Name: Optyczny zapis ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego skoka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Poznaj metodę optycznego zapisu aktywności neuronalnej z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej i algorytmu dekompozycji. Technika umożliwia rejestrację sygnałów wapniowych z do 100 neuronów z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Randy'emu Chitwoodowi za krytyczne przeczytanie rękopisu. Praca ta była wspierana przez granty Whitehall Foundation oraz Alfred P. Sloan Foundation przyznane dla HJK.

1. Układ optyczny (Rysunek 1)
<ol>
 <li>Do wzbudzenia dwufotonowego wykorzystuje się impulsowy system laserowy w podczerwieni z impulsami femtosekundowymi. Wymagana jest wysoka moc wyjściowa lasera (w niektórych przypadkach &gt;2W przy długości fali 890 nm), aby zrekompensować duże straty wprowadzane przez komponenty optyczne układu.</li>
 <li>System prechirpera składający się z dwóch pryzmatów nadaje impulsom laserowym ujemną dyspersję prędkości grupowej (GVD) przed deflektorami akustooptycznymi (AOD), aby skompensować dyspersję czasową wprowadzaną przez AOD1.</li>
 <li>Dwa AOD o dużych aperturach (10 mm dla obiektywu imersyjnego wodnego 40x o NA 0,8) odchylają wiązkę laserową w dwóch wymiarach.</li>
 <li>Refleksyjna siatka dyfrakcyjna z 100 rowkami/mm jest umieszczona 13 cm za AOD, aby skompensować dyspersję przestrzenną wprowadzaną przez AOD podczas korzystania z krótkich impulsów laserowych.</li>
 <li>Wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu pionowego.</li>
 <li>Przysłony irysowe są rozmieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania komponentów optycznych.</li>
 <li>Dichroiczny dzielnik wiązki przed obiektywem przepuszcza podczerwone światło wzbudzenia do preparatu i odbija światło fluorescencyjne z preparatu na detektor.</li>
 <li>Detektory epi- i transfluorescencji (fotopowielacze, PMTs) zbierają sygnał fluorescencji poprzez obiektyw oraz – jeśli dotyczy – przez kondensator.</li>
 <li>Kolorowe filtry szklane (BG-39, 3-5 mm) są umieszczone przed detektorami, aby zapobiec przedostawaniu się światła wzbudzenia do detektorów.</li>
 <li>Kąty odchylenia AOD są sterowane przez komputer wyposażony w kartę przetwornika cyfrowo-analogowego (częstotliwość taktowania 156,25 kHz), która z kolei steruje oscylatorami sterowanymi napięciowo.</li>
 <li>Sygnał z fotopowielaczy jest przekazywany przez filtr dolnoprzepustowy Butterwortha (częstotliwość odcięcia 100 kHz) i digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy (częstotliwość taktowania 156,25 kHz) przed zapisaniem w komputerze do analizy.</li>
 <li>Wyrównanie i szum elektryczny są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencji z i bez światła laserowego, przy niskim i wysokim wzmocnieniu fotopowielaczy, a także z i bez wskaźnika. Skaner jest prawidłowo skonfigurowany i ekranowany, gdy szerokość rozkładu sygnałów fluorescencji przy wysokim wzmocnieniu i ze wskaźnikiem jest znacznie większa niż szerokości pozostałych rozkładów sygnałów fluorescencji (Rycina 2).</li>
</ol>
2. Procedury eksperymentalne
<ol>
 <li>Skanowanie z losowym dostępem z ditheringiem opiera się na detekcji wewnątrzkomórkowych wzrostów poziomu wapnia. Dużą liczbę neuronów można zabarwić poprzez iniekcję bolusową estrowej formy wskaźnika wapnia (na przykład Oregon Green 488 Bapta-1 AM) do tkanki nerwowej5.</li>
 <li>Z ciała komórkowego każdego neuronu rejestrowanych jest kilka lokalizacji, każda przez krótki czas („dithering”, 4 lokalizacje, 6,4 μsec na każdą lokalizację = 25,6 μsec czasu rejestracji dla każdego neuronu w każdym cyklu, Rysunek 3C). W celu wyboru interesujących neuronów pozyskiwana jest pełna klatka składająca się z 256x256 pikseli (Rysunek 3A). Centrum ciała komórkowego każdego neuronu do rejestracji jest wybierane ręcznie na tym obrazie. Oprogramowanie sterujące automatycznie dodaje trzy punkty w odległości 2 μm wokół tego centrum.</li>
 <li>W każdym cyklu sygnał fluorescencji jest rejestrowany z każdego z 40 neuronów (Rysunek 3B). Proces ten jest powtarzany przez cały czas trwania jednej rejestracji (rejestracja 5 sec = 3 255 cykli, 1 cykl = 1,536 msec).</li>
</ol>
3. Narzędzia programowe online w celu zmaksymalizowania wydajności detekcji kolców
<ol>
 <li>Wykrywanie impulsów (spike'ów) na podstawie somatycznych sygnałów fluorescencyjnych wapnia opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu (S/N) tych sygnałów. Wysoki S/N można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia. Intensywność wzbudzenia można jednak zwiększać tylko do określonego limitu ze względu na fotouszkodzenia. Wykrywanie impulsów jest skuteczne jedynie w bardzo wąskim zakresie intensywności wzbudzenia, w którym sygnały fluorescencyjne charakteryzują się wysokim S/N, a jednocześnie obserwuje się bardzo niewielkie fotouszkodzenia3. Aby upewnić się, że rejestrowane sygnały mieszczą się w zakresie wysokiej skuteczności wykrywania impulsów podczas pomiarów, monitorujemy tempo emisji fotonów (patrz równanie 3.2) oraz spadek fluorescencji bazowej przy użyciu analizy online.</li>
 <li>Przybliżone tempo emisji fotonów na neuron oblicza się z krótkiego okna czasowego (100-200 ms) szumu bazowego. Liczbę fotonów (Nλ) oraz tempo emisji fotonów (λ = Nλ / Δt) oblicza się z wartości fluorescencji poprzez dopasowanie rozkładu (σ) względnych zmian fluorescencji do następującego równania:</li>
</ol>
<img alt="Równanie równowagi statycznej, σ(ΔF/F) z rozkładem Gaussa, analiza wzoru, koncepcja fizyczna." src="/files/ftp_upload/4052/4052eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1"> 
Równanie to przedstawia rozkład Poissona dla szumu śrutowego fotonów po zmianie zmiennej na względną zmianę fluorescencji: ΔF/F = (G*Nλ(t)-G*Nλ,0)/G*Nλ,0, gdzie G oznacza całkowite wzmocnienie fotopowielacza i wszystkich pozostałych komponentów elektronicznych. Należy zauważyć, że równanie to nie określa poprawnie liczby wykrytych fotonów w pomiarach in vivo, ponieważ oprócz szumu śrutowego fotonów występują inne źródła szumu (artefakty ruchowe). Niemniej jednak równanie to jest przydatne w pomiarach in vivo do szacowania poziomu szumu.
<ol start="3">
 <li>Fluorescencję bazową oblicza się z tego samego okna czasowego i przedstawia jako funkcję czasu lub prób. Średni spadek poziomu bazowego utrzymuje się poniżej 0,0002/sec poprzez regulację mocy lasera, ponieważ detekcja impulsów gwałtownie spada po przekroczeniu tej granicy.</li>
 <li>Co 10-20 min pozycje somat neuronów są weryfikowane poprzez ponowną akwizycję pełnego obrazu klatki. W razie potrzeby koryguje się miejsca rejestracji. Lokalizacje można dostosować dla wszystkich neuronów jednocześnie lub dla poszczególnych neuronów.</li>
</ol>
4. Rekonstrukcja czasu wystąpienia potencjałów czynnościowych z sygnałów fluorescencyjnych (dekonwolucja)
<ol>
 <li>Sygnały fluorescencji wynikające z aktywności neuronalnej często sumują się w czasie, ponieważ zanik przejściowych zmian stężenia wapnia jest długotrwały (kilkaset ms). Metoda dekonwolucji pozwala na odtworzenie impulsów oraz momentów ich wystąpienia na podstawie sygnałów fluorescencji.</li>
 <li>Aby wyznaczyć najbardziej prawdopodobny ciąg impulsów leżący u podstaw zarejestrowanego sygnału fluorescencji, porównuje się różne modele. W tym przypadku zastosowano algorytm genetyczny w celu wyłonienia modelu – a tym samym ciągu impulsów i momentów ich wystąpienia – o maksymalnym prawdopodobieństwie.</li>
