Wygodna i ogólna platforma do produkcji wydzielanych białek z komórek ludzkich
31 lipca 2012
W erze post-ludzkiej genomiki, dostępność rekombinowanych białek w natywnych konformacjach jest kluczowa dla strukturalnych, funkcjonalnych i terapeutycznych badań i rozwoju. W tym miejscu opisujemy testowy i wielkoskalowy system ekspresji białek w ludzkich embrionalnych komórkach 293T nerki, który można wykorzystać do produkcji różnych rekombinowanych białek.
W tym filmie opisujemy efektywną czasowo i kosztowo procedurę ekspresji wydzielanych białek z wytworzonych limfocytów T Durant HEC 2 9 3. Początkowo na sześcioświatowej płytce przygotowuje się 40% kofluentną hodowlę komórek T HEC 2 9 3. Mieszanina transfekcyjna jest następnie wytwarzana przez rozcieńczenie soku genowego, a następnie testuje plazmidy w pożywce wolnej od surowicy.
Mieszanina transfekcyjna jest osadzana na komórkach, które są następnie inkubowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić ekspresję białka. Wykrywanie białka w czynniku supan można przeprowadzić za pomocą western blot. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu, procedura może być skalowana w górę przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek.
Komórki są transfekowane przy użyciu PEI jako transfekcji. Odczynnik i białko można zebrać z supernatantów hodowlanych za pomocą filtracji o przepływie stycznym, a następnie chromatografii powinowactwa. Ostatecznie platforma ta umożliwia ekspresję szerokiej gamy makrocząsteczek w ilościach miligramowych.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja komórek owadów na podstawie wirusa balo, jest to, że duża liczba konstruktów może być badana przesiewowo i skalowana pod kątem ekspresji, a wyniki uzyskuje się w ciągu trzech tygodni. Tę procedurę zademonstrują Hello Aiden dla Shada Zini i Jonathan Cook. Trzej doktoranci z mojego laboratorium: Zacznij od wysiewu 250 000 komórek T HEC 2 9 3 na studzienkę w objętości jednego mililitra na płytce sześciodołkowej, dodaj jeden mililitr na dołek 10% FBS pentre uzupełnionego DMEM i S zakręć płytką, aby równomiernie rozproszyć komórki.
Następnie inkubuj komórki przez noc w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną płynność około 40%, zastąp SUP natum dwoma mililitrami świeżej pożywki, aby przygotować mieszankę transfekcyjną. Najpierw porcja 90 mikrolitrów wolnego DMEM w surowicy w probówce eend orph.
Następnie dodaj trzy mikrolitry soku genowego, odczynnik do transfekcji delikatnie wymieszaj zawartość probówki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100 nanogramów na mikrolitr bulionu mini oczyszczonego plazmidu, DNA. Do transfekcji.
Wymieszaj zawartość probówki i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 15 minut. Aby przeprowadzić transfekcję, należy umieścić mieszaninę na limfocytach T HEC 2 9 3. Kropla po kropli, delikatnie napęczniaj płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcji.
Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 24 godziny później dodaj jeden mililitr świeżej pożywki do każdej studzienki i inkubuj przez kolejne 48 godzin. Trzy dni po transfekcji zbierz supinat i wykryj poziomy ekspresji interesującego białka za pomocą western blot.
Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu, procedura transfekcji może zostać rozszerzona. Korzystając z 10-warstwowych fabryk komórek, napełnij fabrykę komórek 1,2 litra DMEM uzupełnionym 5% FBS. Następnie dodaj 200 milionów limfocytów T HEC 2 9 3, równomiernie rozprowadzając komórki we wszystkich warstwach.
Cztery kolby do hodowli komórek T o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych wyhodowane do 100% płynności Co zawierają około 200 milionów komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Przygotować mieszaninę transfekcji w kolbie T 75, rozcieńczając 840 mikrogramów DNA w 84 mililitrach sterylnego materiału jeden raz. Pbs.
Dodaj 2,5 mililitra jednego miligrama na mililitr roztworu jonów polietylenu lub PEI i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny. Następnie powoli wlej mieszaninę transfekcji do fabryki komórek i dokładnie ją rozprowadz.
Warstwy ogólne. Dodać kwas walproinowy w końcowym stężeniu czterech milimolów. Zwiększy to wydajność ekspresji po dodaniu mieszaniny transfekcyjnej.
Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery dni, aby umożliwić ekspresję białka. Zbierz pożywkę cztery dni po transfekcji i natychmiast oczyść fabrykę komórek do ponownego użycia, odwiruj zebrane podłoże o sile 6 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltruj je przez aparat filtrujący próżniowy o średnicy 0,22 mikrona w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych. Następnie użyj systemu filtracji stycznego przepływu centra mate, aby stężyć supernatant do 75 mililitrów.
Po zagęszczeniu supernatantu, białko będące przedmiotem zainteresowania można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa. W tym eksperymencie oczyściliśmy podjednostki HA tachowane w domenie zewnątrzkomórkowej ludzkich receptorów AAL za pomocą opisanego tutaj systemu na dużą skalę, a następnie chromatografii anty THA o wysokim powinowactwie. Jak pokazano w tej analizie strony SDS poplamionej kumasi.
