Name: Model ludzkiego jajowodu do badania zakażeń C. trachomatis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Odkryj model zakażenia ex vivo ludzkiego jajowodu używany do badania patologii wywołanej przez C. trachomatis. Metoda pozwala analizować uszkodzenia komórek nabłonkowych i odpowiedzi zapalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez DFG-Cluster of Excellence „Inflammation at Interfaces” (RA-If, RA-D). Jesteśmy wdzięczni za doskonałą pomoc techniczną Kristin Wischnat.

1. Przygotowanie zapasu Chlamydia trachomatis serotypu D
<ol>
 <li> Zainfekuj konfluencyjną butelkę do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2 zawierającą komórki HeLa-229, dodając 4 ml C. trachomatis D w buforze SPG. </li>
 <li> Inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. </li>
 <li> Dodaj 20 ml DMEM z 10% FCS i 240 μl cykloheksymidy. </li>
 <li> Inkubuj w wilgotnym inkubatorze przez 48 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. </li>
 <li> Dodaj 5 ml sterylnych szklanych kulek i energicznie wstrząśnij, aby odczepić i zniszczyć komórki HeLa-229 zawierające C. trachomatis. </li>
 <li> Zbierz nadsącz i dodaj kolejne 5 ml sterylnych szklanych kulek. </li>
 <li> Potrząsaj trzy razy przez 1 min, aby zniszczyć wszystkie komórki HeLa-229 i uwolnić C. trachomatis. </li>
 <li> Wirować przez 5 min przy 1000 rpmi w temperaturze 4 °C, aby usunąć debris komórkowy. </li>
 <li> Zbierz nadsącz do zakażenia od 8 do 10 butelek do hodowli komórkowej o powierzchni 175 cm2 z konfluencyjnie wyhodowanymi komórkami HeLa 229. </li>
 <li> Inkubuj każdą butelkę z 4 ml buforu SPG i 4 ml nadsączu z poprzedniej infekcji przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. </li>
 <li> Po jednej godzinie dodaj 15 ml DMEM z 10% FCS i 230 μl cykloheksymidy, a następnie inkubuj przez 48 h w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2. </li>
 <li> Dodaj 5 ml sterylnych szklanych kulek i wstrząśnij, aby odczepić i zniszczyć komórki HeLa-229 zawierające C. trachomatis. </li>
 <li> Zbierz nadsącz i dodaj kolejne 5 ml sterylnych szklanych kulek. </li>
 <li> Potrząsaj trzy razy przez 1 min, aby zniszczyć wszystkie komórki HeLa-229 i uwolnić C. trachomatis. </li>
 <li> Wirować przez 5 min przy 1000 rpmi w temperaturze 4 °C, aby usunąć debris komórkowy. </li>
 <li> Zbierz nadsącz. </li>
 <li> Przenieś 40 ml nadsączu do probótek Falcon 50 ml i wirować przez 99 min przy 11000 rpmi. </li>
 <li> Po wirowaniu odlej nadsącz i przemyj osad 1 ml buforu SPG. </li>
 <li> Zhomogenizuj osad w 1 ml SPG i rozdziel alikwoty po 20 μl do probótek Eppendorf 1,5 ml, przechowuj w temperaturze -70 °C do momentu użycia. Aktywność biologiczną przygotowanego zapasu potwierdzono w ustalonym modelu infekcji komórek HeLa-229.</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkiej trąbki jajowej
<ol>
 <li> Przechowywać ludzkie jajowody (HFT) pobrane od kobiet poddawanych histerektomii bezpośrednio po operacji w pożywce RPMI z dodatkiem 5% FCS bez antybiotyków w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania. Protokół został zatwierdzony przez komisję etyczną Uniwersytetu w Lubece (09-153). Kobiety włączone do badania (w wieku od 34 do 53 lat) nie miały w wywiadzie wcześniejszych zakażeń C. trachomatis. Tkankę jajowodów pobierano podczas sterylizacji okołoporodowej na prośbę matki podczas cięć cesarskich lub podczas histerektomii z powodu objawowych mięśniaków macicy w fazie lutealnej. Wszystkie próbki HFT w teście PCR dały wynik negatywny w kierunku C. trachomatis. </li>
 <li> Przeprowadzić sekcję HFT w szalce Petri zawierającej pożywkę RPMI z 5% FCS bez antybiotyków. Przez cały czas obróbki tkanka powinna być zanurzona w pożywce, aby zapobiec jej wysychaniu. </li>
 <li> Odciąć i usunąć tkankę łączną oraz tkankę uszkodzoną podczas operacji. </li>
