Protokoły barwienia ludzkich wysp trzustkowych
May 23rd, 2012
Ten film demonstruje procedury charakterystyki ludzkich wysp trzustkowych za pomocą hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz immunohistochemii (IHC). Skrawki trzustki z okolic głowy, ciała i ogona są barwione zarówno przez H&E, jak i IHC w celu określenia składu hormonalnego wysp trzustkowych (insulina, glukagon i polipeptyd trzustki), replikacji komórek (Ki67) i nacieków zapalnych (H&E, CD3). Obszar uncinate jest zlokalizowany za pomocą IHC dla polipeptydu trzustki.
Ogólnym celem tej procedury jest scharakteryzowanie ludzkich oczek trzustki za pomocą barwienia hematyną i eozyną oraz immunohistochemii. Osiąga się to poprzez tworzenie skrawków szeregowych z próbki trzustki osadzonej w bloku parafiny. Sekcje są następnie umieszczane na slajdach w ich pierwotnej orientacji.
Część szkiełek jest barwiona hematyną i eoiną, podczas gdy pozostałe szkiełka są barwione za pomocą immunohistochemii, ostatnim krokiem jest zeskanowanie wybarwionych szkiełek i uporządkowanie ich według przypadku. Ostatecznie obrazy te mogą zostać przesłane do internetowej bazy danych patologii, gdzie mogą być przeglądane przez innych badaczy w tej dziedzinie. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest to, że szkiełka są barwione szeregowo przy zachowaniu swojej pierwotnej orientacji.
Procedurę zademonstrują Linda Snyder, technolog historyczny, Emily Montgomery, biolog i Tiffany Hippo, technik laboratoryjny w moim laboratorium. Aby rozpocząć, należy skonfigurować łaźnię wodną i mikrotom zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii parafinowej. Następnie oznacz dodatnio naładowane szkiełka numerem przypadku, regionem trzustki i numerem szkiełka.
Gdy wszystko jest już przygotowane, umieść blok parafiny w uchwycie mikrotomowym z etykietą kasety po lewej stronie. Po prawidłowych procedurach mikrotomii należy przeciąć blok, aż tkanka zostanie równomiernie odsłonięta. Gdy tkanka zostanie równomiernie napotkana, wytwórz wstęgę z szeregowych odcinków o grubości około czterech mikronów.
Potrzebnych jest od trzech do sześciu sekcji, w zależności od wymaganej liczby początkowych plam. Następnie oddziel sekcje wstążki. Podnieś każdą sekcję w kolejności i umieść ją na zjeżdżalni.
Zapisz numer sekcji ołówkiem. Jeśli sekcja nie nadaje się do użytku, pomiń ten numer i kontynuuj numerowanie sekcji w dokładnej kolejności. Uważaj, aby zachować tę samą orientację na szkiełku, jaka znajduje się w kasecie z etykietą slajdu skierowaną w lewo.
Następnie umieść szkiełka w stojaku na slajdy i pozostaw do wyschnięcia na noc. W temperaturze pokojowej ponownie uszczelnij powierzchnię bloku parafiny cienką warstwą parafiny, aby zachować tkankę i zarchiwizuj ją w temperaturze pokojowej lub minus 20 stopni Celsjusza. Powtórz tę procedurę dla następnej próbki.
Ważne jest, aby zachować numerację sekcji szeregowych na każdym poziomie, jak pokazano powyżej, barwienia dla h i e. Umieść pierwsze szkiełko z każdego bloku w stojaku na prowadnice, a następnie umieść stojak w pierwszej tacy automatycznego barwienia. Wybierz standardowy program HE i rozpocznij proces barwienia.
Po zakończeniu barwienia wyjmij szkiełka z automatycznego barwienia i umieść je w masce w celu wsunięcia pokrywy. Umieść szkiełko nakrywkowe na każdym szkiełku przy użyciu standardowych technik. Na koniec oznacz szkiełka wydrukowaną etykietą i pozwól im dokładnie wyschnąć w kapturze.
Zacznij od ustawienia automatycznego barwienia i przygotowania wszystkich niezbędnych odczynników. Wybierz program Daco do podwójnych plam. Wprowadź liczbę preparatów i leczenie, które każdy z nich otrzyma.
Załaduj wszystkie odczynniki do automatycznego barwienia zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie przygotuj TBST i cytrynian,, przeciwciała i inne odczynniki niezbędne do zabiegu. Zmiksuj szkiełka, umieszczając je w ksylenie na pięć minut.
Nie pozwól, aby szkiełka wyschły, ponieważ spowoduje to nadmierne plamienie tła i porów podczas zdejmowania szkiełek. Wlej bufor cytrynianowy do parowaru, aby podgrzać przed użyciem. Następnie prześlij szkiełka depa do serii myć etanolem.
Opłucz szkiełka po raz ostatni w wodzie dejonizowanej. Dodaj szkiełka do podgrzanego buforu cytrynianu i pozwól im gotować na parze przez 30 minut. Po tym okresie natychmiast przenieś szkiełka do łaźni wodnej o temperaturze pokojowej, aż całkowicie ostygną.
Po schłodzeniu przenieś szkiełka do stojaków Dayco Auto Stainer, zwracając uwagę na zachowanie właściwej kolejności. Na koniec uruchom program podwójnego barwienia, który został załadowany wcześniej po zakończeniu programu podwójnego barwienia. Wyjmij szkiełka z automatycznego barwnika i pozostaw je do wyschnięcia na co najmniej godzinę przed wysuszeniem.
Aby kontynuować odwodnienie, przenieś je do 80% etanolu na jedną minutę. Kontynuuj odwadnianie szkiełk, mocząc je w 95% etanolu, a następnie w 100%. Na koniec zanurz i przytrzymaj szkiełka w ksylenie przez minutę.
Natychmiast zamontuj szkiełka z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą cyto seal Aby zakończyć procedurę. Wydrukuj etykiety zawierające informacje o sprawie, w tym numer narządu i bloku, rodzaj plamy i datę. Umieść etykietę na każdym szkiełku, aby zeskanować szkiełka z plamami.
Umieść je na tacy skanera i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami. Zarchiwizuj szkiełka z plamami w temperaturze pokojowej, a wszelkie pozostałe niezabarwione szkiełka w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do wykorzystania w przyszłości. Na koniec uporządkuj wybarwione obrazy według dawcy i rodzaju obserwowanej tkanki.
Oto przykład barwienia KI 67 plus insuliną zarówno przy małym, jak i wysokim powiększeniu. Obrazy barwionych odcinków trzustki są przesyłane do internetowej bazy danych patologicznych, tworząc wirtualny biobank. Korzystając z tej bazy danych, badacze mogą szybko uzyskać dostęp do informacji potrzebnych do badań nad cukrzycą typu pierwszego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować i zabarwić wysokiej jakości szkiełka z ludzkiej trzustki.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To wideo demonstruje procedury charakteryzacji ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz immunohistochmii (IHC). Technika ta pozwala na ocenę składu endokrynowego wysepek, replikacji komórek oraz nacieków zapalnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Endokrynologia
- Histologia
Tło
- Ludzkie wysepki trzustkowe odgrywają kluczową rolę w metabolizmie glukozy.
- Charakteryzacja składu wysepek jest istotna dla zrozumienia cukrzycy.
- H&E i IHC są standardowymi technikami analizy tkanek.
- Zachowanie oryginalnej orientacji szkieł jest kluczowe dla dokładnej oceny.
Cel badania
- Charakteryzowanie ludzkich wysepek trzustkowych.
- Określenie składu endokrynowego wysepek.
- Ocena replikacji komórek i reakcji zapalnych.
Stosowane metody
- Tworzenie pojedynczych przekrojów z próbek trzustki wparafinowanych.
- Barwienie przekrojów H&E i IHC.
- Skanowanie barwionych szkieł w celu analizy.
- Organizowanie obrazów według przypadków do wgrania do bazy danych.
Główne wyniki
- Identyfikacja insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego w wysepkach.
- Ocena replikacji komórek przy użyciu barwienia Ki67.
- Ocena nacieków zapalnych za pomocą barwienia H&E i CD3.
- Udane zlokalizowanie regionu haczykowatego przy użyciu IHC.
Wnioski
- Metoda zapewnia kompleksową charakteryzację wysepek trzustkowych.
- Zachowanie oryginalnej orientacji szkieł poprawia dokładność analizy.
- Wyniki przyczyniają się do lepszego zrozumienia funkcji trzustki w zdrowiu i chorobie.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized histopathology workflows for human pancreatic islets enable reproducible endocrine cell characterization, supporting target validation in diabetes research. By preserving serial section orientation and generating digitized whole-slide images, the method facilitates cross-functional data sharing and biobanking for mechanistic de-risking of islet-targeted therapies. This approach enhances predictive confidence in preclinical models by providing quantifiable, spatially resolved data on islet composition, replication, and immune infiltrates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through rigorous histopathology and immunolocalization of islet endocrine cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking by characterizing islet morphology, size, density, and endocrine cell composition using H&E and IHC stains.
- Predictive Value: Assists in portfolio triage by evaluating islet replication and apoptotic cells via Ki67 and other proliferation markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows through standardized processing of human pancreas into defined regions (head, body, tail) and transverse sections.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility by numbering and alphabetically denoting subsections based on size for complete cross-sectional analysis.
- Platform Value: Highlights screening readiness and scalability via digitized whole-slide images organized in an online pathology database accessible to over 200 researchers.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by evaluating islets for inflammation, fibrosis, amyloid, and T-cell infiltrates using H&E and CD3 staining.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by assessing both endocrine and exocrine compartments, including ductular pathology and neoplasia.
- Risk-Adjusted Advancement: Focuses on predictive de-risking by characterizing pancreatic intraductal neoplasia and its relationship to the duct system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical assessment by enabling serial sectioning, standardized staining, and digital biobanking of human pancreatic tissue.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through histopathology and immunolocalization of pancreatic islets and endocrine cells.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility by maintaining original slide orientation during serial sectioning and staining in series.
- Analytics: Highlights quantitative measurements of islet area, numbers, endocrine cell composition, replication, and T-cell infiltrates via H&E and IHC to enable cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by evaluating islet amyloid, fibrosis, and inflammatory infiltrates relevant to type 1 diabetes pathogenesis.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability through an online pathology database that provides rapid data sharing and block selection for paraffin or frozen serial sections.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in islet endocrine composition and immune interactions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of serial sectioning, staining, and digital slide archiving.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early identification of islet pathology and replication status.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantifiable islet morphology, density, and endocrine cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in histotechnology, immunohistochemistry, and digital pathology workflows.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including microtome, auto stainer, slide scanner, and online pathology database access.
- Cross-team standardization requirements for slide labeling, section numbering, and orientation maintenance across histology and imaging teams.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for applying standardized regional processing (head, body, tail) to non-human pancreata.
- Practical limitations include tissue variability from organ donors and the need for optimized antibody validation for multiplex IHC staining.
