Izolacja RNA z komórek neuroprecursorowych z wykorzystaniem zestawu Bio-Rad Total RNA Kit

Witam, nazywam się Josh Sh i jestem doktorantem w laboratorium dr. Ed Makiego na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Pokażę Państwu, jak wyizolować RNA z prekursorów komórek neuronalnych przy użyciu zestawu BioRad to RNA mini kit. Korzystam z tego zestawu w naszym laboratorium od kilku lat i zawsze zapewnia on spójne wyniki przy wysokiej wydajności.

Komórki, których używamy, to neuroprekursory E14.5, które zostały ostro zdysocjowane z kory embrionalnej; wysiewamy je zazwyczaj na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, pokrytą PDL i lamininą, w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek. Zanim zacznę, muszę zaznaczyć, że należy pracować na stanowisku wyznaczonym do pracy z RNA. W pierwszej kolejności należy upewnić się, że stanowisko do pracy z RNA jest czyste.

Właściwym sposobem czyszczenia blatu jest użycie preparatu RNA zap. W zasadzie eliminuje on wszelkie cząsteczki RNA, ponieważ RA w zasadzie niszczy Twoje RNA. Inną kwestią jest zawsze noszenie rękawiczek podczas przeprowadzania ekstrakcji, ponieważ skóra jest pełna tych RNA.

Zatem jest to absolutnie zabronione. Dobrze, mam tutaj zestaw BioRad total RNA mini kit. Wyjęłam z niego zawartość, więc pozwólcie, że pokażę wam, co się w nim znajduje.

W pierwszej kolejności przygotowujemy PBS potraktowany X dep C oraz 70% etanol potraktowany DEP. Przygotowujemy roztwór do lizy całkowitego RNA z dodatkiem etanolu. Następnie przygotowujemy płukanie o niskiej rygorystyczności z dodatkiem 100% etanolu, płukanie o wysokiej rygorystyczności, roztwór do rozcieńczania DNA, samo DNA oraz eluat całkowitego RNA.

Zatem roztwór, który umieścimy w bloku grzejnym ustawionym na 70°C. Inne niezbędne rzeczy to probówki z zakrętką o pojemności 1,5 ml. Nie mogą one zawierać DNA ani RNK, więc upewnij się, że używasz probówek wolnych od tych substancji.

Mamy dwie probówki bez zakrętek o pojemności 2 ml. Najważniejszym elementem są jednak same kolumny do RNA. Bez nich nie można przeprowadzić ekstrakcji RNA.

Aby złożyć te kolumny, należy wziąć kolumnę RNA oraz kapsel 2 ml i połączyć je w ten sposób; zestaw będzie wtedy gotowy do użycia. Ostatnim elementem, którego zawsze potrzebujemy, są te komórki. W tym przypadku są to komórki prekursorowe neuronów linii Eton 1,5.

Zostały one ostro rozdzielone z kory embrionalnej. Były hodowane przez kilka dni w pożywce temple. Wyjąłem komórki z inkubatora ustawionego na 37°C.

Niniejszy protokół dotyczy komórek adherentnych. Komórki te były hodowane na płytkach 0,4-dołkowych do hodowli tkankowych, powlekanych PDL oraz lamininą. Teraz użyję węża odsysającego, aby usunąć pożywkę.

Kolejnym krokiem jest dodanie około 500 µL dep SEA PBS. Ponownie należy użyć końcówek z filtrem. Zadaniem PBS jest w zasadzie wypłukanie pożywki.

Należy dopilnować, aby żadne składniki pożywki nie przedostały się do kolumny RNA ani nie zakłócały procesu ekstrakcji RNA, w przeciwnym razie nie uzyskają Państwo dobrych wydajności. Dobrze? Teraz szybko odessam PBS, ponieważ neuronalne komórki macierzyste nie tolerują PBS. Następnie dodam 350 µL buforu lizującego do każdej próbki.

Ponownie upewnij się, że dodałeś beta-merkaptoetanol do buforu lizującego. Teraz pipetuję bufor lizujący w górę i w dół 15 razy, aby upewnić się, że komórki uległy lizie, co pozwoli nam na wydobycie zawartości RNA.

Teraz dodam 70% etanol do każdej studzienki; po dodaniu 350 µL tego 70% etanolu, będę pipetować go w górę i w dół w każdej studzience 10 razy. Pipetowałem w górę i w dół 10 razy dla każdej studzienki. Teraz ustawię pipetę na powyżej 700 µL, ponieważ całkowita objętość każdej studzienki wynosi 700 µL.