 <li>W niejednorodnych populacjach neuronów sygnał wapniowy wywołany impulsem może różnić się między poszczególnymi komórkami. Do nienadzorowanej analizy zestawów danych zaprojektowano algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapniowego wywołanego impulsem w zależności od neuronu.</li>
 <li>Aby uniknąć dużej liczby fałszywie dodatnich detekcji, użyteczne jest ograniczenie dopuszczalnej amplitudy oraz stałej czasu zaniku w modelu sygnału wapniowego wywołanego impulsem. Wspólny rozkład amplitudy i stałej czasu zaniku przejściowych zmian stężenia wapnia wywołanych pojedynczym impulsem jest rejestrowany w oddzielnym zestawie eksperymentów na tym samym typie neuronów, w tych samych warunkach doświadczalnych, przy użyciu jednoczesnych pomiarów elektrofizjologicznych i optycznych.</li>
 <li>Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej oraz zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucji, dłuższe nagrania są dzielone na kilka krótszych śladów o długości 1-5 sec.</li>
 <li>Dla każdego neuronu i każdego nagrania algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli (do 1 000 000 różnych modeli lub więcej). W celu przyspieszenia procesu, dekonwolucja jednego eksperymentu jest przeprowadzana równolegle na maksymalnie 10 różnych komputerach.</li>
 <li>Po dekonwolucji dane dotyczące impulsów są analizowane i weryfikowane. W sposób zautomatyzowany obliczany jest histogram czasu peri-stymulacyjnego, prawdopodobieństwo wystąpienia impulsu oraz częstotliwość wyładowań (średnia liczba impulsów na neuron).</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Skuteczne wykrywanie impulsów (spike'ów) zależy od wysokiego stosunku sygnału do szumu rejestrowanych sygnałów fluorescencji wapniowej w somie. Samo stosowanie wysokich częstotliwości wzbudzenia (wysokiej mocy lasera) może prowadzić do negatywnego wpływu efektów fotochemicznych na materiał biologiczny (fotouszkodzeń). W skanowaniu z losowym dostępem z ditherem fotouszkodzenia objawiają się spadkiem fluorescencji bazowej oraz zmniejszeniem sygnałów fluorescencji wapniowej wywoływanych przez impulsy. Spadek sygnału wywołanego impulsem może szybko doprowadzić do braku możliwości wykrycia spike'ów. Istnieje tylko bardzo wąski zakres intensywności wzbudzenia, w którym skuteczność wykrywania impulsów z sygnałów fluorescencji jest wysoka. Górna granica tego zakresu jest ograniczona przez fotouszkodzenia, natomiast dolna przez niski stosunek sygnału do szumu sygnałów fluorescencji. Dla neuronów kory w skrawkach ostrych stosujemy moc lasera skutkującą natężeniem strumienia fotonów na poziomie około 400 000-1 500 000 photon/sec podczas rejestracji w głębokości około 100 μm poniżej powierzchni skrawka. Przy zastosowaniu wskaźnika o wysokim powinowactwie — w tym przypadku Oregon Green 488 BAPTA - 1 — sygnał ten jest wystarczający do wykrycia pojedynczych impulsów. Rycina 3E przedstawia przykład sygnału fluorescencji zarejestrowanego przy bardzo niskim stopniu wzbudzenia, przykład rejestracji w obrębie okna detekcji oraz przykład przy bardzo wysokim stopniu wzbudzenia.
W porównaniu z innymi technikami rejestracji aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów, skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning) pozwala na rejestrację sygnałów z większej liczby neuronów z tej samej, lokalnej populacji i jest mniej inwazyjne, na przykład w porównaniu z rejestracjami za pomocą tetrod lub wieloelektrod. W związku z tym skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem może być wykorzystywane do rejestracji aktywności wielu neuronów w celu pomiaru informacji wzajemnej przekazywanej przez aktywność ponadprógową6 (Rycina 4A), zmian aktywności neuronalnej w populacji neuronów (plastyczność korowa) oraz propagacji aktywności ponadprogowej przez populacje neuronów14 (Rycina 4B)
<img alt="Schemat układu wzbudzenia optycznego z laserem, pryzmatami i siatką; stosowany do analizy emisji." src="/files/ftp_upload/4052/4052fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Projekt optyczny układu skanowania z ditherowanym dostępem swobodnym.
<img alt="Wykres sygnału fluorescencji; laser/brak lasera, wzmocnienie PMT, porównanie barwników dla analizy fotonicznej." src="/files/ftp_upload/4052/4052fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Wyrównanie i testowanie: rozkłady sygnałów fluorescencji zarejestrowane w różnych warunkach. A) Brak światła laserowego i niskie wzmocnienie fotopowielacza, B) Przy wyższym wzmocnieniu PMT, ale bez światła laserowego, rozkład jest szerszy ze względu na prąd ciemny fotopowielacza. C) Przy włączonym laserze i rejestracji przy wysokim wzmocnieniu PMT. Różnica między rozkładami pokazanymi w B a tym rozkładem wskazywałaby, że światło wzbudzenia dociera do detektorów PMT. D) Rozkład sygnałów fluorescencji zarejestrowanych przy wysokim wzmocnieniu z somat neuronów. Jeśli nie występują inne źródła szumów, rozkład ten wynika wyłącznie z szumu śrutowego fotonów.
<img alt="Proces obrazowania fluorescencyjnego, ścieżka skanowania neuronów, schemat ditheringu, wyniki wykresu czasowego ΔF/F." src="/files/ftp_upload/4052/4052fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. A) Pełny obraz fluorescencyjny służący do wykrywania i wyboru pozycji somat neuronów, B) Ścieżka skanowania jednego cyklu, C) Ilustracja zasady ditheringu; w każdym somacie (okrąg) rejestrowanych jest kilka lokalizacji przed przesunięciem wiązki do następnego somatu, D) Ilustracja wyjścia dwóch kanałów C/A. Dla każdego somatu neuronu sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z 4 różnych punktów w każdym somacie (s1-s4). Lokalizacja każdego punktu jest określona przez jego pozycję x i y. Pozycje x i y dla wszystkich punktów i wszystkich neuronów są przesyłane do przetwornika cyfrowo-analogowego w sposób sekwencyjny. Podczas przemieszczania wiązki między dwoma somatami neuronów żaden sygnał nie jest pozyskiwany (przerwa). E) Przykłady sygnałów fluorescencyjnych. Należy zauważyć, że każdy przykład pokazuje odpowiedź na jeden potencjał czynnościowy (zmierzony za pomocą elektrofizjologicznej rejestracji z metodą cell-attached).
<img alt="Schemat propagacji sygnałów neuronalnych; analiza odpowiedzi neuronalnej; dane o informacji wzajemnej; badanie mózgu." src="/files/ftp_upload/4052/4052fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Badanie funkcji kory mózgowej z wykorzystaniem skanowania z losowym dostępem i ditherowaniem. A) Pomiar informacji wzajemnej przekazywanej przez populacje neuronów. Górny obraz przedstawia fotomikrografię ostrego skrawka mózgu oraz dwie pipety stymulacyjne umieszczone w tej samej kolumnie korowej w warstwie 4(L4). Wykresy w części środkowej pokazują odpowiedzi neuronalne dla każdego powtórzenia bodźca. Dolny wykres przedstawia informację wzajemną Shannona przekazywaną przez rejestrowaną populację neuronów. B) Pomiar propagacji aktywności kolcowej powyżej progu (propagacja sygnału) między populacjami neuronów korowych. Górny wykres ilustruje schemat doświadczenia, środkowy obraz przedstawia obraz fluorescencyjny, linie przerywane wskazują granice beczułek (barrels), a dolny wykres pokazuje wykryte kolce w odpowiedzi na stymulację elektryczną włókien wzgórzowo-korowych (trójkąty).

