Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obrazowanie aktywności neuronalnej myszy za pomocą MRI wzmocnionego manganem. Jest to realizowane poprzez jednostronną stymulację wibrys oraz mapowanie odpowiedzi neuronalnej w przeciwległym polu beczkowatym kory mózgowej. Pierwszym krokiem jest montaż i kalibracja systemu ultradźwiękowego, składającego się z niefokusującego przetwornika ultradźwiękowego sterowanego przez generator sygnałowy i wzmacniacz, przeznaczonego do przeprowadzenia eksperymentu.

Po wewnątrzbrzusznym wstrzyknięciu manganu bariera krew-mózg zostaje otwarta za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków, co umożliwia przenikanie manganu do miąższu mózgu. Następnie mysz zostaje poddana paradygmatowi stymulacji neuronalnej, co skutkuje większym gromadzeniem się manganu w bardziej aktywnych obszarach mózgu. Na koniec uzyskuje się obrazy MRI, które wykazują regionalne różnice w intensywności obrazu MR ważonego w T1, w zależności od różnych poziomów akumulacji manganu w mózgu.

W neuronauce mysz jest dominującym systemem modelowym służącym do badania genetycznych i molekularnych podstaw rozwoju mózgu oraz chorób neurologicznych. Niniejsza technika dostarcza nieinwazyjnego narzędzia do mapowania aktywności neuronalnej w tych modelach mysich. Ultradźwiękowe przerwanie bariery krew-mózg może być wykorzystane nie tylko do dostarczania manganu do miąższu mózgu w celu funkcjonalnego obrazowania neurologicznego, ale także do wprowadzania do miąższu mózgu szerokiej gamy innych związków, w tym środków kontrastowych opartych na gadolinie lub leków chemioterapeutycznych.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas kalibracji systemu ultradźwiękowego oraz obsługi mikrorurek. Procedura ta zostanie zademonstrowana każdemu z techników w naszym laboratorium. System ultradźwiękowy składa się z jednoelementowego przetwornika ultradźwiękowego o średnicy wystarczająco dużej, aby objąć mózg myszy, oraz częstotliwości centralnej w zakresie 2 MHz.

Przetwornik jest sterowany przez generator sygnałowy i wzmacniacz mocy o wzmocnieniu 50 decybeli, które generowały sekwencję impulsów ultradźwiękowych. Skalibruj system ultradźwiękowy w zbiorniku z wodą. Umieść hydrofon na dnie zbiornika i ustaw nad nim przetwornik za pomocą trójosiowego stołu translacyjnego.

Następnie przyłóż krótki ciąg impulsów sinusoidalnych do przetwornika i dostosuj pozycję stolika, aby znaleźć szczytową odpowiedź, która powinna znajdować się w centrum wiązki ultradźwiękowej i w naturalnej ogniskowej przetwornika. Następnie wykonaj kilka pomiarów ciśnienia akustycznego w zakresie różnych napięć wejściowych i wykorzystaj regresję liniową do oszacowania zależności między napięciem wejściowym a ciśnieniem akustycznym. Wyznacz amplitudę impulsu niezbędną do wygenerowania szczytowego ujemnego ciśnienia akustycznego wynoszącego około 0,36 megapascals.

W tym kroku należy znieczulić zwierzę, podając izofluran przez stożek nosowy. Aparatura stożka nosowego powinna precyzyjnie i niezawodnie stabilizować głowę zwierzęcia w tej samej pozycji za każdym razem; nasze urządzenie utrzymuje głowę w pozycji płaskiej czaszki podczas eksperymentu. Należy użyć poduszki pneumatycznej do monitorowania częstotliwości oddechów i miareczkować środek znieczulający tak, aby utrzymać częstotliwość oddechów między 85 a 125 oddechami na minutę. Jednocześnie należy monitorować temperaturę zwierzęcia za pomocą sondy rektalnej i utrzymywać temperaturę ciała, używając lampy grzewczej lub strumienia powietrza.

Następnie wprowadź cewnik do żyły ogonowej oraz cewnik doprzestrzeni otrzewnowej zwierzęciu. Kolejnym krokiem jest przycięcie sierści w celu wykazania jednostronnej stymulacji VII oraz zmapowania odpowiedzi neuronalnej w przeciwległej korze pola beczkowatego. Odetnij przeciwległy VII jak najbliżej powierzchni skóry, nie drażniąc przy tym mieszka włosowego ani otaczającej skóry.

