Name: Transformacja genomowa pikoeukarionta Ostreococcus tauri (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji do transformacji genowej Ostreococcus tauri, morskiego pikoeukarionta o uproszczonej strukturze genomowej. Technika ta umożliwia generowanie stabilnych linii transgenicznych i badanie sieci regulacyjnych bez redundancji genetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SynthSys, Centrum Zintegrowanej Biologii Systemów, finansowane z grantu BBSRC i EPSRC D019621. Rozwój metod transformacji genetycznej został sfinansowany z grantu dla FYB w ramach sieci doskonałości EU FP6 „Marine Genomics”.

1. Przygotowanie materiału glonowego
<ol>
	<li>Komórki Ostreococcus hoduje się w sztucznej wodzie morskiej (ASW). Sole morskie (zazwyczaj około 40 g/L) rozpuszcza się w wodzie dejonizowanej do zasolenia 30 ppt, mierzonego za pomocą salinometru. Pożywkę wzbogacającą11,12, pierwiastki śladowe i witaminy dodaje się zgodnie z opisem w tabelach 1-3. Następnie pożywkę sterylizuje się przez filtr o rozmiarze porów 0,22 μm.</li>
	<li>W celu utrzymania kultury, komórki szczepu Ostreococcus OTTH95 przesiewa się aseptycznie w rozcieńczeniu 1/100 w świeżej ASW co 7 dni i hoduje pod stałym oświetleniem w inkubatorze do roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno wynosić około 20 μmol m-2 s-1, a temperaturę utrzymuje się na poziomie 20 °C. Komórki nie wymagają ciągłego mieszania, ale należy je wstrząsać raz na 2 do 3 dni, aby zapobiec agregacji.</li>
	<li>Do każdej transformacji wymagane jest 50 ml komórek o gęstości 20-30 x 106 ml-1, którą należy osiągnąć w ciągu 5-7 dni po przesiewaniu. Przybliżoną gęstość komórek oraz aksenicznosć można określić za pomocą cytometrii przepływowej lub komory countingowej (hemocytometru) przy minimalnym powiększeniu x40.</li>
</ol>
2. Elektroporacja
<ol>
	<li>Przygotuj DNA do transformacji. Do każdej transformacji wymagane jest 5 μg czystego, zlinearyzowanego plazmidowego DNA o stężeniu 1 μg/μl w sterylnej wodzie dejonizowanej. W celu uzyskania takiego DNA autorzy zalecają użycie zestawu Qiagen midi prep, choć inne metody mogą być równie skuteczne. Przetraw produkt enzymem, który przecina szkielet użytego wektora, ale nie przecina transgenu ani genu selekcyjnego. Następnie oczyść i zagęść otrzymane linearne DNA poprzez precypitację etanolem i zawieś produkt w odpowiedniej objętości wysokiej jakości sterylnej wody dejonizowanej.</li>
	<li>Przygotuj probówki do mikrocentryfugi zawierające 5 μg DNA dla każdej transformacji. Dla każdej transformowanej linii komórkowej niezbędna jest kontrola bez DNA. Przechowuj te probówki w lodzie, wraz z kuwetą do elektroporacji 2 mm dla każdej transformacji.</li>
	<li>Przygotuj 2,2 ml buforu do resuspensji na jedną transformację. Rozpuść sorbitol do uzyskania roztworu 1 M w ddH2O, dodaj 0,1% kwasu pluronic F68 i wysterylizuj przez filtr.</li>
	<li>Dodaj kwas pluronic F68 do komórek do stężenia końcowego 0,1% i odwirowuj je przez 10 minut przy 8000x g w temperaturze 10 °C w probówce 50 ml z dnem stożkowym. Natychmiast resuspenduj komórki w 1 ml buforu do resuspensji poprzez pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieś do probówki do mikrocentryfugi. Wirowuj przez 10 minut przy 8000 x g w temperaturze 10 °C i, pracując szybko, powtórz ten etap płukania jeszcze raz.</li>
	<li>Za pomocą odciętej końcówki pipety resuspenduj każdy końcowy osad w 40 μl buforu do resuspensji. Dodaj 40 μl resuspendowanych komórek do każdej probówki z zlinearyzowanym DNA znajdującej się w lodzie, wymieszaj delikatnie i przenieś do kuwety do elektroporacji.</li>