Domeny zewnątrzkomórkowe podjednostek receptora alfa i gamma interleukiny migrują z masą cząsteczkową 40 kilodaltonów i 46 kilodaltonów. Niejednorodność glikanów EnLink obecnych na IL dwa R alfa i IL dwa R gamma spowodowała poszerzenie pasma na żelu strony SDS. Pasmo o wyższej masie cząsteczkowej reprezentuje zanieczyszczające BSA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać białka z hodowli komórek ludzkich przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek. Nie zapominaj, że limfocyty T HC 2 93 są uważane za niebezpieczne biologicznie i powinny być traktowane na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Należy zawsze nosić odpowiednią odzież ochrony osobistej, a powierzchnie należy dezynfekować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia czasowo i kosztowo efektywną procedurę ekspresji białek wydzielniczych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek nerki 293T. Metoda ta umożliwia produkcję białek rekombinowanych w natywnych konformacjach, co jest niezbędne w wielu zastosowaniach badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekspresja białek
- Białka rekombinowane
- Techniki hodowli komórkowej
Wstęp
- Białka rekombinowane są kluczowe dla badań strukturalnych i funkcjonalnych.
- Ludzkie embrionalne komórki nerki 293T są szeroko stosowane do produkcji białek.
- Efektywne metody ekspresji białek mogą usprawnić badania oraz rozwój terapii.
- Western blotting jest powszechną techniką detekcji białek.
Cel badania
- Opis skalowalnego systemu ekspresji białek.
- Przedstawienie szczegółowego protokołu produkcji białek wydzielanych.
- Ułatwienie identyfikacji odpowiednich konstruktów do dalszych badań.
Zastosowane metody
- Przygotowanie hodowli komórek 293T o 40% konfluencji w płytce sześciodołkowej.
- Przygotowanie mieszaniny do transfekcji z użyciem pożywki bezsurowiczej.
- Inkubacja komórek w temperaturze 37 °C w celu ekspresji białek.
- Wykrywanie białek w supernatancie metodą western blot.
Główne wyniki
- Skuteczna ekspresja białek wydzielanych z komórek 293T.
- Identyfikacja odpowiednich konstruktów do produkcji białek.
- Skalowalność procedury z wykorzystaniem 10-warstwowych fabryk komórkowych.
- Prezentacja kosztowo efektywnego podejścia do produkcji białek rekombinowanych.
Wnioski
- Opisana metoda jest wydajna w produkcji białek rekombinowanych.
- Podejście to można skalować w celu zaspokojenia większych potrzeb produkcyjnych.
- Western blotting jest skuteczną metodą potwierdzania ekspresji białek.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wydajna produkcja wydzielanych ludzkich białek w ich natywnych konformacjach jest kluczowym etapem w procesie odkrywania leków biofarmaceutycznych i badań przedklinicznych. Ta platforma oparta na komórkach HEK 293T umożliwia szybkie, skalowalne i kosztowo efektywne generowanie miligramowych ilości funkcjonalnych białek, wspierając badania strukturalne, biofizyczne i biochemiczne. Podejście to bezpośrednio odpowiada na potrzebę uzyskania ssaczych modyfikacji potranslacyjnych i przyspiesza przesiew konstruktów oraz zwiększanie skali produkcji dla różnorodnych celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia szybki screening wielu konstruktów w celu zidentyfikowania optymalnych kandydatów do ekspresji białek.
- Wspiera walidację funkcjonalną białek wydzielanych z natywnymi modyfikacjami potranslacyjnymi.
- Ułatwia badanie szlaków sygnałowych oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego dla celów ludzkich i wirusowych.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowaną i skalowalną produkcję białek na potrzeby późniejszego opracowywania analiz.
- Gwarantuje powtarzalne, ilościowe wydajności białek, odpowiednie do standaryzacji pomiędzy różnymi platformami.
- Umożliwia niezawodne dostarczanie białek do przesiewania związków oraz badań wiązania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera produkcję białek istotnych dla przebiegu choroby, w tym cytokin i glikoprotein wirusowych, na potrzeby badań translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki gwarancji jakości i funkcjonalności białek.
- Zmniejsza ryzyko wystąpienia artefaktów glikozylacji niepochodzących z organizmów ludzkich w modelach przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Platforma ta integruje procesy od wczesnego przesiewania konstruktów po wielkoskalową produkcję białek, stanowiąc pomost pomiędzy biologią odkrywczą a badaniami przedklinicznymi.
- Biologia odkrywcza: Przyspiesza testowanie hipotez i selekcję konstruktów poprzez umożliwienie równoległej ekspresji i detekcji za pomocą metody western blot.
- Screening: Dostarcza białka gotowe do analizy z możliwością skalowania wydajności i zapewnieniem spójnej jakości.
- Analityka: Zapewnia wyniki ilościowe niezbędne do porównania wydajności konstruktów i optymalizacji oczyszczania.
- Badania translacyjne: Dostosowuje produkcję białek do systemów istotnych dla przebiegu chorób oraz badań nad biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Oferuje uogólniony przepływ pracy, który można zaadaptować do różnych klas białek i potrzeb badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Optymalizuje produkcję białek przy minimalnym zapotrzebowaniu na specjalistyczny sprzęt i krótkim czasie realizacji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia szybsze podejmowanie decyzji go/no-go i poprawia efektywność kapitałową we wczesnych fazach B+R.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie wysokiej jakości odczynników dla wielu programów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli komórek ssaków oraz technik oczyszczania białek.
- Niezbędny jest dostęp do standardowych inkubatorów CO2 oraz systemów filtracji przepływu stycznego do skalowania procesu.
- Wymagana jest standaryzacja projektu konstruktów i testów detekcyjnych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do koekspresji, złożonych kompleksów białkowych oraz produkcji wektorów wirusowych.
- W przypadku pracy z komórkami HEK 293T konieczne jest stosowanie środków ostrożności dla materiałów biologicznie niebezpiecznych i zachowanie poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