 <li> Po sekcji ostrożnie otworzyć HFT za pomocą małego skalpela. </li>
 <li> Do dalszych eksperymentów przygotować fragmenty tkanki o rozmiarach od 0,5 cm x 0,5 cm do 1 cm x 1 cm. </li>
 <li> W celu zakażenia przechowywać próbki HFT w 1 ml RPMI z dodatkiem 5% FCS bez antybiotyków. Próbki HFT zakażono dawką 5,5x105 IFU (inclusion forming units) C. trachomatis. </li>
 <li> Inkubować próbki HFT w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 21% O2, a także w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i 2% O2 przez 24 h. </li>
 <li> Po czasie inkubacji zebrać próbki i przechowywać w utrwalaczu Montiego przez co najmniej trzy dni w temperaturze 4 °C do czasu przygotowania do SEM/TEM. </li>
</ol>
3. Przygotowanie preparatu HFT do TEM
<ol>
 <li>Do badań TEM należy wyjąć preparat z fiksaty Montiego i wyciąć fragmenty o wymiarach od 2 x 2 mm do 4 x 5 mm. Pozostała tkanka może zostać wykorzystana do badań SEM.</li>
 <li>Fragmenty należy przemywać buforem z kacodylanu sodu, pH 7.35 przez 1 h.</li>
 <li>Inkubować w 1% (w/v) tetroksydzie osmu w aqua dest. przez noc.</li>
 <li>Nadmiar tetroksydu osmu należy usunąć, przemywając preparaty 6 x 5 min w buforze z kacodylanu sodu, pH 7.35.</li>
 <li>Odwodnienie przeprowadza się poprzez inkubację w rosnących stężeniach etanolu w wodzie (v/v) (30% przez 2 h, 40% przez 2 h, 50% przez 2 h, 60% przez 2 h, 70% przez noc, 80% przez 2 h, 90% przez 1 h, 95% przez 1 h, 100% przez 1 h).</li>
 <li>Etanol należy wypłukać, inkubując preparaty 2 x 15 min w tlenku propylenu, a następnie przenieść do mieszaniny 50% (v/v) świeżo przygotowanego aralditu (zawierającego wszystkie komponenty) w tlenku propylenu i inkubować przez noc.</li>
 <li>Przenieść do świeżo przygotowanego aralditu (zawierającego wszystkie komponenty) na co najmniej 1 h.</li>
 <li>Przenieść do płaskich form do zatapiania i wypełnić aralditem.</li>
 <li>Pozostawić araldit do utwardzenia na co najmniej 48 h w temperaturze 60 °C.</li>
 <li>Po przycięciu zatopionej próbki wykonać cienkie przekroje (700 nm) na ultramikrotomie przy użyciu noży szklanych lub diamentowego noża histologicznego i barwić barwnikiem Richardsona.</li>
 <li>Wyciąć ultracienkie przekroje (ok. 70 nm) przy użyciu noża diamentowego i przenieść na siatki miedziane (np. o oczkach 150 mesh).</li>
 <li>Ultracienkie przekroje należy barwić 0.5% (w/v) octanem uranylu w aqua dest., a następnie 3% (w/v) cytrynianem ołowiu w aqua dest. w automatycznej barwiarce do przekrojów. Alternatywnie przekroje można barwić ręcznie, pozostawiając siatki na 15 min w nasyconym odwirowanym roztworze octanu uranylu w aqua dest., a następnie w 0.3% (w/v) cytrynianie ołowiu w aqua dest.</li>
</ol>
4. Przygotowanie preparatu HFT do SEM
<ol>
 <li> Do analizy SEM wyjąć preparat z utrwalacza Montiego, ułożyć go nabłonkiem do góry na arkuszu korkowym o wymiarach 1,5 x 1 cm i unieruchomić za pomocą igieł entomologicznych. </li>
 <li> Przenieść preparat wraz z korkiem do odpowiednich koszyczków metalowych i płukać przez 30 min w buforze kakodylanu sodu, pH 7,35. </li>
 <li> Odwodnić preparat poprzez inkubację w mieszaninach acetonu z wodą (v/v) o rosnącym stężeniu: 30% przez 6 h, 40% przez 6 h, 60% przez 8 h, 70% przez noc, 80% przez 2 h, 90% przez 2 h oraz 100% przez noc (należy zachować szczególną ostrożność, aby preparat był stale zanurzony). </li>
 <li> Przenieść do świeżego 100% acetonu i wysuszyć preparat metodą punktu krytycznego (temperatura 40 °C, ciśnienie 80 bar). </li>
 <li> Usunąć igły i korek, a następnie przykleić preparat nabłonkiem do góry do uchwytu do SEM wyposażonego w przewodzącą taśmę węglową, używając przewodzącego cementu węglowego. Aby zwiększyć przewodnictwo między uchwytem a przewodzącą taśmą węglową, zastosować ciekłe przewodzące srebro. </li>
 <li> Przygotować przewodzącą powłokę z platyny, złota lub palladu na powierzchni preparatu za pomocą napylacza (sputter coater). </li>
