Name: Protokoły barwienia ludzkich wysp trzustkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Poznaj metody barwienia H&E i immunohistochemii do charakteryzacji ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta umożliwia ocenę składu endokrynnego, replikacji komórek i stanu zapalnego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują rodzinom dawców i Organizacjom Pozyskiwania Organów za udział w tych badaniach, a także Emily Montgomery, Robertowi Pietrasowi, Ann Fu, Mitali Agarwal i Roshanowi Agarwal za ich ekspercką pomoc. Praca ta była finansowana przez Juvenile Diabetes Research Foundation (M.C-T.) w ramach wsparcia Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes.

1. Mikrotomia dla przekrojów niebarwionych
<ol>
 <li>Przygotować kąpiel wodną i mikrotom zgodnie ze standardową procedurą mikrotonii parafiny. Należy użyć szkiełek pozytywnie naładowanych i uprzednio opisać je numerem przypadku, regionem trzustki (próbki) oraz numerem szkiełka. Umieścić blok parafiny w uchwycie mikrotomu tak, aby etykieta kasety znajdowała się po lewej stronie. </li>
 <li>Postępować zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotonii, wykonując skrawki z bloku aż do momentu równomiernego napotkania tkanki. Wyciąć taśmę serii skrawków (grubość 4 μm, od 3 do 6 w zależności od liczby wymaganych początkowych barwień (patrz Formularz zgłoszenia przypadku, Appendix 1)). Rozdzielić skrawki w taśmie, pobierać każdy po kolei i umieszczać na szkiełkach, numerując je ołówkiem w odpowiedniej kolejności. Jeśli dany skrawek nie został użyty, należy go zaznaczyć, numerując skrawki w ścisłej kolejności. Zachować na szkiełku tę samą orientację, która występowała w kasecie, z etykietą szkiełka skierowaną w lewo. Suszyć przez noc w temperaturze pokojowej, a następnie przystąpić do barwienia lub przekazać próbki badaczom.</li>
 <li>Ponownie uszczelnić powierzchnię bloku parafiny cienką warstwą parafiny w celu zabezpieczenia tkanki i przechowywać w temperaturze pokojowej lub -20 °C.</li>
 <li>Przy kolejnych etapach mikrotonii zachować powyższe numerowanie serii skrawków na każdym poziomie. Dla każdego poziomu ok. 100 μM w obrębie każdego bloku przygotować jeden dodatkowy skrawek i barwić go metodą H&amp;E.</li>
</ol>
2. Barwienie H&amp;E
<ol>
 <li>Umieść pierwszy preparat z serii seryjnych przekrojów z każdego bloku w kasetce do szkiełek, a następnie w pierwszej kuwecie autobarwiarki.</li>
 <li>Wybierz standardowy program barwienia H&amp;E i kontynuuj procedurę zgodnie z instrukcją.</li>
 <li>Po zakończeniu barwienia wyjmij preparaty z autobarwiarki i umieść je w dygestorium w celu przykrycia szkiełek.</li>
 <li>Przykryj preparaty stosując standardową technikę. Dokładnie wysusz i opisz za pomocą wydrukowanej etykiety (patrz sekcja 12).</li>
</ol>
3. Przygotowanie do IHC
<ol>
 <li>Wybierz program Dako dla podwójnego barwienia i wprowadź liczbę slajdów. Przygotuj bufory TBST i cytrynianowe, przeciwciała oraz inne odczynniki zgodnie z określonymi objętościami (Tabela 1). Załaduj tackę z odczynnikami oraz slajdy. Rotacja linii czystych i odpadowych jest zaprogramowana zgodnie z zaleceniami producenta.</li>
 <li>W przypadku wykonywania tych analiz ręcznie, przygotuj szacunkowe objętości. Inkubuj slajdy w komorze nawilżanej, aby zapobiec ich wysychaniu na każdym etapie. Postępuj zgodnie z tą samą procedurą dla każdego z odczynników, co w przypadku korzystania z autostainera.</li>
</ol>
4. Deparafinizacja IHC i odsłanianie antygenów
<ol>
 <li>Umieścić preparaty w ksylenie na 5 minut. Powtórzyć raz. Nie dopuszczać do wyschnięcia preparatów na żadnym z kolejnych etapów, chyba że wskazano inaczej, ponieważ spowoduje to nadmierne tło i słabe barwienie.</li>
 <li>Przenieść preparaty do 100% etanolu na 2 minuty. Powtórzyć raz.</li>
 <li>Umieścić preparaty w świeżo przygotowanym 3% H2O2 w metanolu na 10 minut.</li>
 <li>Zanurzyć preparaty w 90% etanolu, a następnie pozostawić w 90% etanolu na 3 minuty.</li>
 <li>Przenieść preparaty do 70% etanolu na 1 minutę.</li>
 <li>Opłukać preparaty w wodzie dejonizowanej.</li>
 <li>Podgrzać wstępnie steamer oraz bufor cytrynanowy w steamerze przez 5 minut.</li>
 <li>Włożyć preparaty do buforu cytrynanowego w steamerze i parować przez 30 minut.</li>
 <li>Natychmiast przenieść preparaty do wody i pozostawić do czasu ostygnięcia preparatów do temperatury pokojowej (~20 minut).</li>
 <li>Przenieść preparaty do kaset automatycznego barwiarki Dako zgodnie z sekwencją barwienia (Rysunek 1) i uruchomić program podwójnego barwienia. Główne etapy programu automatycznej barwiarki zostały wymienione w celu umożliwienia powtórzenia procedury ręcznie.</li>
