Optyczny zapis ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoka

Ogólnym celem eksperymentu FollowMe jest zarejestrowanie neuronalnej aktywności impulsowej z dużej liczby neuronów. Osiąga się to poprzez obserwację wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w somie neuronu związanego z każdym potencjałem czynnościowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w pierwszym etapie. Wzbudzenie dwoma fotonami i zasada skanowania o dostępie swobodnym są wykorzystywane do rejestrowania sygnałów fluorescencyjnych wapnia z 40 neuronów somato z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

W drugim kroku dokładne czasy skoków są wyodrębniane z sygnałów fluorescencyjnych za pomocą algorytmu dekonwolucji. Ta technika może być wykorzystana do rejestrowania aktywności impulsowej z dziesiątek neuronów. Dane dotyczące skoków mogą być następnie wykorzystane do pomiaru wzajemnych informacji, propagacji sygnału między populacjami neuronów lub korelacji neurologicznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak zapisy mikroelektrodowe, jest to, że można rejestrować aktywność impulsową neuronów z dużej liczby neuronów z lokalnej populacji. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące funkcji kory mózgowej na poziomie lokalnych sieci neuronów, takie jak znaczenie poszukiwania korelacji informacji oraz zmiany dynamiki sieci z plastycznością kory mózgowej Do wzbudzenia dwóch fotonów stosuje się system laserowy impulsów podczerwonych z impulsami femtosekundowymi. Wymagana jest wysoka moc wyjściowa lasera, aby zrównoważyć duże straty wprowadzane przez elementy optyczne systemu.

Kaznodzieja na system składający się z dwóch pryzmatów nadaje ujemną dyspersję prędkości grupowej na impulsy laserowe przed deflektorami optycznymi kusto, aby skompensować dyspersję czasową wprowadzoną przez AD, dwa AD z dużymi otworami odchylają wiązkę laserową w dwóch wymiarach. Refleksyjna gradacja dyfrakcyjna ze 100 rowkami na milimetr jest umieszczona 13 centymetrów za AOD, aby skompensować dyspersję przestrzenną wprowadzoną przez AOD. W przypadku korzystania z krótkich impulsów laserowych wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu pionowego.

Przysłony są umieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania elementów optycznych. Dichroiczny rozdzielacz wiązki umieszczony przed obiektywem przesyła światło wzbudzenia w podczerwieni do próbki i odbija światło fluorescencyjne z próbki na detektor. Detektory fluorescencji epi i trans zbierają sygnał fluorescencyjny przez obiektyw, a filtry z kolorowego szkła kondensatora są umieszczone przed detektorami, aby zapobiec przedostawaniu się światła wzbudzającego do detektorów.

Kąty odchylenia OD A są kontrolowane przez komputer wyposażony w cyfrowo-analogową płytkę konwertera, która z kolei napędza oscylatory sterowane napięciem. Sygnał z powielaczy fotograficznych jest przekazywany przez dolnoprzepustowy filtr Butterwortha o częstotliwości odcięcia 100 kiloherców i jest digitalizowany przez analogowy przetwornik cyfrowy z częstotliwością zegara 156,25 kiloherca, zanim zostanie zapisany na komputerze w celu analizy, wyrównania i szumu elektrycznego są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencyjnych ze światłem laserowym i bez niego przy niskim i wysokim wzmocnieniu powielaczy zdjęć, Skanowanie o dostępie swobodnym, zarówno ze wskaźnikiem, jak i bez niego, opiera się na wykrywaniu wewnątrzkomórkowego wzrostu stężenia wapnia. Pierwszym krokiem w protokole jest zabarwienie dużej liczby neuronów wskaźnikiem wapnia w formie Estery poprzez wstrzyknięcie bolusa.

Następnie rejestruj aktywność somy w każdym neuronie w czterech lokalizacjach przez 6,4 mikrosekundy w każdym miejscu. Aby wybrać interesujące nas neurony, uzyskaj pełną klatkę składającą się z 256 na 256 pikseli. Następnie ręcznie wybierz środki neuronów, które mają zostać zarejestrowane na tym obrazie.

Trzy punkty w odległości dwóch mikronów wokół każdego środka są automatycznie dodawane przez oprogramowanie sterujące w każdym cyklu. Sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z czterech lokalizacji we wszystkich 40 neuronach. Zapis ze wszystkich neuronów w jednym cyklu wymaga 1,536 milisekundy.

Powtarzaj ten sekwencyjny zapis wszystkich 40 neuronów przez pięć sekund. Wykrywanie skoków na podstawie fluorescencyjnych somatycznych sygnałów wapniowych opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu. Wysoki stosunek sygnału do szumu można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia.