</ol>
5. Barwienie półcienkich przekrojów barwnikiem Richardsona
<ol>
 <li>Pozostawić półcienkie przekroje do wyschnięcia na szkiełku.</li>
 <li>Barwić przekroje roztworem barwiącym w temperaturze 60 °C przez 1-2 min.</li>
 <li>Przemyć w aqua dest.</li>
 <li>Wysuszyć przekroje i przykryć szkiełkiem zakrywowym.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
W modelu infekcji ludzkiego jajowodu byliśmy w stanie zwizualizować różnice w morfologii nabłonka pomiędzy kontrolami niezinfekowanymi (Rycina 1) a jajowodami zakażonymi C. trachomatis (Rycina 2) w warunkach normoksji. Charakterystyczne różnice morfologiczne wskazywały na indukowany przez patogen obrzęk i lizę komórek nabłonka jajowodu, których nie stwierdzono w kontrolach niezinfekowanych. Wykorzystując przekroje półcienkie i transmisyjną mikroskopię elektronową, zdołaliśmy udowodnić tworzenie się wewnątrzkomórkowych inkluzji C. trachomatis w zakażonej ex vivo tkance ludzkiego jajowodu (Rycina 3, 5), natomiast nie zaobserwowano ich w kontrolach niezinfekowanych (Rycina 4). Ponieważ stężenia tlenu w żeńskich drogach rodnych są niskie już w warunkach fizjologicznych 11, a następnie ulegają dalszemu obniżeniu podczas procesu zapalnego, zbadaliśmy nasz model również w warunkach hipoksji. Wstępne wyniki wskazują, że model ten jest użyteczny do analizy wzrostu chlamydii i ich potomstwa przy różnych stężeniach tlenu. Uszkodzenia komórek nabłonka wywołane przez chlamydie należy odróżnić od artefaktów wynikających z nieostrożnego przygotowania i obchodzenia się z jajowodami przed infekcją (Rycina 6).
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig1.jpg" alt="Obraz z rozpylnego mikroskopu elektronowego przedstawiający ziarna pyłku, ukazujący teksturę powierzchni i morfologię." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) niezakażonego ludzkiego jajowodu po jednym dniu inkubacji w medium kontrolnym (zielona strzałka wskazuje komórkę rzęskową, niebieska strzałka wskazuje komórkę nierzęskową).
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig2.jpg" alt="Obraz z elektronowego mikroskopu skaningowego, struktura błony komórkowej, skala 3 μm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) ludzkiego jajowodu zainfekowanego ex vivo C. trachomatis jeden dzień po infekcji (biała strzałka wskazuje przerwane włączenie). <img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig3.jpg" alt="Histologia, obraz mikroskopowy próbki komórek; analiza struktury i morfologii komórkowej, skala 10µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Półcienkie skrawki ukazują typowe inkluzje wewnątrzkomórkowe (białe strzałki) 1 dzień po zakażeniu ludzkiego jajowodu C. trachomatis ex vivo.
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig4.jpg" alt="Struktura komórkowa na mikrografii elektronowej, ukazująca organelle i błonę komórkową w skali 5 µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) niezakażonego ludzkiego jajowodu po jednym dniu inkubacji w medium kontrolnym.
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig5.jpg" alt="Obraz mikroskopowy struktury komórki, ultrastruktura, analiza TEM, organelle, biologia komórki." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) ludzkiej trąbki jajowej zainfekowanej ex vivo C. trachomatis jeden dzień po infekcji (białe strzałki wskazują inkluzje chlamydii).
<img src="/files/ftp_upload/4036/4036fig6.jpg" alt="Mikroskopia, mikrograf elektronowy; struktura biofilmu bakteryjnego; morfologia powierzchni; badanie drobnoustrojów; skala 500 µm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 6"> 
Rycina 6. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) nabłonka jajowodu uszkodzonego w wyniku nieostrożnego przygotowania i obchodzenia się z próbką (białe strzałki wskazują zniszczoną tkankę nabłonkową).

