Izolacja RNA z komórek neuroprecursorowych z wykorzystaniem zestawu Bio-Rad Total RNA Kit

Witam, nazywam się Josh Sh i jestem doktorantem w laboratorium dr. Ed Maki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Pokażę Państwu, jak wyizolować RNA z prekursorów komórek neuronalnych, korzystając z zestawu BioRad to RNA mini kit. Używam tego zestawu w tym laboratorium od kilku lat i zawsze zapewnia on spójne wyniki oraz wysoką wydajność.

Komórki, których używamy, to neuroprekursory z linii E13,5, które zostały świeżo dysocjowane z korowe embrionalnej kory mózgowej. Wysiewamy je zazwyczaj na 24-dołkową płytkę do hodowli tkankowej, pokrytą PDL oraz lamininą, w zagęszczeniu 100 000 komórek na dołek. Zanim zacznę, muszę zaznaczyć, że należy pracować na stanowisku wyznaczonym do pracy z RNA. Pierwszym krokiem jest upewnienie się, że stanowisko do pracy z RNA jest czyste.

Właściwym sposobem czyszczenia blatu jest użycie preparatu RNA zap. W zasadzie eliminuje on wszelkie cząsteczki RNA, ponieważ RA w zasadzie niszczy Twoje RNA. Inną ważną kwestią jest zawsze noszenie rękawiczek podczas przeprowadzania ekstrakcji, ponieważ skóra jest pełna tych RNA.

Zatem jest to absolutnie niedopuszczalne. Dobrze, mam tutaj zestaw BioRad total RA mini kit. Wyjąłem jego zawartość, więc pozwólcie, że pokażę wam, co się w nim znajduje.

W pierwszej kolejności przygotowujemy PBS traktowany X dep C oraz etanol 70% traktowany DEP. Przygotowujemy roztwór do lizy całkowitego RNA z dodatkiem etanolu. Następnie przygotowujemy płukanie o niskiej rygorystyczności z dodatkiem 100% etanolu, płukanie o wysokiej rygorystyczności, roztwór do rozcieńczania DNA, samo DNA oraz eluat całkowitego RNA.

Roztwór ten umieścimy w bloku grzewczym ustawionym na 70 °C. Pozostałe niezbędne elementy to probówki z zakrętkami o pojemności 1,5 ml. Muszą one być wolne od DNA i RNaz, dlatego upewnij się, że posiadasz probówki pozbawione tych zanieczyszczeń.

Mamy dwie probówki bez zakrętek o pojemności 2 ml. Najważniejszym elementem są jednak same kolumny do RNA. Bez nich nie można przeprowadzić ekstrakcji RNA.

Aby złożyć te kolumny, należy wziąć kolumnę RNA oraz nakrętkę 2 ml bez kapturka i połączyć je w ten sposób; zestaw jest teraz gotowy do użycia. Ostatnim elementem, którego zawsze potrzebujemy, są te komórki. Są to komórki prekursorowe neuronów linii Eton and a half.

Komórki zostały poddane ostrej dysocjacji z kor w stadium embrionalnym. Były hodowane przez kilka dni w pożywce DMEM. Wyjąłem komórki z inkubatora ustawionego na 37 °C.

Niniejszy protokół dotyczy komórek przylegających. Komórki te były hodowane na 0,4-dołkowych płytkach do hodowli tkanek, pokrytych polilizyną (PDL) oraz lamininą. Teraz użyję węża próżniowego, aby odessać medium.

Kolejnym krokiem jest dodanie około 500 µL dep SEA PBS. Ponownie należy użyć końcówek z filtrem. PBS służy w tym przypadku przede wszystkim do wypłukania pożywki.

Chcemy uniknąć przedostania się składników medium do kolumny RNA lub zakłócenia ekstrakcji RNA, ponieważ w przeciwnym razie nie uzyska się dobrej wydajności. Dobrze? Szybko odessam PBS, ponieważ neuralne komórki macierzyste go nie tolerują. Teraz dodam 350 µL buforu lizującego do każdej próbki.

Ponownie upewnijcie się, że macie beta-merkaptoetanol w buforze lizującym. Teraz będę pipetować bufor lizujący w górę i w dół 15 razy, aby upewnić się, że komórki zostały poddane lizie, co pozwoli nam na odzyskanie zawartości RNA.

