Name: Wygodna i ogólna platforma do produkcji wydzielanych białek z komórek ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Poznaj efektywną metodę ekspresji białek wydzielanych z komórek HEK 293T. Ta technika umożliwia produkcję białek rekombinowanych w natywnych konformacjach z możliwością skalowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez Ontario HIV Treatment Network Research Operating Grant (ROG-G645) oraz Canadian Institutes of Health Research New Investigator Award (MSH-113554) dla JEL, oraz stypendia University of Toronto dla HA, FCA i JDC. Autorzy chcieliby podziękować Marnie Fusco, Dafna Abelson i dr Erica Ollmann Saphire z The Scripps Research Institute (La Jolla, CA) za dostarczenie komórek, wektora ekspresji ebolawirusa GP i ogólnej porady.

1. Preparation Work - Constructs and Cell Cultures
Przed rozpoczęciem protokołu, gen interesujący powinien być zoptymalizowany kodonowo dla ekspresji w komórkach ssaczy i sklonowany do odpowiedniego wektora ekspresji za pomocą standardowych technik biologii molekularnej. Aby zapewnić najwyższą szansę na pomyślną ekspresję, należy wygenerować wiele wariantów genu interesującego. Wiele wektorów ekspresji ssaków jest dostępnych komercyjnie i ma różne tagi do oczyszczania (polihistydyna, hemaglutyniny, streptawidyna, HALO-Tag, glutationowa S-transferaza, między innymi). Wolimy używać wektora pDISPLAY, który koduje dla mocnego promotora ludzkiego wirusa cytomegalii, sygnału wydzielania Ig κ, tagu do oczyszczania hemaglutyny i ma C-końcowy kotwica przezbłonowa, aby przekierować białko przez ścieżkę wydzielniczą do wyświetlania na błonie plazmatycznej. Zazwyczaj wstawiamy kodon stop przed kotwica przezbłonową kodowaną przez wektor, aby pozwolić na wydzielanie białka do skondycjonowanego medium.
Komórki nerek zarodkowych człowieka (HEK) 293T są szeroko dostępne i łatwo hodować i transfektować. HEK 293T są rutynowo używane do ekspresji białek ssaków, ale są uważane za niebezpieczne biologicznie i powinny być obsługiwane na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2. Proszę nosić odpowiednią odzież ochronną; prace powinny być wykonywane w zatwierdzonym szafie bezpieczeństwa biologicznego z zastosowaniem technik aseptycznych. Wszystkie odpady i powierzchnie powinny być dezynfekowane zgodnie z instytucjonalnymi i rządowymi wytycznymi. Zaleca się, aby komórki były testowane na zakażenie mykoplazmą przed użyciem. Komórki mogą być traktowane cyprofloksacyną (10 μg/ml) przez dziesięć dni, aby wyeliminować jakiekolwiek źródło zakażenia mykoplazmą spp. Ogólne protokoły propagacji komórek HEK 293T są przedstawione osobno (Rysunek 1).
Dodatkowe zagadnienia dotyczące testowej i dużej skali ekspresji białek są omówione w 11-15.
2. Małoskalowa testowa ekspresja
Po zaprojektowaniu i wygenerowaniu konstruktów, małoskalowe testowe transfekcje mogą być przeprowadzone za pomocą komórek HEK 293T; schemat podsumowujący proces jest przedstawiony poniżej (Rysunek 1).
<ol>
 <li>Użyj kolb do hodowania komórek T75 cm2 lub T225 cm2 (w zależności od liczby testowych ekspresji do wykonania) do wyhodowania komórek HEK 293T i podzielić komórki co 2-3 dni, gdy komórki są 100% konfluencyjne (Rysunek 1).</li>
 <li>Zasiej 2.5 x 105 komórek HEK 293T na dole w 6-dołowej płytce i dodaj 2 ml DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS, delikatnie mieszaj płytkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie komórek w każdym dole, i inkubatoruj przez noc w 37 °C w wilgotnej komorze z 5% CO2.</li>
 <li>Kiedy komórki HEK 293T osiągną 40% konfluencję, wyrzucić medium i dodać świeże 2 ml DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS do dołów. Przeprowadzić testy transfekcji.</li>
 <li>Wymieszaj 90 μl serum-wolnego DMEM do sterylnego 1.5 ml mikrocentrfużującego probówka. Wlej 3 μl GeneJuice do serum-wolnego DMEM i delikatnie mieszaj probówkę (finger vortex). Inkubatoruj przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Dodaj 1 μg MiniPrep oczyszczonego DNA plasmidowego (DNA stock= 100 ng/μl) do mieszanki DMEM-GeneJuice, mieszaj palcami i inkubatoruj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wlej mieszankę transfekcyjną kroplowo na komórki HEK 293T i delikatnie mieszaj 6-dołową płytkę, aby zapewnić równomierne rozproszenie mieszanki transfekcyjnej. Inkubatoruj 6-dołową płytkę w 37 °C w wilgotnej komorze z 5% CO2.</li>
 <li>Dodaj 1 ml świeżego DMEM z 1X pen/strep i 10% (v/v) FBS do każdego dołu 24 godziny po transfekcji i inkubatoruj przez kolejne 48 godzin (łącznie 72 godzin).</li>
 <li>Pobierz 1 ml supernatantu z każdego dołu w trzecim dniu po transfekcji i mikrocentrfużuj próbki przy 16,000 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przeprowadź analizę western blot zgodnie z Rysunkiem 2. Próbki mogą być przechowywane w 4 °C. Czas przechowywania w 4 °C zależy od białka.</li>
</ol>
3. Małoskalowa testowa ekspresja i oczyszczanie
Gdy konstrukt został zidentyfikowany, wytwarzanie białka rekombinantnego w ilości miligramowej osiąga się przez transfekcję PEI komórek HEK 293T przylegających do podłoża za pomocą 10-warstwowych fabryk komórek (Rysunek 2; 6360 cm2 powierzchni). W przypadku bardziej eksploratorskich badań, mniejsze fabryki komórek lub kolby T-flask (Tabela 1) mogą być użyte.
<ol>
 <li>Oczyść 1 mg DNA do transfekcji za pomocą zestawu do oczyszczania plasmidowego MaxiPrep