</ol>
5. Pierwsze przeciwciała pierwszorzędowe (Ki-67, CD3, polipeptyd trzustkowy)
<ol>
 <li>Zablokować preparaty na szkiełkach za pomocą roztworu Sniper przez 15 minut. Przemyć dwukrotnie buforem TBST.</li>
 <li>Inkubować preparaty z przeciwciałem pierwszorzędowym przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie buforem TBST.</li>
 <li>Inkubować z polimerem peroksydazy chrzanowej (HRP) Mach2 przeciwko mysi (Ki-67) lub przeciwko królikom (CD3, polipeptyd trzustkowy) przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie buforem TBST.</li>
 <li>Nanieść 3,3-diaminobenzydynę tetrahydrochlorek (DAB) na preparaty na 4 minuty. Przemyć dwukrotnie wodą.</li>
 <li>Preparaty inkubowane z polipeptydem trzustkowym należy pozostawić w urządzeniu Dako podczas jednoczesnego przeprowadzania analizy, stosując TBST we wszystkich kolejnych krokach, podczas gdy pozostałe preparaty są inkubowane z drugim zestawem przeciwciał pierwszorzędowych. W przypadku analiz manualnych przejść do sekcji 6.</li>
</ol>
6. Drugie przeciwciała pierwszorzędowe (insulina, glukagon)
<ol>
 <li>Inkubować preparaty w DEEB przez 20 minut. Przemyć dwukrotnie TBST.</li>
 <li>Blokować 10% normalnym surowicą kozią w 20% blokerze awidyny w TBST (insulina) lub Sniperze w TBST przez 20 minut. Przemyć dwukrotnie TBST.</li>
 <li>Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym przeciw insulinie lub glukagonowi przez 15 minut. Przemyć dwukrotnie TBST.</li>
 <li>Insulina: Inkubować preparaty w biotynilowanym przeciwciału kozim anty-świnkowatym w rozcieńczeniu 1:300 przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie TBST. Inkubować ze standardowym odczynnikiem wektora ABC-AP przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie TBST.</li>
 <li>Glukagon: Inkubować preparaty w buforze przez 30 minut, a następnie w polimerze kozim anty-mysim z fosfatazą alkaliczną (AP) przez 30 minut. Przemyć dwukrotnie TBST.</li>
 <li>Podczas inkubacji preparatów w koniugatach ogrzać bufor LPR do temperatury pokojowej. Bezpośrednio przed użyciem dodać 1 kroplę płynnego czerwonego barwnika permanentnego (LPR) na 3 mL buforu i umieścić w statywie na odczynniki Dako. Inkubować preparaty w LPC przez 4 minuty. Przemyć dwukrotnie wodą.</li>
 <li>Inkubować preparaty w hematoksylinie przez 1 minutę. Przepłukać dwukrotnie wodą.</li>
 <li>Inkubować preparaty w TBS pH 7.6 przez 1 minutę. Przepłukać dwukrotnie wodą.</li>
 <li>Wyjąć preparaty z autostainera DAKO.</li>
 <li>Natychmiast odwodnić preparaty barwione na polipeptyd trzustkowy. Wszystkie preparaty barwione podwójnie suszyć przez co najmniej 1 godzinę, a następnie odwodnić.</li>
</ol>
7. Odwodnienie
<ol>
 <li>Umieść preparaty w 80% etanolu na 1 minutę.</li>
 <li>Zanurz preparaty w 95% etanolu.</li>
 <li>Wytrzymaj preparaty w 95% etanolu przez 30 sekund.</li>
 <li>Przenieś preparaty do 100% etanolu i wytrzymaj 1 minutę. Powtórz czynność.</li>
 <li>Zanurz preparaty w ksylenie.</li>
 <li>Wytrzymaj preparaty w ksylenie przez 1 minutę. Powtórz czynność.</li>
 <li>Bezzwłocznie nałóż szkiełka nakrywki na preparaty, używając cytosealu.</li>
</ol>
8. Opisywanie szkiełek
<ol>
 <li>Wprowadź dane identyfikacyjne przypadku, w tym narząd i numer bloku, barwienie oraz datę, a następnie wydrukuj. Numer seryjnego skrawka jest opcjonalny dla pierwszych preparatów barwionych z każdego bloku. Kolejne poziomy są oznaczone numeracją.</li>
 <li>Naklej etykiety na preparaty.</li>
</ol>
9. Skanowanie preparatów
<ol>
 <li>Umieścić zbarwione preparaty na taczce skanera i przeprowadzić skanowanie zgodnie z instrukcją obsługi urządzenia.</li>
 <li>Uпоrządkować preparaty według dawcy i rodzaju tkanki (głowa, trzon i ogon trzustki, śledziona).</li>
 <li>Przechowywać zbarwione preparaty w temperaturze pokojowej, a pozostałe niebarwione preparaty w temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
</ol>
10. Reprezentatywne wyniki
