Model ludzkiego jajowodu do badania infekcji C. trachomatis

Chlamydia trachomatis to gram-ujemna bakteria obligatoryjnie wewnątrzkomórkowa. Znane są różne serowary chlamydii, które wywołują infekcje oczu lub dróg rodnych. Infekcje dróg rodnych wywołane przez Chlamydia trachomatis są najczęstszą chorobą przenoszoną drogą płciową na świecie.

W Unii Europejskiej w latach 1990–2009 odnotowano niemal 3 miliony zakażeń. W samym 2009 roku zgłoszono prawie 400 000 przypadków. Pomimo stałego rozwoju zdrowia publicznego i edukacji seksualnej, stwierdzono wzrost liczby nowych zakażeń chlamydialnych narządów płciowych z 70 000 przypadków w 1990 roku do 400 000 przypadków w 2009 roku.

75% wszystkich nowych zakażeń zgłaszanych jest u osób młodych w wieku od 15 do 24 lat. Przypuszcza się, że następstwa kliniczne występują z powodu nieefektywnego usuwania patogenów, co może prowadzić do infekcji wstępujących z dolnego do górnego odcinka dróg rodnych, a w konsekwencji powodować przewlekłe uszkodzenia zapalne zakażonej tkanki. Od 10 do 30% kobiet zakażonych Chlamydia trachomatis zapada na chorobę zapalną miednicy PID, a do 50% przypadków PID przypisuje się zakażenia Chlamydia trachomatis.

W konsekwencji u 50% pacjentek z niepłodnością jajowodową oraz u 40% pacjentek z ciążą pozamaciczną chlamydia jest stwierdzana jako patogen etiologiczny. U zdrowej kobiety niezakażonej zapłodniona komórka jajowa migruje przez jajowód do macicy, gdzie rozwija się aż do momentu porodu. U pacjentek zakażonych chlamydia może przedostać się z dolnych dróg rodnych do jajowodu, wywołując przewlekłe procesy zapalne.

Zakłada się, że wywołane przez patogeny uszkodzenia komórek nabłonkowych oraz utrata funkcji centralnych komórek nabłonkowych ostatecznie prowadzą do niedrożności jajowodów, co skutkuje ograniczeniem lub całkowitym zniesieniem transportu komórek jajowych z jajników do macicy. W tym celu pobierane i przechowywane są ludzkie jajowody od kobiet poddawanych histerektomii. Jajowody są preparowane i ostrożnie otwierane.

Zgodnie z planem eksperymentalnym, tkanki są pocięte na małe próbki i zakażone zakaźnymi ciałami elementarnymi chlamydia tracheitis na okres od 24 do 48 godzin, zależnie od odpowiednich punktów czasowych. Próbki są utrwalane w utrwalaczu Monty'ego przez co najmniej trzy dni do czasu dalszego przygotowania. Ludzkie jajowody HFT pobrane od kobiet poddawanych histerektomii należy przechowywać niezwłocznie po operacji.

W medium RPMI zawierającym 5% FCS bez antybiotyków w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu przygotowania. Przeprowadź sekcję ludzkiego jajłowodu w szalce Petrigo zawierającej RPMI z 5% FCS bez antybiotyków przez cały czas trwania procedury. Jajowód powinien być zanurzony w medium, aby zapobiec wysychaniu; odetnij i usuń tkankę łączną oraz tkanki uszkodzone podczas operacji.

Po sekcji ostrożnie otwórz HFT za pomocą małego skalpela. Unikaj uszkodzenia tkanek poprzez nieostrożne posługiwanie się pęsetą i skalpelem. Przygotuj małe fragmenty tkanki o rozmiarze 5 x 5 mm do zakażenia; próbkę HFT przechowuj w 1 mL RPMI zawierającego 5% FCS bez antybiotyków i dodaj C track.

Preparaty HFT ciał elementarnych OMAS inkubuje się do 48 godzin w temperaturze 37 °C, przy 5%CO2 i 20%O2 w zwykłym inkubatorze lub w środowisku o niskiej zawartości tlenu, poniżej 5%O2 w komorze hipoksyjnej. Po odpowiednich punktach czasowych inkubacji preparaty zbiera się i przechowuje w utrwalaczu Monty'ego przez co najmniej trzy dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu przygotowania do SEM lub TEM do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Utrwaloną tkankę tnie się na małe kawałki, płucze i inkubuje przez noc z 1% osse i tetroksydem.

