Name: Dwie metody powstawania heterokarionów w celu odkrycia czynników restrykcyjnych HCV (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 49 s
Description: Poznaj dwie metody tworzenia heterokarionów do badania czynników restrykcyjnych wirusa zapalenia wątroby typu C. Techniki te umożliwiają skuteczne przesiewanie linii komórkowych pod kątem ekspresji dominujących czynników hamujących produkcję zakaźnych cząstek HCV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Takaji Wakicie oraz Jensowi Bukhowi odpowiednio za izolaty JFH1 i J6CF. Ponadto dziękujemy Charlesowi Rice’owi za komórki Huh-7.5 i przeciwciało 9E10, Stevenowi Foungowi za przeciwciało CBH-23 specyficzne dla E2 oraz wszystkim członkom Department of Experimental Virology, Twincore za pomocne sugestie i dyskusje.

<ol><li>Zhu, Q., Guo, J. T., Seeger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+hepatitis+C+virus+subgenomes+in+nonhepatic+epithelial+and+mouse+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of hepatitis C virus subgenomes in nonhepatic epithelial and mouse hepatoma cells.</a> J. Virol. 77, 9204-9210 (2003).</li>
<li>Kato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhepatic+cell+lines+HeLa+and+293+support+efficient+replication+of+the+hepatitis+C+virus+genotype+2a+subgenomic+replicon%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Nonhepatic cell lines HeLa and 293 support efficient replication of the hepatitis C virus genotype 2a subgenomic replicon.</a> J. Virol. 79, 592-596 (2005).</li>
<li>Ali, S., Pellerin, C., Lamarre, D., Kukolj, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+subgenomic+replicons+in+the+human+embryonic+kidney+293+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus subgenomic replicons in the human embryonic kidney 293 cell line.</a> J. Virol. 78, 491-501 (2004).</li>
<li>Date, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+2a+hepatitis+C+virus+subgenomic+replicon+can+replicate+in+HepG2+and+IMY-N9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon can replicate in HepG2 and IMY-N9 cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 22371-22376 (2004).</li>
<li>Chang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+hepatitis+C+virus+%28HCV%29+RNA+in+mouse+embryonic+fibroblasts%3A+protein+kinase+R+%28PKR%29-dependent+and+PKR-independent+mechanisms+for+controlling+HCV+RNA+replication+and+mediating+interferon+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of hepatitis C virus (HCV) RNA in mouse embryonic fibroblasts: protein kinase R (PKR)-dependent and PKR-independent mechanisms for controlling HCV RNA replication and mediating interferon activities.</a> J. Virol. 80, 7364-7374 (2006).</li>
<li>Zhong, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 9294-9299 (2005).</li>
<li>Lindenbach, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309, 623-626 (2005).</li>
<li>Wakita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat. Med. 11, 791-796 (2005).</li>
<li>Witteveldt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD81+is+dispensable+for+hepatitis+C+virus+cell-to-cell+transmission+in+hepatoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD81 is dispensable for hepatitis C virus cell-to-cell transmission in hepatoma cells.</a> J. Gen. Virol. 90, 48-58 (2009).</li>
<li>Bitzegeio, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+hepatitis+C+virus+to+mouse+CD81+permits+infection+of+mouse+cells+in+the+absence+of+human+entry+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Adaptation of hepatitis C virus to mouse CD81 permits infection of mouse cells in the absence of human entry factors.</a> PLoS Pathog. 6, e1000978(2010).</li>
<li>Lindemann, D., Goepfert, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+foamy+virus+envelope+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Microbiol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The foamy virus envelope glycoproteins.</a> Curr Top Microbiol Immunol. 277, 111-129 (2003).</li>
<li>Brohm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+determinants+important+for+hepatitis+C+virus+p7+function+in+morphogenesis+by+using+trans-complementation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of determinants important for hepatitis C virus p7 function in morphogenesis by using trans-complementation.</a> J. Virol. 83, 11682-11693 (2009).</li>
<li>Steinmann, E., Brohm, C., Kallis, S., Bartenschlager, R., Pietschmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+trans-encapsidation+of+hepatitis+C+virus+RNAs+into+infectious+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient trans-encapsidation of hepatitis C virus RNAs into infectious virus-like particles.</a> J. Virol. 82, 7034-7046 (2008).</li>
<li>Koutsoudakis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+early+steps+of+hepatitis+C+virus+infection+by+using+luciferase+reporter+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the early steps of hepatitis C virus infection by using luciferase reporter viruses.</a> J. Virol. 80, 5308-5320 (2006).</li>
<li>Frentzen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Completion+of+hepatitis+C+virus+replication+cycle+in+heterokaryons+excludes+dominant+restrictions+in+human+non-liver+and+mouse+liver+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Completion of hepatitis C virus replication cycle in heterokaryons excludes dominant restrictions in human non-liver and mouse liver cell lines.</a> PLoS Pathog. 7, e1002029(2011).</li>
<li>Lindemann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+particle-associated+glycoprotein+signal+peptide+essential+for+virus+maturation+and+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">A particle-associated glycoprotein signal peptide essential for virus maturation and infectivity.</a> J. Virol. 75, 5762-5771 (2001).</li>
<li>Blight, K. J., McKeating, J. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+permissive+cell+lines+for+subgenomic+and+genomic+hepatitis+C+virus+RNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus RNA replication.</a> J. Virol. 76, 13001-13014 (2002).</li>
</ol>