Następnie przenieś zwierzę do systemu ultradźwiękowego, nałóż żel do USG na skórę głowy i umieść na niej cienką plastikową płytkę zawierającą słup wody. Za pomocą patyczka higienicznego usuń z poziomu słupa wody wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w żelu do USG. Następnie umieść przetwornik ultradźwiękowy w wodzie w jego naturalnej odległości ogniskowej bezpośrednio nad mózgiem myszy i przetrzyj przetwornik palcem, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.

Następnie należy wytworzyć mikrosfery lipidowe perrina, potrząsając fiolką w mieszadle przez 45 sekund podczas pracy. Pozostawić w temperaturze pokojowej, ale po ostatnim użyciu w ciągu dnia przechowywać w lodówce do momentu pierwszego użycia następnego dnia. W kolejnych dniach przechowywaną fiolkę ponownie wymieszać w mieszadle.

Następnie wstrzyknij dootrzewnowo 0.5 millimole na kilogram chlorku manganu i odczekaj 10 minut, aby umożliwić jego rozprowadzenie. Następnie potrząśnij ręcznie fiolką z mikropęcherzykami przez jedną minutę, aby resuspendować mikrosfery. W dalszej kolejności pobierz 30 µL plus objętość martwą cewnika.

Należy uważać, aby nie wstrzyknąć powietrza do fiolki, ponieważ spowoduje to degradację pozostałych mikropęcherzyków. Natychmiast rozpocząć sekwencję impulsów ultradźwiękowych i z minimalną zwłoką wstrzyknąć mikrosfery przez cewnik żyły ogonowej. Kontynuować sonikację przez trzy minuty.

Następnie wyłącz system ultradźwiękowy. Po tym, jak poziom manganu w mózgu ustabilizuje się przez około 40 minut, wyłącz izofluran i zdejmij stożek nosowy. W tym momencie rozpocznij paradygmat stymulacji neuronalnej w celu zmapowania kory pola beczkowatego.

Przesuwaj pędzel okrężnym ruchem z częstotliwością około 1 do 5 Hz przez przeciwległą macierz wibracyjną przez 90 minut. Po stymulacji wznów anestezję, następnie kontynuuj utrzymywanie temperatury ciała i dostosuj poziom izofluranu do częstotliwości oddechów wynoszącej od 85 do 125 oddechów na minutę. Następnie umieść mysz w cewce MRI i przenieś ją do systemu MRI.

Następnie należy pozyskać obrazy T1-zależne o wysokiej rozdzielczości, jak pokazano tutaj. Przerwanie bariery krew-mózg po podaniu środka kontrastowego skracającego czas T1, takiego jak mangan lub środek oparty na gadolinie, skutkuje wzrostem sygnału w miąższu mózgu w obrazowaniu T1-zależnym w porównaniu do mózgów, w których nie przeprowadzono BOMA. W pierwszej kolumnie przedstawiono mapy aktywności neuronalnej wygenerowane poprzez jednostronną stymulację risi u siedmiu zwierząt.

Mapy różnic w dwóch różnych lokalizacjach wykazują zwiększony sygnał MRI po stronie przeciwnej do stymulowanej przez brissy. W drugiej kolumnie mapy wartości p wskazują względną istotność tych różnic. W trzeciej kolumnie odpowiadające im schematy atlasu mózgu pokazują, że te aktywne obszary odpowiadają polu beczkowemu pierwotnej kory sensorycznej.

Przy wprawie technikę tę można przeprowadzić w około dwie godziny, nie licząc czasu trwania symulacji. Podczas wykonywania procedury ważne jest, aby pamiętać o wymieszaniu fiołki z mikropęcherzykami przed wstrzyknięciem oraz o zachowaniu ostrożności, aby nie wstrzyknąć powietrza do fiołki. Ponadto należy upewnić się, że w żelu do badań ultrasonograficznych lub pod przetwornikiem ultrasonograficznym nie uwięzione są pęcherzyki powietrza.

W tej demonstracji zdecydowaliśmy się na stymulację wibrysów, jednak technika ta może zostać oczywiście dostosowana do badania dowolnego interesującego nas bodźca. Po przeprowadzeniu procedury zwierzę może całkowicie dojść do siebie, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych.