Name: Wygodna i ogólna platforma do produkcji wydzielanych białek z komórek ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj efektywną metodę ekspresji białek wydzielanych z komórek HEK 293T. Ta technika umożliwia produkcję białek rekombinowanych w natywnych konformacjach z możliwością skalowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant badawczy Ontario HIV Treatment Network Research Operating Grant (ROG-G645) oraz Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) przyznane dla JEL, a także stypendia University of Toronto dla HA, FCA i JDC. Autorzy chcieliby podziękować Marnie Fusco, Dafna Abelson oraz dr Ericie Ollmann Saphire ze The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) za udostępnienie komórek, wektora ekspresyjnego GP ebolavirus oraz ogólne wskazówki.

<ol><li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li>
<li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li>
<li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Applications+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li>
<li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li>
<li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li>
<li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li>
<li>Ye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li>
<li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric%2C+prefusion+Ebola+virus+GP%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst%22%5BJournal%5D)">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li>
<li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+expression%3A+developments+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li>
<li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Crystallogr.+D+Biol.+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li>
<li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+structural+genomics%3A+solving+the+glycosylation+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li>
<li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li>
<li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li>
<li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li>
<li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li>
<li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha%2C+beta%2C+and+gammac+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

10-warstwowe fabryki komórkowe (cell factories) stanowią efektywne naczynie do produkcji białek w ilościach liczonych w miligramach. Główną zaletą stosowania fabryki komórkowej w porównaniu z innymi tradycyjnymi naczyniami, takimi jak butle obrotowe, kolby wytrząsowe czy kolby z mieszadłem magnetycznym, jest fakt, że nie wymagają one zakupu żadnego dodatkowego sprzętu laboratoryjnego. Standardowy inkubator CO2 (~6,0 cu. ft.) bez problemu pomieści cztery 10-warstwowe fabryki komórkowe (Ryc. 2)....

<table><tbody><tr><td>Płynny substrat do fosfatazy zasadowej (BCIP/NBT)</td><td>Sigma</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk/środek przeciwgrzybiczy, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Macierz powinowactwa anty-HA, klon 3F10</td><td>Roche</td><td>1815016</td><td></td></tr><tr><td>mysi mAb przeciwko HA, klon 16B12</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórek, T75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; przeznaczony do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowej, T225 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; przetworzone do hodowli tkankowej</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>Płytki do hodowli komórkowej, 6-dołkowe, traktowane do hodowli tkanek</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Fabryka komórek, 10-warstwowy CellSTACK</td><td>Corning</td><td>3312</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta Centramate Omega 5K</td><td>Pall</td><td>OS005C12</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta Centramate Omega 30K</td><td>Pall</td><td>OS030C12</td><td></td></tr><tr><td>Szklana kolumna chromatograficzna, 1,0x10 cm</td><td>Kontes</td><td>4204001010</td><td></td></tr><tr><td>Cyprofloksacyna</td><td>Sigma</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pożywka Eagle'a modyfikowana przez Dulbecco (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), inaktywowana termicznie</td><td>Invitrogen</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>odczyn do transfekcji FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>4709691001</td><td></td></tr><tr><td>odczyn do transfekcji GeneJuice</td><td>EMD/Merck</td><td>70967-6</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciała anty-mysie IgG F(ab')&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; alkaliczny</td><td>Thermo Scientific</td><td>31324</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało sprzężone z fosfatazą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptyd hemaglutyniny (HA), 100 mg</td><td>Genscript</td><td>synteza na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>(sekwencja: YPYDVPDYA; czystość 95%)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>komórki HEK 293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Domowy wybielacz (4% m/v podchlorynu sodu)</td><td>dostępne są różne marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>membrana PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH07850</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do minipreparatywnego oczyszczania plazmidów, PureLink Quick</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidów MaxiPrep, PureLink HiPure</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>Błąd: brak danych wejściowych. Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>wektor ekspresyjny pDISPLAY</td><td>Invitrogen</td><td>V660-20</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna (pen/strep), 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS), sterylna 1X</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenoimina (PEI), liniowa 25 kDa</td><td>Wielonaukowość</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Goździk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>jednorazowa jednostka do filtracji próżniowej Stericup-GP PES,</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m, pojemność 500 ml</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanowy</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA, 0,05% (m/v)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Kwas walproinowy</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>System przepływu stycznego Centramate</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; inkubator z nawilżaczem, standardowy, 6 stóp sześciennych</td><td>dostępne są różne marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Układ do elektroforezy i transferu</td><td>dostępne są różne marki</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator, 37°C &amp;deg;C</td><td>dostępne są różne marki</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Ekspresja białek rekombinowanych w bakteriach, zazwyczaj *E. coli*, okazała się najskuteczniejszą strategią ekspresji białek w ilościach miligramowych. Jednakże gospodarze prokariotyczne często nie są odpowiednie do ekspresji białek ludzkich, wirusowych lub eukariotycznych ze względu na toksyczność obcej makrocząsteczki, różnice w mechanizmach fałdowania białek lub brak określonych modyfikacji ko- lub potranslacyjnych w bakteriach. Systemy ekspresyjne oparte na drożdżach (P. pastoris lub S. cerevisiae) 1,2, owad zainfekowany bakulowirusem (S. frugiperda lub T. ni) komórki 3, oraz bezkomórkowy in vitro systemy translacyjne 2,4 zostały z powodzeniem wykorzystane do produkcji białek ssaków. Intuicyjnie najlepszym rozwiązaniem jest użycie gospodarza z grupy ssaków, aby zapewnić produkcję białek rekombinowanych zawierających odpowiednie modyfikacje potranslacyjne. Liczne linie komórkowe ssaków (komórki embrionalnej nerki człowieka (HEK) 293, Ckomórki V-1 w Opochodzenia niosącego SV40 larget T-antigen (COS), komórki jajnika chomika chińskiego (CHO) oraz inne systemy zostały z sukcesem wykorzystane do nadekspresji białek ludzkich w ilościach liczonych w miligramach 5-9Jednakże zalety wykorzystania komórek ssaków są często niwelowane przez wyższe koszty, konieczność posiadania specjalistycznego wyposażenia laboratoryjnego, niższą wydajność białek oraz czasochłonny proces opracowywania stabilnych linii komórkowych ekspresyjnych. Zwiększenie wydajności oraz przyspieszenie produkcji białek przy jednoczesnym zachowaniu niskich kosztów stanowią kluczowe czynniki dla wielu laboratoriów akademickich i komercyjnych.
W niniejszej pracy opisujemy wydajną pod względem czasu i kosztów, dwuetapową procedurę ekspresji wydzielanych ludzkich białek z adhezyjnych komórek HEK 293T. System ten umożliwia otrzymanie mikrogramowych i miligramowych ilości funkcjonalnego białka do badań strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. W pierwszej części równolegle wytwarzane są liczne konstrukty interesującego nas genu, które następnie są przejściowo transfekowane do adhezyjnych komórek HEK 293T w małej skali. Detekcję i analizę rekombinowanego białka wydzielanego do pożywki hodowlanej przeprowadza się za pomocą analizy western blot, stosując komercyjnie dostępne przeciwciała skierowane przeciwko kodowanemu w wektorze znacznikowi oczyszczania białek. Następnie odpowiednie konstrukty do wielkoskalowej produkcji białka są przejściowo transfekowane przy użyciu polietylenoiminy (PEI) w 10-warstwowych fabrykach komórkowych (cell factories). Białka wydzielone do litrowych objętości warunkowanej pożywki są zagęszczane do ilości możliwych do dalszej obróbki za pomocą filtracji przepływu stycznego, a następnie oczyszczane metodą chromatografii powinowactwa anti-HA. Użyteczność tej platformy została potwierdzona zdolnością do ekspresji miligramowych ilości cytokin, receptorów cytokin, receptorów powierzchniowych komórek, wewnętrznych czynników restrykcyjnych oraz wirusowych glikoprotein. Metoda ta została również z sukcesem zastosowana w wyznaczeniu struktury trymerycznej glikoproteiny ebolavirus 5,10.
Podsumowując, platforma ta oferuje łatwość obsługi, szybkość i skalowalność, maksymalizując jednocześnie jakość i funkcjonalność białek. Ponadto nie jest wymagany żaden dodatkowy sprzęt poza standardowym inkubatorem z nawilżaniem i CO2. Procedura ta może zostać szybko rozszerzona na systemy o większej złożoności, takie jak koekspresja kompleksów białkowych, antygenów i przeciwciał, produkcja cząstek wirusopodobnych do szczepionek lub produkcja adenowirusów lub lentiwirusów do transdukcji trudnych linii komórkowych.

W erze genomiki post-humanistycznej dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju w obszarze strukturalnym, funkcjonalnym oraz terapeutycznym. W niniejszej pracy opisujemy system ekspresji białek w skali testowej i przemysłowej z wykorzystaniem ludzkich komórek embrionalnej nerki 293T, który może być stosowany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Ekspresja białek rekombinowanych w bakteriach, zazwyczaj w *E. coli*, jest najskuteczniejszą strategią uzyskiwania białek w ilościach rzędu miligramów. ...

W tym filmie opisujemy efektywną pod względem czasu i kosztów procedurę ekspresji białek wydzielniczych z linii komórkowych HEK 293T. Początkowo, w płytce sześciodołkowej, przygotowywana jest hodowla komórek HEK 293T o 40% konfluencji. Następnie przygotowuje się mieszaninę do transfekcji poprzez rozcieńczenie GeneJuice, a następnie plazmidów testowych w medium bezsurowiczym.Mieszaninę do transfekcji nanosi się na komórki, które następnie inkubuje się w temperaturze 37 °C, aby umożliwić ekspresję białka. Wykrywanie białka w nadnadczynie można przeprowadzić za pomocą metody western blot. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu procedurę można przeskalować, wykorzystując 10-warstwowe fabryki komórkowe.Komórki są transfekowane z użyciem PEI jako odczynnika do transfekcji. Białko można odzyskiwać z supernatantów hodowli, stosując filtrację przepływową styczną, a następnie chromatografię powinowactwa. Ostatecznie platforma ta pozwala na ekspresję szerokiego zakresu makrocząsteczek w ilościach liczonych w miligramach.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod, takich jak ekspresja w komórkach owadzich oparta na wirusach baculowirusowych, jest możliwość przesiewania i skalowania dużej liczby konstruktów w celu uzyskania ekspresji w ciągu zaledwie trzech tygodni. Procedurę tę zaprezentują Hello Aiden, Shada Zini oraz Jonathan Cook, trzej doktoranci z mojego laboratorium. Rozpocznij od wysiania 250 000 komórek HEK 293T na dołek w objętości 1 mL w płytce 6-dołkowej; dodaj 1 mL na dołek pożywki DMEM uzupełnionej o 10% FBS i penstre, a następnie zakręć płytką, aby równomiernie rozprzestrzenić komórki.Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze z wilgotnym powietrzem i 5% carbon dioxide w temperaturze 37 stopni Celsius. Gdy komórki osiągną konfluencję na poziomie około 40%, zastąp supernatant dwoma mililitrami świeżej pożywki, aby przygotować mieszaninę do transfekcji. Najpierw odmierz 90 mikrolitrów serum-free DMEM do probówki typu eppendorf.Następnie należy dodać 3 µL GeneJuice, odczynnika do transfekcji, delikatnie wymieszać zawartość probówki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie dodać 10 µL roztworu zapasowego oczyszczonego plazmidowego DNA z mini-prepu o stężeniu 100 ng/µL, który ma zostać poddany transfekcji.Wymieszaj zawartość probówki i pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut. Aby przeprowadzić transfekcję, nanieś mieszaninę na komórki HEC 2 9 3 T. Kropla po kropli, delikatnie kołysz płytką, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę do transfekcji.Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej studzienki i inkubuj przez kolejne 48 godzin. Trzy dni po transfekcji zbierz supernatant i określ poziomy ekspresji białka docelowego za pomocą metody western blot.Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu można zwiększyć skalę procedury transfekcji. Używając 10-warstwowych fabryk komórek, należy napełnić fabrykę 1,2 litrami DMEM uzupełnionego o 5% FBS. Następnie dodaje się 200 milionów komórek HEC 2 9 3 T, rozdzielając je równomiernie na wszystkie warstwy.Cztery kolby do hodowli komórkowych T 225 cm², hodowane do 100% konfluencji, zawierają około 200 milionów komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37°C przez noc. Przygotuj mieszaninę do transfekcji w kolbie T 75, rozcieńczając 840 µg DNA w 84 ml sterylnego 1× PBS.Dodaj 2,5 ml roztworu polietyleniminy (PEI) o stężeniu 1 mg/ml i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny. Następnie powoli wlej mieszaninę do transfekcji do cell factory i dokładnie ją rozprowadź.Warstwy ogólne. Dodaj kwas walproowy do końcowego stężenia 4 mM. Zwiększy to wydajność ekspresji po dodaniu mieszaniny do transfekcji.Inkubować hodowlę w temperaturze 37°C przez cztery dni, aby umożliwić ekspresję białka. Zebrać pożywkę cztery dni po transfekcji i niezwłocznie oczyścić fabrykę komórkową w celu ponownego użycia; odwirować zebraną pożywkę przy 6 000 G przez 30 minut w temperaturze 4°C, a następnie przefiltrować ją przez aparat do filtracji próżniowej z filtrem sterylnym 0,22 μm, aby usunąć wszelkie cząstki stałe. Następnie użyć systemu tangentialnej filtracji przepływowej Centra Mate, aby skoncentrować nadsącz do objętości 75 ml.Po skoncentrowaniu nadsączu białko docelowe można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa. W tym doświadczeniu oczyszczono podjednostki z przyłączonymm tagiem HA domeny zewnątrzkomórkowej ludzkich receptorów AAL two, wykorzystując opisany tutaj system wielkoskalowy, a następnie chromatografię o wysokim powinowactwie przeciwko THA. Wykazano to w analizie SDS-PAGE barwionej kumasy.Domeny pozakomórkowe podjednostek alfa i gamma receptora interleukiny 2 migrują przy masach cząsteczkowych 40 kilodaltonów i 46 kilodaltonów. Heterogeniczność glikanów EnLink obecnych na IL two R alpha i IL two R gamma spowodowała poszerzenie prążków na żelu SDS-PAGE. Prążek o wyższej masie cząsteczkowej reprezentuje zanieczyszczającą BSA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać sprawiedliwą wiedzę na temat tego, jak ekspresować białka z ludzkich hodowli komórkowych przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórkowych. Należy pamiętać, że komórki HC 2 93 T są uważane za materiał biologicznie niebezpieczny i powinny być obsługiwane na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Prosimy o stałe noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej; powierzchnie powinny być dezynfekowane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi.

a-convenient-general-expression-platform-for-production-secreted

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wygodna i ogólna platforma ekspresji dla produkcji wydzielanych białek z ludzkich komórek

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj efektywną metodę ekspresji białek wydzielanych z komórek HEK 293T. Ta technika umożliwia produkcję białek rekombinowanych w natywnych konformacjach z możliwością skalowania.

Wygodna i uniwersalna platforma ekspresyjna do produkcji białek wydzielanych z komórek ludzkich

Przeglądaj więcej filmów