TP otrzymał honoraria za usługi konsultingowe od firmy Biotest.

Przedstawiamy dwie metody indukcji tworzenia heterokaryonów w hodowlach komórkowych w celu analizy dominantnich ograniczeń negatywnych, które uniemożliwiają replikację HCV. Wykorzystując te procedury, wykluczyliśmy obecność dominantniego czynnika konstytutywnie ekspresowanego lub indukowanego przez wirusa w różnych ludzkich liniach komórkowych poza wątrobą oraz w mysich liniach komórkowych wątroby. Pierwszy test służy przede wszystkim do analizy, czy czynniki restrykcyjne zapobiegają składaniu HCV i uwalnianiu zakaźnego ...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>PAA, C&amp;#246;lbe, Niemcy</td><td>A15151</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-E2 (CBH23)</td><td>uprzejmie udostępnione przez Stevena Founga &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>A2833-106</td><td></td></tr><tr><td>Glutation</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>G4251-1G</td><td></td></tr><tr><td>Blastycydyna</td><td>Invivo Gen, San Diego, USA</td><td>Ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>G418 (genetycyna)</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>11811-064</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy-1500</td><td>Roche, Mannheim, Niemcy</td><td>10783641001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>G9023-5mL</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-NS5A (9E10)</td><td>uprzejmie udostępnione przez Charlesa Rice'a &lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6'-diamidino-2-fenyloindolu dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 546 - kozi anty-ludzki IgG</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>A21089</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 488 - kozi anty-mysi IgG</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>A10680</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CMTMR</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker CMFDA</td><td>Invitrogen, Karlsruhe, Niemcy</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount</td><td>Sigma, Steinheim, Niemcy</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Wszystkie pozostałe odczynniki chemiczne</td><td>Roth, Karlsruhe, Niemcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materiały do hodowli komórkowej</td><td>Sarstedt, N&amp;#252;mbrecht, Niemcy</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych hcv