<ol><li>Dean, D., Suchland, R. J., Stamm, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+long-term+cervical+persistence+of+Chlamydia+trachomatis+by+omp1+genotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Evidence for long-term cervical persistence of Chlamydia trachomatis by omp1 genotyping.</a> J. Infect. Dis. 182, 909-916 (2000).</li>
<li>Campbell, L. A., Patton, D. L., Moore, D. E., Cappuccio, A. L., Mueller, B. A., Wang, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Chlamydia+trachomatis+deoxyribonucleic+acid+in+women+with+tubal+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil.+Steril%22%5BJournal%5D)">Detection of Chlamydia trachomatis deoxyribonucleic acid in women with tubal infertility.</a> Fertil. Steril. 59, 45-50 (1993).</li>
<li>Peipert, J. F. Clinical practice. Genital chlamydial infections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeipert%2C+JF+%22N.+Engl.+J.+Med%22">N. Engl. J. Med</a>. 349, 2424-2430 (2003).</li>
<li>Mardh, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubal+factor+infertility%2C+with+special+regard+to+chlamydial+salpingitis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubal factor infertility, with special regard to chlamydial salpingitis.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 17, 49-52 (2004).</li>
<li>Ertel, A., Verghese, A., Byers, S. W., Ochs, M., Tozeren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+differences+between+tumor+cell+lines+and+normal+and+tumor+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific differences between tumor cell lines and normal and tumor tissue cells.</a> Mol. Cancer. 5, 55(2006).</li>
<li>Roshick, C., Wood, H., Caldwell, H. D., McClarty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+gamma+interferon-mediated+antichlamydial+defense+mechanisms+in+human+and+mouse+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Comparison of gamma interferon-mediated antichlamydial defense mechanisms in human and mouse cells.</a> Infect. Immun. 74, 225-238 (2006).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: differences between mouse and human immunology.</a> J. Immunol. 172, 2731-2738 (2004).</li>
<li>Hvid, M., Baczynska, A., Deleuran, B., Fedder, J., Knudsen, H. J., Christiansen, G., Birkelund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1+is+the+initiator+of+Fallopian+tube+destruction+during+Chlamydia+trachomatis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1 is the initiator of Fallopian tube destruction during Chlamydia trachomatis infection.</a> Cell Microbiol. 9, 2795-2803 (2007).</li>
<li>Roth, A., Konig, P., van, Z. G., Klinger, M., Hellwig-Burgel, T., Daubener, W., Bohlmann, M. K., Rupp, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+abrogates+antichlamydial+properties+of+IFN-gamma+in+human+fallopian+tube+cells+in+vitro+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 19502-19507 (2010).</li>
<li>Wyrick, P. B., Knight, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-exposure+of+infected+human+endometrial+epithelial+cells+to+penicillin+in+vitro+renders+Chlamydia+trachomatis+refractory+to+azithromycin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Pre-exposure of infected human endometrial epithelial cells to penicillin in vitro renders Chlamydia trachomatis refractory to azithromycin.</a> J. Antimicrob. Chemother. 54, 79-85 (2004).</li>
<li>Van Voorhis, W. C., Barrett, L. K., Sweeney, Y. T., Kuo, C. C., Patton, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+Chlamydia+trachomatis+infection+of+Macaca+nemestrina+fallopian+tubes+produces+a+Th1-like+cytokine+response+associated+with+fibrosis+and+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Repeated Chlamydia trachomatis infection of Macaca nemestrina fallopian tubes produces a Th1-like cytokine response associated with fibrosis and scarring.</a> Infect. Immun. 65, 2175-2182 (1997).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wizualizacja uszkodzeń tkanki zainfekowanej przez patogen jest trudna i często ograniczona do procedur eksperymentalnych na myszach. Opracowaliśmy model infekcji ex vivo w ludzkich jajowodach, aby analizować infekcje C. trachomatis w górnym odcinku żeńskiego układu rozrodczego. Dzięki zastosowaniu tej metody byliśmy w stanie zwizualizować uszkodzenia nabłonka ludzkiego jajowodu wywołane przez C. trachomatis w ciągu jednego dnia po zakażeniu. Obrzęk oraz lizę komórkową były typowymi zmianami morfologicznymi obserwowanymi w jajowodach zainfekowanych C. trachomatis, których nie stwierdzono w niezinfekowanych próbkach kontrolnych. Analizy TEM wykazały, że chlamydie realizują typowy wewnątrzkomórkowy cykl rozwojowy w zainfekowanych tkankach, wykazując duże inkluzje z redyferencjowanymi ciałami elementarnymi, ale także mniejsze inkluzje z powiększonymi ciałami siточkowatymi, co może wskazywać na persistencję. Jednak sam obraz morfologiczny nie jest wystarczający do rozróżnienia między infekcjami replikującymi a persistentnymi, które charakteryzują się obniżonym metabolizmem i zwiększoną odpornością na środki przeciwdrobnoustrojowe 10.
Zniszczenie nabłonka w zainfekowanych jajowodach wynika albo z rozpadu zainfekowanych C. trachomatis komórek nabłonkowych po zakończeniu wewnątrzkomórkowego cyklu rozwojowego i uwolnieniu zakaźnych ciał elementarnych, albo z uwalniania cytokin prozapalnych 8. Przypuszcza się, że uszkodzenia tkanek wywołane przez patogen oraz indukowane przez gospodarza reakcje immunologiczne przeciwko C. trachomatis są głównymi czynnikami prowadzącymi do utraty funkcji komórek nabłonkowych, przebudowy fibroblastów, a w konsekwencji do bezpłodności jajowodowej in vivo 8,11.
Jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak komórek zapalnych, co utrudnia analizę efektów wtórnych do pierwotnego zakażenia nabłonka jajowodu przez C. trachomatis. Niemniej jednak model ten jest odpowiedni do badania różnych warunków środowiskowych (np. zawartości tlenu) oraz wstępnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza w ostrych zakażeniach C. trachomatis 8,9. Dalsze plany obejmują opracowanie modelu do testowania środków przeciwdrobnoustrojowych przeciwko C. trachomatis w całych ludzkich jajowodach oraz charakterystykę stanów metabolicznych różnych etapów rozwojowych obserwowanych w nabłonku jajowodu za pomocą dwufotonowej laserowej mikroskopii skanującej.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>PAA</td><td>E15-843</td><td></td></tr><tr><td>RPMI </td><td>PAA</td><td>R15-802</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-101</td><td></td></tr><tr><td>Cyklheksymida </td><td>Sigma - Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bufor SPG</td><td>różne</td><td></td><td>patrz receptura poniżej</td></tr><tr><td>Fiksatyw Montiego </td><td>różne</td><td></td><td>patrz receptura poniżej</td></tr><tr><td>bufor kakodylanu sodu</td><td>różne</td><td></td><td>patrz receptura poniżej</td></tr><tr><td>Barwienie Richardsona</td><td>różne</td><td></td><td>patrz receptura poniżej</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">Receptury: &lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">1. Bufor SPG&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Dodać 75 g sacharozy. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 2.47 g fosforanu disodowego. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 0.36 g fosforanu monosodowego. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 0.72 g kwasu glutaminowego. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Uzupełnić aqua dest. do objętości 1 l. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dostosować pH do 7.3. &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">2. 0.1 M bufor kakodylanu sodu, pH 7.35.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Dodać 42.80 g soli sodowej kwasu dimetylarsenowego. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 68.46 g sacharozy.&lt;/li&gt; &lt;li&gt; Uzupełnić aqua dest. do objętości 1 l, aby otrzymać 0.2 M bufor kakodylanu sodu. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Przed użyciem rozcieńczyć roztwór aqua dest. do pożądanego stężenia i w razie potrzeby dostosować pH do 7.35. &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">3. Fiksatyw Montiego&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Dodać 156 ml 0.12 M buforu kakodylanu sodu. 3.2 Dodać 25 ml 25% glutaraldehydu w aqua dest. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 19 ml 10% paraformaldehydu w aqua dest. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dodać 3 ml 3% CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w aqua dest. &lt;/li&gt; &lt;li&gt; Dostosować pH do 7.35 i uzupełnić aqua dest. do końcowej objętości roztworu 312 ml. &lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">4. Barwienie Richardsona&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ol&gt; &lt;li&gt; Wymieszać w równych częściach 1% roztwór błękitu metylenowego w 1% wodnym roztworze boraksu oraz 1% roztwór Azuru II w aqua dest.&lt;/li&gt; &lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