Teraz dodam 70% etanol do każdej studni. Po dodaniu 350 µL tego 70% etanolu, będę pipetować w górę i w dół w każdej studni 10 razy. Pipetowałem 10 razy w górę i w dół dla każdej studni. Teraz ustawię pipetę na ponad 700 µL, ponieważ całkowita objętość każdej studni wynosi 700 µL.

Następnie, po pobraniu objętości przekraczającej 700 µL, przelewam ją do kolumny do izolacji RNA. Po nałożeniu zawartości na kolumnę, umieszczam ją w wirówce i wiruję przez 30 s z maksymalną prędkością. Po pierwszym wirowaniu lizatu, usuwam filtrat, wylewając go do pustego pojemnika.

Inni wykonują tę czynność w inny sposób, używając węża odsysającego do odprowadzenia filtratu. Następnie należy dodać 700 µL buforu do płukania o niskiej rygorystyczności. Ponownie upewnij się, że dodano do niego etanol.

Teraz odwiruję próbkę przez 30 s przy pełnej prędkości. Po wirowaniu buforu do płukania o niskiej rygorystyczności odrzucę filtrat. Dobrze? Następnie przygotuję roztwór DNA.

Do każdej próbki należy dodać 5 µL DNA. W naszym przypadku przed rozpoczęciem procedury dokonujemy alikwotowania DNA, ponieważ, jak wspomniano, jest to enzym.

Lepiej jest przechowywać je w formie alikwotów. Przechowywanie całości spowoduje, że cykle zamrażania i rozmrażania zniszczą aktywność enzymatyczną. Dlatego po dodaniu 5 µL DNA rozcieńczę je 75 µL roztworu do rozcieńczania DNA.

Po dodaniu tego składnika całkowita objętość roztworu DNA wyniesie 80 µL. Teraz dodam 80 µL roztworu DNA do każdej próbki. Należy upewnić się, że ciecz zostanie naniesiona bezpośrednio na membranę kolumny.

Należy dopuścić do nasiąknięcia membrany roztworem DNA. W ten sposób usunie się DNA, co pozwoli zwiększyć wydajność izolacji RNA.

Po dodaniu cząsteczek DNA należy pozostawić kolumnę na 15 minut w temperaturze pokojowej, aby enzym mógł zadziałać. Ponownie inkubujemy próbkę przez 15 minut. Dobrze, czasomierz skończył odliczanie.

Po 15-minutowej inkubacji przejdę do wirówki, aby odwirować DNA przez 30 sekund z maksymalną prędkością. Po 30-sekundowym wirowaniu w celu oddzielenia DNA, odrzucę filtrat. Teraz dodam 700 µL buforu o wysokiej rygorystyczności, aby wypłukać wszelkie pozostałości DNA.

Następnie, po dodaniu tego składnika, ponownie wiruję próbkę w wirówce przez kolejne 30 sekund. Po wirowaniu usuwam filtrat o wysokiej rygorystyczności, wylewając go do pojemnika. Następnie dodajemy 700 µL buforu o niskiej rygorystyczności.

Tym razem wirować będę przez jedną minutę z maksymalną prędkością w urządzeniu Centri Beach. Po pierwszym minutowym płukaniu o niskiej rygorystyczności odrzucę filtrat. Tym razem nie dodam niczego, lecz ponownie zawiruję próbkę przez kolejne dwie minuty, aby pozbyć się nadmiaru buforu o niskiej rygorystyczności, ponieważ zawiera on etanol, co mogłoby obniżyć wydajność uzyskanego RNA.

Teraz wyjmę bufor elucyjny z bloku grzewczego ustawionego na 70 °C. Przypominam, aby przed rozpoczęciem eksperymentu upewnić się, że bufor elucyjny jest podgrzany do 70 °C; utrzymanie go w cieple zwiększy wydajność uzysku RNA. Kolumny są już przygotowane.

Zostały one odwirowane w wirówce. W kolejnym kroku wyjmuje się kolumny. Dobrze, wyrzucę probówki z nakrętkami i przeleję zawartość do tych probówek z nakrętkami.

Do każdej kolumny należy dodać 50 µL buforu Lucian. Należy upewnić się, że bufor Lucian znajduje się na membranie, aby została ona dokładnie nasączona. W przeciwnym razie wydajność RNA będzie niska.

Teraz pozostawiamy kolumnę na jedną lub dwie minuty, aby upewnić się, że eluat wnika w membranę kolumny. Minęła jedna minuta. Teraz mogę przenieść ją do wirówki.