<ol><li>Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+functional+imaging+of+single+neurons+using+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy.</a> J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).</li>
<li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248, 73(1990).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+recording+of+neuronal+spiking+activity+from+unbiased+populations+of+neurons+with+high+spike+detection+efficiency+and+high+temporal+precision%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Optical recording of neuronal spiking activity from unbiased populations of neurons with high spike detection efficiency and high temporal precision.</a> J. Neurophysiol. 104, 1812-1824 (2010).</li>
<li>Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+in+vivo+calcium+imaging+reveals+neuronal+network+activity+with+near-millisecond+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision.</a> Nat. Methods. 7, 399-405 (2010).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pita-Almenar, J. D., Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cortical+plasticity+on+information+signaled+by+populations+of+neurons+in+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Impact of cortical plasticity on information signaled by populations of neurons in the cerebral cortex.</a> J. Neurophysiol. 106, 1118-1124 (2011).</li>
<li>Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+input+and+output+of+neocortical+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Imaging input and output of neocortical networks in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).</li>
<li>Lin, B. J., Chen, T. W., Schild, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+relationships+between+spiking+and+%5BCa2%2B%5Di+in+neurons+of+the+Xenopus+tadpole+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific relationships between spiking and [Ca2+]i in neurons of the Xenopus tadpole olfactory bulb.</a> J. Physiol. 582, 163-175 (2007).</li>
<li>Zeng, S., Lv, X., Zhan, C., Chen, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+compensation+for+spatial+and+temporal+dispersion+of+acousto-optical+deflectors+for+two-dimensional+scanning+with+a+single+prism%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Simultaneous compensation for spatial and temporal dispersion of acousto-optical deflectors for two-dimensional scanning with a single prism.</a> Opt. Lett. 31, 1091-1093 (2006).</li>
<li>Otsu, Y., Bormuth, V., Wong, J., Mathieu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+neuronal+activity+at+high+frame+rate+with+a+digital+random-access+multiphoton+%28RAMP%29+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of neuronal activity at high frame rate with a digital random-access multiphoton (RAMP) microscope.</a> J. Neurosci. Methods. 173, 259-270 (2008).</li>
<li>Vogelstein, J. T., Watson, B. O., Packer, A. M., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike+inference+from+calcium+imaging+using+sequential+Monte+Carlo+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Spike inference from calcium imaging using sequential Monte Carlo methods.</a> Biophys. J. 97, 636-655 (2009).</li>
<li>Yaksi, E., Friedrich, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+firing+rate+changes+across+neuronal+populations+by+temporally+deconvolved+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of firing rate changes across neuronal populations by temporally deconvolved Ca2+ imaging.</a> Nat. Methods. 3, 377-383 (2006).</li>
<li>Hendel, T., Mank, M., Schnell, B., Griesbeck, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+changes+of+genetic+calcium+indicators+and+OGB-1+correlated+with+neural+activity+and+calcium+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence changes of genetic calcium indicators and OGB-1 correlated with neural activity and calcium in vivo and in vitro.</a> J. Neurosci. 28, 7399-7411 (2008).</li>
<li>Ranganathan, G. N., Koester, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlations+decrease+with+propagation+of+spiking+activity+in+the+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Correlations decrease with propagation of spiking activity in the mouse barrel cortex.</a> Front Neural Circuits. 5, 8(2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Skanowanie z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning) pośrednio wykrywa aktywność impulsacyjną powyżej progu na podstawie wzrostów wewnątrzkomórkowego wapnia w somie, związanych z każdym impulsem w somie neuronu. Wzrosty wewnątrzkomórkowego wapnia są wykrywane za pomocą fluorescencyjnych barwników wapniowych. Ograniczenia skanowania z losowym dostępem z ditherowaniem wynikają w dużej mierze z ograniczonego stosunku sygnału do szumu sygnałów fluorescencji wapnia. Stosunek sygnału do szumu jest z ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Komponenty optyczne wymieniono w kolejności, zaczynając od lasera</td></tr><tr><td>Laser tytanowo-szafirowy</td><td>Coherent Inc.</td><td>Chameleon Ultra 2</td><td>Zalecana wysoka moc wyjściowa (&amp;gt;2W przy 900 nm)</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna f = 30 mm</td><td>Thor labs</td><td>AC254-030-B</td><td>Powłoka antyrefleksyjna (AR) dla 650-1050 nm</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna f = 100 mm</td><td>Thor labs</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>soczewka f = 75 mm</td><td>Thor labs</td><td>LA1608-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>soczewka f = 175 mm</td><td>Thor labs</td><td>LA1229-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna f = 300 mm</td><td>Thor labs</td><td>AC254-300-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna f = 100 mm</td><td>Thor labs</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>Soczewka achromatyczna f = 100 mm</td><td>Thor labs</td><td>AC254-100-B</td><td>AR 650-1050 nm</td></tr><tr><td>Akustyczno-optyczne odchylacze</td><td>Intraaction Corp</td><td>ATD 6510CD2</td><td></td></tr><tr><td>Refleksyjna siatka dyfrakcyjna</td><td>Newport</td><td>53-011R</td><td>100 rowków/mm dla AOD o szerokości pasma 65 MHz i kącie skanowania 45 mrad</td></tr><tr><td>Pryzmaty Brewstera 21,6 mm</td><td>Lambda Research Optics Inc.</td><td>IBP21.6SF10</td><td></td></tr><tr><td>Szkło kolorowe</td><td>Schott</td><td>BG-39</td><td></td></tr><tr><td>Lustro dichroiczne</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>Z532RDC</td><td></td></tr><tr><td>Moduły fotopowielaczy</td><td>Hamamatsu</td><td>H9305-03</td><td></td></tr><tr><td>Karta DAC-ADC</td><td>National Instruments</td><td>PCI-6115</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 Bapta-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr></tbody></table>

optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Przekazywanie informacji w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców często odbywa się za pomocą populacji neuronów, a nie pojedynczych komórek. Podobnie propagacja aktywności impulsowej powyżej progu pobudzenia angażuje populacje neuronów. Badania empiryczne bezpośrednio dotyczące funkcji kory wymagają zatem rejestracji aktywności populacji neuronów z wysoką rozdzielczością. W niniejszej pracy opisujemy metodę optyczną oraz algorytm dekonwolucji służące do rejestrowania aktywności neuronalnej do 100 neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego impulsu. Metoda ta opiera się na detekcji przejściowych wzrostów wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia w somie, związanych z elektrycznymi impulsami (potencjałami czynnościowymi) powyżej progu pobudzenia w neuronach korowych. Wysoka rozdzielczość czasowa rejestracji optycznych jest osiągana dzięki technice szybkiego skanowania z dostępem swobodnym przy użyciu deflektorów akustyczno-optycznych (AODs)1. Dwufotonowe wzbudzanie barwnika wrażliwego na wapń zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną w nieprzezroczystej tkance mózgowej2. Rekonstrukcja impulsów z fluorescencyjnych pomiarów wapnia jest realizowana za pomocą metody maksymalnej wiarygodności. Równoczesne rejestracje elektrofizjologiczne i optyczne wskazują, że nasza metoda niezawodnie wykrywa impulsy (wydajność detekcji impulsów &gt;97%), charakteryzuje się niską częstotliwością fałszywie dodatnich detekcji impulsów (&lt; 0,003 impulsów/s) oraz wysoką precyzją czasową (około 3 ms) 3. Ta optyczna metoda detekcji impulsów może być stosowana do rejestracji aktywności neuronalnej in vitro oraz u znieczulonych zwierząt in vivo3,4.

Zrozumienie funkcji ośrodkowego układu nerwowego kręgowców wymaga rejestracji aktywności wielu neuronów, ponieważ funkcje kory powstają na poziomie populacji neuronów. Opisujemy tutaj optyczną metodę rejestracji nadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów (spikes), zwaną skanowaniem z losowym dostępem z ditherowaniem (dithered random-access scanning). Metoda ta rejestruje somatyczne sygnały fluorescencji wapnia z maksymalnie 100 neuronów z wysoką rozdzielczością czasową. Algorytm maksymalnej wiarygodności dekonwoluje podstawową nadprogową aktywność neuronalną z somatycznych sygnałów fluorescencji wapnia. Metoda ta niezawodnie wykrywa impulsy z wysoką wydajnością detekcji i niskim wskaźnikiem wyników fałszywie dodatnich i może być stosowana do badania populacji neuronów in vitro oraz in vivo.

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Przesyłanie informacji w ośrodkowym układzie nerwowym kręgowców często odbywa się za pomocą populacji neuronów, a nie pojedynczych neuronów. Ponadto...

Ogólnym celem eksperymentu FollowMe jest rejestracja aktywności impulsowej dużych populacji neuronów. W pierwszym etapie osiąga się to poprzez obserwację wzrostu wewnątrzkomórkowego stężenia jonów wapnia w somie neuronu, powiązanego z każdym potencjałem czynnościowym, z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Do rejestracji sygnałów fluorescencji wapnia z 40 som neuronów z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową zastosowano dwufotonowe wzbudzenie oraz zasadę skanowania z dostępem swobodnym.W drugim kroku precyzyjne momenty wystąpienia impulsów (spike timings) są wyodrębniane z sygnałów fluorescencyjnych przy użyciu algorytmu dekonwolucji. Technika ta może być wykorzystywana do rejestrowania aktywności impulsowej dziesiątek neuronów. Uzyskane dane o impulsach mogą następnie służyć do pomiaru informacji wzajemnej, propagacji sygnału między populacjami neuronów lub korelacji neuronowych.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod, takich jak rejestracje mikroelektrodowe, jest możliwość zapisu aktywności impulsacyjnej dużej liczby neuronów z lokalnej populacji. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące funkcji kory na poziomie lokalnych sieci neuronowych, takie jak znaczenie korelacji w poszukiwaniu informacji oraz zmiany w dynamice sieci związane z plastycznością kory. Do wzbudzenia dwufotonowego wykorzystuje się system laserowy impulsowy w podczerwieni z impulsami femtosekundowymi. Wymagana jest wysoka moc wyjściowa lasera, aby zrekompensować duże straty wprowadzane przez komponenty optyczne układu.Układ prekompensacyjny składający się z dwóch pryzmatów nadaje impulsom laserowym ujemną dyspersję prędkości grupowej przed ich wejściem do optycznych deflektorów, aby zrekompensować dyspersję czasową wprowadzaną przez AOD. Dwa AOD z dużymi aperturami odchylają wiązkę laserową w dwóch wymiarach. Refleksyjna siatka dyfrakcyjna o gęstości 100 kresek na milimetr jest umieszczona 13 centymetrów za AOD w celu kompensacji dyspersji przestrzennej wprowadzanej przez AOD. W przypadku użycia krótkich impulsów laserowych, wiązka laserowa jest kierowana za pomocą dwóch teleskopów przekaźnikowych do portu kamery mikroskopu prostego.Przysłony są rozmieszczone w regularnych odstępach w celu wyrównania komponentów optycznych. Dichroiczny dzielnik wiązki umieszczony przed obiektywem transmituje podczerwone światło wzbudzenia do preparatu i odbija światło fluorescencyjne z preparatu na detektor. Detektory fluorescencji epi- i trans- zbierają sygnał fluorescencyjny poprzez obiektyw, a przed detektorami umieszczone są kolorowe filtry szklane kondensatora, aby zapobiec przedostawaniu się światła wzbudzenia do detektorów.Kąty odchylenia A OD są kontrolowane przez komputer wyposażony w płytkę przetwornika cyfrowo-analogowego, która z kolei steruje oscylatorami sterowanymi napięciowo. Sygnał z fotopowielaczy jest przekazywany przez filtr dolnoprzepustowy Butterwortha o częstotliwości odcięcia 100 kHz i digitalizowany przez przetwornik analogowo-cyfrowy z częstotliwością taktowania 156,25 kHz przed zapisaniem w komputerze do analizy; dopasowanie i szum elektryczny są testowane poprzez rejestrację rozkładu sygnałów fluorescencyjnych z i bez światła laserowego przy niskim i wysokim wzmocnieniu fotopowielaczy, a także z i bez ditherowania wskaźnika. Skanowanie z losowym dostępem opiera się na detekcji wewnątrzkomórkowych wzrostów poziomu wapnia. Pierwszym krokiem protokołu jest zabarwienie dużej liczby neuronów estrową formą wskaźnika wapnia poprzez iniekcję bolusową.Następnie zarejestruj aktywność somy każdego neuronu w czterech lokalizacjach przez 6,4 microseconds w każdej z nich. Aby wybrać interesujące neurony, wykonaj pełny obraz składający się z 256 na 256 pikseli. Następnie ręcznie zaznacz w tym obrazie środki neuronów, których aktywność ma zostać zarejestrowana.Oprogramowanie sterujące w każdym cyklu automatycznie dodaje trzy punkty w odległości 2 µm wokół każdego centrum. Sygnał fluorescencyjny jest rejestrowany z czterech lokalizacji we wszystkich 40 neuronach. Rejestracja ze wszystkich neuronów w jednym cyklu trwa 1,536 ms.Powtórz tę sekwencyjną rejestrację wszystkich 40 neuronów przez pięć sekund. Wykrywanie impulsów z fluorescencyjnych sygnałów wapniowych w somie opiera się na wysokim stosunku sygnału do szumu. Wysoki stosunek sygnału do szumu można osiągnąć poprzez zwiększenie intensywności wzbudzenia.Natyżenie wzbudzenia można jednak zwiększyć tylko do pewnej granicy ze względu na fotouszkodzenia. Istnieje jedynie bardzo wąski zakres natężenia wzbudzenia, w którym fotouszkodzenia są niskie, a stosunek sygnału do szumu jest wystarczający do wykrywania pojedynczych kolców, co pozwala zapewnić, że rejestrowane sygnały mieszczą się w oknie wysokiej detekcji kolców. Podczas eksperymentu wykorzystuje się szereg programów do analizy online opracowanych w naszym laboratorium.Następnie oblicz przybliżoną liczbę fotonów na neuron w krótkim oknie czasowym szumu bazowego wynoszącym około 100 do 200 milisekund. Liczbę fotonów oraz tempo emisji fotonów oblicza się z wartości fluorescencji poprzez dopasowanie rozkładu względnych zmian fluorescencji do tego równania, a następnie oblicza się fluorescencję bazową z tego samego okna czasowego i przedstawia ją w funkcji czasu lub prób. Utrzymuj średni spadek poziomu bazowego poniżej 0,0002 na sekundę poprzez regulację mocy lasera.Ponieważ wykrywanie impulsów gwałtownie spada po przekroczeniu tego limitu. Następnie co 10 do 20 minut weryfikuj pozycje somatyczne neuronów, wykonując obraz pełnej klatki. W razie potrzeby skoryguj miejsca rejestracji.Sygnały fluorescencyjne wynikające z aktywności neuronalnej często są opóźnione w czasie ze względu na długi czas zaniku przejściowego stężenia wapnia. W niniejszej procedurze zastosowano metodę dekonwolucji w celu wyznaczenia impulsów oraz czasu ich wystąpienia na podstawie sygnałów fluorescencyjnych. Wykorzystujemy tutaj algorytm genetyczny, aby określić najbardziej prawdopodobny model pociągu impulsów pasujący do zarejestrowanego sygnału fluorescencyjnego.Z każdą iteracją algorytmu maksymalna wiarygodność asymptotycznie dąży do swojego maksimum, które jest determinowane przez szum zapisów fluorescencji. W niejednorodnych populacjach neuronów sygnał wapniowy wywołany impulsem może różnić się między neuronami. W celu nienadzorowanej analizy dużych zbiorów danych opracowaliśmy algorytm, który uwzględnia zmienność sygnału wapniowego wywołanego impulsem z neuronu na neuron, aby uniknąć dużej liczby wyników fałszywie dodatnich.Wspólny rozkład amplitudy i stałej czasu zaniku przejściowych sygnałów wapniowych wywołanych pojedynczym kolcem zarejestrowano w oddzielnym zestawie eksperymentów na tym samym typie neuronów w tych samych warunkach doświadczalnych. Aby uwzględnić powolne zmiany linii bazowej i zmniejszyć koszty obliczeniowe dekonwolucji, dłuższe pomiary podzielono na kilka krótszych śladów o długości od jednej do pięciu sekund dla każdego neuronu w każdym pomiarze. Algorytm dekonwolucji może testować dużą liczbę modeli, nawet do 1 miliona różnych modeli lub więcej; aby przyspieszyć dekonwolucję, jeden eksperyment jest dekonwolwowany równolegle na maksymalnie 10 różnych komputerach.Po dekonwolucji dane o impulsach są analizowane i sprawdzane. Histogram prawdopodobieństwa wystąpienia impulsu w czasie wokół bodźca (PSTH) oraz częstotliwość wyładowań neuronu są obliczane w sposób zautomatyzowany. Poniżej przedstawiono przykłady sygnału fluorescencyjnego zarejestrowanego przy bardzo niskiej częstotliwości pobudzenia oraz innego przy bardzo wysokiej częstotliwości pobudzenia w oknie detekcji.Należy zauważyć, że każdy przykład przedstawia odpowiedź na jeden impuls. Przedstawiona tutaj fotomikrografia obrazuje ostry skrawek mózgu oraz dwie pipety stymulacyjne umieszczone w tej samej kolumnie korowej. W warstwie czwartej widoczne są odpowiedzi neuronalne na powtarzalne bodźce, a ten wykres przedstawia wzajemną informację Shannona sygnalizowaną przez zarejestrowaną populację neuronów.Poniżej przedstawiono pomiar propagacji aktywności impulsowej powyżej progu między różnymi populacjami neuronów kory mózgowej. Są to wykryte impulsy w neuronach korowych będące odpowiedzią na stymulację elektryczną włókien wzgórzowo-korowych. Podczas rejestracji aktywności neuronalnej przy użyciu skanowania z dostępem swobodnym bardzo ważne jest, aby rejestracja odbywała się w obrębie okna detekcji.W przeciwnym razie bardzo łatwo jest otrzymać nieużyteczne zestawy danych. Detekcja impulsów optycznych jest wciąż w fazie początkowej. Istnieje wiele możliwości ulepszenia tej metody.Dzięki wprowadzeniu pewnych ulepszeń rejestrujemy sygnały z jeszcze większej liczby neuronów. Wprowadzenie innych udoskonaleń pozwoli nam na prowadzenie pomiarów nawet u zwierząt budzących się i wykazujących aktywność behawioralną.