Jednak intensywność wzbudzenia można zwiększyć tylko do pewnego limitu z powodu uszkodzenia zdjęcia. Istnieje tylko bardzo małe okno intensywności wzbudzenia, w którym uszkodzenia fotograficzne są niskie, a stosunek sygnału do szumu jest wystarczający do wykrycia pojedynczych skoków, aby zapewnić, że zarejestrowane sygnały mieszczą się w oknie wykrywania wysokich skoków. Podczas eksperymentu wykorzystywane jest wiele programów do analizy online opracowanych przez nasze laboratorium.

Następnie oblicz przybliżoną szybkość fotonów na neuron z krótkiego okna czasowego wyjściowego szumu wynoszącego około 100 do 200 milisekund. Liczba fotonów i szybkość fotonów są obliczane na podstawie wartości fluorescencji, dopasowując rozkład względnych zmian fluorescencji do tego równania, a następnie obliczają fluorescencję bazową z tego samego okna czasowego i wykreślają ją jako funkcję czasu lub prób. Utrzymuj średni spadek linii bazowej poniżej 0,0002 na sekundę, dostosowując moc lasera.

Ponieważ wykrywanie skoków gwałtownie spada po przekroczeniu tego limitu. Następnie weryfikuj pozycje somatyczne neuronów co 10 do 20 minut, uzyskując obraz pełnoklatkowy. W razie potrzeby dostosuj lokalizacje nagrywania.

Sygnały fluorescencyjne wynikające z aktywności neuronalnej często zjadały się w czasie z powodu długiego rozpadu przejściowego wapnia. W tej procedurze stosuje się metodę dekonwolucji do skoków i czasów skoków od sygnałów fluorescencyjnych. Tutaj używamy algorytmu genetycznego do określenia najbardziej prawdopodobnego modelu pociągu kolczastego, który pasuje do zarejestrowanego sygnału fluorescencyjnego.

Z każdą iteracją algorytmu maksymalne prawdopodobieństwo asymptotycznie zbliża się do maksimum, które jest określone przez szum zapisów fluorescencyjnych. W jednorodnych populacjach neuronów sygnał wapnia wywołany przez kolec może się różnić między neuronami. Do nienadzorowanej analizy dużych zbiorów danych zaprojektowaliśmy algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapnia wywołanego przez skok z neuronu na neuron, aby uniknąć dużej liczby fałszywych alarmów.

Łączny rozkład amplitudy i stałej czasowej zaniku pojedynczego impulsu wywołanego przez wapń jest rejestrowany w oddzielnym zestawie eksperymentów z tego samego typu neuronów w tych samych warunkach eksperymentalnych. Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej i zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucji, dłuższe nagrania są dzielone na kilka krótszych śladów trwających od jednej do pięciu sekund dla każdego neuronu w każdym nagraniu, algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli do 1 miliona różnych modeli lub więcej, aby przyspieszyć dekonwolucję. Równolegle.

Po dekonwolucji dane spajków są analizowane i sprawdzane. Czas bodźca peri, prawdopodobieństwo skoku histogramu i szybkość wypalania neuronów są obliczane w sposób zautomatyzowany. Oto przykłady sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego przy bardzo niskiej szybkości wzbudzenia, a drugi przy bardzo wysokiej szybkości wzbudzenia w oknie detekcji.

Zauważ, że każdy przykład pokazuje reakcję na jeden skok. Pokazano tutaj mikrofotografię ostrego wycinka mózgu i dwóch pipet stymulacyjnych umieszczonych w tej samej kolumnie korowej. W warstwie czwartej pokazują one reakcje neuronalne na powtarzające się bodźce, a ten wykres pokazuje wzajemne informacje Shannona sygnalizowane przez zarejestrowaną populację neuronów.

Oto pomiar propagacji aktywności skokowej super progu między różnymi populacjami neuronów korowych. Są to wykryte skoki w neuronach korowych, odpowiedź na elektryczną stymulację włókien korowych wzgórza. Podczas rejestrowania aktywności neuronalnej za pomocą skanowania o dostępie swobodnym bardzo ważne jest, aby nagrywać w oknie wykrywania.

W przeciwnym razie bardzo łatwo jest skończyć z bezużytecznymi zestawami danych. Optyczne wykrywanie skoków jest wciąż w powijakach. Jest jeszcze wiele do zrobienia.

Dzięki pewnym ulepszeniom nagrywamy z jeszcze większej liczby neuronów. Dzięki innym ulepszeniom będziemy mogli nawet nagrywać przebudzone i zachowujące się zwierzęta.