Neuroobrazowanie funkcjonalne z wykorzystaniem ultradźwiękowego przerwania bariery krew-mózg i rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zobrazowanie aktywności neuronalnej myszy za pomocą rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem. Odbywa się to poprzez jednostronne stymulowanie wibracji i mapowanie odpowiedzi neuronalnej w przeciwległej korze pola beczkowego. Pierwszym krokiem jest zmontowanie i skalibrowanie systemu ultradźwiękowego składającego się z nieostrego przetwornika ultradźwiękowego napędzanego przez generator sygnału i wzmacniacz na potrzeby eksperymentu.

Po dootrzewnowym wstrzyknięciu manganu bariera krew-mózg jest otwierana za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków, dzięki czemu mangan może dostać się do miąższu mózgu. Następnie mysz poddawana jest paradygmatowi stymulacji neuronalnej, co skutkuje większą akumulacją manganu w bardziej aktywnych obszarach mózgu. Na koniec uzyskuje się obrazy MRI, które pokazują regionalne różnice w intensywności obrazu MR ważonego T jeden w oparciu o różne poziomy akumulacji manganu w mózgu.

W neurobiologii mysz jest dominującym systemem modelowym do badania genetycznych i molekularnych podstaw rozwoju i chorób mózgu. Ta technika zapewnia nieinwazyjne narzędzie do mapowania aktywności neuronalnej w tych modelach mysich. Ultradźwiękowe przerwanie bariery krew-mózg może być nie tylko wykorzystywane do dostarczania manganu do miąższu mózgu w celu funkcjonalnego obrazowania neurologicznego, ale może być również wykorzystywane do dostarczania wielu innych związków do miąższu mózgu, w tym środków kontrastowych na bazie gadolinu lub chemioterapeutyków.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności z kalibracją systemu ultradźwiękowego i obsługą mikrorubli. Procedurę zademonstruje każdy z techników w naszym laboratorium. System ultrasonograficzny składa się z jednoelementowego przetwornika ultradźwiękowego o średnicy wystarczająco szerokiej, aby pokryć mózg myszy i częstotliwości środkowej w zakresie dwóch megaherców.

Przetwornik jest napędzany przez generator sygnału i wzmacniacz mocy 50 decybeli, który wytwarza sekwencję impulsów ultradźwiękowych. Skalibruj system ultradźwiękowy w zbiorniku na wodę. Umieść hydrofon na dnie zbiornika i ustaw nad nim przetwornik z trzyosiowym stolikiem translacyjnym.

Następnie zastosuj krótki ciąg impulsów sinusoidalnych do przetwornika i wyreguluj stopień, aby znaleźć szczytową odpowiedź, która powinna znajdować się w środku wiązki ultradźwiękowej i naturalnym skupieniu przetwornika. Następnie wykonaj kilka pomiarów ciśnienia akustycznego w zakresie napięć wejściowych i użyj regresji liniowej, aby oszacować zależność między napięciem wejściowym a ciśnieniem akustycznym. Znajdź amplitudę impulsu, aby wygenerować szczytowe ujemne ciśnienie akustyczne wynoszące około 0,36 megapaskali

Na tym etapie znieczulij zwierzę, dostarczając izofluor przez stożek nosowy. Aparat stożkowy do nosa powinien precyzyjnie i niezawodnie ustawiać głowę zwierzęcia w tej samej pozycji za każdym razem, gdy nasze urządzenie utrzymuje głowę w czaszce Płaska pozycja podczas eksperymentu to poduszka pneumatyczna do monitorowania częstości oddechów i miareczkowania środka znieczulającego, aby utrzymać częstość oddechów między 85 a 125 oddechów na minutę. W tym samym czasie monitoruj temperaturę zwierzęcia za pomocą sondy doodbytniczej i utrzymuj temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej lub wdmuchiwanego powietrza.

Następnie włóż zwierzęciu cewnik do żyły ogonowej i cewnik dootrzewnowy. Następnym krokiem jest przycięcie włosów w celu zademonstrowania jednostronnej stymulacji VII i zmapowania odpowiedzi neuronalnej w przeciwległej korze pola beczkowego. Przeciąć przeciwległą VII jak najbliżej powierzchni skóry, nie podrażniając mieszków włosowych ani otaczającej skóry.