Następnie, po pobraniu objętości przekraczającej 700 µL, będę ją przenosić do kolumny RNA. Po dodaniu zawartości do kolumny, umieszczę ją w wirówce i będę wirować przez 30 sekund przy maksymalnej prędkości. Po pierwszym wirowaniu lizatu, usunę filtrat, wylewając go do pustego pojemnika.

Innym sposobem, stosowanym przez niektórych, jest użycie węża ssawnego do odessania filtratu. W następnym kroku należy dodać 700 µL buforu do płukania o niskiej rygorystyczności. Ponownie upewnij się, że dodałeś do niego etanol.

Teraz wirować będę przez 30 sekund z maksymalną prędkością. Po wirowaniu buforu do płukania o niskiej rygorystyczności odrzucę filtrat. Dobrze? Następnie przygotuję roztwór DNA.

Zatem do każdej próbki należy dodać 5 µL DNA. W naszym przypadku DNA zostały wcześniej podzielone na alikwoty, zanim rozpoczęliśmy pracę, ponieważ, jak wspomniano, jest to enzym.

Lepiej jest przechowywać je w formie alikwotów. Przechowywanie całości spowoduje utratę aktywności enzymatycznej w wyniku wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. Dlatego po dodaniu 5 µL DNA rozcieńczę je 75 µL roztworu do rozcieńczania DNA.

Po dodaniu tej ilości całkowita objętość roztworu DNA wyniesie 80 µL. Teraz dodam 80 µL roztworu DNA do każdej próbki. Należy upewnić się, że ciecz spłynęła na membranę kolumny.

Należy dopuścić do nasączenia membrany roztworem DNA, aby usunąć DNA, co pozwoli zwiększyć uzysk RNA.

Po dodaniu DNA należy pozostawić kolumnę na 15 minut w temperaturze pokojowej, aby enzym mógł zadziałać. Ponownie, inkubujemy próbkę przez 15 minut. Dobrze, czasomierz zadzwonił.

Po 15-minutowej inkubacji przejdę do wirówki i odwiruję DNA przez 30 sekund przy maksymalnej prędkości. Po 30 sekundach wirowania w celu usunięcia DNA wyleję filtrat. Teraz dodam 700 µL buforu o wysokiej rygorystyczności, aby wypłukać wszelkie pozostałości DNA.

Następnie po dodaniu tego składnika, ponownie odwiruję próbkę w wirówce przez kolejne 30 sekund. Po wirowaniu usunę filtrat o wysokiej rygorystyczności, wylewając go do pojemnika. Następnie dodamy 700 µL buforu o niskiej rygorystyczności.

Tym razem wirować będę przez jedną minutę z maksymalną prędkością w Centri Beach. Po pierwszym minutowym płukaniu o niskiej rygorystyczności odrzucę filtrat. Tym razem nie dodam niczego, ale ponownie zawirowuję próbkę przez kolejne dwie minuty, aby pozbyć się nadmiaru buforu do płukania o niskiej rygorystyczności, ponieważ zawiera on etanol, co obniżyłoby wydajność izolacji RNA.

Teraz wyjmę bufor elucyjny z bloku grzejnego ustawionego na 70°C. Przypominam, aby przed rozpoczęciem eksperymentu upewnić się, że bufor elucyjny został podgrzany do 70°C; należy go utrzymać w cieple, aby zwiększyć wydajność uzysku RNA. Kolumny są już przygotowane.

Zostały odwirowane w wirówce. W następnym kroku wyjmujemy kolumny. Dobrze, wyrzucę probówki z nakrętkami i przeleję zawartość do tych probówek z nakrętkami.

Należy dodać 50 µL buforu Lucian do każdej kolumny. Upewnij się, że bufor Lucian został naniesiony na membranę w taki sposób, aby została ona dobrze nasączona. W przeciwnym razie wydajność RNA będzie niska.

Teraz należy pozostawić kolumnę na jedną lub dwie minuty, aby upewnić się, że eluant przesiąka przez membranę kolumny. Minęła już jedna minuta. Teraz mogę przenieść ją do wirówki.

Teraz umieszczę kolumny w wirówce. Będę je wirować przez jedną minutę przy pełnej prędkości. Jest to ostatni etap wirowania, po którym zbierzemy eluat z zanieczyszczeniami lub RNA do tych probówek z zakrętkami.