Teraz umieszczę kolumny w wirówce. Będę wirować przez jedną minutę przy maksymalnej prędkości. Jest to ostatni etap wirowania, w wyniku którego zbierzemy eluowany zanieczyszczony materiał lub RNA do tych probówek z zakrętkami.

Po ostatnim wirowaniu wyjmij zawartość, usuń kolumnę (można ją teraz wyrzucić), zamknij probówkę i przechowuj próbki w temperaturze -80 °C; można z nich korzystać w dowolnym późniejszym terminie. W ten sposób wyekstrahowałem RNA przy użyciu zestawu BioRad RNA. Teraz zmierzę stężenie wyekstrahowanego RNA lub odczytam jego gęstość optyczną (OD) za pomocą spektrofotometru.

To, co teraz zaprezentuję, zacznie się od przygotowania mieszaniny rozcieńczającej. Będzie to rozcieńczenie w stosunku 1:5.

Wymieszamy nasze RNA z wodą filtrowaną MQ. Najpierw przygotuję próbę ślepą. Pobiorę 2 µL samego roztworu elucyjnego, którego użyliśmy wcześniej do elucji RNA, a następnie dodam 8 µL wody MQ. Dobrze?

To jest nasza próbka kontrolna. Teraz przygotuję próbkę badawczą. Będą to dwa mikrolitry naszego badanego RNA.

Ponownie dodamy 8 µL wody MQ. Dzięki temu otrzymamy rozcieńczenie 1:5, prawda? Mam tutaj kuwetę szklaną, do której wleję próbki, a następnie umieszczę tę kuwetę w spektrometrze.

Przejdźmy zatem do pomiaru. Przed zmierzeniem OD próbek RNA muszę oczyścić kuwetę. Oto szklana kuweta.

Nigdy nie należy dotykać przedniej części urządzenia. W przeciwnym razie pozostawią Państwo na niej odciski, co spowoduje uzyskanie błędnych pomiarów. Dlatego w pierwszej kolejności umyję szklaną kuwetę wodą podwójnie destylowaną (double DI).

Następnie użyję węża odsysającego, aby usunąć wodę. Po tym przemyciu wypłuczę próbkę 95% etanolem, a następnie ponownie użyję węża odsysającego, aby usunąć etanol.

Teraz jestem gotowy do nałożenia próbki ślepej. Najpierw potrzebujemy próbki ślepej, aby znormalizować odczyty. Pobiorę zatem 10 µL przygotowanej przed chwilą mieszaniny.

Wymieszam roztwór góra-dół, aby uzyskać jednorodną mieszaninę. Przeniosę go teraz do spektrofotometru. Jest to urządzenie Ultra Spec 3, 100 probe, za pomocą którego zmierzymy stężenie RNA.

Otwórz urządzenie i umieść próbkę w jednym z uchwytów. Skonfigurujemy programy w taki sposób, aby odczytać wyłącznie RNA. Przypominam, że wykonaliśmy rozcieńczenie 1:5.

Chcemy ustawić czynnik rozcieńczenia na pięć. Dobrze, jestem gotowy. Teraz nacisnę przycisk run, aby odnieść pomiar do próbki blank.

Gotowe, urządzenie zostało wytarowane. Teraz możemy przystąpić do pomiaru próbki. Wyjmę teraz szklany podkład.

Odsysam zawartość próbki ślepej. Następnie ponownie przemywam ją podwójnie destylowaną wodą. Przemywam ją również 5% etanolem.

Teraz jestem gotowy do pobrania 10 µL badanej próbki. Ponownie upewnijcie się, że próbka została wymieszana. Następnie wprowadzimy ją do szklanej kuwety.

Teraz możemy przystąpić do odczytu. Po pomiarze gęstości optycznej (od), prawidłowa wydajność i czystość powinny charakteryzować się stosunkiem absorbancji RNA 260 do 280 na poziomie około 2,0. Wydajność wynosi około 144 µg/ml.

Mimo że urządzenie wskazuje 72 µg/ml, musimy pomnożyć tę wartość przez dwa ze względu na połowę długości w naszych próbkach, dwa centymetry. Pokazaliśmy, jak wyekstrahować RNA z komórek prekursorowych neuronów. Ponownie korzystamy z zestawu Total RNA Mini z BioRad. Przetestowaliśmy inne zestawy i ten jest najlepszymi rozwiązaniem, którego używamy ze względu na jego wydajność.

Zapewnia to wysoką jakość RNA. Stosując ten zestaw, uzyskają Państwo tak samo wysoką jakość wyników, jaką my otrzymujemy za każdym razem.