optical-recording-suprathreshold-neural-activity-with-single-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Optyczne rejestrowanie aktywności neuronalnej powyżej progu z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych skokowców

Komórki zwojowe siatkówki przekazują informacje wizualne z oka do mózgu za pomocą sekwencji potencjałów czynnościowych. W niniejszym materiale demonstrujemy sposób rejestracji potencjałów czynnościowych pojedynczych komórek zwojowych in vivo u znieczulonych szczurów.

Rejestracja pojedynczych jednostek In vivo z skrzyżowania wzrokowego szczura

Opisujemy metody wielkoskalowej rejestracji wielu pojedynczych jednostek oraz lokalnych potencjałów polowych u gryzoni podczas zachowań, z wykorzystaniem sond krzemowych. Procesy wykonania napędu, mocowania sondy do napędu oraz implantacji sondy zostały przedstawione w wystarczających szczegółach, aby umożliwić łatwą replikację.

Wielkoskalowa rejestracja neuronów za pomocą ruchomych sond krzemowych u gryzoni podczas zachowań

Opisano technikę obrazowania służącą do monitorowania zmian potencjału błonowego z rozdzielczością przestrzenną poniżej mikrometra i rozdzielczością czasową poniżej milisekundy. Technika ta, oparta na wzbudzaniu laserowym barwników wrażliwych na napięcie, umożliwia pomiar sygnałów w aksonach i kolaterałach aksonalnych, końcowych gałęziach dendrytycznych oraz pojedynczych kolcach dendrytycznych.

