Dwie metody tworzenia heterokaryonów w celu wykrycia czynników restrykcyjnych HCV

Celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu czynników restrykcyjnych na ukończenie cyklu replikacyjnego wirusa zapalenia wątroby C w dowolnej linii komórkowej, z wykorzystaniem dwóch metod opierających się na tworzeniu hybryd. W pierwszej metodzie należy rozpocząć od hodowli ludzkich komórek wątroby, a także komórek pakujących heal A i Hep 56 1D. Następnie, za pomocą elektroporacji, należy wprowadzić RNA wirusa zapalenia wątroby C (HCV RNA) do komórek wątroby. W drugiej metodzie fuzji należy w dalszej kolejności połączyć linię komórek replikujących HCV z odpowiednią linią komórek pakujących przy użyciu glikolu polietylenowego. Pierwszym krokiem jest przygotowanie zapasu HCV o wysokim mianie.

Następnie różne linie komórkowe poddaje się kokulturze, a fuzję komórek indukuje poprzez transfekcję glikoproteiny prototypowego wirusa pienistego. W kolejnym kroku heterokarionu zakaża się HCV. Po zastosowaniu każdej z metod tworzenia heterokarionów wykonuje się mikroskopię fluorescencyjną w celu potwierdzenia fuzji, a następnie przeprowadza się ilościowe oznaczenie produkcji cząsteczek zakaźnych.

Główną zaletą tej techniki jest jej użyteczność w przesiewaniu szerokiego panelu linii komórkowych i komórek pierwotnych pod kątem ekspresji dominantnich czynników restrykcyjnych specyficznych dla HV. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące specyficzności gatunkowej i norm HCV. Wizualna demonstracja tej metody jest niezbędna, aby ułatwić zrozumienie podstawowych koncepcji dwóch systemów fuzji przed indukcją fuzji komórek za pomocą glikolu polietylenowego.

Komórki HUH 7.5 są transfekowane H-C-V-R-N-A zgodnie ze standardowymi protokołami i hodowane przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2; następnego dnia przeprowadza się zbiór. Zbierz transfekowane komórki HUH 7.5 zawierające replikon subgenomowy oraz komórki pakujące heal R i hep 56 1D. Komórki pakujące te zostały zmodyfikowane tak, aby ektopowo eksprimować białka HCV core, E1, E2, p7 oraz NS2. Po trypsynizacji resuspenduj komórki w pełnej pożywce DMEM i rozcieńcz zawiesiny komórkowe do następujących stężeń: komórki HUH 7.5 do 5×10⁵ komórek/mL oraz komórki heal i hep 56 1D do 2×10⁵ komórek/mL.

Następnie należy przygotować sześciodołkową płytkę hodowlaną, umieszczając w każdym dołku od dwóch do trzech sterylnych szkiełek nakrywkowych. W celu dalszej analizy wydajności fuzji, wymieszaj 1 mL transfektowanych komórek HUH 7.5 z 1 mL komórek pakujących i zasiać mieszaninę w jednym dołku płytki sześciodołkowej; inkubować przez 24 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 24 h należy sprawdzić gęstość komórek.

Gęstość komórek przed indukcją fuzji powinna wynosić od 60 do 80% konfluencji, aby komórki znajdowały się w bliskim sąsiedztwie, co umożliwi fuzję błon komórkowych. Odessać medium z hodowli współdzielonej i wypłukać raz 1 mL PBS. Następnie ostrożnie dodać 500 µL uprzednio ogrzanego 40% glikolu polietylenowego (PEG 1 500). Do innego dołka z hodowlą współdzieloną dodać 500 µL PBS w celu uzyskania kontroli. Inkubować przez 5 minut w 37 °C, aby wywołać tworzenie się heterokaryonów. Odessać PEG i ostrożnie dodać 2 mL PBS. Po jednej minucie odessać PBS i dodać 2 mL świeżego PBS. Płukać PBS-em od 3 do 5 razy przez jedną minutę na każde płukanie, aby usunąć nadmiar PEG.

Na koniec do każdej studni dodaj dwa mililitry pełnej pożywki DMEM i inkubuj w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Po 48 godzinach od fuzji zbierz każdy SNAT i przefiltruj przez filtr 0,45 µm. Po zebraniu kultury komórkowej SNAT można określić wydajność fuzji za pomocą immunofluorescencji; studnie zawierające szkiełka podstawowe przemyj raz jednym mililitrem PBS przez jedną minutę.

Utrwal komórki w 600 µL 3% paraldehydu w PBS przez 15 minut. Przemyj trzy razy PBS, po jednej minucie na każde płukanie. Po ostatnim płukaniu za pomocą pęsety ostrożnie przenieś szkiełka podstawowe do płytki 24-dołkowej i przeprowadź permeabilizację komórek w 500 µL 0,5% Triton X 100 w PBS przez pięć minut.