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest wirusem hepatotropowym, którego zakres gospodarzy ogranicza się do ludzi i szympansów. Chociaż obserwowano replikację RNA HCV w ludzkich liniach komórkowych pozahepatycznych oraz w mysich liniach komórkowych, wydajność ta była bardzo niska i wymagała długotrwałych procedur selekcyjnych z wykorzystaniem konstruktów replikonów HCV wykazujących dominujące markery selekcyjne z antybiotykami1-5. Badania HCV in vitro są zatem ograniczone do ludzkich linii komórkowych raka wątroby, które są podatne na wniknięcie wirusa i dopełnienie cyklu życiowego wirusa. Ze względu na wąski tropizm gatunkowy HCV, nie istnieje dostępny immunokompetentny model małego zwierzęcia, który utrzymywałby pełny cykl replikacji HCV 6-8. Nieefektywna replikacja HCV w komórkach niehumanoidalnych, np. pochodzenia mysiego, wynika prawdopodobnie z niezgodności genetycznej niezbędnych czynników zależnych od gospodarza i/lub ekspresji czynników restrykcyjnych.
Zbadaliśmy, czy propagacja HCV jest tłumiona przez dominujące czynniki restrykcyjne w liniach komórkowych człowieka pochodzących z tkanek pozawątrobowych lub w liniach komórkowych wątroby mysiej. W tym celu opracowaliśmy dwie niezależne, warunkowe metody trans-komplementacji opierające się na fuzji komórek somatycznych. W obu przypadkach ukończenie cyklu replikacyjnego wirusa jest możliwe wyłącznie w heterokaryonach. W konsekwencji pomyślna trans-komplementacja, stwierdzana poprzez pomiar produkcji nowego, zakaźnego potomstwa wirusowego de novo, wskazuje na brak dominujących restrykcji.
W szczególności subgenomowe replikony HCV zawierające transgen lucyferazy zostały transfektowane do wysoce permisywnych ludzkich komórek hepatomy (komórki Huh-7.5). Następnie komórki te były hodowane wspólnie i fuzjonowane z różnymi komórkami ludzkimi i mysimi wykazującymi ekspresję białek strukturalnych HCV: rdzenia (core), białek otoczki 1 i 2 (E1, E2) oraz białek akcesoryjnych p7 i NS2. Po zainicjowaniu fuzji komórkowej poprzez zastosowanie glikolu polietylenowego (PEG), hodowla uwalniała infekcyjne cząstki wirusa, które infekowały komórki naiwne w sposób zależny od receptorów.
Aby ocenić wpływ dominujących restrykcji na pełny cykl życiowy wirusa, obejmujący wniknięcie do komórki, translację RNA, replikację oraz składanie wirusa, wykorzystaliśmy linię komórek wątroby człowieka (komórki Huh-7 Lunet N 9), w której brakuje endogennej ekspresji CD81, niezbędnego czynnika wniknięcia HCV. W przypadku braku ektopowej ekspresji CD81 komórki te są w zasadzie oporne na zakażenie HCV 10. Co istotne, po wspólnej hodowli i fuzji z komórkami wykazującymi ekspresję ludzkiego CD81, ale pozbawionymi co najmniej jednego innego kluczowego czynnika wniknięcia do komórki (np. SR-BI, CLDN1, OCLN), tylko powstałe heterokariony wykazują pełny zestaw czynników wniknięcia HCV niezbędnych do infekcji. Zatem, aby przeanalizować, czy dominujące czynniki restrykcyjne hamują zakończenie cyklu replikacyjnego HCV, przeprowadziliśmy fuzję komórek Lunet N z różnymi komórkami pochodzenia ludzkiego i mysiego, które spełniały wyżej wymienione kryteria. Gdy komórki w wspólnej hodowli przetransfekowano wysoce fuzogennym mutantem białka otoczki wirusowej prototypowego wirusa pienistego (PFV11), a następnie poddano je działaniu zakaźnych cząsteczek HCV (HCVcc), zaobserwowano produkcję zakaźnego wirusa de novo. Wskazuje to, że HCV pomyślnie ukończyło swój cykl replikacyjny w heterokaryonach, co wyklucza ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych w tych liniach komórkowych. Te nowe warunkowe metody trans-komplementacji będą przydatne do przesiewowej analizy szerokiego panelu linii komórkowych i komórek pierwotnych pod kątem ekspresji specyficznych dla HCV dominujących czynników restrykcyjnych.

Opisujemy dwie metody warunkowej komplementacji trans w procesie składania wirusa zapalenia wątroby C (HCV) i dopełnienia pełnego cyklu życiowego wirusa, które opierają się na tworzeniu heterokaryonów. Techniki te są odpowiednie do przesiewania linii komórkowych wykazujących ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych, które uniemożliwiają produkcję zakaźnego potomstwa HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest wirusem hepatotropowym o zakresie gospodarzy ograniczonym do ludzi i szympansów. Chociaż obserwowano replikację RNA HCV w...

Celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu czynników restrykcyjnych na ukończenie cyklu replikacyjnego wirusa zapalenia wątroby C w dowolnej linii komórkowej, z wykorzystaniem dwóch metod opierających się na tworzeniu hybryd. W pierwszej metodzie należy rozpocząć od hodowli ludzkich komórek wątroby, a także komórek pakujących heal A i Hep 56 1D. Następnie, za pomocą elektroporacji, należy wprowadzić RNA wirusa zapalenia wątroby C (HCV RNA) do komórek wątroby. W drugiej metodzie fuzji należy w dalszej kolejności połączyć linię komórek replikujących HCV z odpowiednią linią komórek pakujących przy użyciu glikolu polietylenowego. Pierwszym krokiem jest przygotowanie zapasu HCV o wysokim mianie.Następnie różne linie komórkowe poddaje się kokulturze, a fuzję komórek indukuje poprzez transfekcję glikoproteiny prototypowego wirusa pienistego. W kolejnym kroku heterokarionu zakaża się HCV. Po zastosowaniu każdej z metod tworzenia heterokarionów wykonuje się mikroskopię fluorescencyjną w celu potwierdzenia fuzji, a następnie przeprowadza się ilościowe oznaczenie produkcji cząsteczek zakaźnych.Główną zaletą tej techniki jest jej użyteczność w przesiewaniu szerokiego panelu linii komórkow

two-methods-heterokaryon-formation-to-discover-hcv-restriction

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Dwie metody tworzenia heterokarionu w celu odkrycia czynników restrykcyjnych HCV

Opisano elastyczną i wydajną metodę charakteryzacji specyficznej dla typu komórek lokalizacji białek oraz ich transportu nukleocytoplazmatycznego. To podejście z wykorzystaniem heterokaryonów wykorzystuje fluorescencyjnie znakowane białka fuzyjne do obrazowania lokalizacji białek po fuzji komórek. Protokół ten można zastosować do określania lokalizacji w stanie stacjonarnym lub do bardziej dynamicznych analiz w oparciu o obrazowanie żywych komórek.