model ludzkiego jajowodu do badania infekcji c. trachomatis

A Human Fallopian Tube Model for Investigation of C. trachomatis Infections

Zakażenia dróg rodnych wywołane przez Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) są najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową u kobiet na całym świecie. Niewydolne eliminowanie lub przetrwanie patogenów może prowadzić do infekcji wstępujących górnych dróg rodnych i prawdopodobnie powodować przewlekłe uszkodzenia zapalne zakażonych tkanek 1,2. W konsekwencji mogą wystąpić poważne następstwa kliniczne, takie jak zapalenie miednicy mniejszej (PID), niedrożność jajowodów oraz niepłodność 3,4.
Większość badań z wykorzystaniem *C. trachomatis* przeprowadzono w liniach komórek nabłonkowych (np. komórkach HEp-2 i HeLa-229) lub u myszy. Jednakże, podobnie jak w modelach opartych na hodowlach komórkowych, nie odzwierciedlają one ani fizjologii tkanki natywnej, ani patofizjologii C. trachomatis infekcje dróg rodnych in vivo 5Dalsze ograniczenia wynikają z faktu, że centralne kaskady sygnalizacyjne (np. szlak sygnalizacyjny JAK/STAT zależny od IFN-γ), które kontrolują wewnątrzkomórkowy wzrost chlamydii, różnią się zasadniczo u myszy i ludzi. 6,7W związku z tym my oraz inne zespoły opracowaliśmy model całego narząduu trąbki jajowodnej, aby zbadać bezpośrednie oddziaływania pomiędzy *C. trachomatis* oraz ludzkie komórki jajdowodu ex vivo 8,9.
W tym celu pobrano ludzkie jajowody od kobiet poddawanych histerektomii i zainfekowano je C. trachomatis serotypu D. W ciągu 24 h po infekcji próbki poddano analizie z wykorzystaniem skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) oraz transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu wykrycia uszkodzeń nabłonka wywołanych przez Chlamydia trachomatis, a także formowania się inkluzji C. trachomatis w tkance jajowodu.

Opisujemy model infekcji ex vivo służący do wizualizacji bezpośrednich oddziaływań patogenów bakteryjnych z komórkami ludzkich jajowodów. Model tkankowy całego narządu został opracowany w celu zbadania patologii wywołanej przez C. trachomatis w żeńskich jajowodach w warunkach zbliżonych do naturalnych.

Model ludzkiego jajowodu do badania infekcji C. trachomatis

Infekcje dróg rodnych wywołane przez *Chlamydia trachomatis* (*C. trachomatis*) są najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową u kobiet na całym świecie. Niewydolność...

Chlamydia trachomatis to gram-ujemna bakteria obligatoryjnie wewnątrzkomórkowa. Znane są różne serowary chlamydii, które wywołują infekcje oczu lub dróg rodnych. Infekcje dróg rodnych wywołane przez Chlamydia trachomatis są najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową na świecie.W Unii Europejskiej w latach 1990–2009 odnotowano niemal 3 miliony zakażeń. W samym 2009 roku zgłoszono prawie 400 000 przypadków. Pomimo stałego rozwoju zdrowia publicznego i edukacji seksualnej, stwierdzono wzrost liczby nowych zakażeń chlamydialnych narządów płciowych z 70 000 przypadków w 1990 roku do 400 000 przypadków w 2009 roku.75% wszystkich nowych zakażeń zgłaszanych jest u osób młodych w wieku od 15 do 24 lat. Przypuszcza się, że następstwa kliniczne występują z powodu nieefektywnego usuwania patogenów, co może prowadzić do infekcji wstępujących z dolnego do górnego odcinka dróg rodnych, a w konsekwencji powodować przewlekłe uszkodzenia zapalne zakażonej tkanki. Od 10 do 30% kobiet zakażonych Chlamydia trachomatis zapada na chorobę zapalną miednicy PID, a do 50% przypadków PID przypisuje się zakażenia Chlamydia trachomatis.W konsekwencji u 50% pacjentek z niepłodnością jajowodową oraz u 40% pacjentek z ciążą pozamaciczną chlamydia jest stwierdzana jako patogen etiologiczny. U zdrowej kobiety niezakażonej zapłodniona komórka jajowa migruje przez jajowód do macicy, gdzie rozwija się aż do momentu porodu. U pacjentek zakażonych chlamydia może przedostać się z dolnych dróg rodnych do jajowodu, wywołując przewlekłe procesy zapalne.Zakłada się, że wywołane przez patogeny uszkodzenia komórek nabłonkowych oraz utrata funkcji centralnych komórek nabłonkowych ostatecznie prowadzą do niedrożności jajowodów, co skutkuje ograniczeniem lub całkowitym zniesieniem transportu komórek jajowych z jajników do macicy. W tym celu pobierane i przechowywane są ludzkie jajowody od kobiet poddawanych histerektomii. Jajowody są preparowane i ostrożnie otwierane.Zgodnie z planem eksperymentalnym, tkanki są pocięte na małe próbki i zakażone zakaźnymi ciałami elementarnymi chlamydia tracheitis na okres od 24 do 48 godzin, zależnie od odpowiednich punktów czasowych. Próbki są utrwalane w utrwalaczu Monty'ego przez co najmniej trzy dni do czasu dalszego przygotowania. Ludzkie jajowody HFT pobrane od kobiet poddawanych histerektomii należy przechowywać niezwłocznie po operacji.W medium RPMI zawierającym 5% FCS bez antybiotyków w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu przygotowania. Przeprowadź sekcję ludzkiego jajłowodu w szalce Petrigo zawierającej RPMI z 5% FCS bez antybiotyków przez cały czas trwania procedury. Jajowód powinien być zanurzony w medium, aby zapobiec wysychaniu; odetnij i usuń tkankę łączną oraz tkanki uszkodzone podczas operacji.Po sekcji ostrożnie otwórz HFT za pomocą małego skalpela. Unikaj uszkodzenia tkanek poprzez nieostrożne posługiwanie się pęsetą i skalpelem. Przygotuj małe fragmenty tkanki o rozmiarze 5 x 5 mm do zakażenia; próbkę HFT przechowuj w 1 mL RPMI zawierającego 5% FCS bez antybiotyków i dodaj C track.Preparaty HFT ciał elementarnych OMAS inkubuje się do 48 godzin w temperaturze 37 °C, przy 5%CO2 i 20%O2 w zwykłym inkubatorze lub w środowisku o niskiej zawartości tlenu, poniżej 5%O2 w komorze hipoksyjnej. Po odpowiednich punktach czasowych inkubacji preparaty zbiera się i przechowuje w utrwalaczu Monty'ego przez co najmniej trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przygotowania do SEM lub TEM do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Utrwaloną tkankę tnie się na małe kawałki, płucze i inkubuje przez noc z 1% osse i tetroksydem.Po kilku etapach płukania i suszenia odwodnione preparaty przenosi się do świeżo przygotowanej żywicy i polimeryzuje przez 48 godzin w temperaturze 60 °C. Po przycięciu wykonuje się skrawki półcienkie i ultracienkie, które następnie przenosi się odpowiednio na szkiełka lub siateczki. Po barwieniu skrawki półcienkie można badać pod mikroskopem świetlnym w celu przygotowania do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.Wyjąć preparat z utrwalacza Monty'ego i pociąć na kawałki o wymiarach do 2 × 2 × 5 mm. Po przemyciu, inkubacji w buforze rozszerzającym z sodowym CCO, przemyciu czwartotlenkiem osmu, odwodnieniu w rosnących stężeniach etanolu, przenieść preparat do mieszaniny 50% tlenku propylenu i aite na noc. Następnego dnia przenieść do świeżo przygotowanego aite na co najmniej jedną godzinę.Następnie przenieść do płaskich foremek, wypełnić żywicą i pozostawić do polimeryzacji przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po przycięciu zatopionej próbki, wykonać półcienkie przekroje o grubości około 700 nanometrów lub ultrascienkie przekroje o grubości 70 nanometrów przy użyciu ultramikrotomu wyposażonego w nóż szklany lub najlepiej w nóż diamentowy. Przekroje półcienkie i ultrascienkie poddać analizie preparatu za pomocą mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz dla skaningowej mikroskopii elektronowej.Okazy zostają przypięte do płyt korkowych nabłonkiem do góry, przemyte i odwodnione przy użyciu rosnących stężeń acetonu. Po wysuszeniu w suszarce do punktu krytycznego okazy przenosi się na uchwyt do SEM i napylają platyną, złotem lub palladem za pomocą napylacza. Następnie są one gotowe do analizy w skaningowym mikroskopie elektronowym w celu przeprowadzenia skaningowej mikroskopii elektronowej.Wyjmij preparat z fiksatywa Monty'ego i ułóż fragment tkanki na arkuszu korkowym nabłonkiem do góry, stabilizując go za pomocą igieł entomologicznych. Po przemyciu buforem rozszerzającym sodium caco i przeprowadzeniu obróbki acetonem, wysusz preparat w suszarce punktu krytycznego. Po przeniesieniu preparatu z korka na uchwyt do SEM, przygotuj przewodzącą powłokę z platyny, złota lub palladu, korzystając z naparowarki. Przenieś naparowany preparat do skaningowego mikroskopu elektronowego w celu przeprowadzenia dalszej analizy.Niezmiennie wysoka zapadalność na zakażenia układu moczowo-płciowego u kobiet oraz ogromne konsekwencje kliniczne wznoszących się infekcji stanowią uzasadnienie dla intensyfikacji badań podstawowych i translacyjnych w tej dziedzinie. Wykorzystaliśmy opracowany wcześniej przez grupę St.Perus i wsp. model tkankowy ex vivo ludzkiego jajowodu, aby morfologicznie scharakteryzować uszkodzenia komórek w jajowodzie wywołane przez chlamydie. Dzięki zastosowaniu tej metody zaobserwowano tworzenie się wewnątrzkomórkowych inkluzji na różnych etapach rozwoju, obrazując zarówno infekcje replikujące, jak i trwałe.Nadal brakuje jednak dowodów eksperymentalnych potwierdzających obecność trwałych form chlamydii w tkance ludzkich jajowodów, co wymaga dalszej analizy chlamydii, ich potomstwa oraz upregulacji transkrypcji genów odpowiedzialnych za persistencję. Jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak komórek zapalnych, co utrudnia analizę efektów wtórnych wynikających z pierwotnej infekcji glaucomatous KLA. Niemniej jednak model ten wydaje się odpowiedni do analizy warunków środowiskowych, takich jak zawartość tlenu w kontekście uszkodzenia komórek nabłonkowych jajowodów, a także do analizy pierwotnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko ostrej infekcji glaucomatous.Jednym z przyszłych celów jest opracowanie bardziej rozbudowanego modelu do badania MIC dla CTU w modelu tkanki jajowodu człowieka o określonym pH oraz wykorzystanie tego modelu do precyzyjnego zdefiniowania różnych stadiów rozwoju CLI pod kątem metabolicznym, z zastosowaniem techniki dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej.