Niniejsze procedury barwienia zostały opracowane dla sieci JDRF Network for Pancreatic Organ donors with Diabetes (nPOD) w celu zapewnienia podstawowej charakterystyki bloków parafinowych oraz świeżo zamrożonych. Dla każdego dawcy przeprowadzana jest podstawowa charakterystyka obejmująca barwienie 2 bloków z każdego regionu trzustki (głowy, trzonu i ogona) oraz śledziony (Ryc. 1, patrz również formularz zgłoszenia przypadku, Aneks 1). Barwienie H&amp;E wykonuje się przy użyciu autobarwiarki zaprogramowanej zgodnie ze standardami placówek klinicznych, stosując przez cały czas roztwory klasy klinicznej. W miarę przygotowywania kolejnych skrawków z bloków dawcy, z każdego z nich pobiera się preparat do barwienia H&amp;E w celu oceny morfologii tkanki. Podczas ponownego skrawania bloków, np. na potrzeby dystrybucji do badaczy, pobierane są również preparaty z głębszych poziomów dla reprezentatywnych skrawków H&amp;E, aby udokumentować morfologię tkanki w całym bloku, a także numerowane są sekcje seryjne na każdym poziomie. Pobarwione preparaty są opisywane z uwzględnieniem identyfikacji przypadku, regionu trzustki, numeru bloku, rodzaju barwienia i daty (Ryc. 2), a następnie skanowane do internetowego systemu zarządzania informacjami patologicznymi. Reprezentatywne obrazy z dawcy kontrolnego przedstawiono na Ryc. 3 przy małym i dużym powiększeniu, aby ukazać oczekiwane wyniki po wykonaniu tej procedury. Preparat barwiony na polipeptyd trzustkowy (D,H) był analizowany innego dnia metodą manualną i wykazuje zmniejszoną intensywność barwienia kontrastowego hematoksyliną. Należy unikać różnic w intensywności barwienia przeciwciał pierwszorzędowych lub barwienia kontrastowego pomiędzy analizami, szczególnie w przypadku stosowania analizy obrazu; w przeciwnym razie preparaty będą wymagały indywidualnej korekcji kolorów, aby uzyskać spójne obszary komórkowe lub wyniki zliczeń.
Każde laboratorium powinno spodziewać się konieczności optymalizacji stężeń przeciwciał, ponieważ różnice między partiami oraz inne odczynniki i warunki mogą wpływać na intensywność i specyficzność barwienia. Po nabyciu nowych odczynników procedury barwienia są walidowane z użyciem znanych próbek kontrolnych dodatnich i ujemnych, aby uzyskać taki sam stopień intensywności barwienia, jak w przypadku poprzednich odczynników. Dodatkowe przeciwciała zoptymalizowane w rdzeniu patologii nPOD zostały podane w Tabeli 2 jako źródło referencyjne i były wykorzystywane w wielokrotnych testach immunofluorescencji do mikroskopii konfokalnej.
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig1.jpg" alt="Schemat sekcji trzustki; przygotowanie bloków parafinowych i OCT do analizy histologicznej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Siatka barwień Dako. Ten schemat przedstawia rutynową analizę trzustki dawcy nPOD przeprowadzoną za pomocą autostainera Dako. Dawcy nPOD są kodowani 4-cyfrowym numerem identyfikacyjnym. Przedstawiono dwie tacki z preparatami uporządkowanymi według rodzaju barwienia. Przewidywane są alternatywne konfiguracje preparatów w zależności od liczby slajdów od dawcy. Kontrole dodatnie obejmują włączenie znanego pozytywnego dawcy dla dwóch podwójnych barwień oraz śledziony dawcy dla Ki-67 i CD3. Kontrole ujemne są dwurodne i obejmują dwa preparaty z jednego bloku trzustki dawcy inkubowane z immunoglobulinami (Ig) z gatunku gospodarza przeciwciał pierwszorzędowych oraz dwa preparaty ze śledziony dawcy dla insuliny i glukagonu. 
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig2.jpg" alt="Schemat rozwoju kręgosłupowej rurki nerwowej; etapy segmentacji osi przednio-tylnej A, B, D." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywny preparat podwójnie barwiony. Przedstawiono typowy gotowy preparat z parametrami etykietowania oraz rozmieszczeniem tkanki przed wykonaniem skanowania cyfrowego.
<img src="/files/ftp_upload/4068/4068fig3.jpg" alt="Schemat analizy histologicznej tkanki trzustki z barwieniem H&amp;E oraz markerami Ki67+Insulina i CD3+Glukagon." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne barwienia H&amp;E oraz IHC w przekrojach trzustki. Przekroje trzustki od dorosłej kobiety-dawcy organów (6096-04 PanHead) zostały zabarwione, a skany cyfrowe wykonane zgodnie z opisem w protokole. Obrazy całego przekroju (A-D) oraz jednego wysepki (E-H) uzyskano za pomocą programu do przeglądania ImageScope. W przekrojach B-D obserwuje się oczekiwane intensywności barwienia wysepek dla insuliny, glukagonu i polipeptydu trzustkowego; przekrój D wskazuje, że ten blok głowy trzustki zawiera niewielką część obszaru haczykowatego lub brzusznego płata trzustki, ponieważ wszystkie wysepki zawierają głównie komórki dodatnie dla polipeptydu trzustkowego. Należy zauważyć, że przeciwbarwienie hematoksyliną w panelu D jest zbyt słabe, podczas gdy intensywność przeciwbarwienia hematoksyliną w B i C jest optymalna. Panele E-H przedstawiają wysepkę z płata grzbietowego z oczekiwanym rozkładem komórek β i α. Kilka komórek polipeptydu trzustkowego znajduje się w dolnej lewej części wysepki (H). A, E- H&amp;E; B, F- Ki67+Insulina; C, G- CD3+Glukagon; D, H- Polipeptyd trzustkowy. A-D, 0.2x, E-H- 12.8x.

<ol><li>In't Veld, P., Marichal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+anatomy+of+the+human+islet+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).</li>
<li>Matveyenko, A. V., Butler, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+beta-cell+mass+and+diabetes+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes.+Metab%22%5BJournal%5D)">Relationship between beta-cell mass and diabetes onset.</a> Diabetes Obes. Metab. 10, Suppl . 4. 23-31 (2008).</li>
<li>Saisho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+volumes+in+humans+from+birth+to+age+one+hundred+taking+into+account+sex%2C+obesity%2C+and+presence+of+type-2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Anat%22%5BJournal%5D)">Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes.</a> Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).</li>
<li>Hruban, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+intraepithelial+neoplasia%3A+a+new+nomenclature+and+classification+system+for+pancreatic+duct+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Surg.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.</a> Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+localised+chronic+severe+pancreatitis+show+an+increased+number+of+single+beta+cells%2C+without+alterations+in+fractional+insulin+area%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area.</a> Diabetologia. 52, 262-270 (2009).</li>
<li>Meier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-cell+replication+is+the+primary+mechanism+subserving+the+postnatal+expansion+of+beta-cell+mass+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans.</a> Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).</li>
<li>Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The pancreas in human type 1 diabetes.</a> Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).</li>
<li>Veld, I. n't, P, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulitis+in+human+type+1+diabetes%3A+The+quest+for+an+elusive+lesion%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion.</a> Islets. 3, 131-138 (2011).</li>
<li>van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+diabetes%3A+etiology%2C+immunology%2C+and+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies.</a> Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Standaryzacja procedur IHC jest kluczowa dla analizy obrazu, szczególnie przy zastosowaniu algorytmów komputerowych w przypadku dużej liczby preparatów w czasie. Procedura barwienia IHC opisana w niniejszym raporcie pozwoli na seryjną analizę próbek danego dawcy przy użyciu autostainera w ciągu 8-godzinnego dnia pracy i stanowi modyfikację procedury z poprzedniego raportu 5. Zdigitalizowane obrazy całych preparatów (whole slide images) każdego z barwionych slajdów są udostępniane badaczom współpracującym z nPO...