Technika heterokarionu do analizy lokalizacji specyficznej dla typu komórek

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

Wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) jest głównym ludzkim patogenem, który powoduje choroby wątroby, w tym marskość wątroby i raka. System hodowli komórek zakaźnych HCV jest niezbędny do zrozumienia molekularnego mechanizmu replikacji HCV i opracowania nowych podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy protokół badania różnych etapów cyklu replikacji HCV.

Protokół analizy replikacji wirusa zapalenia wątroby typu C

Patogeneza HIV-1 jest definiowana zarówno przez cechy wirusa, jak i czynniki genetyczne gospodarza. W tym miejscu opisujemy solidną metodę, która pozwala na powtarzalne pomiary w celu oceny wpływu zmienności sekwencji genu gag na zdolność replikacji wirusa in vitro.

Metoda klonowania oparta na enzymach restrykcyjnych w celu oceny zdolności replikacji in vitro chimerycznych wirusów HIV-1 podtypu C Gag-MJ4

Tutaj opisujemy nowo opracowany system zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) do monitorowania wczesnych etapów cyklu życia wirusa HBV. Ten uproszczony system in vitro pomoże w badaniach przesiewowych środków anty-HBV przy użyciu strategii wysokoprzepustowej.

Opracowanie systemu zgłaszania wirusa zapalenia wątroby typu B w celu monitorowania wczesnych etapów cyklu replikacji

Kropelki lipidów są ważnymi organellami do replikacji kilku patogenów, w tym wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV). Opisujemy metodę izolowania kropelek lipidów do ilościowej spektrometrii mas powiązanych białek; Może być stosowany w różnych warunkach, takich jak infekcja wirusowa, stres środowiskowy lub leczenie farmakologiczne.

Izolacja kropelek lipidów do ilościowej analizy spektrometrii mas

Opisujemy tutaj generowanie in vitro DNA HBV za pomocą systemu infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B i bardzo czułe wykrywanie jego (1-2 kopii) integracji za pomocą odwrotnego zagnieżdżonego PCR.

Wykrywanie zintegrowanego wirusowego DNA o niskiej liczbie kopii utworzonego w wyniku zakażenia in vitro wirusowym zapaleniem wątroby typu B

Tutaj prezentujemy metodę badania przesiewowego czynników przeciwwirusowych zapalenia wątroby typu B, które hamują interakcję HBx-DDB1 za pomocą systemu testów z podziałem lucyferazy. System ten pozwala na łatwe wykrywanie oddziaływań białko-białko i nadaje się do identyfikacji inhibitorów takich interakcji.

Identyfikacja inhibitorów interakcji HBx-DDB1 przy użyciu systemu testów z podziałem lucyferazy

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół infekcji wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV) w nowych zmodyfikowanych komórkach 293T (293T-NE-3NRs, wyrażających ludzkie NTCP, HNF4α, RXRα i PPARα) oraz tradycyjnych komórkach wątroby (HepG2-NE, wyrażających ludzkie NTCP).

Modelowanie zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B w niewątrobowych komórkach 293T-NE-3NRs

Protokół opisuje metodę wprowadzania kontrolowanej różnorodności genetycznej w genomie wirusa zapalenia wątroby typu C poprzez połączenie pełnej długości syntezy zmutowanego RNA za pomocą podatnego na błędy PCR i genetyki odwrotnej. Metoda ta stanowi model selekcji fenotypu i może być stosowana do 10 kb długich genomów wirusa RNA o dodatnim sensie.

Genetyka odwrotna w celu inżynierii wariantów wirusa RNA o pozytywnym wyczuwaniu

Prezentujemy protokół do badania związków wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) ukierunkowanych na etapy cyklu życia przed i po wejściu wirusa, używając izotermicznej kalorymetrii miareczkowej do pomiaru powinowactwa wiązania (KD) z polipeptydem kotransportującym taurocholan sodu gospodarza. Skuteczność przeciwwirusową określono poprzez supresję markerów cyklu życia wirusa (tworzenie cccDNA, transkrypcja i składanie wirusa).

Kompetentny model hepatocytów badający wnikanie wirusa zapalenia wątroby typu B przez polipeptyd transportujący taurocholan sodu jako cel terapeutyczny

Poznaj dwie metody tworzenia heterokarionów do badania czynników restrykcyjnych wirusa zapalenia wątroby typu C. Techniki te umożliwiają skuteczne przesiewanie linii komórkowych pod kątem ekspresji dominujących czynników hamujących produkcję zakaźnych cząstek HCV.

Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Przeglądaj więcej filmów