Name: Neuroobrazowanie funkcjonalne z wykorzystaniem ultradźwiękowego przerwania bariery krew-mózg i rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronowej myszy za pomocą ultradźwiękowego otwierania bariery krew-mózg i rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem. Technika umożliwia nieinwazyjne mapowanie funkcji mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie prace zostały przeprowadzone w Duke Center for In vivo Mikroskopia, NIH/NIBIB Krajowe Centrum Zasobów Technologii Biomedycznych (national Biomedical Technology Resource Center, P41 EB015897) oraz Program Zasobów Obrazowania Małych Zwierząt NCI (NCI Small Animal Imaging Resource Program, U24 CA092656). Dodatkowe wsparcie zapewniło stypendium badawcze dla doktorantów NSF (NSF Graduate Research Fellowship, 2003014921).

1. Montaż i kalibracja systemu ultradźwiękowego
<ol>
	<li>Układ ultradźwiękowy składa się z jednoprzetwornikowego przetwornika ultradźwiękowego o średnicy wystarczającej do pokrycia mózgu myszy i częstotliwości centralnej z zakresu 2 MHz. Przetwornik jest sterowany przez wzmacniacz mocy 50 dB, który jest połączony z generatorem sygnałów wytwarzającym sekwencję impulsów ultradźwiękowych.</li>
	<li>Aby skalibrować ciśnienie akustyczne układu ultradźwiękowego, należy użyć hydrofonu w celu ustalenia zależności między przyłożonym napięciem a wynikowym ciśnieniem akustycznym. Umieść przetwornik w zbiorniku z wodą nad hydrofonem. Przyłóż do przetwornika prosty impuls (np. sinusoidę o długości 10 cykli o częstotliwości przetwornika z częstotliwością repetycji impulsów 10 Hz). Użyj trójosiowego stołu translacyjnego, aby znaleźć odpowiedź szczytową, która powinna znajdować się w centrum wiązki ultradźwiękowej w naturalnej ogniskowej przetwornika (około 60 mm dla naszego przetwornika o średnicy 13 mm i częstotliwości 2,15 MHz).</li>
	<li>Wykonaj kilka pomiarów dla zakresu napięć wejściowych (np. 50-400 mVpp), aby zweryfikować liniowość układu. Wykorzystaj prostą regresję liniową do oszacowania zależności między napięciem wejściowym a ciśnieniem akustycznym. W naszym układzie napięcia wejściowe 258 i 167 mVpp odpowiadały szczytowym ujemnym ciśnieniom akustycznym wynoszącym odpowiednio 0,52 i 0,36 MPa.</li>
	<li>Zaprogramuj generator sygnałów tak, aby wytwarzał sekwencję impulsów ultradźwiękowych składającą się z paczek impulsów sinusoidalnych o częstotliwości przetwornika, z 50000 cyklami na paczkę i okresem paczki wynoszącym 64 ms. Na podstawie pomiarów kalibracyjnych ustaw amplitudę impulsu tak, aby generować szczytowe ujemne ciśnienie akustyczne 0,36 MPa w centrum naturalnej ogniskowej przetwornika.</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Rozpuścić tetrachydrat chlorku manganu (MnCl2·4H2O) w sterylnej wodzie do stężenia 100 mM (300 mOsM), a następnie poddać sterylizacji przez filtrowanie.</li>
	<li>Przygotować lipidowe mikrosfery perflutrenowe poprzez „aktywację” fiolki w mieszalniku dostarczonym przez producenta przez 45 s. W dniu przeprowadzania eksperymentów pojedynczą fiolkę można aktywować raz na początku dnia i używać bez ponownej aktywacji przez resztę dnia.</li>
	<li>Bezpośrednio przed podaniem mikrosfer wstrząsnąć fiolką ręcznie przez 1 min, aby resuspender mikrosfery. Podczas pobierania mikropęcherzyków z fiolki nie należy wstrzykiwać do niej powietrza z otoczenia, ponieważ prowadzi to do degradacji pozostałych mikropęcherzyków. Pozostawić fiolkę poza lodówką aż do ostatniego użycia w danym dniu, a następnie przechowywać ją w lodówce. Przechowywane w ten sposób pojedyncze opakowanie może być wykorzystywane przez kilka dni. Przed pierwszym użyciem w kolejnych dniach ponowić aktywację przechowywanej fiolki w mieszalniku.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zanurz zwierzęta w narkozie przy użyciu izofluranu podawanego przez stożek nosowy. Aparatura stożka nosowego powinna być zaprojektowana tak, aby precyzyjnie i niezawodnie utrwalać głowę zwierzęcia w tej samej pozycji za każdym razem. Nasze urządzenie 15 utrzymuje głowę w pozycji „płaskiej czaszki” (tj. grzbietowa powierzchnia czaszki jest pozioma), stosowanej w atlasie mózgu Paxinosa 16. Titruj środek znieczulający tak, aby utrzymać częstotliwość oddychania między 85 a 125 oddechami na minutę. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą lampy grzewczej lub nadmuchiwanego powietrza. Chroń oczy za pomocą środka nawilżającego.</li>
	<li>Usuń włosy ze skóry głowy myszy za pomocą trymera elektrycznego.</li>
	<li>Wprowadź cewnik do żyły ogonowej oraz cewnik doprzewnowy (IP). W przypadku badań z przeżyciem należy zastosować odpowiednią technikę sterylną; umieszczenie cewnika IP zaprezentowane w filmie do niniejszego artykułu jest odpowiednie wyłącznie dla eksperymentów bez przeżycia.</li>
	<li>Wykonaj wszelkie dodatkowe przygotowania wymagane do eksperymentu stymulacji neuronowej. W przypadku mapowania stymulacji wibrissae w korze pola beczułkowego, użyj mikroskopu stereoskopowego i nożyczek mikrochirurgicznych, aby odciąć wibrissae jak najbliżej powierzchni skóry, nie drażniąc mieszka włosowego ani otaczającej skóry.</li>
	<li>Nałóż żel ultradźwiękowy na skórę głowy, a następnie opuść na głowę kolumnę wody ograniczoną cienką plastikową folią (np. worek na śmieci o grubości 7,6 μm). Przez kolumnę wody wprowadź patyczek z watą, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w żelu ultradźwiękowym. Ustaw przetwornik ultradźwiękowy w jego naturalnej odległości ogniskowej (58 mm) bezpośrednio nad mózgiem myszy w kolumnie wody i przetrzyj przetwornik opuszką palca, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza.</li>
</ol>
4. Otwieranie bariery krew-mózg za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS)
<ol>
	<li>Wykonaj zastrzyk domięśniowy roztworu manganu w dawce 0,5 mmol/kg IP. Zaślep cewnik dosytnieniowy, aby mangan nie wyciekł, i odczekaj 10 minut w celu umożliwienia jego dystrybucji (Rysunek 1).</li>
	<li>Aby otworzyć barierę krew-mózg (BBB), podaj 30 μL lipidowych mikrosfer perflutrenu (aktywowane DEFINITY) przez cewnik w żyle ogonowej, jednocześnie uruchamiając sekwencję impulsów ultradźwiękowych. Kontynuuj sonikację przez 3 minuty.</li>
</ol>
5. Stymulacja neuronów
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem stymulacji neuronalnej należy odczekać około 40 minut, aż poziomy Mn2+ w mózgu się ustabilizują. W ten sposób można odróżnić gwałtowny wzrost wzmocnienia bazowego wynikający z dyfuzji Mn2+ przez barierę krew-mózg od subtelnego różnicowego wzmocnienia spowodowanego stymulacją. Następnie należy rozpocząć stymulację zgodnie z wybranym paradygmatem (Rycina 1).</li>
	<li>W przypadku stymulacji wibrys należy wyłączyć izofluran i zdjąć stożek nosowy. Miękkim pędzlem artystycznym należy wykonywać ręcznie koliste ruchy (1-5 Hz) przez układ wibrys w odległości około 2-5 mm od skóry. Stymulację należy kontynuować przez 90 min. Mangan wykazuje działanie sedatywne, co umożliwia nieskrępowaną stymulację zwierzęcia. Jeśli zwierzę stanie się niespokojne, należy podać 5% izofluranu za pomocą stożka nosowego przez około 15 sekund.</li>
</ol>
6. Obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego
<ol>
	<li>Po stymulacji wznowić znieczulenie za pomocą maski nosowej. Należy kontynuować utrzymywanie temperatury ciała oraz miareczkować poziom izofluranu, aby utrzymać częstotliwość oddychania w zakresie od 85 do 125 oddechów na minutę.</li>
	<li>Umieścić mysz w cewce do obrazowania MR i przenieść do systemu MRI. Wykonać wysokorozdzielcze trójwymiarowe obrazy MR ważone T1. Przykładowo, należy zastosować sekwencję 3D spoiled gradient recalled echo (SPGR) z następującymi parametrami: czas repetycji 25 ms; czas echa 2 ms; kąt odchylenia 30 stopni; szerokość pasma 15,63 kHz; pole widzenia 20 × 20 × 12 mm; macierz 128 × 128 × 60.</li>
</ol>
7. Analiza obrazu
<ol>
	<li>Analiza obrazu jest specyficzna dla zastosowanego paradygmatu stymulacji. W przypadku eksperymentu ze stymulacją wibrys (Rysunek 2), zaimportuj obrazy z kilku zwierząt do odpowiedniego środowiska analitycznego. Jeśli niektóre zwierzęta były stymulowane po stronie prawej, a inne po lewej, odzwierciedl niektóre z nich, aby wszystkie obrazy były efektywnie „stymulowane po lewej stronie”. Następnie, aby porównać stymulowaną stronę każdego mózgu z jego przeciwległą stroną niestymulowaną, utwórz zduplikowany i lustrzany zestaw obrazów lewej strony niestymulowanej. Zarejestruj wszystkie obrazy w wspólnej przestrzeni, a następnie wygładź je za pomocą gaussowskiego jądra o rozmiarze 3 × 3 × 3 piksele.</li>
	<li>Eksportuj dane do środowiska analizy matematycznej, takiego jak MATLAB. Opcjonalnie zamaskuj nieistotne elementy anatomiczne w zbiorach danych. Znormalizuj intensywność obrazów metodą iteracyjną Venot et al. 17,18.</li>
	<li>Użyj parowego jednostronnego testu t, aby porównać każdy woxel stymulowanych stron każdego mózgu z odpowiadającym mu przeciwległym voxelem na stronach niestymulowanych każdego mózgu.</li>
	<li>Wyświetl wynikową mapę wartości p, aby zidentyfikować obszary różnicowej aktywności (Rysunek 3).</li>
</ol>
8. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiona tutaj metoda składa się z dwóch podstawowych etapów: (1) otwierania BBB za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS) oraz (2) rezonansu magnetycznego z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI). Ponieważ drugi etap zależy od pierwszego, istotne jest zweryfikowanie prawidłowej implementacji BOMUS.
Przerwanie bariery krew-mózg po podaniu kontrastu skracającego czas T1 (takiego jak mangan lub środek oparty na gadolinie) skutkuje wzrostem sygnału w miąższu mózgu w obrazowaniu T1-zależnym w porównaniu do mózgów, w których nie przeprowadzono procedury BOMUS (Rycina 4). Rozkład tego wzmocnienia manganowego nie jest całkowicie jednorodny, choć jest dość spójny pomiędzy zwierzętami. Rozkład ten odzwierciedla nie tylko niejednorodność otwarcia BBB, ale wynika również z naturalnego, nierównomiernego rozkładu Mn w obrębie mózgu 19. Dynamika przestrzenna i czasowa otwarcia BBB została opisana szczegółowo w poprzednich publikacjach 12.
Po pomyślnym przeprowadzeniu procedury BOMUS następnym krokiem jest wykonanie obrazowania AIM MRI. Możliwe jest zastosowanie wielu paradygmatów eksperymentalnych; jednak ze względu na liczne potencjalne czynniki zakłócające, grupy kontrolne i analiza muszą zostać starannie zaprojektowane. Efekty zakłócające obejmują niejednorodne otwieranie BBB, niejednorodne gromadzenie się Mn w mózgu, dynamikę czasową dyfuzji Mn oraz nieswoistą aktywność neuronalną. W niniejszej demonstracji zmapowano odpowiedź neuronalną na jednostronną stymulację wibrysów. Aby uwzględnić niejednorodności i przepływ Mn, niestymulowana strona każdego mózgu została wykorzystana jako kontrola wewnętrzna. W celu uwzględnienia nieswoistej aktywności neuronalnej, która może się różnić między zwierzętami, w analizie zastosowano testy statystyczne, aby zidentyfikować obszary, które były spójnie odmienne u badanych zwierząt (Rysunek 2). Wynikiem była trójwymiarowa mapa różnic oraz trójwymiarowa mapa wartości p (Rysunek 3), z której prawa strona wskazywała obszary o wyższym sygnale po stronie przeciwległej do stymulowanych wibrysów. Lewa strona mapy wskazywała obszary, w których sygnał był znacząco wyższy po stronie tej samej co stymulowane wibrysy. Mapa wartości p zidentyfikowała szeroki obszar podwyższonego sygnału po stronie przeciwległej do stymulowanych wibrysów, który odpowiadał polu beczkowemu pierwotnej kory czuciowej, którego odpowiedź na stymulację wibrysów została szeroko udokumentowana za pomocą elektrofizjologii 20,21 oraz badań z użyciem 2-deoksyglukozy. Bardziej szczegółowa dyskusja tych wyników została opublikowana wcześniej 13.
<img alt="Schemat ram czasowych stymulacji ultradźwiękowej z analizą MRI, manganu i mikropęcherzyków." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Harmonogram protokołu funkcjonalnego obrazowania neurologicznego z wykorzystaniem BOMUS i AIM MRI (Zaadaptowano z Howles et al. 13).
<img alt="Schemat równowagi statycznej; schemat blokowy przetwarzania obrazów z testem t dla analizy stymulacji neuronalnej." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat analizy służący do identyfikacji obszarów o różnej intensywności pomiędzy stroną stymulowaną a niestymulowaną każdego mózgu. Aby porównać stymulowaną stronę każdego mózgu z przeciwległą stroną niestymulowaną, tworzony jest zduplikowany i lustrzany zestaw obrazów lewej strony niestymulowanej. Obrazy te są rejestrowane, filtrowane i normalizowane. Na koniec test t pozwala porównać obrazy lewej strony stymulowanej i lewej strony niestymulowanej. Test t jest „parzysty”, tak aby stymulowana strona każdego mózgu była porównywana wyłącznie ze stroną niestymulowaną tego samego mózgu. Test t jest „jednostronny”, dzięki czemu jedna strona mapy wartości p wskazuje na istotnie wyższy sygnał po stymulowanej stronie mózgu, podczas gdy druga strona mapy wartości p wskazuje na istotnie wyższy sygnał po stronie niestymulowanej (Adaptowano z Howles et al. 13).
<img alt="Analiza obrazowania mózgu pokazująca przekroje czołowe, procentowy wzrost, wartość p, mapowanie statystyczne." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wyniki połączonej analizy 7 zwierząt w dwóch różnych pozycjach osiowych. Pierwsza kolumna przedstawia średnią ze wszystkich wyrównanych obrazów zarejestrowanych w taki sposób, aby efektywnie u wszystkich myszy stymulowane były lewe wibrysy. Obrazy te są nałożone na mapę kolorów wskazującą średni procentowy wzrost sygnału w każdym wokselu względem przeciwległej półkuli, zgodnie z paskiem kolorów. Kolorowe obszary po prawej stronie obrazu pokazują miejsca, w których półkula przeciwległa do stymulacji wykazywała wyższy sygnał. Kolorowe obszary po lewej stronie obrazu pokazują miejsca, w których półkula ipsilateralna do stymulacji wykazywała wyższy sygnał. Druga kolumna przedstawia te same obrazy z nałożoną mapą wartości p wskazującą istotność statystyczną wzrostu sygnału. Trzecia kolumna przedstawia tę samą mapę wartości p nałożoną na odpowiadające jej ryciny z atlasu stereotaksycznego Paxinosa16 z zaznaczonymi polami beczkowymi kory sensorycznej (Adaptowano z Howles et al. 13).
<img alt="Analiza obrazowania MRI mózgu przedstawiająca mapy średniej wartości sygnału i odchylenia standardowego oraz wykres słupkowy stosunku sygnału do szumu." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przestrzenny rozkład Mn2+ w mózgu. Obrazy wykonano 170 min po podaniu 0,5 mmol/kg IP MnCl2 u myszy traktowanych BOMUS (n=5) oraz w grupie kontrolnej (n=4). Po normalizacji obliczono mapy średniej wartości i odchylenia standardowego (lewy panel). Wzmocnienie było większe u myszy traktowanych BOMUS. Choć wzmocnienie to nie było jednolite w całym mózgu, było ono dość spójne, z wyjątkiem obszarów w pobliżu krawędzi mózgu i komór. Wykorzystując obszary zainteresowania (ROI) wyznaczone wokół różnych struktur, obliczono średni SNR (+ 1 SD) dla każdej grupy (prawy panel). Zwierzęta traktowane BOMUS wykazały wyższy SNR, ale także większą wariancję między strukturami i między osobnikami (Adaptacja z Howles et al. 13).
<img alt="Wpływ ciśnienia akustycznego na tkankę; wykres słupkowy i histologia, analiza szczytowego ciśnienia ujemnego." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. Aby zbadać wpływ BOMUS na tkankę, mózgi myszy poddanych działaniu BOMUS utrwalono, pocięto w odstępach 500- μm i zabarwiono hematoksyliną oraz eozyną. Przedstawiono średnią liczbę wycieków erytrocytów widocznych w każdym przekroju mózgu dla ciśnień akustycznych 0,36 MPa (n = 3), 0,52 MPa (n = 4) i 5,0 MPa (n = 1). Słupki błędów wskazują błąd standardowy. Drugi panel przedstawia przykład rozległego wycieku erytrocytów z mózgu poddanego działaniu ciśnienia 5,0 MPa (Adaptacja z Howles et al. 12).
<img alt="Wykres słupkowy porównujący wyniki behawioralne po znieczuleniu w trakcie leczenia Gd-DTPA w czasie." src="/files/ftp_upload/4055/4055fig6.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Do oceny aktywności, pobudzenia i reaktywności przed znieczuleniem oraz 3 i 24 godziny po wybudzeniu z narkozy zastosowano ilościowe testy behawioralne. System punktacji, opisany wcześniej 12, oparto na uznanej ilościowej ocenie behawioralnej myszy opracowanej przez Irwina w 1968 roku22. Przedstawiono średnią punktację behawioralną (± SEM) dla zwierząt z grupy kontrolnej (n = 3) oraz traktowanych BOMUS (0,36 MPa) (n = 8). W stosunku do poziomu bazowego sprzed znieczulenia u wszystkich zwierząt zaobserwowano spadek punktacji behawioralnej 3 godziny po znieczuleniu, jednak w dużej mierze powróciła ona do normy następnego dnia. W każdym punkcie czasowym nie stwierdzono różnic między obiema grupami, co wskazuje, że BOMUS nie wpłynął w sposób mierzalny na zachowanie zwierząt (Adaptacja z Howles et al. 12).

<ol><li>Aoki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+the+anoxic+depolarization+of+focal+ischemia+using+manganese-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of the anoxic depolarization of focal ischemia using manganese-enhanced MRI.</a> Magnet. Reson. Med. 50, 7-12 (2003).</li>
<li>Aoki, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+activity-induced+manganese-dependent+contrast+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22DAIM+MRI%29.+Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic activity-induced manganese-dependent contrast magnetic resonance imaging.</a> DAIM MRI). Magnet. Reson. Med. 48, 927-933 (2002).</li>
<li>Duong, T. Q., Silva, A. C., Lee, S. P., Kim, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+MRI+of+calcium-dependent+synaptic+activity%3A+Cross+correlation+with+CBF+and+BOLD+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Functional MRI of calcium-dependent synaptic activity: Cross correlation with CBF and BOLD measurements.</a> Magnet. Reson. Med. 43, 383-392 (2000).</li>
<li>Lin, Y. J., Koretsky, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+ion+enhances+T-1-weighted+MRI+during+brain+activation%3A+An+approach+to+direct+imaging+of+brain+function%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Manganese ion enhances T-1-weighted MRI during brain activation: An approach to direct imaging of brain function.</a> Magnet. Reson. Med. 38, 378-388 (1997).</li>
<li>Lu, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine-induced+brain+activation+detected+by+dynamic+manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+%28MEMRI%29%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cocaine-induced brain activation detected by dynamic manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI).</a> P. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 2489-2494 (2007).</li>
<li>Drapeau, P., Nachshen, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese+fluxes+and+manganese-dependent+neurotransmitter+release+in+presynaptic+nerve-endings+isolated+from+rat-brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Manganese fluxes and manganese-dependent neurotransmitter release in presynaptic nerve-endings isolated from rat-brain.</a> J. Physiol-London. 348, 493-510 (1984).</li>
<li>Narita, K., Kawasaki, F., Kita, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mn+and+Mg+influxes+through+Ca+channels+of+motor-nerve+Terminals+are+prevented+by+verapamil+in+Frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mn and Mg influxes through Ca channels of motor-nerve Terminals are prevented by verapamil in Frogs.</a> Brain Res. 510, 289-295 (1990).</li>
<li>Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+MR+imaging-guided+focal+opening+of+the+blood-brain+barrier+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits.</a> Radiology. 220, 640-644 (2001).</li>
<li>Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+of+the+blood-brain+barrier+opening+induced+by+ultrasound+in+presence+of+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in presence of microbubbles.</a> Ultrasound Med. Biol. 30, 979-989 (2004).</li>
<li>McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+targeted+blood-brain+barrier+disruption+with+focused+ultrasound%3A+Histological+findings+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: Histological findings in rabbits.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1527-1537 (2005).</li>
<li>McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+blood-brain+barrier+with+focused+ultrasound%3A+association+with+cavitation+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the blood-brain barrier with focused ultrasound: association with cavitation activity.</a> Phys. Med. Biol. 51, 793-807 (2006).</li>
<li>Howles, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast-enhanced+in+vivo+magnetic+resonance+microscopy+of+the+mouse+brain+enabled+by+noninvasive+opening+of+the+blood-brain+barrier+with+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Contrast-enhanced in vivo magnetic resonance microscopy of the mouse brain enabled by noninvasive opening of the blood-brain barrier with ultrasound.</a> Magnet. Reson. Med. 64, 995-1004 (2010).</li>
<li>Howles, G. P., Qi, Y., Johnson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+disruption+of+the+blood-brain+barrier+enables+in+vivo+functional+mapping+of+the+mouse+barrel+field+cortex+with+manganese-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic disruption of the blood-brain barrier enables in vivo functional mapping of the mouse barrel field cortex with manganese-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 50, 1464-1471 (2010).</li>
<li>Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomical+studies+of+sml+face+cortex+with+special+reference+to+occurrence+of+barrels+in+layer-4%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomical studies of sml face cortex with special reference to occurrence of barrels in layer-4.</a> J. Comp. Neurol. 164, 79-94 (1975).</li>
<li>Howles, G. P., Nouls, J. C., Qi, Y., Johnson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+production+of+specialized+animal+handling+devices+using+computer-aided+design+and+solid+freeform+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magnet.+Reson.+Imag%22%5BJournal%5D)">Rapid production of specialized animal handling devices using computer-aided design and solid freeform fabrication.</a> J. Magnet. Reson. Imag. 30, 466-471 (2009).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Cross, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+mapping+of+functional+olfactory+connections+of+the+rat+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Statistical mapping of functional olfactory connections of the rat brain in vivo.</a> Neuroimage. 23, 1326-1335 (2004).</li>
<li>Venot, A., Lebruchec, J. F., Golmard, J. L., Roucayrol, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated-method+for+the+normalization+of+scintigraphic+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucl.+Med%22%5BJournal%5D)">An automated-method for the normalization of scintigraphic images.</a> J. Nucl. Med. 24, 529-531 (1983).</li>
<li>Aoki, I., Naruse, S., Tanaka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+%28MEMRI%29+of+brain+activity+and+applications+to+early+detection+of+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nmr.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI) of brain activity and applications to early detection of brain ischemia.</a> Nmr. Biomed. 17, 569-580 (2004).</li>
<li>Welker, E., Vanderloos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+correlation+between+barrel-field+size+and+the+sensory+innervation+of+the+whiskerpad+-+a+comparative-study+in+6+strains+of+mice+bred+for+different+patterns+of+mystacial+vibrissae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitative correlation between barrel-field size and the sensory innervation of the whiskerpad - a comparative-study in 6 strains of mice bred for different patterns of mystacial vibrissae.</a> J. Neurosci. 6, 3355-3373 (1986).</li>
<li>McCasland, J. S., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+2-deoxyglucose+mapping+of+functional+cortical+columns+in+mouse+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">High-resolution 2-deoxyglucose mapping of functional cortical columns in mouse barrel cortex.</a> J. Comp. Neurol. 278, 555-569 (1988).</li>
<li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+observational+assessment+%3A+A+systematic+quantitative+procedure+for+assessing+behavioral+and+physiologic+state+of+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacologia%22%5BJournal%5D)">Comprehensive observational assessment : A systematic quantitative procedure for assessing behavioral and physiologic state of mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li>
<li>Choi, J. J., Pernot, M., Small, S. A., Konofagou, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive%2C+transcranial+and+localized+opening+of+the+blood-brain+barrier+using+focused+ultrasound+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Noninvasive, transcranial and localized opening of the blood-brain barrier using focused ultrasound in mice.</a> Ultrasound Med. Biol. 33, 95-104 (2007).</li>
<li>McDannold, N., Vykhodtseva, N., Hynynen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ultrasound+pulses+combined+with+definity+for+targeted+blood-brain+barrier+disruption%3A+A+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of ultrasound pulses combined with definity for targeted blood-brain barrier disruption: A feasibility study.</a> Ultrasound Med. Biol. 33, 584-590 (2007).</li>
<li>Silva, A. C., Lee, J. H., Aoki, L., Koretsky, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+magnetic+resonance+imaging+%28MEMRI%29%3A+methodological+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Nmr.+Biomed%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced magnetic resonance imaging (MEMRI): methodological and practical considerations.</a> Nmr. Biomed. 17, 532-543 (2004).</li>
<li>Meiri, U., Rahamimoff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+transmission+-+inhibition+by+manganese+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular transmission - inhibition by manganese ions.</a> Science. 176, 308(1972).</li>
<li>Aschner, M., Guilarte, T. R., Schneider, J. S., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese%3A+Recent+advances+in+understanding+its+transport+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Manganese: Recent advances in understanding its transport and neurotoxicity.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 221, 131-147 (2007).</li>
<li>Watanabe, T., Frahm, J., Michaelis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manganese-enhanced+MRI+of+the+mouse+auditory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Magnet.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Manganese-enhanced MRI of the mouse auditory pathway.</a> Magnet. Reson. Med. 60, 210-212 (2008).</li>
<li>Yu, X., Wadghiri, Y. Z., Sanes, D. H., Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+auditory+brain+mapping+in+mice+with+Mn-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo auditory brain mapping in mice with Mn-enhanced MRI.</a> Nat. Neurosci. 8, 961-968 (2005).</li>
<li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+mapping+of+sound-evoked+activity+in+the+mouse+auditory+midbrain+using+Mn-enhanced+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Statistical mapping of sound-evoked activity in the mouse auditory midbrain using Mn-enhanced MRI.</a> Neuroimage. 39, 223-230 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę nieinwazyjnego otwierania BPP w całym mózgu myszy za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków (BOMUS). Po otwarciu BPP podano Mn2+, a następnie wykorzystano obrazowanie rezonansem magnetycznym z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI) do obrazowania odpowiedzi neuronalnej na krótkotrwałą stymulację u myszy w lekkiej sedacji.
Odpowiednie otwarcie bariery krew-mózg (BBB) osiągnięto przy szczytowym ujemnym ciśnieniu akustycznym wynos...

<table><tbody><tr><td>Hydrofon</td><td>Sonora Medical Systems, Longmont, CA</td><td>SN S4-251</td><td></td></tr><tr><td>Stół translacyjny</td><td>Newport Corporation, Irvine, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przetwornik ultradźwiękowy</td><td>Olympus NDT, Inc., Waltham MA</td><td>A306S-SU</td><td>Należy sprawdzić arkusz testowy producenta dołączony do przetwornika, aby ustalić dokładną częstotliwość środkową konkretnego przetwornika, która może różnić się od częstotliwości nominalnej podanej w katalogu. (np. częstotliwość nominalna naszego przetwornika wynosiła 2.25 MHz, ale rzeczywista częstotliwość środkowa wynosiła 2.15 MHz.)</td></tr><tr><td>Stacja obrazowania Vevo</td><td>VisualSonics, Inc. Toronto, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wzmacniacz mocy 50 dB</td><td>E&amp;amp;I, Rochester, NY</td><td>model 240L</td><td></td></tr><tr><td>Generator sygnałowy</td><td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td><td>model 33220A</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-(H2O)4</td><td>Sigma</td><td></td><td>Masa cząsteczkowa różni się w zależności od partii, należy skontaktować się z producentem w celu uzyskania dokładnego pomiaru</td></tr><tr><td>Lipidowe mikrosfery perflutrenowe</td><td>Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA</td><td>DEFINITY</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło do mikrosfer</td><td>Lantheus Medical Imaging, N. Billerica, MA</td><td>VIALMIX</td><td></td></tr><tr><td>Cewka obrazowania MR</td><td>m2m Imaging Corp., Hillcrest, OH</td><td></td><td>Kwadraturowa cewka wolumetryczna nadawczo-odbiorcza o średnicy 35 mm</td></tr><tr><td>System MRI</td><td>GE Healthcare, Milwaukee, WI</td><td></td><td>Konsola GE EXCITE obsługująca magnes z poziomym otworem 7-T</td></tr><tr><td>Środowisko analizy obrazu</td><td>Visage Imaging, San Diego, CA, MathWorks, Natick MA</td><td>Amira MATLAB</td><td></td></tr></tbody></table>

funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i mri z wzmocnieniem manganem

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Mimo że myszy są dominującym systemem modelowym w badaniach nad genetycznymi i molekularnymi podstawami neuronauki, funkcjonalne obrazowanie neuronów u myszy pozostaje wyzwaniem technicznym. Jedną z metod, która znalazła zastosowanie w mapowaniu aktywności neuronalnej u gryzoni, jest MRI z wzmocnieniem manganem indukowanym aktywacją (AIM MRI) 1-5. W metodzie AIM MRI Mn2+ pełni rolę analogu wapnia i gromadzi się w zdepolaryzowanych neuronach 6,7. Ponieważ Mn2+ skraca czas T1 tkanki, obszary o podwyższonej aktywności neuronalnej wykazują wzmocnienie sygnału w obrazowaniu MRI. Co więcej, Mn2+ powoli usuwa się z aktywowanych obszarów, dzięki czemu stymulację można przeprowadzić poza magnesem przed rozpoczęciem obrazowania, co zapewnia większą elastyczność eksperymentalną. Jednakże fakt, że Mn2+ nie przenika łatwo przez barierę krew-mózg (BBB), sprawia, że konieczność otwarcia BBB ograniczyła zastosowanie AIM MRI, szczególnie w przypadku myszy.
Jednym z narzędzi służących do otwierania BBB są ultradźwięki. Choć mogą być one potencjalnie szkodliwe, w przypadku podania ultradźwięków w połączeniu z wypełnionymi gazem mikropęcherzykami (tj. środkami kontrastowymi do USG), ciśnienie akustyczne wymagane do otwarcia BBB jest znacznie niższe. Taka kombinacja ultradźwięków i mikropęcherzyków może być wykorzystana do niezawodnego otwierania BBB bez powodowania uszkodzeń tkanki 8-11.
W niniejszym opracowaniu przedstawiono metodę wykonywania AIM MRI z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków w celu otwarcia BBB. Po dożylnym wstrzyknięciu mikropęcherzyków perflutrenu, na ogoloną głowę myszy przez 3 minuty przykładana jest nieskupiona wiązka ultradźwięków impulsowych. Dla uproszczenia tę technikę otwierania BBB za pomocą mikropęcherzyków i ultradźwięków (BOMUS) określamy mianem BOMUS 12. Po wykorzystaniu BOMUS do otwarcia BBB w obu półkulach mózgu, do całego mózgu myszy podaje się mangan. Po stymulacji eksperymentalnej lekko zsedowanych myszy, AIM MRI jest wykorzystywane do mapowania odpowiedzi neuronalnej.
Aby zademonstrować to podejście, w niniejszej pracy wykorzystano BOMUS oraz AIM MRI do mapowania jednostronnej stymulacji mechanicznej wibrysów u lekko zsedowanych myszy 13. Ponieważ BOMUS może otwierać BBB w obu półkulach, niestymulowana strona mózgu służy jako kontrola dla nieswoistej stymulacji tła. Wynikowa mapa aktywacji 3D jest zgodna z opublikowanymi przedstawieniami regionów wibrysów w korze pola beczułkowego 14. Ultradźwiękowe otwieranie BBB jest szybkie, nieinwazyjne i odwracalne; w związku z tym podejście to nadaje się do badań wysokoprzepustowych i/lub podłużnych u czuwających myszy.

Opisano technikę szerokiego otwierania bariery krew-mózg u myszy z wykorzystaniem mikropęcherzyków i ultradźwięków. Dzięki zastosowaniu tej metody do mózgu myszy można wprowadzić mangan. Ponieważ mangan jest środkiem kontrastowym do MRI, który kumuluje się w zdepolaryzowanych neuronach, podejście to umożliwia obrazowanie aktywności neuronalnej.

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Choć myszy stanowią dominujący model badawczy w analizie genetycznych i molekularnych podstaw neuronauki, funkcjonalne obrazowanie neuronów u myszy pozostaje...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest obrazowanie aktywności neuronalnej myszy za pomocą MRI wzmocnionego manganem. Jest to realizowane poprzez jednostronną stymulację wibrys oraz mapowanie odpowiedzi neuronalnej w przeciwległym polu beczkowatym kory mózgowej. Pierwszym krokiem jest montaż i kalibracja systemu ultradźwiękowego, składającego się z niefokusującego przetwornika ultradźwiękowego sterowanego przez generator sygnałowy i wzmacniacz, przeznaczonego do przeprowadzenia eksperymentu.Po wewnątrzbrzusznym wstrzyknięciu manganu bariera krew-mózg zostaje otwarta za pomocą ultradźwięków i mikropęcherzyków, co umożliwia przenikanie manganu do miąższu mózgu. Następnie mysz zostaje poddana paradygmatowi stymulacji neuronalnej, co skutkuje większym gromadzeniem się manganu w bardziej aktywnych obszarach mózgu. Na koniec uzyskuje się obrazy MRI, które wykazują regionalne różnice w intensywności obrazu MR ważonego w T1, w zależności od różnych poziomów akumulacji manganu w mózgu.W neuronauce mysz jest dominującym systemem modelowym służącym do badania genetycznych i molekularnych podstaw rozwoju mózgu oraz chorób neurologicznych. Niniejsza technika dostarcza nieinwazyjnego narzędzia do mapowania aktywności neuronalnej w tych modelach mysich. Ultradźwiękowe przerwanie bariery krew-mózg może być wykorzystane nie tylko do dostarczania manganu do miąższu mózgu w celu funkcjonalnego obrazowania neurologicznego, ale także do wprowadzania do miąższu mózgu szerokiej gamy innych związków, w tym środków kontrastowych opartych na gadolinie lub leków chemioterapeutycznych.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności podczas kalibracji systemu ultradźwiękowego oraz obsługi mikrorurek. Procedura ta zostanie zademonstrowana każdemu z techników w naszym laboratorium. System ultradźwiękowy składa się z jednoelementowego przetwornika ultradźwiękowego o średnicy wystarczająco dużej, aby objąć mózg myszy, oraz częstotliwości centralnej w zakresie 2 MHz.Przetwornik jest sterowany przez generator sygnałowy i wzmacniacz mocy o wzmocnieniu 50 decybeli, które generowały sekwencję impulsów ultradźwiękowych. Skalibruj system ultradźwiękowy w zbiorniku z wodą. Umieść hydrofon na dnie zbiornika i ustaw nad nim przetwornik za pomocą trójosiowego stołu translacyjnego.Następnie przyłóż krótki ciąg impulsów sinusoidalnych do przetwornika i dostosuj pozycję stolika, aby znaleźć szczytową odpowiedź, która powinna znajdować się w centrum wiązki ultradźwiękowej i w naturalnej ogniskowej przetwornika. Następnie wykonaj kilka pomiarów ciśnienia akustycznego w zakresie różnych napięć wejściowych i wykorzystaj regresję liniową do oszacowania zależności między napięciem wejściowym a ciśnieniem akustycznym. Wyznacz amplitudę impulsu niezbędną do wygenerowania szczytowego ujemnego ciśnienia akustycznego wynoszącego około 0,36 megapascals.W tym kroku należy znieczulić zwierzę, podając izofluran przez stożek nosowy. Aparatura stożka nosowego powinna precyzyjnie i niezawodnie stabilizować głowę zwierzęcia w tej samej pozycji za każdym razem; nasze urządzenie utrzymuje głowę w pozycji płaskiej czaszki podczas eksperymentu. Należy użyć poduszki pneumatycznej do monitorowania częstotliwości oddechów i miareczkować środek znieczulający tak, aby utrzymać częstotliwość oddechów między 85 a 125 oddechami na minutę. Jednocześnie należy monitorować temperaturę zwierzęcia za pomocą sondy rektalnej i utrzymywać temperaturę ciała, używając lampy grzewczej lub strumienia powietrza.Następnie wprowadź cewnik do żyły ogonowej oraz cewnik doprzestrzeni otrzewnowej zwierzęciu. Kolejnym krokiem jest przycięcie sierści w celu wykazania jednostronnej stymulacji VII oraz zmapowania odpowiedzi neuronalnej w przeciwległej korze pola beczkowatego. Odetnij przeciwległy VII jak najbliżej powierzchni skóry, nie drażniąc przy tym mieszka włosowego ani otaczającej skóry.Następnie przenieś zwierzę do systemu ultradźwiękowego, nałóż żel do USG na skórę głowy i umieść na niej cienką plastikową płytkę zawierającą słup wody. Za pomocą patyczka higienicznego usuń z poziomu słupa wody wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w żelu do USG. Następnie umieść przetwornik ultradźwiękowy w wodzie w jego naturalnej odległości ogniskowej bezpośrednio nad mózgiem myszy i przetrzyj przetwornik palcem, aby usunąć ewentualne pęcherzyki powietrza.Następnie należy wytworzyć mikrosfery lipidowe perrina, potrząsając fiolką w mieszadle przez 45 sekund podczas pracy. Pozostawić w temperaturze pokojowej, ale po ostatnim użyciu w ciągu dnia przechowywać w lodówce do momentu pierwszego użycia następnego dnia. W kolejnych dniach przechowywaną fiolkę ponownie wymieszać w mieszadle.Następnie wstrzyknij dootrzewnowo 0.5 millimole na kilogram chlorku manganu i odczekaj 10 minut, aby umożliwić jego rozprowadzenie. Następnie potrząśnij ręcznie fiolką z mikropęcherzykami przez jedną minutę, aby resuspendować mikrosfery. W dalszej kolejności pobierz 30 µL plus objętość martwą cewnika.Należy uważać, aby nie wstrzyknąć powietrza do fiolki, ponieważ spowoduje to degradację pozostałych mikropęcherzyków. Natychmiast rozpocząć sekwencję impulsów ultradźwiękowych i z minimalną zwłoką wstrzyknąć mikrosfery przez cewnik żyły ogonowej. Kontynuować sonikację przez trzy minuty.Następnie wyłącz system ultradźwiękowy. Po tym, jak poziom manganu w mózgu ustabilizuje się przez około 40 minut, wyłącz izofluran i zdejmij stożek nosowy. W tym momencie rozpocznij paradygmat stymulacji neuronalnej w celu zmapowania kory pola beczkowatego.Przesuwaj pędzel okrężnym ruchem z częstotliwością około 1 do 5 Hz przez przeciwległą macierz wibracyjną przez 90 minut. Po stymulacji wznów anestezję, następnie kontynuuj utrzymywanie temperatury ciała i dostosuj poziom izofluranu do częstotliwości oddechów wynoszącej od 85 do 125 oddechów na minutę. Następnie umieść mysz w cewce MRI i przenieś ją do systemu MRI.Następnie należy pozyskać obrazy T1-zależne o wysokiej rozdzielczości, jak pokazano tutaj. Przerwanie bariery krew-mózg po podaniu środka kontrastowego skracającego czas T1, takiego jak mangan lub środek oparty na gadolinie, skutkuje wzrostem sygnału w miąższu mózgu w obrazowaniu T1-zależnym w porównaniu do mózgów, w których nie przeprowadzono BOMA. W pierwszej kolumnie przedstawiono mapy aktywności neuronalnej wygenerowane poprzez jednostronną stymulację risi u siedmiu zwierząt.Mapy różnic w dwóch różnych lokalizacjach wykazują zwiększony sygnał MRI po stronie przeciwnej do stymulowanej przez brissy. W drugiej kolumnie mapy wartości p wskazują względną istotność tych różnic. W trzeciej kolumnie odpowiadające im schematy atlasu mózgu pokazują, że te aktywne obszary odpowiadają polu beczkowemu pierwotnej kory sensorycznej.Przy wprawie technikę tę można przeprowadzić w około dwie godziny, nie licząc czasu trwania symulacji. Podczas wykonywania procedury ważne jest, aby pamiętać o wymieszaniu fiołki z mikropęcherzykami przed wstrzyknięciem oraz o zachowaniu ostrożności, aby nie wstrzyknąć powietrza do fiołki. Ponadto należy upewnić się, że w żelu do badań ultrasonograficznych lub pod przetwornikiem ultrasonograficznym nie uwięzione są pęcherzyki powietrza.W tej demonstracji zdecydowaliśmy się na stymulację wibrysów, jednak technika ta może zostać oczywiście dostosowana do badania dowolnego interesującego nas bodźca. Po przeprowadzeniu procedury zwierzę może całkowicie dojść do siebie, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych.

functional-neuroimaging-using-ultrasonic-blood-brain-barrier

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Funkcjonalne obrazowanie neurologiczne z wykorzystaniem ultradźwiękowego otwarcia bariery krew-mózg i wzmocnienia MRI manganem

Metody obrazowania biologicznego stosowane do oceny biodystrybucji komórkowej nanocząsteczek znajdują zastosowanie w monitorowaniu terapeutycznym i diagnostycznym związków sformułowanych w nanostruktury. Metody opisane w niniejszym opracowaniu są czułe i swoiste w ocenie za pomocą korejestracji histologicznej. Przedstawione metodologie zapewniają ścieżkę translacyjną od zastosowań na modelach gryzoni do zastosowań u ludzi.

Rejestrowane obrazowanie biomedyczne nanomateriałów w monitorowaniu diagnostyki i terapii

Wywoływanie przerwania bariery krew-mózg (BBB) za pomocą skupionego ultradźwięku z wykorzystaniem mikropęcherzyków jest obiecującą techniką nieinwazyjnego, celowanego dostarczania leków do mózgu1-3. Niniejszy protokół opisuje procedurę eksperymentalną dla transkranialnego przerwania BBB pod kontrolą MRI w modelu szczura.

Przełamywanie bariery krew-mózg pod kontrolą MRI z użyciem przezczaszkowego ultradźwiękowego ogniskowania w modelu szczura

Ten protokół opisuje standardową metodę jednoczesnego funkcjonalnego obrazowania metodą rezonansu magnetycznego i głębokiej stymulacji mózgu u gryzonia. Połączone wykorzystanie tych narzędzi eksperymentalnych pozwala na badanie globalnej aktywności w odpowiedzi na stymulację elektryczną w praktycznie każdym miejscu w mózgu.

Głęboka stymulacja mózgu z jednoczesnym fMRI u gryzoni

Ten film ilustruje metodę, przy użyciu klinicznego skanera 3 T, do obrazowania MR z kontrastem projekcji wzrokowej naiwnej myszy oraz do powtarzalnych i podłużnych badań in vivo zwyrodnienia nerwu wzrokowego związanego z ostrym uszkodzeniem nerwu wzrokowego i przewlekłym zwyrodnieniem nerwu wzrokowego u myszy z nokautem (p50KO).

In vivo (in vivo) Obrazowanie integralności włókien nerwu wzrokowego za pomocą rezonansu magnetycznego ze wzmocnieniem kontrastowym u myszy

Obecna praca opisuje nowy protokół do wykonywania nieinwazyjnych ultradźwięków o wysokiej częstotliwości i obrazowania fotoakustycznego na mózgu szczura, aby efektywnie wizualizować głębokie obszary podkorowe i ich wzorce naczyniowe poprzez kierowanie sygnałów na otwór czaszki naturalnie występujący na zwierzęcej czaszce.

Nieinwazyjne miąższowe, naczyniowe i metaboliczne ultrasonografie wysokiej częstotliwości i fotoakustyczne obrazowanie głębokiego mózgu szczura

Skoncentrowane ultradźwięki z mikropęcherzykami mogą otworzyć barierę krew-mózg punktowo i przejściowo. Technika ta została wykorzystana do dostarczania szerokiej gamy środków przez barierę krew-mózg. Ten artykuł zawiera szczegółowy protokół miejscowego dostarczania do mózgu gryzonia z lub bez wskazówek MRI.

Podejście laboratoryjne do specyficznego dla lokalizacji otworu bariery krew-mózg przy użyciu zogniskowanych ultradźwięków w modelu szczurzym

Bariera krew-mózg (BBB) może być tymczasowo przerwana za pomocą skoncentrowanych ultradźwięków za pośrednictwem mikropęcherzyków (FUS). W tym miejscu opisujemy krok po kroku protokół wysokoprzepustowego otwierania BBB in vivo przy użyciu modułowego systemu FUS dostępnego dla ekspertów niebędących ekspertami w dziedzinie ultrasonografii.

Wysokoprzepustowy, sterowany obrazem stereotaktyczny neuronawigacja i skoncentrowany system ultrasonograficzny do otwierania bariery krew-mózg u gryzoni

Celem protokołu jest dostarczenie metody do wytwarzania nieinwazyjnych uszkodzeń neuronów w mózgu. Metoda wykorzystuje skoncentrowane ultradźwięki pod kontrolą rezonansu magnetycznego (MRgFUS) do otwarcia bariery krew-mózg w sposób przejściowy i ogniskowy, w celu dostarczenia krążącej neurotoksyny do miąższu mózgu.

Ukierunkowane uszkodzenie neuronów w celu nieinwazyjnego odłączenia obwodów mózgowych

Ten protokół opisuje kwantyfikację wolumetrycznych zmian hemodynamicznych mózgu w mózgu myszy za pomocą funkcjonalnych ultradźwięków (fUS). Procedury dla mapy aktywacji funkcjonalnej 3D po stymulacji sensorycznej, a także łączności funkcjonalnej w stanie spoczynku są przedstawione jako przykłady ilustracyjne u myszy znieczulonych i obudzonych.

Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

To badanie opisuje połączone obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i protokół ultradźwięków o niskiej intensywności (FUS), wykorzystujący żywe szczury z cewnikowaniem żyły szyjnej do monitorowania otwarcia bariery krew-mózg (BBB).

Monitorowanie otwarcia bariery krew-mózg u szczurów za pomocą przedklinicznego systemu ultrasonograficznego

Ultrasonograficzna mikroskopia lokalizacyjna (ULM) to niedawno opracowana technika, która pozwala na niespotykany dotąd poziom rozdzielczości obrazowania mikronaczyń in vivo. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy, jak uzyskać superrozdzielcze obrazy mikronaczyniowej mikronaczyniowej mózgu u gryzoni, wykorzystując standaryzowaną funkcjonalną platformę ultradźwiękową zaprojektowaną do badań przedklinicznych.

Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Poznaj metodę obrazowania aktywności neuronowej myszy za pomocą ultradźwiękowego otwierania bariery krew-mózg i rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem. Technika umożliwia nieinwazyjne mapowanie funkcji mózgu.

Neuroobrazowanie funkcjonalne z wykorzystaniem ultradźwiękowego przerwania bariery krew-mózg i rezonansu magnetycznego wzmocnionego manganem (Wideo) | JoVE Journal

Funkcjonalne obrazowanie neuronaukowe z wykorzystaniem ultrasonicznego otwierania bariery krew-mózg i MRI z wzmocnieniem manganem

Przeglądaj więcej filmów