	<li>Włóż kuwetę do urządzenia do elektroporacji. Zmień ustawienia na 6 kV cm-1, 600 Ω i 25 μF. Przeprowadź elektroporację komórek.</li>
	<li>Inkubuj elektroporowane komórki w kuwetach w temperaturze pokojowej przez 10 minut; wykorzystaj ten czas na przygotowanie kolb do hodowli tkankowych. Opisz je i dodaj do każdej 30 ml świeżej ASW. Odlej 1 ml z każdej kolby i delikatnie dodaj do odpowiadającej jej kuwety. Inkubuj przez 2 minuty, a następnie delikatnie usuń ASW zawierającą grudkę komórek i powoli, ostrożnie pipetuj ją bezpośrednio do ASW w kolbie hodowlanej.</li>
	<li>Komórki zazwyczaj pozostają w formie grudki. Należy zadbać o to, aby w tym momencie nie wstrząsać i nie zakłócać agregatów komórkowych. Pozostaw komórki do regeneracji w inkubatorze na 1-2 godziny, a następnie resuspenduj poprzez potrząsanie kolbami. W tym czasie komórki powinny swobodnie się resuspendować i nie powinny być widoczne żadne grudki. Pozostaw kultury do regeneracji w inkubatorze przez noc.</li>
</ol>
3. Osadzanie komórek na płytkach w medium półstałym
<ol>
	<li>Następnego dnia wysterylizuj w autoklawie roztwór 2,1% nisko topnej agarozy w ddH2O w butelce z prętem do mieszania. Utrzymuj w stanie stopionym w temperaturze 65-90 °C w większym zlewce z wodą na magnetycznej mieszadle grzejnej. Dla każdej transformacji przygotuj 8 szalek Petriego (średnica 55 mm) oraz 8 probówek o pojemności 15 ml, z których każda zawiera 9 ml ASW z wymaganym selekcjonerem. W przypadku użycia Nourseothricyny lub G418 zastosuj stężenie 2 mg/ml.</li>
	<li>Wyjmij przetransformowane komórki z inkubatora. Pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, dodaj 1 ml wrzącej agarozy LMP do 9 ml cieczy w jednej z probówek. Zamknij probówkę i wymieszaj poprzez odwracanie. Następnie dodaj 0,5 ml świeżo przetransformowanych komórek, szybko wymieszaj i wlej na szalkę. Powtórz ten proces z pozostałymi 7 probówkami, a następnie przejdź do kolejnej kolby z transformacją.</li>
	<li>Pozostaw otwarte szalki w komorze z laminarnym przepływem powietrza na godzinę, aby agaroza stężała. Następnie zamknij szalki i przenieś je do dużych kwadratowych szalek Petriego, z których każda pomieści 4 mniejsze szalki. Uszczelnij kwadratowe szalki parafilmem. Należy pamiętać, że szalki nie stężeją całkowicie, w wyniku czego żel jest bardzo kruchy. Podczas przenoszenia szalek należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić żelu. Umieść wszystkie kwadratowe szalki w inkubatorze.</li>
</ol>
4. Selekcja transformowanych kolonii
<ol>
	<li>Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach na płytkach po transformacji, natomiast nie powinny wystąpić na płytkach kontrolnych (mock). Do wyboru kolonii należy użyć pipety 200 μl z odciętymi końcówkami. Należy po prostu wybrać izolowane kolonie i zassać zieloną kolonię. Należy zadbać o to, aby nie pobrać komórek z sąsiednich kolonii.</li>
	<li>Przenieść komórki do 2 ml medium płynnego z selekcją, w płytce 24-dołkowej. W przypadku stosowania Nourseothricin, należy użyć stężenia 1,75 mg/ml. Wymieszać poprzez pipetowanie w górę i w dół. Wybrać od 24 do 50 kolonii z jednej transformacji. Uszczelnić płytki parafilmem i przenieść do inkubatora.</li>
