć SNA.

Powtórz płukanie buforem dwukrotnie, a następnie Reese zgnij granulkę w równej objętości bufora do płukania paciorkowców, dodaj 200 mikrolitrów umytych paciorkowców Działaj w zawiesinie kulek do każdej frakcji. Obracaj probówki przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować probówki przez jedną minutę w temperaturze 1000 razy G w czterech stopniach Celsjusza, wyrzucić supinat.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu do płukania do kulek dla kulek inkubowanych z frakcją cytoplazmatyczną w 15-mililitrowej probówce. Dodaj bufor do płukania i przenieś kulki do 1,5 mililitrowej tuby. Myj kulki przez jedną minutę, a następnie odwiruj probówki przez jedną minutę w temperaturze 1000 razy G w czterech stopniach Celsjusza.

Powtórz dwa razy po ostatnim etapie prania. Usuń wszelkie ślady buforu płuczącego za pomocą płaskiej końcówki pipety. Następnie dodaj 100 mikrolitrów buforu elucjańskiego, delikatnie wymieszaj i umieść probówki na lodzie na 15 minut.

Podczas inkubacji od czasu do czasu mieszaj kulki, delikatnie stukając w spód probówek. Po upływie 15 minut wirówka wybiera przez jedną minutę w temperaturze 1000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Zbierz Sennę zawierającą eluowane VRP oznaczone paciorkowcami.

On, nasze komórki były zakażone szczepem wirusa grypy, WSN przez dziewięć godzin, a frakcjonowane lizaty były analizowane przez zachodnie kwitnienie, jak pokazano tutaj. Delikatna izolacja jądrowa skutecznie ekstrahuje białka cytoplazmatyczne, takie jak tubulina, unikając jednocześnie uwalniania obfitych białek jądrowych. Należy pamiętać, że frakcja chromatyny ekstrahowana niską solą jest wzbogacona w białka ważne dla transkrypcji.

Podczas gdy frakcja o wysokiej zawartości soli zawiera głównie nukleosomy w celu określenia składu białkowego eluowanej frakcji cytoplazmatycznej, V NPS z komórek R zakażonych przez dziewięć godzin nieoznakowanym wirusem, RWSN lub RWSN PB dwa paciorkowców analizowano przez barwienie srebrem, jak pokazano dla eluatu cytoplazmatycznego. Tutaj występuje wysoki stosunek NP do PA PB jeden, PB dwa, o czym świadczy główne pasmo powyżej 55 kilodaltonów w porównaniu z pasmami od 95 do 100 kilodaltonów, co sugeruje, że większość paciorkowca PB dwa jest oczyszczana jako część w pełni uformowanego VRNP lub innymi słowy, wychwytywana jest niewielka rozpuszczalna polimeraza w celu porównania względnej wydajności. VR NPS oczyszczony po dziewięciu godzinach infekcji RWSN PB dwa paciorkowca lub RWSN lub srebro barwione, jak pokazano na tym żelu do barwienia srebra v RMP, można oczyścić ze wszystkich czterech frakcji komórkowych po dziewięciu godzinach od infekcji.

Najwyższe stężenie v RMP znajduje się w plazmie jądrowej, chociaż spore porcje można również oczyścić z cytoplazmy i chromatyny. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić wysokie plony nienaruszonych kompleksów rybonukleoproteinowych wirusa grypy z jądra zainfekowanych komórek. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o użyciu czystych i unikaniu niepotrzebnego wystawiania próbek na działanie temperatury pokojowej, ponieważ w ten sposób można uniknąć degradacji zarówno RNA, jak i białka, a także uniknąć rozkładu kompleksu białkowego.

I nie zapominaj, że praca z zakaźnym wirusem grypy może być niebezpieczna. Wszystkie kroki powinny być wykonywane na stole warsztatowym drugiego poziomu bezpieczeństwa biologicznego, aż do momentu dodania NP 40 do lizatów.