Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych
23 maja 2012
W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku polipeptydu trzustkowego.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemii. Jest to realizowane poprzez przygotowanie serii przekrojów z próbki trzustki zatopionej w bloku parafiny. Następnie przekroje są nanoszone na szkiełka w ich oryginalnej orientacji.
Część preparatów barwi się hematyną i eozyną, natomiast pozostałe barwi się metodą immunohistochemiczną; ostatnim krokiem jest zeskanowanie zabarwionych preparatów i uporządkowanie ich według przypadków. Ostatecznie obrazy te mogą zostać przesłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, gdzie mogą być przeglądane przez innych badaczy z tej dziedziny. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że preparaty są barwione seryjnie przy zachowaniu ich pierwotnej orientacji.
Procedurę zaprezentują Linda Snyder, technolog histopatolog, Emily Montgomery, naukowiec biologiczny oraz Tiffany Hippo, technik laboratoryjny w moim laboratorium. Na początek należy przygotować kąpiel wodną oraz mikrotom, postępując zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii parafiny. Następnie należy opisać dodatnio naładowane szkiełka, podając numer przypadku, region trzustki oraz numer szkiełka.
Po przygotowaniu wszystkich elementów umieść blok parafinowy w uchwycie mikrotomu, tak aby etykieta kasety znajdowała się po lewej stronie. Zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii, wykonuj skrawki z bloku, aż tkanka zostanie równomiernie odsłonięta. Po uzyskaniu równomiernego przekroju tkanki, przygotuj taśmę seryjnych skrawków o grubości około czterech mikronów.
W zależności od liczby wymaganych pierwotnych barwień niezbędne są od trzech do sześciu przekrojów. Następnie oddziel przekroje z taśmy. Pobierz poszczególne przekroje po kolei i umieść je na szkiełku.
Zapisz numer przekroju ołówkiem. Jeśli przekrój jest nieużyteczny, pomiń ten numer i kontynuuj numerowanie przekrojów w dokładnej kolejności. Należy zadbać o zachowanie na szkiełku tej samej orientacji, w jakiej znajdował się materiał w kasecie, z etykietą szkiełka skierowaną w lewo.
Następnie należy umieścić preparaty na statywie do szkiełek i pozostawić je do wyschnięcia na noc. W temperaturze pokojowej powierzchnię bloku parafinowego należy ponownie zaskleić cienką warstwą parafiny, aby zakonserwować tkankę, a następnie zarchiwizować go w temperaturze pokojowej lub w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Powtórzyć tę procedurę dla kolejnej próbki.
Ważne jest zachowanie numeracji dla skrawków seryjnych na każdym poziomie, tak jak przedstawiono powyżej dla barwienia H&E. Pierwszy preparat z każdego bloku należy umieścić w kasecie do szkiełek, a następnie włożyć kasetę do pierwszej kuwety automatycznego barwiarki. Należy wybrać standardowy program HE i rozpocząć proces barwienia.
Po zakończeniu barwienia wyjmij preparaty z autostainera i umieść je w komorze z wyciągiem w celu nałożenia szkiełek nakrywkowych. Na każdy preparat nałóż szkiełko nakrywkowe, stosując standardowe techniki. Na koniec opisz preparaty za pomocą wydrukowanych etykiet i pozostaw je do całkowitego wyschnięcia w komorze z wyciągiem.
Zacznij od konfiguracji automatycznego barwiarza i przygotowania wszystkich niezbędnych odczynników. Wybierz program Daco dla barwień podwójnych. Wprowadź liczbę slajdów oraz rodzaj obróbki, jaką otrzyma każdy z nich.
Wprowadź wszystkie odczynniki do autobarwiarki zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie przygotuj bufor TBST, bufor cytrynianowy, przeciwciała oraz inne odczynniki wymagane do przeprowadzenia procedury. Odparafinuj preparaty, umieszczając je w ksylenie na pięć minut.
Nie dopuszczać do wyschnięcia preparatów, ponieważ spowoduje to nadmierne barwienie tła i porów podczas deparafinowania. Przed użyciem wlać bufor cytrynianowy do steamera w celu jego wstępnego podgrzania. Następnie poddać deparafiniowane preparaty serii przemywań etanolem.
Opłucz preparaty po raz ostatni w wodzie dejonizowanej. Przenieś preparaty do podgrzanego buforu cytrynianowego i pozostaw do inkubacji w temperaturze wrzenia przez 30 minut. Po tym czasie niezwłocznie przenieś preparaty do kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej, aż całkowicie ostygną.
Po ochłodzeniu przenieść preparaty na szkiełka do aparatury automatycznego barwienia Dayco, dbając o zachowanie właściwej kolejności. Następnie uruchomić wcześniej wgrany program podwójnego barwienia. Po zakończeniu programu podwójnego barwienia wyjąć preparaty z automatycznego barwiarki i pozostawić je do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed odwadnianiem.
Aby kontynuować odwadnianie, przenieś je do 80% etanolu na jedną minutę. Kontynuuj odwadnianie preparatów poprzez namaczanie ich w 95% etanolu, a następnie w 100% etanolu. Na koniec zanurz preparaty w ksylenie i pozostaw je w nim przez jedną minutę.
Aby zakończyć procedurę, natychmiast zamknij preparaty szkiełkami nakrywkowymi, używając preparatu Cyto Seal. Wydrukuj etykiety zawierające informacje o przypadku, w tym organ, numer bloku, rodzaj barwienia oraz datę. Przyklej etykietę do każdego preparatu przed zeskanowaniem barwionych szkiełek.
Umieść je na tacy skanera i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami. Przechowuj zbarwione preparaty w temperaturze pokojowej, a pozostałe niebarwione preparaty w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Na koniec uporządkuj obrazy zbarwionych preparatów według dawcy i rodzaju zaobserwowanej tkanki.
Poniżej przedstawiono przykład barwienia na KI 67 oraz insulinę przy małym i dużym powiększeniu. Obrazy zabarwionych przekrojów trzustki są przesyłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, tworząc wirtualną biobank. Korzystając z tej bazy danych, badacze mogą szybko uzyskać informacje niezbędne do prowadzenia badań nad cukrzycą typu 1.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i barwić wysokiej jakości preparaty z ludzkiej trzustki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W tym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochemii (IHC). Technika ta pozwala na ocenę składu endokrynnego wysepek, replikacji komórek oraz nacieków zapalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Endokrynologia
- Histologia
Wstęp
- Ludzkie wysepki trzustkowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie glukozy.
- Charakterystyka składu wysepek jest niezbędna dla zrozumienia cukrzycy.
- Barwienie H&E oraz IHC to standardowe techniki analizy tkankowej.
- Zachowanie pierwotnej orientacji preparatów jest krytyczne dla dokładnej oceny.
Cel badania
- Charakterystyka ludzkich wysepek trzustkowych.
- Określenie składu endokrynnego wysepek.
- Ocena replikacji komórek i odpowiedzi zapalnych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie seryjnych skrawków z próbek trzustki zatopionych w parafinie.
- Barwienie skrawków metodą H&E oraz IHC.
- Skanowanie zabarwionych preparatów do analizy.
- Organizacja obrazów według przypadków w celu przesłania do bazy danych.
Główne wyniki
- Identyfikacja insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego w wysepkach.
- Ocena replikacji komórek za pomocą barwienia Ki67.
- Ocena nacieków zapalnych poprzez barwienie H&E oraz CD3.
- Skuteczna lokalizacja obszaru haczykowatego za pomocą IHC.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia kompleksową charakterystykę wysepek trzustkowych.
- Zachowanie pierwotnej orientacji preparatu zwiększa dokładność analizy.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia funkcji trzustki w stanie zdrowia i choroby.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ustandaryzowane procedury histopatologiczne dla ludzkich wysepek trzustkowych umożliwiają powtarzalną charakterystykę komórek endokrynnych, wspierając walidację celów w badaniach nad cukrzycą. Poprzez zachowanie orientacji serii cięć oraz generowanie zdigitalizowanych obrazów całych preparatów, metoda ta ułatwia interdyscyplinarne udostępnianie danych i biobanking w celu zmniejszenia ryzyka mechanistycznego terapii skierowanych przeciwko wysepkom. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych, dostarczając mierzalnych, rozdzielczych przestrzennie danych na temat składu wysepek, replikacji oraz nacieków immunologicznych.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez rygorystyczną histopatologię i immunolokalizację endokrynnych komórek wysepek.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez charakteryzację morfologii, wielkości, gęstości wysepek oraz składu komórek endokrynnych z wykorzystaniem barwień H&E i IHC.
- Wartość prognostyczna: Pomaga w selekcji projektów z portfela poprzez ocenę replikacji wysepek i komórek apoptotycznych za pomocą Ki67 oraz innych markerów proliferacji.
Przesiew oraz opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych analiz poprzez standaryzowane przetwarzanie trzustki ludzkiej w celu wyodrębnienia określonych regionów (głowicy, trzonu, ogona) oraz wykonania przekrojów poprzecznych.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji i powtarzalności testów poprzez numerowanie i oznaczanie literowe podsekcji w zależności od ich rozmiaru, co umożliwia pełną analizę przekrojów poprzecznych.
- Wartość platformy: Wykazanie gotowości do badań przesiewowych i skalowalności dzięki zdigitalizowanym obrazom całych preparatów, zorganizowanym w internetowej bazie danych patomorfologicznych, dostępnej dla ponad 200 badaczy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Omówienie znaczenia dla choroby poprzez ocenę stanu zapalnego, włóknienia, obecności amyloidu oraz nacieków limfocytów T w wyzyskach trzustkowych z wykorzystaniem barwień H&E oraz CD3.
- Wartość operacyjna: Opis ciągłości procesu od etapu odkryć po walidację przedkliniczną poprzez ocenę zarówno części endokrynnej, jak i egzokrynnej, w tym patologii cewek oraz neoplazji.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Koncentracja na predykcyjnej redukcji ryzyka poprzez charakterystykę wewnątrzprzewodowej neoplazji trzustki oraz jej związku z układem przewodowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania – od wczesnej walidacji celu po ocenę przedkliniczną – umożliwiając seryjne cięcie, standaryzowane barwienie oraz cyfrowe biobankowanie ludzkiej tkanki trzustki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez histopatologię oraz immunolokalizację wysepek trzustkowych i komórek endokrynnych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość i powtarzalność analizy poprzez zachowanie pierwotnej orientacji preparatów podczas seryjnego cięcia i barwienia seryjnego.
- Analityka: Podkreśla pomiary ilościowe powierzchni wysepek, ich liczby, składu komórek endokrynnych, replikacji oraz nacieków limfocytów T za pomocą barwienia H&E i IHC, co umożliwia porównanie między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez ocenę amyloidu w wysepkach, włóknienia oraz nacieków zapalnych istotnych dla patogenezy cukrzycy typu 1.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Przedstawia metodę jako powtarzalną funkcjonalność dzięki internetowej bazie danych patologicznych, która zapewnia szybkie udostępnianie danych i wybór bloków dla seryjnych skrawków parafiniowych lub mrożonych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna, walidacja celu, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej w składzie endokrynnym wysepek oraz w interakcjach immunologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność seryjnego cięcia, barwienia oraz cyfrowej archiwizacji preparatów.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa oraz zmniejszone ryzyko biologiczne w późnych etapach dzięki wczesnej identyfikacji patologii wysepek i statusu replikacji.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko oraz decyzje dotyczące dalszego rozwoju w oparciu o mierzalną morfologię wysepek, ich gęstość oraz fenotypy komórek endokrynnych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana wiedza specjalistyczna z zakresu histotechnologii, immunohistochemii oraz cyfrowych procesów patomorfologicznych.
- Potrzeby w zakresie instrumentarium i infrastruktury analitycznej, w tym mikrotom, automatyczny barwiarka, skaner slajdów oraz dostęp do internetowej bazy danych patomorfologicznych.
- Wymogi standaryzacji międzyzespołowej w zakresie etykietowania slajdów, numeracji przekrojów oraz zachowania orientacji tkanek pomiędzy zespołami histologicznymi i obrazowymi.
- Kwestie adaptacyjne w odniesieniu do różnych systemów modelowych, w szczególności w przypadku stosowania standaryzowanego przetwarzania regionalnego (głowa, trzon, ogon) w odniesieniu do trzustek nie-ludzkich.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność tkanek pochodzących od dawców narządów oraz konieczność zoptymalizowanej walidacji przeciwciał dla multipleksowego barwienia IHC.