Następnie przemyj trzy razy PBS i nanieś 250 µL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do każdego dołka. Użyj przeciwciała anty NS5 w stężeniu 0,5 µg/mL oraz ludzkiego monoklonalnego przeciwciała anty E2 w stężeniu 6,4 ng/mL. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze pokojowej, a po 45 minutach przemyj trzy razy PBS.

Następnie do każdej studzienki dodaje się 250 µL przeciwciał wtórnych; stosuje się przeciwciała kozie anty-mysie lub kozie anty-ludzkie swoiste dla IgG, sprzężone z Alexa Fluor 546 lub Alexa Fluor 488, w stężeniu 2 µg/mL. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po 30 minutach wypłukać raz za pomocą PBS.

Następnie jądra komórkowe należy zabarwić 250 µL DPI rozcieńczonego w PBS w stosunku 1:3000. Inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej w ciemności, przemyć cztery razy PBS i raz wodą. Na koniec szkiełka podstawowe należy przykleić odwrócone do kropli medium Flora Mount na szkiełku przedmiotowym i pozostawić do wyschnięcia w ciemności.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy zebrać i przygotować zawiesiny pojedynczych komórek z następujących linii: linii komórek wątroby człowieka Luna NA pozbawionej endogennej ekspresji CD 81, komórek pakujących He r oraz komórek Hep 56 1D stabilnie eksponujących ludzkie CD 81. Należy przeprowadzić kokultywację komórek Luna n z komórkami he r w stosunku 1:1 oraz z komórkami Hep 56 1D HCD 81 w stosunku 1:2, aby uzyskać całkowitą gęstość komórek wynoszącą 1,5 × 10⁵ komórek na 12.

Inkubować w studzienkach przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Następnego dnia przeprowadzić przejściową transfekcję komórek wysoce genicznym białkiem otoczki PFE, używając lipofektaminy 2000 zgodnie z instrukcjami producenta. 30 godzin po transfekcji glikoproteiną PFE zaszczepić heterokarony 350 µL wcześniej przygotowanego zapasu wirusa przy MOI wynoszącym około 2,3.

Inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego ranka przemyć raz roztworem PBS i dodać 1 mL kompletnej pożywki DMEM na każdą studzienkę; inkubować przez 48 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po 48 godzinach zebrać nadsącz z kultur heterokariotów i przefiltrować go przez filtr 0,45 µm. Następnie użyć nadsączu do inokulacji komórek HUH 7.5, które zostały wysiane dzień wcześniej w płytkach 96-dołkowych w ramach testu rozcieńczeń ograniczających; inkubować przez 72 godziny przed ilościowym oznaczeniem produkcji zakaźnych cząstek potomnych.

Procedurę wizualizacji zdarzeń fuzji należy zakończyć na sześć godzin przed współhodowlą. Przemyć przylegające komórki raz pięcioma mililitrami PBS, a następnie dodać cztery mililitry odpowiedniego roztworu DI na każdą szalkę 10 cm. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Przemyć komórki raz pięcioma mililitrami PBS przez jedną minutę, a następnie dodać pełną pożywkę DMEM. Inkubować przez sześć godzin w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla przed wysianiem. Do każdego dołka płytki 12-dołkowej dodać szkiełko podstawowe, po czym wysiać i przeprowadzić transfekcję oraz barwienie komórek zgodnie z wcześniejszym opisem. 30 godzin po transfekcji ostrożnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS przez jedną minutę, a następnie utrwalić komórki 250 mikrolitrami 3% paraldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Przemyj komórki raz 1 mL PBS przez 1 minutę, a następnie barw dappy przez 1 minutę; po jednorazowym przemyciu komórek PBS i raz wodą, zamontuj szkiełka nakrywkowe, okulary przeciwsłoneczne oraz preparaty na szkiełkach. W pierwszym podejściu do zbadania wpływu czynników restrykcyjnych na ukończenie cyklu replikacyjnego HCV, w heterokaronach komórki HUH 7.5 zostały najpierw przejściowo transfekowane subgenomowym replikonem wykazującym ekspresję transgenu lucyferazy oraz białek niestrukturalnych HCV, a następnie współhodowane i fuzowane z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję białek strukturalnych rdzenia (core) oraz białek akcesoryjnych HCV. Reprezentatywny wynik przedstawiono na tej rycinie; komórki poddano immunobarwieniu z użyciem przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku strukturalnemu E2 oraz białku niestrukturalnemu NS5A.

Obrazy w górnych panelach pokazują, że po traktowaniu PEG jednocześnie w tej samej cytoplazmie wykryto sygnały zarówno dla MS pięciu A, jak i D dwóch, co wskazuje na samofuzję. W przeciwieństwie do tego, obrazy w dolnych panelach pokazują, że gdy komórki w ko-kulturze traktowano PBS, nie wywołano fuzji. W związku z tym nie zaobserwowano kolokalizacji sygnałów; aby określić zakaźność wirusów wytworzonych z heterokaryonów, pobrano nadnadstawniki z ko-kultur 48 godzin po indukcji fuzji i wykorzystano je do inokulacji naiwnych komórek HUH 7.5 w celu przeprowadzenia późniejszych testów lucyferazowych.

Na tym wykresie przedstawiono wartości średnie z trzech niezależnych eksperymentów. Szara pozioma belka reprezentuje tło dla względnych jednostek światła (RLU) wyznaczonych w niezinfekowanych komórkach HUH 7.5. Co istotne, w przypadku komórek replikant HUH 7.5 po fuzji z naiwnymi liniami komórkowymi lub po traktowaniu PBS w ramach kontroli, w płynach hodowlanych nie wykryto zakaźności.

Jednakże, gdy za pomocą PEG indukowano fuzję komórek linii replikonu HUH 7.5 i linii komórek pakujących, do płynów hodowlanych uwalniane były zakaźne cząsteczki wirusa. Wskazuje to, że produkcja wirusa wymaga fuzji komórkowej oraz ekspresji białek wirusowych w liniach komórek pakujących; co uderzające, uwalnianie wirusa umożliwiały nie tylko heterokariony komórek ludzkiego raka wątroby HUH 7.5, ale także heterokariony z ludzkimi komórkami nieżyjącymi oraz komórkami wątroby myszy, co świadczy o tym, że montaż i uwalnianie nie są w stopniu dominującym hamowane przez ewentualne czynniki restrykcyjne w tych typach komórek. W podejściu alternatywnym, po hodowli komórek, fuzję komórek somatycznych indukowano poprzez ekspresję genicznej glikoproteiny.

Heterokariony zwizualizowano poprzez barwienie oddzielnych linii komórkowych barwnikami typu cell tracker przed wspólną hodowlą i transfekcją; komórki z białkiem genicznym utrwalono i zabarwiono DPI 30 godzin po transfekcji, a reprezentatywny wynik przedstawiono na tej rycinie. Fuzja dwóch typów komórek jest wskazana przez heterokarion z homogenicznie rozłożonymi barwnikami w cytoplazmie, co zilustrowano tutaj. W przeciwieństwie do tego, obrazy w dolnym panelu pokazują brak komórek z podwójnie zabarwioną cytoplazmą, co wskazuje na brak fuzji komórek.

Ostatni wykres pokazuje, że wszystkie czynniki wejścia HCV są ekspresowane wyłącznie w heterokaryonach komórek Luna N z komórkami hela lub Hep 56 1D ekspresującymi ludzkie CD 81. W tym przypadku hodowle zaszczepiono zakaźnymi cząsteczkami HCV. Płyny hodowlane zebrano po 48 godzinach, a uwalnianie nowych cząsteczek z heterokaryonów określono za pomocą testu rozcieńczeń granicznych z wykorzystaniem naiwnych komórek docelowych HUH 7.5. Przedstawiono średnie wartości z trzech niezależnych eksperymentów, a szary poziomy pasek reprezentuje granicę wykrywalności testu.

Jako kontrolę komórki lunar N połączono z komórkami lunar N, co zaowocowało bardzo niskim poziomem zakaźnego HCV, bliskim granicy wykrywalności. Podobne wyniki uzyskano po połączeniu komórek lunar N z naiwnymi komórkami HEP 56 1D. W obu przypadkach brakowało ludzkiego CD 81, przez co HCV nie mógł produktywnie zakażać heteronukleusów.

Z kolei de novo produkcję zakaźnego potomstwa wirusowego, około dziesięciokrotnie wyższą od tła testu, zaobserwowano w komórkach lunar 10 po fuzji z heer oraz w komórkach lunar hand po fuzji z komórkami HEP 56 1D wykazującymi ekspresję ludzkiego CD 81. Wskazuje to, że HCV pomyślnie ukończyło swój cykl replikacyjny w RetroCars, co wyklucza ekspresję dominujących czynników restrykcyjnych w tych liniach komórkowych. Po opanowaniu techniki, cała procedura eksperymentalna może zostać przeprowadzona w ciągu jednego tygodnia, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania heterokarionu w celu identyfikacji potencjalnych czynników restrykcyjnych HV. Należy pamiętać, że praca z wirusem zapalenia wątroby typu C może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas przeprowadzania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak rygorystyczne zasady bezpieczeństwa biologicznego.