Następnie przenieś zwierzę do systemu ultrasonograficznego i nałóż żel ultradźwiękowy na skórę głowy, dolny cienki plastikowy arkusz zawierający słup wody na głowę. Sięgnij przez słup wody wacikiem z bawełnianą końcówką, aby wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które zostaną uwięzione w żelu ultradźwiękowym. Następnie umieść przetwornik ultradźwiękowy w wodzie w jego naturalnej odległości ogniskowej bezpośrednio nad mózgiem myszy i przetrzyj przetwornik palcem, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.

Następnie wyprodukuj mikrosfery lipidowe perryny, potrząsając fiolką w mieszadle przez 45 sekund podczas pracy. Pozostaw fioletową temperaturę pokojową, ale przechowuj ją w lodówce po ostatnim użyciu w ciągu dnia poprzedzającego pierwsze użycie. W kolejnych dniach należy wymieszać przechowywaną fiolkę w mieszadle. Znów.

Następnie wstrzyknij 0,5 milimola na kilogram chlorku manganu dootrzewnowo i odczekaj 10 minut, aby umożliwić jego dystrybucję. Następnie należy ręcznie mieszać fiolkę z mikropęcherzykami przez jedną minutę w celu ponownego zawieszenia mikrosfer. Następnie pobrać 30 mikrolitrów plus martwa objętość cewnika.

Należy uważać, aby nie wstrzykiwać powietrza do fiolki, ponieważ spowoduje to degradację pozostałych mikropęcherzyków. Natychmiast rozpocznij sekwencję impulsów ultradźwiękowych i wstrzyknij mikrosfery przez cewnik do żyły ogonowej z minimalnym opóźnieniem. Kontynuuj sonifikację przez trzy minuty.

Następnie wyłącz system ultrasonograficzny. Po ustabilizowaniu się poziomu manganu w mózgu przez około 40 minut, wyłącz izofluor i usuń stożek nosowy. W tym momencie rozpocznij paradygmat stymulacji neuronalnej, aby zmapować korę pola beczkowego.

Przesuwaj pędzel ruchem okrężnym z częstotliwością od jednego do pięciu Hz przez przeciwległy układ wibracyjny przez 90 minut. Po stymulacji wznów znieczulenie, a następnie kontynuuj utrzymywanie temperatury ciała i miareczkowanie poziomu fluoru do częstości oddechów od 85 do 125 oddechów na minutę. Następnie umieść mysz w cewce MRI i przenieś ją do systemu MRI.

Następnie uzyskaj trzy obrazy DT o wysokiej rozdzielczości, jak pokazano tutaj. Przerwanie bariery krew-mózg po podaniu środka kontrastowego skracającego T jeden, takiego jak mangan lub środek na bazie gadolinu, powoduje wzrost sygnału w miąższu mózgu w obrazowaniu ważonym T one w porównaniu z mózgami, w których nie wykonano BOMA. Oto mapy aktywności neuronalnej wygenerowane przez jednostronną stymulację risi u siedmiu zwierząt w pierwszej kolumnie.

Mapy różnic w dwóch różnych lokalizacjach pokazują zwiększony sygnał MRI przeciwległy do stymulowanego przez brissy. W drugiej kolumnie mapy wartości p wskazują względną istotność tych różnic. W trzeciej kolumnie odpowiednie diagramy atlasu mózgu pokazują, że te aktywne obszary odpowiadają polu beczkowemu pierwotnej kory czuciowej.

Przy odrobinie wprawy technikę tę można wykonać w około dwie godziny plus symulacja czasu trwania. Podczas wykonywania zabiegu należy pamiętać o poruszeniu fiolki z mikropęcherzykami przed wstrzyknięciem i uważać, aby nie wstrzyknąć powietrza do fiolki. Ponadto ważne jest, aby upewnić się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w żelu ultradźwiękowym lub pod przetwornikiem ultradźwiękowym.

Na potrzeby tej demonstracji zdecydowaliśmy się stymulować wąsy, ale oczywiście tę technikę można dostosować do badania dowolnego bodźca, który nas interesuje. Po zabiegu zwierzę może całkowicie wyzdrowieć, co pozwala na badania podłużne.