Po kilku etapach płukania i suszenia odwodnione preparaty przenosi się do świeżo przygotowanej żywicy i polimeryzuje przez 48 godzin w temperaturze 60 °C. Po przycięciu wykonuje się skrawki półcienkie i ultracienkie, które następnie przenosi się odpowiednio na szkiełka lub siateczki. Po barwieniu skrawki półcienkie można badać pod mikroskopem świetlnym w celu przygotowania do transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Wyjąć preparat z utrwalacza Monty'ego i pociąć na kawałki o wymiarach do 2 × 2 × 5 mm. Po przemyciu, inkubacji w buforze rozszerzającym z sodowym CCO, przemyciu czwartotlenkiem osmu, odwodnieniu w rosnących stężeniach etanolu, przenieść preparat do mieszaniny 50% tlenku propylenu i aite na noc. Następnego dnia przenieść do świeżo przygotowanego aite na co najmniej jedną godzinę.

Następnie przenieść do płaskich foremek, wypełnić żywicą i pozostawić do polimeryzacji przez 48 godzin w temperaturze 60 stopni Celsjusza. Po przycięciu zatopionej próbki, wykonać półcienkie przekroje o grubości około 700 nanometrów lub ultrascienkie przekroje o grubości 70 nanometrów przy użyciu ultramikrotomu wyposażonego w nóż szklany lub najlepiej w nóż diamentowy. Przekroje półcienkie i ultrascienkie poddać analizie preparatu za pomocą mikroskopii świetlnej i transmisyjnej mikroskopii elektronowej oraz dla skaningowej mikroskopii elektronowej.

Okazy zostają przypięte do płyt korkowych nabłonkiem do góry, przemyte i odwodnione przy użyciu rosnących stężeń acetonu. Po wysuszeniu w suszarce do punktu krytycznego okazy przenosi się na uchwyt do SEM i napylają platyną, złotem lub palladem za pomocą napylacza. Następnie są one gotowe do analizy w skaningowym mikroskopie elektronowym w celu przeprowadzenia skaningowej mikroskopii elektronowej.

Wyjmij preparat z fiksatywa Monty'ego i ułóż fragment tkanki na arkuszu korkowym nabłonkiem do góry, stabilizując go za pomocą igieł entomologicznych. Po przemyciu buforem rozszerzającym sodium caco i przeprowadzeniu obróbki acetonem, wysusz preparat w suszarce punktu krytycznego. Po przeniesieniu preparatu z korka na uchwyt do SEM, przygotuj przewodzącą powłokę z platyny, złota lub palladu, korzystając z naparowarki. Przenieś naparowany preparat do skaningowego mikroskopu elektronowego w celu przeprowadzenia dalszej analizy.

Niezmiennie wysoka zapadalność na zakażenia układu moczowo-płciowego u kobiet oraz ogromne konsekwencje kliniczne wznoszących się infekcji stanowią uzasadnienie dla intensyfikacji badań podstawowych i translacyjnych w tej dziedzinie. Wykorzystaliśmy opracowany wcześniej przez grupę St.Perus i wsp. model tkankowy ex vivo ludzkiego jajowodu, aby morfologicznie scharakteryzować uszkodzenia komórek w jajowodzie wywołane przez chlamydie. Dzięki zastosowaniu tej metody zaobserwowano tworzenie się wewnątrzkomórkowych inkluzji na różnych etapach rozwoju, obrazując zarówno infekcje replikujące, jak i trwałe.

Nadal brakuje jednak dowodów eksperymentalnych potwierdzających obecność trwałych form chlamydii w tkance ludzkich jajowodów, co wymaga dalszej analizy chlamydii, ich potomstwa oraz upregulacji transkrypcji genów odpowiedzialnych za persistencję. Jednym z głównych ograniczeń tego modelu jest brak komórek zapalnych, co utrudnia analizę efektów wtórnych wynikających z pierwotnej infekcji glaucomatous KLA. Niemniej jednak model ten wydaje się odpowiedni do analizy warunków środowiskowych, takich jak zawartość tlenu w kontekście uszkodzenia komórek nabłonkowych jajowodów, a także do analizy pierwotnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza przeciwko ostrej infekcji glaucomatous.

Jednym z przyszłych celów jest opracowanie bardziej rozbudowanego modelu do badania MIC dla CTU w modelu tkanki jajowodu człowieka o określonym pH oraz wykorzystanie tego modelu do precyzyjnego zdefiniowania różnych stadiów rozwoju CLI pod kątem metabolicznym, z zastosowaniem techniki dwufotonowej skaningowej mikroskopii laserowej.