Wygodna i ogólna platforma do produkcji wydzielanych białek z komórek ludzkich
31 lipca 2012
W erze post-ludzkiej genomiki, dostępność rekombinowanych białek w natywnych konformacjach jest kluczowa dla strukturalnych, funkcjonalnych i terapeutycznych badań i rozwoju. W tym miejscu opisujemy testowy i wielkoskalowy system ekspresji białek w ludzkich embrionalnych komórkach 293T nerki, który można wykorzystać do produkcji różnych rekombinowanych białek.
W tym filmie opisujemy efektywną czasowo i kosztowo procedurę ekspresji wydzielanych białek z wytworzonych limfocytów T Durant HEC 2 9 3. Początkowo na sześcioświatowej płytce przygotowuje się 40% kofluentną hodowlę komórek T HEC 2 9 3. Mieszanina transfekcyjna jest następnie wytwarzana przez rozcieńczenie soku genowego, a następnie testuje plazmidy w pożywce wolnej od surowicy.
Mieszanina transfekcyjna jest osadzana na komórkach, które są następnie inkubowane w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby umożliwić ekspresję białka. Wykrywanie białka w czynniku supan można przeprowadzić za pomocą western blot. Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu, procedura może być skalowana w górę przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek.
Komórki są transfekowane przy użyciu PEI jako transfekcji. Odczynnik i białko można zebrać z supernatantów hodowlanych za pomocą filtracji o przepływie stycznym, a następnie chromatografii powinowactwa. Ostatecznie platforma ta umożliwia ekspresję szerokiej gamy makrocząsteczek w ilościach miligramowych.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ekspresja komórek owadów na podstawie wirusa balo, jest to, że duża liczba konstruktów może być badana przesiewowo i skalowana pod kątem ekspresji, a wyniki uzyskuje się w ciągu trzech tygodni. Tę procedurę zademonstrują Hello Aiden dla Shada Zini i Jonathan Cook. Trzej doktoranci z mojego laboratorium: Zacznij od wysiewu 250 000 komórek T HEC 2 9 3 na studzienkę w objętości jednego mililitra na płytce sześciodołkowej, dodaj jeden mililitr na dołek 10% FBS pentre uzupełnionego DMEM i S zakręć płytką, aby równomiernie rozproszyć komórki.
Następnie inkubuj komórki przez noc w nawilżonym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy komórki osiągną płynność około 40%, zastąp SUP natum dwoma mililitrami świeżej pożywki, aby przygotować mieszankę transfekcyjną. Najpierw porcja 90 mikrolitrów wolnego DMEM w surowicy w probówce eend orph.
Następnie dodaj trzy mikrolitry soku genowego, odczynnik do transfekcji delikatnie wymieszaj zawartość probówki i inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100 nanogramów na mikrolitr bulionu mini oczyszczonego plazmidu, DNA. Do transfekcji.
Wymieszaj zawartość probówki i pozostaw ją w temperaturze pokojowej na 15 minut. Aby przeprowadzić transfekcję, należy umieścić mieszaninę na limfocytach T HEC 2 9 3. Kropla po kropli, delikatnie napęczniaj płytkę, aby równomiernie rozprowadzić mieszaninę transfekcji.
Następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. 24 godziny później dodaj jeden mililitr świeżej pożywki do każdej studzienki i inkubuj przez kolejne 48 godzin. Trzy dni po transfekcji zbierz supinat i wykryj poziomy ekspresji interesującego białka za pomocą western blot.
Po zidentyfikowaniu odpowiedniego konstruktu, procedura transfekcji może zostać rozszerzona. Korzystając z 10-warstwowych fabryk komórek, napełnij fabrykę komórek 1,2 litra DMEM uzupełnionym 5% FBS. Następnie dodaj 200 milionów limfocytów T HEC 2 9 3, równomiernie rozprowadzając komórki we wszystkich warstwach.
Cztery kolby do hodowli komórek T o powierzchni 225 centymetrów kwadratowych wyhodowane do 100% płynności Co zawierają około 200 milionów komórek. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Przygotować mieszaninę transfekcji w kolbie T 75, rozcieńczając 840 mikrogramów DNA w 84 mililitrach sterylnego materiału jeden raz. Pbs.
Dodaj 2,5 mililitra jednego miligrama na mililitr roztworu jonów polietylenu lub PEI i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Roztwór powinien stać się mętny. Następnie powoli wlej mieszaninę transfekcji do fabryki komórek i dokładnie ją rozprowadz.
Warstwy ogólne. Dodać kwas walproinowy w końcowym stężeniu czterech milimolów. Zwiększy to wydajność ekspresji po dodaniu mieszaniny transfekcyjnej.
Inkubuj kulturę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery dni, aby umożliwić ekspresję białka. Zbierz pożywkę cztery dni po transfekcji i natychmiast oczyść fabrykę komórek do ponownego użycia, odwiruj zebrane podłoże o sile 6 000 G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przefiltruj je przez aparat filtrujący próżniowy o średnicy 0,22 mikrona w celu usunięcia wszelkich cząstek stałych. Następnie użyj systemu filtracji stycznego przepływu centra mate, aby stężyć supernatant do 75 mililitrów.
Po zagęszczeniu supernatantu, białko będące przedmiotem zainteresowania można oczyścić za pomocą chromatografii powinowactwa. W tym eksperymencie oczyściliśmy podjednostki HA tachowane w domenie zewnątrzkomórkowej ludzkich receptorów AAL za pomocą opisanego tutaj systemu na dużą skalę, a następnie chromatografii anty THA o wysokim powinowactwie. Jak pokazano w tej analizie strony SDS poplamionej kumasi.
Domeny zewnątrzkomórkowe podjednostek receptora alfa i gamma interleukiny migrują z masą cząsteczkową 40 kilodaltonów i 46 kilodaltonów. Niejednorodność glikanów EnLink obecnych na IL dwa R alfa i IL dwa R gamma spowodowała poszerzenie pasma na żelu strony SDS. Pasmo o wyższej masie cząsteczkowej reprezentuje zanieczyszczające BSA.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyrażać białka z hodowli komórek ludzkich przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek. Nie zapominaj, że limfocyty T HC 2 93 są uważane za niebezpieczne biologicznie i powinny być traktowane na drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego. Należy zawsze nosić odpowiednią odzież ochrony osobistej, a powierzchnie należy dezynfekować zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł przedstawia efektywną pod względem czasu i kosztów procedurę ekspresji białek sekretowanych z wykorzystaniem ludzkich zarodkowych komórek nerkowych 293T. Metoda ta umożliwia produkcję rekombinowanych białek w natywnych konformacjach, co jest niezbędne dla różnych zastosowań badawczych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Ekspresja białek
- Rekombinowane białka
- Techniki hodowania komórek
Tło
- Rekombinowane białka są kluczowe dla badań strukturalnych i funkcjonalnych.
- Ludzkie zarodkowe komórki nerkowe 293T są szeroko stosowane do produkcji białek.
- Efektywne metody ekspresji białek mogą poprawić rozwój badań i terapii.
- Western blotting jest powszechną techniką wykrywania białek.
Cel badania
- Opisanie skalowalnego systemu ekspresji białek.
- Podanie szczegółowego protokołu produkcji sekretowanych białek.
- Ułatwienie identyfikacji odpowiednich konstrukcji do dalszych badań.
Zastosowane metody
- Przygotowanie 40% konfluencyjnej kultury komórek 293T na sześcio-dołkowej płytce.
- Przygotowanie mieszanki do transfekcji za pomocą pożywki bez surowicy.
- Inkubacja komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu ekspresji białek.
- Wykrywanie białek w nadstanie za pomocą western blot.
Główne wyniki
- Sukces w ekspresji sekretowanych białek z komórek 293T.
- Identyfikacja odpowiednich konstrukcji do produkcji białek.
- Skalowanie procedury przy użyciu 10-warstwowych fabryk komórek.
- Demonstracja opłacalnego podejścia do produkcji rekombinowanych białek.
Wnioski
- Opisana metoda jest efektywna w produkcji rekombinowanych białek.
- To podejście można skalować dla większych potrzeb produkcyjnych.
- Western blotting jest skutecznym narzędziem do potwierdzenia ekspresji białek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Efficient production of secreted human proteins in native conformations is a critical inflection point for biopharma discovery and preclinical research. This HEK 293T-based platform enables rapid, scalable, and cost-effective generation of milligram quantities of functional proteins, supporting structural, biophysical, and biochemical studies. The approach directly addresses the need for mammalian post-translational modifications and accelerates construct screening and scale-up for diverse therapeutic targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid screening of multiple constructs to identify optimal protein expression candidates.
- Supports functional validation of secreted proteins with native post-translational modifications.
- Facilitates pathway interrogation and mechanistic de-risking for human and viral targets.
Screening & Assay Development
- Provides validated, scalable protein production for downstream assay development.
- Delivers reproducible, quantitative protein yields suitable for standardization across platforms.
- Enables reliable supply of proteins for compound screening and binding studies.
Translational & Preclinical Research
- Supports production of disease-relevant proteins, including cytokines and viral glycoproteins, for translational studies.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by ensuring protein quality and functionality.
- Reduces risk of non-human glycosylation artifacts in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This platform integrates from early construct screening through large-scale protein production, bridging discovery biology and preclinical research.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and construct triage by enabling parallel expression and detection via western blot.
- Screening: Delivers assay-ready proteins with scalable yields and consistent quality.
- Analytics: Provides quantitative outputs for comparing construct performance and optimizing purification.
- Translational Research: Aligns protein production with disease-relevant systems and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a generalizable workflow adaptable to diverse protein classes and research needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Streamlines protein production with minimal specialized equipment and rapid turnaround.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency in early R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing high-quality reagents for multiple programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture and protein purification techniques.
- Needs access to standard CO2 incubators and tangential flow filtration systems for scale-up.
- Demands cross-team standardization of construct design and detection assays.
- Adaptable to co-expression, complex protein assemblies, and viral vector production.
- Biohazard handling and biosafety level 2 precautions are necessary for HEK 293T cells.