<table><tbody><tr><td>30% nadtlenek wodoru (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td>Blokowanie endogennej peroksydazy</td></tr><tr><td>ABC-fosfataza alkaliczna (AP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>AK-5000</td><td>Koniugat AP</td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik przeciwciał</td><td>Invitrogen</td><td>003218</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe</td></tr><tr><td>Blokery awidyny</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-2001</td><td>Blokowanie endogennej biotyny</td></tr><tr><td>Biotynilowane przeciwciało kozie anty-świnkowe</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-7000</td><td>Przeciwciało drugorzędowe</td></tr><tr><td>Odczyn błękitniejący</td><td>Fisher Scientific</td><td>7301</td><td>Autobarwiarka Leica</td></tr><tr><td>Bufor cytrynianowy, pH 6.0</td><td>BioGenex</td><td>HK086-9K</td><td>Odnowienie antygenu</td></tr><tr><td>Klarowny 1</td><td>Fisher Scientific</td><td>7401</td><td>Autobarwiarka Leica</td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>Fisher Scientific</td><td>8312-4</td><td>Medium montażowe do szkiełek coverglass</td></tr><tr><td>DAB</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>Chromogen HRP</td></tr><tr><td>DEEB</td><td>Dako</td><td>S2003</td><td>Odczyn blokujący endogenną AP</td></tr><tr><td>Eozyna Y alkoholowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>71204</td><td>Autobarwiarka Leica</td></tr><tr><td>Ethanole- 100%, 95%, 90%, 70%</td><td>Fisher Scientific</td><td>Różne</td><td>Deparafinizacja i przykrywanie szkiełek</td></tr><tr><td>Hematoksylina</td><td>Dako</td><td>S3301</td><td>Autobarwiarka Dako</td></tr><tr><td>Hematoksylina 7211</td><td>Fisher Scientific</td><td>7211</td><td>Autobarwiarka Leica</td></tr><tr><td>IgG (wszystkie gatunki gospodarzy dla przeciwciał pierwszorzędowych)</td><td>Różne</td><td>Różne</td><td>Kontrole negatywne dla przeciwciał pierwszorzędowych</td></tr><tr><td>Czerwony stały ciekły (LPR)</td><td>Dako</td><td>K0640</td><td>Chromogen AP</td></tr><tr><td>Mach2 AP</td><td>Biocare Medical</td><td>MALP521L</td><td>Koniugat kozie anty-mysie AP</td></tr><tr><td>Mach2 HRP</td><td>Biocare Medical</td><td>MHRP520L</td><td>Koniugat kozie anty-mysie HRP</td></tr><tr><td>Mach2 HRP</td><td>Biocare Medical</td><td>RHRP520L</td><td>Koniugat kozie anty-mysie HRP</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>Różne</td><td>Rozcieńczalnik H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td>Odczyn blokujący IHC</td></tr><tr><td>Sniper</td><td>Biocare Medical</td><td>BS966M</td><td>Odczyn blokujący IHC</td></tr><tr><td>TBST 20X</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>TA-999-TT</td><td>Bufor IHC</td></tr><tr><td>Triology 20x</td><td>Cell Marque</td><td>920P-06</td><td>Odnowienie antygenu</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Fisher Scientific</td><td>Różne</td><td>Deparafinizacja i przykrywanie szkiełek</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki.</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td colspan="4">Parafina</td></tr><tr><td>Amylaza</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-46657</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Amylina</td><td>Serotec</td><td>MCA11267</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Anhydraza węglanowa 19.9</td><td>Abcam</td><td>ab15146</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Kaspaza-3, rozszczepiona</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9961</td><td>Królik</td></tr><tr><td>CD20</td><td>Dako</td><td>M0755</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD3</td><td>Dako</td><td>A0452</td><td>Królik</td></tr><tr><td>CD34</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3569</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Dako</td><td>M7310</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Dako</td><td>M0754</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD68</td><td>Dako</td><td>M0876</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Dako</td><td>M7103</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Chromogranina A</td><td>Dako</td><td>A0430</td><td>Królik</td></tr><tr><td>CK17</td><td>Dako</td><td>M7046</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CK19</td><td>Dako</td><td>M0772</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CK7</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>C-peptyd</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4593</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Foxp3</td><td>e Bioscience</td><td>14-4776-80</td><td>Szczur</td></tr><tr><td>Grelina</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-10386</td><td>Koza</td></tr><tr><td>Grelina</td><td>Abcam</td><td>ab85104</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Glukagon</td><td>Dako</td><td>A0565</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Glukagon</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Glukagon</td><td>Bachem</td><td>T-5037</td><td>Świnia morska</td></tr><tr><td>Glut-1</td><td>Abcam</td><td>ab40084</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Glut-2</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9117</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>Świnia morska</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>Dako</td><td>M7240</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Mafa</td><td>Novus Biological</td><td>NB400-137A</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Polipeptyd trzustkowy</td><td>Invitrogen</td><td>18-0043</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Pdx-1</td><td>Abcam</td><td>ab47308</td><td>Świnia morska</td></tr><tr><td>Proinsulina</td><td>Novocastra</td><td>NCL-proin-1G4</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Proinsulina</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>GS-9A8</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>Sekretagogina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA 006641</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Aktyna mięśni gładkich</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Somatostatyna</td><td>Dako</td><td>A0566</td><td>Królik</td></tr><tr><td>Synaptofizyna</td><td>Dako</td><td>M0776</td><td>Mysz</td></tr><tr><td colspan="4">Świeżo zamrożone</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Abcam</td><td>ab6332</td><td>Szczur</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Serotec</td><td>AHP1226</td><td>Królik</td></tr><tr><td>CD25</td><td>Novus Biological</td><td>NB 600-564</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>CD94</td><td>Abcam</td><td>ab61874</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>GAD65</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-130569</td><td>Mysz</td></tr><tr><td>HLA-ABC</td><td>Dako</td><td>M0736</td><td>Mysz</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 2.&lt;/strong&gt; Przeciwciała pierwszorzędowe.</td></tr><tr><td colspan="4">[nagłówek]</td></tr><tr><td>Aperio Scanscope CS</td><td>Aperio Technologies</td><td></td><td>Cyfrowy skaner szkiełek</td></tr><tr><td>DAKO Autostainer Plus</td><td>Dako</td><td></td><td>Barwienia IHC</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do drukowania etykiet Label Matrix</td><td>BioCarta</td><td>LM7UP57</td><td>Oprogramowanie do etykietowania szkiełek</td></tr><tr><td>Leica XL Autostainer</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Barwienia H&amp;amp;E</td></tr><tr><td>Szkiełka coverglass Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td>Szkiełko coverglass</td></tr><tr><td>Spectrum Information Manager</td><td>Aperio Technologies</td><td></td><td>Oprogramowanie skanera</td></tr><tr><td>Szkiełka Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td>Szkiełka naładowane dodatnio</td></tr><tr><td>Parowar warzywny</td><td>Black and Decker</td><td>Różne</td><td>Odnowienie antygenu</td></tr><tr><td>Zebra TLP 3742</td><td>CDWG</td><td>TLP3742</td><td>Drukarka etykiet do szkiełek</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3.&lt;/strong&gt; Specyficzne materiały i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Szacunki dotyczące powierzchni i liczby wysepek oraz składu komórek endokrynnych w trzustce dorosłego człowieka wahają się od kilkuset tysięcy do kilku milionów, a masa komórek beta mieści się w przedziale od 500 do 1500 mg 1-3. Z uwagi na tę znaną heterogeniczność, opracowano standardową procedurę preparatyki i barwienia, aby obszary trzustki były wyraźnie zdefiniowane, a wysepki scharakteryzowane przy użyciu rygorystycznych badań histopatologicznych i immunolokalizacyjnych.
Znormalizowane procedury przetwarzania trzustki ludzkiej pobranej od dawców organów zostały opisane w pierwszej części tej serii. Trzustkę przetwarza się na 3 główne regiony (główkę, trzon i ogon), a następnie wykonuje przekroje poprzeczne. Przekroje poprzeczne z główki trzustki są dalej dzielone, zgodnie ze wskazaniami dotyczącymi wielkości, i numerowane alfabetycznie w celu oznaczenia podsekcji. Taka standaryzacja umożliwia pełną analizę przekroju poprzecznego od regionu główki, w tym regionu haczykowatego, który zawiera wysepki złożone głównie z komórek polipeptydu trzustkowego, aż po region ogona.
Niniejszy raport stanowi drugą część tej serii i opisuje procedury stosowane do seryjnego cięcia oraz charakterystyki histopatologicznej parafiniowych przekrojów trzustki, ze szczególnym uwzględnieniem endokrynnych komórek wysepek, replikacji oraz nacieków limfocytów T. Patologia przekrojów trzustki ma na celu scharakteryzowanie komponentów egzokrynnych, przewodowych oraz endokrynnych. W obrębie części egzokryny ocenia się obecność zapalenia trzustki (ostrego lub przewlekłego), zaniku, włóknienia i otłuszczenia, a także stan układu przewodowego, szczególnie w kontekście występowania wewnątrzprzewodowych nowotworów trzustki4. Wysepki oceniane są pod kątem morfologii, wielkości i gęstości, komórek endokrynnych, stanu zapalnego, włóknienia, amyloidy oraz obecności komórek replikujących lub apoptotycznych przy użyciu barwienia H&amp;E i metod IHC. 
Ostatnim elementem opisanym w części 2 jest udostępnienie barwionych preparatów w formie zdigitalizowanych obrazów całych preparatów (whole slide images). Zdigitalizowane slajdy są zorganizowane według przypadków i obszarów trzustki w internetowej bazie danych patomorfologicznych, tworząc wirtualny biobank. Dostęp do tej internetowej kolekcji mają obecnie ponad 200 klinicystów i naukowców zaangażowanych w badania nad cukrzycą typu 1. Internetowa baza danych umożliwia szybką i pełną wymianę danych oraz pozwala badaczom na wybór bloków do seryjnych cięć w parafinie lub mrożonych.

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury charakterystyki ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) oraz immunohistochemii (IHC). Przekroje trzustki z obszarów głowy, trzonu i ogona poddaje się barwieniu H&amp;E oraz IHC w celu określenia składu endokrynnego wysepek (insulina, glukagon i polipeptyd trzustkowy), replikacji komórek (Ki67) oraz nacieków zapalnych (H&amp;E, CD3). Obszar haczykowaty jest lokalizowany za pomocą IHC w kierunku polipeptydu trzustkowego.

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Szacunki dotyczące powierzchni i liczby wysepek oraz składu komórek endokrynnych w trzustce dorosłego człowieka wahają się od kilkuset tysięcy do kilku milionów i...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest charakterystyka ludzkich wysepek trzustkowych z wykorzystaniem barwienia hematoksyliną i eozyną oraz immunohistochemii. Osiąga się to poprzez przygotowanie seryjnych skrawków z próbki trzustki zatopionej w bloku parafinowym. Następnie skrawki są przenoszone na szkiełka w ich pierwotnej orientacji.Część preparatów barwi się hematoksyliną i eozyną, natomiast pozostałe preparaty poddawane są barwieniu immunohistochemicznemu; ostatnim krokiem jest zeskanowanie zabarwionych preparatów i uporządkowanie ich według przypadków. Ostatecznie obrazy te mogą zostać przesłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, gdzie mogą być przeglądane przez innych badaczy w tej dziedzinie. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że preparaty są barwione seryjnie przy zachowaniu ich pierwotnej orientacji.Procedurę zaprezentują Linda Snyder, histotechnik, Emily Montgomery, biolog oraz Tiffany Hippo, technik laboratoryjny z mojego laboratorium. Na początek należy przygotować kąpiel wodną i mikrotom zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii parafiny. Następnie należy opisać szkiełka dodatnio naładowane, podając numer przypadku, region trzustki oraz numer szkiełka.Po przygotowaniu wszystkich elementów należy umieścić bloczek parafiny w uchwycie mikrotomu tak, aby etykieta kasety znajdowała się po lewej stronie. Zgodnie ze standardowymi procedurami mikrotomii, należy wykonywać skrawki z bloczka, aż do momentu równomiernego odsłonięcia tkanki. Po uzyskaniu jednorodnego przekroju tkanki należy wykonać serię skrawków o grubości około 4 µm.W zależności od liczby wymaganych barwień wstępnych niezbędnych jest od trzech do sześciu skrawków. Następnie należy rozdzielić skrawki z taśmy. Należy pobrać każdy skrawek po kolei i umieścić go na szkiełku.Zapisz numer przekroju ołówkiem. Jeśli przekrój jest niezdatny do użycia, pomiń ten numer i kontynuuj numerowanie kolejnych przekrojów w dokładnej kolejności. Należy zadbać o zachowanie na szkiełku tej samej orientacji, w jakiej znajdował się materiał w kasecie, z etykietą szkiełka skierowaną w lewo.Następnie umieść preparaty w statywie do szkiełek i pozostaw je do wyschnięcia na noc. W temperaturze pokojowej ponownie zabezpiecz powierzchnię bloku parafinowego cienką warstwą parafiny, aby zakonserwować tkankę, a następnie zarchiwizuj go w temperaturze pokojowej lub minus 20 stopni Celsjusza. Powtórz tę procedurę dla kolejnej próbki.Ważne jest zachowanie numeracji dla serii skrawków na każdym poziomie, zgodnie z powyższym opisem dla barwienia H&amp;E. Pierwszy preparat z każdego bloku należy umieścić w kasecie do slajdów, a następnie włożyć kasetę do pierwszej kuwety automatycznego barwiarki. Należy wybrać standardowy program HE i rozpocząć proces barwienia.Po zakończeniu barwienia wyjmij preparaty z automatycznego barwiarki i umieść je w dygestorium w celu nałożenia szkiełek zakrywek. Na każdy preparat nałóż szkiełko zakrywką, stosując standardowe techniki. Na koniec opisz preparaty za pomocą wydrukowanych etykiet i pozostaw je w dygestorium do całkowitego wyschnięcia.Należy rozpocząć od skonfigurowania automatycznego barwiarki i przygotowania wszystkich niezbędnych odczynników. Do barwień podwójnych należy wybrać program Daco. Następnie należy wprowadzić liczbę preparatów oraz rodzaj obróbki, jaką otrzyma każdy z nich.Wprowadzić wszystkie odczynniki do automatycznego barwiarki zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie przygotować bufor TBST, bufor cytrynianowy, przeciwciała oraz pozostałe odczynniki wymagane do procedury. Odparafinizować preparaty, umieszczając slajdy w ksylenie na pięć minut.Nie należy dopuścić do wyschnięcia preparatów, ponieważ spowoduje to nadmierne barwienie tła i porów podczas deparafinowania. Przed użyciem należy wlać bufor cytrynianowy do steamera w celu wstępnego podgrzania. Następnie preparaty po deparafinowaniu należy poddać serii płukań w etanolu.Przepłucz preparaty po raz ostatni w wodzie dejonizowanej. Przenieś preparaty do podgrzanego buforu cytrynianowego i pozostaw do inkubacji w temperaturze wrzenia przez 30 minut. Po tym czasie niezwłocznie przenieś preparaty do kąpieli wodnej o temperaturze pokojowej i pozostaw do całkowitego ochłodzenia.Po ochłodzeniu przenieś preparaty do kaset automatycznego barwiarki Dayco, dbając o zachowanie właściwej kolejności. Na koniec uruchom wcześniej wgrany program podwójnego barwienia. Po zakończeniu programu podwójnego barwienia wyjmij preparaty z automatycznej barwiarki i pozostaw je do wyschnięcia na co najmniej jedną godzinę przed odwodnieniem.Aby kontynuować odwadnianie, przenieś je do 80% etanolu na jedną minutę. Kontynuuj odwadnianie preparatów poprzez moczenie ich w 95% etanolu, a następnie w 100% etanolu. Na koniec zanurz preparaty w ksylenie i potrzymaj je w nim przez jedną minutę.Aby zakończyć procedurę, bezzwłocznie zamocuj szkiełka podstawowe za pomocą szkiełek nakrywkowych, używając preparatu cyto seal. Wydrukuj etykiety zawierające informacje o przypadku, w tym narząd i numer bloku, rodzaj barwienia oraz datę. Naklej etykietę na każdym szkiełku, aby umożliwić skanowanie preparatów barwionych.Umieść je na tacy skanera i postępuj zgodnie ze standardowymi procedurami. Zarchiwizuj barwione preparaty w temperaturze pokojowej, a wszelkie pozostałe niebarwione preparaty w temperaturze -20 °C do późniejszego wykorzystania. Na koniec uporządkuj obrazy barwionych preparatów według dawcy i rodzaju zaobserwowanej tkanki.Oto przykład barwienia na KI 67 oraz insulinę przy małym i dużym powiększeniu. Obrazy zabarwionych przekrojów trzustki są przesyłane do internetowej bazy danych patomorfologicznych, tworząc wirtualną biobankę. Korzystając z tej bazy, badacze mogą szybko uzyskać informacje niezbędne do prowadzenia badań nad cukrzycą typu 1.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak przygotować i barwić wysokiej jakości preparaty z ludzkiej trzustki.

staining-protocols-for-human-pancreatic-islets

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Protokoły barwienia wysp trzustkowych u ludzi

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Tutaj prezentujemy metodologię generowania i podawania mikrosfer z poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego) (PLGA) do nienaruszonych mysich wysp trzustkowych w hodowli, a następnie analizy immunofluorescencyjnej proliferacji komórek β. Metoda ta jest odpowiednia do określania skuteczności kandydujących mitogenów β-komórkowych.

Trwałe podawanie mitogenów z komórek β do nienaruszonych wysepek myszy ex vivo przy użyciu biodegradowalnych mikrosfer poli(kwasu mlekowo-ko-glikolowego)

Badania ex vivo wysp trzustkowych są ważne dla badań nad cukrzycą. Istniejące techniki badania hodowanych wysepek w ich natywnej architekturze trójwymiarowej są czasochłonne, nieefektywne i rzadko stosowane. W pracy opisano nową, prostą i wydajną metodę generowania wysokiej jakości skrawków parafinowych całych hodowanych wysepek.

Osadzanie wysp trzustkowych w skrawkach parafinowych

Ten protokół przedstawia metodę analizy ilościowej tworzenia kompleksu białek mitofagii, szczególnie w komórkach beta z pierwotnych próbek ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta pozwala zatem na analizę mitofagii z ograniczonego materiału biologicznego, który ma kluczowe znaczenie w cennych próbkach ludzkich komórek beta trzustki.

Wizualizacja endogennych kompleksów mitofagii in situ w ludzkich komórkach beta trzustki z wykorzystaniem testu ligacji zbliżeniowej

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zawiera przewodnik krok po kroku dotyczący pobierania trzustki świni do izolacji i oczyszczania wysp trzustkowych.

Chirurgiczna perfuzja i izolacja trzustki świni w celu izolacji wysp trzustkowych

To badanie wykorzystuje wielobarwne markery fluorescencji śmierci komórki i apoptozy w połączeniu z mikroskopią konfokalną do oceny apoptozy wywołanej cytokinami i śmierci specyficznej dla komórek β w wyspach trzustkowych. Ujawnia przestrzenne i czasowe zmiany w śmierci komórki i apoptozie w odpowiedzi na bodźce zewnątrzkomórkowe.

Leczenie izolowanych wysp trzustkowych i pomiar apoptozy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Dostępność wysepek trzustkowych od osób z cukrzycą typu 2 do celów badawczych jest niewystarczająca. Przedstawiamy tutaj nasz protokół izolacji wysepek od pacjentów poddawanych częściowej pankreatektomii. Podejście to stanowi unikalną możliwość pozyskania wysepek od osób z cukrzycą typu 2 oraz klinicznie dopasowanych osób niediabetycznych w liczbie odpowiedniej do badań podstawowych i klinicznych.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka od pacjentów po częściowej pankreatektomii

Poznaj metody barwienia H&E i immunohistochemii do charakteryzacji ludzkich wysp trzustkowych. Technika ta umożliwia ocenę składu endokrynnego, replikacji komórek i stanu zapalnego.

Protokoły barwienia dla ludzkich wysepek trzustkowych

Przeglądaj więcej filmów