a-human-fallopian-tube-model-for-investigation-c-trachomatis

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Model ludzkiego jajowodu do badań nad infekcjami C. trachomatis

Jajowód (FT) wyłania się jako alternatywne miejsce pochodzenia surowiczego raka jajnika (SOC). Niniejszy protokół opisuje nową metodę izolacji i hodowli ex vivo komórek nabłonkowych jajowodu. System ten odwzorowuje nabłonek in vivo i umożliwia badanie patogenezy SOC.

Kultura ex vivo pierwotnych ludzkich komórek nabłonkowych jajowodu

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Źródło: O'Brien, V. P., i in., Nawracająca infekcja dróg moczowych Escherichia coli wywołana ekspozycją pęcherza pochwowego Gardnerella u myszy. J. Vis. Exp. (2020)Ten film demonstruje wykorzystanie skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji kolonizacji bakterii oraz interakcji gospodarz–patogen w nabłonku pęcherza moczowego modelu myszy przed zakażeniem.

Przygotowanie tkanek pęcherza myszy do wizualizacji infekcji bakteryjnej

Ten film pokazuje proces zapoczątkowania uropatogennej infekcji Escherichia coli u samicy pęcherza myszy poprzez przezcewkowe wkroplenie cewnika. Wstrzyknięte bakterie z powodzeniem wywołują infekcję dróg moczowych w obrębie pęcherza moczowego, stanowiąc cenną platformę do badania chorób związanych z opieką zdrowotną związanych z drogami moczowymi.

Cewnikowanie przezcewkowe i inokulacja bakteryjna w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u samców myszy

Opracowanie modelu infekcji dróg moczowych u samic myszy

Ustalony model przezcewkowego cewnikowania myszy pozwala na badanie patologii pęcherza moczowego, w tym infekcji dróg moczowych, ale może być wykonywane tylko u samic. Zaprezentowany tu nowy model wkraplania przezcewkowego u mężczyzn umożliwi prowadzenie badań w obszarze charakteryzującym się silnymi różnicami klinicznymi i epidemiologicznymi między płciami.

Zakażenie dróg moczowych w modelu małego zwierzęcia: cewnikowanie przezcewkowe samców i samic myszy

Zbadaliśmy metodę cytologiczną jajowodów, pobierając próbki jajowodu bezpośrednio po chirurgicznym wycięciu jako narzędzie do wczesnego wykrywania raka jajnika. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół pobierania komórek jajowodu ze świeżo pobranych wycinków chirurgicznych.

Cytologia jajowodów jako obiecujące narzędzie do wczesnego wykrywania raka jajnika

Pokazano mysi model przezcewkowej inokulacji uropatogennej E. coli (UPEC) w celu stworzenia utajonych wewnątrzkomórkowych zbiorników pęcherza moczowego, a następnie ekspozycji pęcherza moczowego na G. vaginalis w celu wywołania nawrotu UPEC UTI. Zademonstrowano również liczenie bakterii, cytologię moczu oraz utrwalanie i przetwarzanie pęcherza moczowego in situ w skaningowej mikroskopii elektronowej.

Nawracające zakażenie dróg moczowych Escherichia coli wywołane ekspozycją pęcherza moczowego Gardnerella vaginalis u myszy

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

Ten protokół szczegółowo opisuje model in vitro cewnikowanego układu moczowego, który może być wykorzystany do badania zarówno planktonowych, jak i związanych z biofilmem populacji komórek bakteryjnych w symulowanych infekcjach dróg moczowych związanych z cewnikiem. Model ten może być dalej wykorzystywany do badania skuteczności produktów przeciwdrobnoustrojowych mających na celu kontrolowanie infekcji dróg moczowych.

Model pęcherza moczowego in vitro infekcji dróg moczowych związanej z cewnikiem

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

Odkryj model zakażenia ex vivo ludzkiego jajowodu używany do badania patologii wywołanej przez C. trachomatis. Metoda pozwala analizować uszkodzenia komórek nabłonkowych i odpowiedzi zapalne.

Model ludzkiego jajowodu do badania infekcji C. trachomatis

Przeglądaj więcej filmów