Teraz, po ostatnim wirowaniu, wyjmij zawartość, usuń kolumnę (można ją wyrzucić), zamknij probówkę, a następnie przechowuj próbki w temperaturze -80°C; później możesz z nimi dowolnie pracować. W ten sposób wyekstrahowałam RNA przy użyciu zestawu BioRad RNA. Teraz zmierzę stężenie wyekstrahowanego RNA lub odczytam jego gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru.

Oto co zamierzam Państwu pokazać. Najpierw musimy przygotować mieszaninę do rozcieńczenia. Będzie to rozcieńczenie w stosunku 1:5.

Wymieszamy nasze RNA z wodą filtrowaną typu Milli-Q. Najpierw przygotuję próbę ślepą. Pobiorę dwa mikrolitry samego roztworu elucyjnego, którego użyliśmy wcześniej do elucji RNA, a następnie dodam osiem mikrolitrów wody Milli-Q. Dobrze?

To jest nasza próbka ślepa. Teraz przygotuję próbkę właściwą. Będą to dwa 2 µL badanego RNA.

Ponownie dodamy 8 µL wody MQ. Dzięki temu otrzymamy rozcieńczenie w stosunku 1:5, prawda? Mam tutaj kuwetę szklaną, do której przeleję moje próbki, a następnie wprowadzę tę kuwetę do spektrometru.

Przejdźmy zatem do pomiaru. Zanim zmierzę OD próbek RNA, muszę wyczyścić kuwetę. Oto zatem szklana kuweta.

Nigdy nie należy dotykać jego przedniej części. W przeciwnym razie pozostawią Państwo na niej odciski, co spowoduje błędne pomiary. Dlatego w pierwszej kolejności umyję szklany klucz cuwety wodą podwójnie destylowaną.

Następnie użyję węża odsysającego, aby usunąć wodę. Po tym płukaniu przemyję próbkę 95% etanolem, a następnie ponownie użyję węża odsysającego, aby usunąć etanol.

Teraz jestem gotowy do nałożenia próbki ślepej. Najpierw potrzebujemy próbki ślepej, aby znormalizować nasze odczyty. Pobiorę więc 10 µL mieszaniny, którą właśnie przygotowaliśmy.

Wymieszam teraz roztwór, aby uzyskać jednorodną zawiesinę. Przeniosę go do spektrofotometru. Jest to urządzenie Ultra Spec 3, 100 probe, za pomocą którego zmierzymy stężenie RNA.

Otwórz urządzenie i umieść próbkę w jednym z uchwytów. Skonfigurujemy programy tak, aby odczytywał tylko RNA. Przypominam, że wykonaliśmy rozcieńczenie 1:5.

Chcemy zatem ustawić współczynnik rozcieńczenia na pięć. Dobrze, jestem gotowa. Teraz naciśnę przycisk „run”, aby odnieść pomiar do próbki blank.

Dobrze, urządzenie zostało teraz wytarowane. Jesteśmy zatem gotowi do pomiaru naszej próbki. Wyjmę teraz szklany podkład.

Odsysam zawartość próbki ślepej. Następnie przemywam ją podwójnie wodą DDW. Przemywam ją dziewięciokrotnie 5% etanolem.

Teraz jestem gotowy do nabrania 10 µL naszej próbki badawczej. Ponownie przypominam, aby upewnić się, że próbka została wymieszana. Następnie wprowadzimy ją do szklanej kuwety.

Teraz możemy przejść do odczytu. Po pomiarze od, prawidłowa wydajność i czystość powinny charakteryzować się stosunkiem absorbancji RNA od 2,60 do 2,80, co powinno oscylować wokół 2. Wydajność wynosi około 144 µg/ml.

Mimo że urządzenie wskazuje 72 µg/ml, musimy pomnożyć tę wartość przez dwa ze względu na połowową długość w naszych wetach; pokazano Państwu, jak ekstrahować RNA z komórek prekursorowych neuronów w obszarze dwóch centymetrów. Ponownie korzystamy z zestawu Total RNA Mini Kit firmy BioRad. Przetestowaliśmy inne zestawy i ten jest najlepszy z uwagi na jego wydajność.

Pozwala to na uzyskanie RNA wysokiej jakości. Stosując ten zestaw, otrzymają Państwo tak samo wysoką jakość wyników, jaką uzyskujemy my.