<ol>
	<li>Celik, E., Calik, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+proteins+by+yeast+cells.">Production of recombinant proteins by yeast cells.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Yokoyama, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+expression+systems+for+structural+genomics+and+proteomics.">Protein expression systems for structural genomics and proteomics.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 7, 39-43 (2003).</li><li>Nettleship, J. E., Assenberg, R., Diprose, J. M., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+production+of+proteins+in+insect+and+mammalian+cells+for+structural+biology.">Recent advances in the production of proteins in insect and mammalian cells for structural biology.</a> J. Struct. Biol. 172, 55-65 (2010).</li><li>Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis:+Applications+come+of+age.">Cell-free protein synthesis: Applications come of age.</a> Biotechnol. Adv. , (2011).</li><li>Lee, J. E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+Ebola+virus+glycoprotein+bound+to+an+antibody+from+a+human+survivor.">Structure of the Ebola virus glycoprotein bound to an antibody from a human survivor.</a> Nature. 454, 177-182 (2008).</li><li>Bowden, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+Nipah+and+Hendra+virus+attachment+to+their+cell-surface+receptor+ephrin-B2.">Structural basis of Nipah and Hendra virus attachment to their cell-surface receptor ephrin-B2.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 15, 567-572 (2008).</li><li>Evans, M. J., Hartman, S. L., Wolff, D. W., Rollins, S. A., Squinto, S. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+expression+of+an+anti-human+C5+chimeric+Fab+utilizing+a+vector+that+replicates+in+COS+and+293+cells.">Rapid expression of an anti-human C5 chimeric Fab utilizing a vector that replicates in COS and 293 cells.</a> J. Immunol. Methods. 184, 123-138 (1995).</li><li>Ye, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+protein+expression+in+scalable+CHO+transient+transfection.">High-level protein expression in scalable CHO transient transfection.</a> Biotechnol. Bioeng. 103, 542-551 (2009).</li><li>Wurm, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+recombinant+protein+therapeutics+in+cultivated+mammalian+cells.">Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Hessell, A. J., Burton, D. R., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+and+tactics+used+in+determining+the+structure+of+trimeric,+prefusion+Ebola+virus+GP.">Techniques and tactics used in determining the structure of trimeric, prefusion Ebola virus GP.</a> Acta Cryst. 65, 1162-1180 (2009).</li><li>Aricescu, A. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+expression:+developments+for+structural+proteomics.">Eukaryotic expression: developments for structural proteomics.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 62, 1114-1124 (2006).</li><li>Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+time-+and+cost-efficient+system+for+high-level+protein+production+in+mammalian+cells.">A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells.</a> Acta. Crystallogr. D Biol. Crystallogr. D62, 1243-1250 (2006).</li><li>Chang, V. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycoprotein+structural+genomics:+solving+the+glycosylation+problem.">Glycoprotein structural genomics: solving the glycosylation problem.</a> Structure. 15, 267-273 (2007).</li><li>Lee, J. E., Fusco, M. H., Saphire, E. O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+platform+for+screening+expression+and+crystallization+of+glycoproteins+produced+in+human+cells.">An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells.</a> Nature Protocols. 4, 592-604 (2009).</li><li>Nettleship, J. E., Rahman-Huq, N., Owens, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+glycoproteins+by+transient+expression+in+Mammalian+cells.">The production of glycoproteins by transient expression in Mammalian cells.</a> Methods Mol. Biol. 498, 245-263 (2009).</li><li>Neil, S. J., Zang, T., Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetherin+inhibits+retrovirus+release+and+is+antagonized+by+HIV-1+Vpu.">Tetherin inhibits retrovirus release and is antagonized by HIV-1 Vpu.</a> Nature. 451, 425-430 (2008).</li><li>Nakamura, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterodimerization+of+the+IL-2+receptor+beta-+and+gamma-chain+cytoplasmic+domains+is+required+for+signalling.">Heterodimerization of the IL-2 receptor beta- and gamma-chain cytoplasmic domains is required for signalling.</a> Nature. 369, 330-333 (1994).</li><li>Wang, X., Rickert, M., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+quaternary+complex+of+interleukin-2+with+its+alpha,+beta,+and+gammac+receptors.">Structure of the quaternary complex of interleukin-2 with its alpha, beta, and gammac receptors.</a> Science. 310, 1159-1163 (2005).</li></ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Fabryki komórkowe z 10 warstwą są efektywnym pojemnikiem do produkcji miligramowych ilości białka. Główną zaletą używania fabryki komórkowej w porównaniu z innymi tradycyjnymi pojemnikami, takimi jak butelki wałeczkowe, flaszki wstrząsające czy flaszki rotacyjne, jest to, że nie wymagają zakupu dodatkowego sprzętu laboratoryjnego. Standardowy inkubator CO2 (~6,0 stóp sześciennych) z łatwością pomieści cztery fabryki komórkowe z 10 warstwą (Rys. 2). Ponadto te pojemnik...

<table><tbody><tr><td>Alkaline phosphatase (BCIP/NBT) liquid substrate solution</td><td>Sigma</td><td>B6404</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic/Antimycotic, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA affinity matrix, clone 3F10</td><td>Roche</td><td>1815016</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA murine mAb, clone 16B12</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask, T75 cm2 tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture flask, T225 cm2 tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>431082</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture plates,6-well tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Cell factory, 10-layer CellSTACK</td><td>Corning</td><td>3312</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Omega 5K Cassette</td><td>Pall</td><td>OS005C12</td><td></td></tr><tr><td>Centramate Omega 30K Cassette</td><td>Pall</td><td>OS030C12</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography glass column, 1.0x10 cm</td><td>Kontes</td><td>4204001010</td><td></td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified Eagle's media (DMEM)</td><td>Sigma</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS), heat inactivated</td><td>Invitrogen</td><td>12484-028</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD transfection reagent</td><td>Promega</td><td>4709691001</td><td></td></tr><tr><td>GeneJuice transfection reagent</td><td>EMD/Merck</td><td>70967-6</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG F(ab')2 alkaline</td><td>Thermo Scientific</td><td>31324</td><td></td></tr><tr><td>phosphatase-conjugated antibody</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemagglutinin (HA) peptide, 100 mg</td><td>Genscript</td><td>custom synthesis</td><td></td></tr><tr><td>(sequence: YPYDVPDYA; 95% purity)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>Household bleach (4% w/v sodium hypochlorite)</td><td>various brands are available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH07850</td><td></td></tr><tr><td>MiniPrep plasmid purification kit, PureLink Quick</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>MaxiPrep plasmid purification kit, PureLink HiPure</td><td>Invitrogen</td><td>K2100-07</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>pDISPLAY expression vector</td><td>Invitrogen</td><td>V660-20</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin (pen/strep), 100X</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered saline (PBS), sterile 1X</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleneimine (PEI), linear 25 kDa</td><td>Polyscience</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk dry powder</td><td>Carnation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GP PES vacuum filtration unit,</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &mu;m, 500 ml capacity</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Invitrogen</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Valproic acid</td><td>Sigma</td><td>P4543</td><td></td></tr><tr><td>Centramate tangential flow system</td><td>Pall</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 humidified incubator, standard 6.0 cu. ft.</td><td>various brands are available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis and transfer unit</td><td>various brands are available</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator, 37 &deg;C</td><td>various brands are available</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a convenient and general expression platform for the production of secreted proteins from human cells

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Ekspresja białka rekombinowanego w bakteriach, zazwyczaj E. coli, była najbardziej skuteczną strategią dla ekspresji białek w ilościach miligramowych. Jednak bakterie jako gospodarze prokariotyczni często nie są odpowiednie do ekspresji ludzkich, wirusowych lub eukariotycznych białek ze względu na toksyczność obcego makrocząsteczki, różnice w maszynerii fałdowania białek, lub ze względu na brak określonych modyfikacji ko- lub posttranslacyjnych w bakteriach. Systemy ekspresji oparte na drożdżach (P. pastoris lub S. cerevisiae) 1,2, komórkach owadów zarażonych bakulovirusem (S. frugiperda lub T. ni) 3 oraz wolne od komórek systemy translacji in vitro 2,4 zostały pomyślnie wykorzystane do produkcji białek ssaczych. Intuicyjnie, najlepszym rozwiązaniem jest użycie gospodarza ssaczego, aby zapewnić produkcję rekombinowanych białek, które zawierają odpowiednie modyfikacje posttranslacyjne. Kilka linii komórek ssaczych (Ludzkie Zarodkowe Komórki Nerkowe (HEK) 293, komórki CV-1 w Origin zawierające duże antygen T SV40 (COS), Komórki Jajasteczek Chomika Chińskiego (CHO) i inne) zostało pomyślnie wykorzystanych do nadmiernej ekspresji miligramowych ilości różnych ludzkich białek 5-9. Jednak zalety używania komórek ssaczych są często przeciwwskazaniami wyższych kosztów, wymogu specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, niższych wydajności białka i długiego czasu rozwoju stabilnych linii komórek ekspresujących. Zwiększenie wydajności i produkcja białek szybciej, przy jednoczesnym utrzymaniu niskich kosztów, są głównymi czynnikami dla wielu akademickich i komercyjnych laboratoriów.
Tutaj opisujemy czasowo i efektywną pod względem kosztów, dwuczęściową procedurę ekspresji wydzielanych białek ludzkich z przylegających komórek HEK 293T. Ten system jest zdolny do produkcji mikrogramowych do miligramowych ilości funkcjonalnych białek dla badań strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. Pierwsza część polega na produkcji wielu konstruktów genu interesującego się równolegle i przejściowej transfekcji do przylegających komórek HEK 293T w małej skali. Wykrywanie i analiza rekombinowanego białka wydzielanego do środowiska kultury komórkowej jest przeprowadzane przez analizę western blot przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwciał skierowanych przeciwko wektorowemu zakodowanemu tagowi do oczyszczania białka. Następnie, odpowiednie konstrukty do produkcji białka na dużą skalę są przejściowo transfekowane za pomocą polietyleniminy (PEI) w 10-warstwowych fabrykach komórkowych. Białka wydzielane do litrowych objętości warunkowego medium są skoncentrowane do zarządzalnych ilości przy użyciu filtracji przepływowej stycznej, następnie czyszczone przez chromatografię powinowacza do HA. Przydatność tej platformy jest dowodzona przez jej zdolność do ekspresji miligramowych ilości cytokin, receptorów cytokin, receptorów powierzchni komórkowych, wrodzonych czynników restrykcyjnych i wirusowych glikoprotein. Ta metoda została również pomyślnie zastosowana w oznaczaniu strukturalnym trimerycznej glikoproteiny ebolawirusa 5,10.
Podsumowując, ta platforma oferuje łatwość użycia, szybkość i skalowalność, jednocześnie maksymalizując jakość i funkcjonalność białka. Co więcej, nie jest wymagane żadne dodatkowe sprzęt, oprócz standardowego inkubatora z wilgotnym CO2. Ta procedura może być szybko rozszerzona do systemów o większej złożoności, takich jak współekspresja kompleksów białkowych, antygenów i przeciwciał, produkcja cząstek przypominających wirusa do szczepionek lub produkcja adenowirusów lub lentiwirusów do transdukcji trudnych linii komórek.