Rejestracja za pomocą barwników napięciowo-czułych z aksonów, dendrytów i kolców dendrytycznych pojedynczych neuronów w skrawkach mózgu

Ten film demonstruje rejestrację sygnałów elektrycznych z pojedynczych neuronów mózgowych za pomocą mikropipety szklanej z cienką końcówką i specjalistycznej konfiguracji. Mikropipeta jest ostrożnie wprowadzana do mózgu szczura i jest brzęcząca, aby przeniknąć do neuronu w celu zarejestrowania wewnętrznych neuronalnych sygnałów elektrycznych.

Rejestracja in vivo sygnałów wewnątrzkomórkowych z pojedynczego neuronu

Ten film demonstruje procedurę obserwacji zmian w aktywności neuronalnej w wycinku mózgu zabarwionym barwnikiem wrażliwym na napięcie. Barwnik odzwierciedla zmiany w potencjale błonowym neuronu poprzez zmianę jego intensywności fluorescencji. Dzięki zastosowaniu bodźców elektrycznych i zaawansowanych technik obrazowania, proces ten umożliwia wizualne śledzenie zmian potencjału błony neuronalnej w czasie rzeczywistym w oparciu o fluorescencję VSD.

Optyczny zapis aktywności neuronalnej w wycinkach mózgu barwionych barwnikiem wrażliwym na napięcie

Ten film przedstawia metodę jednoczesnego obrazowania i rejestrowania aktywności elektrycznej z transgenicznych wycinków mózgu, które zawierają specyficzne dla neuronów białka fluorescencyjne. Procedura polega na utrzymywaniu wycinka mózgu w komorze perfuzyjnej z napowietrzonym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, użyciu źródła światła do wzbudzenia komórek znakowanych fluorescencyjnie oraz rejestrowaniu sygnałów elektrycznych za pomocą wielokanałowej sondy i zacisku krosowego.

Jednoczesne optyczne i elektrofizjologiczne monitorowanie komórek neuronalnych w wycinkach mózgu

Niedawny rozwój narzędzi neuronauki, które łączą genetykę i optykę, określany jako "optogenetyka", umożliwia kontrolę nad aktywnością obwodów neuronowych z niespotykanym dotąd poziomem rozdzielczości przestrzennej i czasowej. W tym miejscu przedstawiamy protokół integracji zapisu in vivo z manipulacją optogenetyczną genetycznie zdefiniowanych podzbiorów neuronów przedczołowych korowych i podkostnych neuronów piramidowych.

Metoda wysokiej wierności optogenetycznej kontroli pojedynczych neuronów piramidowych in vivo

Uczenie się nowych powiązań bodziec-reakcja angażuje szeroki zakres procesów neuronalnych, które ostatecznie znajdują odzwierciedlenie w zmianie wydajności skoków poszczególnych neuronów. Tutaj opisujemy protokół behawioralny pozwalający na ciągłą rejestrację aktywności pojedynczego neuronu, podczas gdy zwierzęta nabywają, wygaszają i ponownie nabywają warunkową reakcję w ciągu jednej sesji eksperymentalnej.

Rejestrowanie potencjałów czynnościowych pojedynczych neuronów od swobodnie poruszających się gołębi na trzech etapach uczenia się

Tutaj opisujemy naszą strategię uzyskiwania stabilnych, dobrze izolowanych pojedynczych nagrań jednostkowych ze zidentyfikowanych interneuronów hamujących w znieczulonej korze myszy. Neurony wyrażające ChR2 są identyfikowane na podstawie ich reakcji na niebieskie światło. Metoda wykorzystuje standardowy zewnątrzkomórkowy sprzęt rejestrujący i służy jako niedroga alternatywa dla obrazowania wapnia lub wizualnie sterowanego łatania.

Przewodnik po jednojednostkowym zapisie in vivo z optogenetycznie zidentyfikowanych korowych interneuronów hamujących

Wprowadzamy powtarzalną i stabilną metodę zapisu optycznego dla wycinków mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie. W artykule opisano barwienie barwnikiem wrażliwym na napięcie oraz rejestrację sygnałów optycznych przy użyciu konwencjonalnych preparatów plastrów hipokampa.

Szerokokątny zapis optyczny pojedynczych fotonów w wycinkach mózgu przy użyciu barwnika wrażliwego na napięcie

Ten protokół przedstawia metodę obrazowania aktywności populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczej komórki u nietransgenicznych gatunków bezkręgowców przy użyciu barwników absorbancyjnych wrażliwych na napięcie i matrycy fotodiodowej. Takie podejście umożliwia szybki przepływ pracy, w którym obrazowanie i analiza mogą być realizowane w ciągu jednego dnia.

Obrazowanie optyczne oparte na fotodiodach do rejestrowania dynamiki sieci z rozdzielczością pojedynczego neuronu u bezkręgowców nietransgenicznych

Poznaj metodę optycznego zapisu aktywności neuronalnej z użyciem mikroskopii fluorescencyjnej i algorytmu dekompozycji. Technika umożliwia rejestrację sygnałów wapniowych z do 100 neuronów z wysoką rozdzielczością czasową i przestrzenną.

Optyczna rejestracja ponadprogowej aktywności neuronalnej z rozdzielczością pojedynczych komórek i pojedynczych impulsów

Przeglądaj więcej filmów