Watch this Scientific Journal Video about A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells at JoVE.com

Wygodna i ogólna platforma ekspresji dla produkcji wydalanych białek z ludzkich komórek

W erze post-genomiki ludzkiej, dostępność białek rekombinowanych w natywnych konformacjach jest kluczowa dla badań i rozwoju strukturalnego, funkcjonalnego i terapeutycznego. Przedstawiamy tu system ekspresji białek na skalę laboratoryjną i przemysłową w ludzkich komórkach nerkowych embrionalnych 293T, który może być wykorzystany do produkcji różnorodnych białek rekombinowanych.

Wygodna i ogólna platforma ekspresji dla produkcji wydzielanych białek z ludzkich komórek

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

W tym filmie opisujemy czasowo i kosto efektywną procedurę ekspresji białek sekretowanych z ludzkich komórek HEC 2 9 3 T. Początkowo przygotowuje się 40% konfluencyjną kulturę komórek HEC 2 9 3 T na sześcio-guzikowej płytce. Następnie produkuje się mieszaninę transfekcyjną poprzez rozcieńczenie soku genowego, a następnie testowych plazmidów w środowisku bez osocza.Mieszanina transfekcyjna jest nakładana na komórki, które następnie inkubowane są w 37 stopniach Celsjusza, aby umożliwić ekspresję białka. Wykrywanie białka w supan czynniku można przeprowadzić za pomocą western blot. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu, procedurę można skalować za pomocą 10-warstwowych fabryk komórek.Komórki są transfekowane za pomocą PEI jako reagentu transfekcyjnego. Białko można zebrać z nadkultur kulturowych za pomocą filtracji przepływowej stycznej, a następnie chromatografii powinowactwo. Ostatecznie, ta platforma pozwala na ekspresję szerokiego zakresu makrocząsteczek w ilościach miligramowych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja komórek owadów na bazie wirusa balo, jest to, że dużą liczbę konstrukcji można przesiewać i skalować pod kątem

a-convenient-general-expression-platform-for-production-secreted

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano wysokoprzepustową, zautomatyzowaną platformę rozwoju linii komórkowych do produkcji białkowych leków terapeutycznych. Wdrożenie sortera komórek BD FACS Aria, obrazownika CloneSelect Imager oraz systemu do obsługi cieczy TECAN Freedom EVO wykazało znaczące zwiększenie wydajności przetwarzania w procesie rozwoju linii komórkowych, przy jednoczesnej poprawie jakości linii komórkowych i wysokiej powtarzalności.

Wysokoprzepustowa zautomatyzowana platforma do opracowywania linii komórkowych produkcyjnych dla białkowych produktów terapeutycznych

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

Rozwój biotynylowalnych białek fuzyjnych ma wiele potencjalnych zastosowań w różnych dziedzinach badań. Inżynieria białek rekombinowanych to prosta procedura, która jest opłacalna, zapewniając wysoką wydajność niestandardowych białek.

Ekspresja, izolacja i oczyszczanie rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych białek biotynylowanych do regeneracji tkanki nerwowej

Ekspresja białek rekombinowanych przez systemy ssaków staje się atrakcyjną metodą wytwarzania kompleksów białkowych dla biologii strukturalnej. W tym artykule przedstawiamy prosty, ale bardzo wydajny system ekspresji wykorzystujący hodowane w zawiesinie komórki ssaków do oczyszczania kompleksów białkowych do badań strukturalnych.

Ekspresja białek rekombinowanych w biologii strukturalnej w komórkach zawiesinowych HEK 293F: nowatorskie i dostępne podejście

Opisujemy tutaj opłacalny system ekspresji granzymu wykorzystujący komórki HEK293T, który daje wysokie plony czystej, w pełni glikozylowanej i enzymatycznie aktywnej proteazy.

Wysokowydajny i ekonomiczny system ekspresji ludzkich granzymów w komórkach ssaków

To jest szybki, efektywny kosztowo protokół produkcji wydzielanych, glikozylowanych białek ssaków i późniejszego jednoetapowego oczyszczania z wystarczającą wydajnością jednorodnego białka do krystalografii rentgenowskiej i innych badań biofizycznych.

Wydajna ekspresja komórek ssaków i jednoetapowe oczyszczanie zewnątrzkomórkowych glikoprotein do krystalizacji

Laboratoryjna produkcja białek eukariotycznych z odpowiednią modyfikacją potranslacyjną stanowi istotną barierę. Oto solidny protokół z szybkim ustanowieniem i przekształceniem w ekspresję białek przy użyciu systemu ekspresji ssaków. System ten wspomaga selektywne znakowanie aminokwasów, selektywne znakowanie białek i małocząsteczkowych modulatorów składu glikanów.

Wysoka ekspresja rekombinowanych białek ludzkich z przejściową transfekcją komórek HEK293 w zawiesinie

Tutaj prezentujemy protokoły wykorzystania systemu ekspresji białek komórek owadów i bakulowirusa do produkcji dużych ilości białek wydzielanych przez rośliny do krystalizacji białek. Wektor ekspresyjny bakulowirusa został zmodyfikowany za pomocą GP67 lub peptydu sygnałowego hemoliny owadów w celu ekspresji wydzielania białek roślinnych w komórkach owadów.

Modyfikowanie wektorów ekspresyjnych bakulowirusa w celu wytwarzania wydzielanych białek roślinnych w komórkach owadów

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj efektywną metodę ekspresji białek wydzielanych z komórek HEK 293T. Ta technika umożliwia produkcję białek rekombinowanych w natywnych konformacjach z możliwością skalowania.

Wygodna i ogólna platforma ekspresji dla produkcji wydzielanych białek z ludzkich komórek

Przeglądaj więcej filmów