	<li>Po tygodniu przenieść 100 μl z każdego dołka do 2 ml świeżego ASW z selekcją w nowej płytce 24-dołkowej i hodować przez kolejne 7 dni. Przeżyłe linie komórkowe można wykorzystać w dalszych badaniach. Stabilną integrację z genomem oraz liczbę insercji należy przeanalizować za pomocą PCR i Southern Blot. DNA genomowe na potrzeby tych analiz można uzyskać, stosując dowolną zredukowaną standardową metodę ekstrakcji DNA z roślin.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Komórki rozdzielone w stosunku 1 / 100 osiągnęły gęstość 25 milionów komórek na mililitr po 7 dniach hodowli. Elektroporacja komórek z zastosowaniem odpowiednich ustawień pozwoliła uzyskać stałą czasową między 10 a 14 milisekund. Po przeniesieniu komórek do pożywki w kolbach hodowlanych powinien utworzyć się agregat komórek. Po lekkim wstrząśnięciu po godzinie komórki powinny łatwo ulec resuspensji. Wprowadzenie 1 ml transformowanych komórek do 0,2% agaru LMP powinno skutkować uzyskaniem spójnego, lecz jedynie półstałego żelu. Kolonie powinny pojawić się po 10 do 21 dniach. Przy transformacji 5 μg linearyzowanego DNA zgodnie z powyższym protokołem, zazwyczaj oczekiwano od 50 do 100 kolonii na płytkę transformacyjną, w przeciwieństwie do braku kolonii na płytkach kontrolnych ujemnych. Około 80% wybranych kolonii zostało pozytywnie wyselekcjonowanych pod kątem oporności na antybiotyk w pożywce płynnej i wykorzystanych w kolejnych badaniach.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td> </td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Roztwór stokowy</td>
			<td >Objętość na 1 litr</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NaNO3</td>
			<td >8.83 x 10-4 M</td>
			<td >75 g/L dH2O</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >NH4Cl</td>
			<td >3.63 x 10-5 M</td>
			<td >2.68 g/L dH2O</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >β-glycerophosphate</td>
			<td >1 x 10-5 M</td>
			<td >2.16 g/L dH2O</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >H2SeO3</td>
			<td >1 x 10-8 M</td>
			<td >1.29 mg/L dH2O</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tris-base(pH 7.2)</td>
			<td >1 x 10-3 M</td>
			<td >121.1 g/L dH2O</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór śladowych metali K</td>
			<td > </td>
			<td >Tabela 2</td>
			<td >1 mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Roztwór witamin f/2</td>
			<td > </td>
			<td >Tabela 3</td>
			<td >0.5 mL</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Skład pożywki do hodowli O. tauri11, 12. Przygotować całkowitą objętość 1 litra sztucznej wody morskiej o zasoleniu 30 ppt, a następnie dodać powyższe składniki z roztworów zapasowych zgodnie z instrukcją. Pożywkę wysterylizować poprzez filtrację i zużyć w ciągu tygodnia. Roztwory zapasowe wszystkich związków, z wyjątkiem roztworu witamin, można połączyć w taki sposób, aby dodawać 6 ml tego roztworu na każdy litr pożywki.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td> </td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
			<td >Roztwór stokowy</td>
			<td >Ilość na 1 litr</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Na2EDTA • 2H2O</td >
			<td >1 x 10-4 M</td >
			<td> </td>
			<td >41.6 g</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >FeCl3 • 6H2O</td >
			<td >1 x 10-5 M</td >
			<td> </td>
			<td >3.15 g</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Na2MoO4 • 2H2O</td >
			<td >1 x 10-8 M</td >
			<td >6.3 g/L dH2O</td >
			<td >1 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >ZnSO4 • 7H2O</td >
			<td >1 x 10-9 M</td >
			<td >22.0 g/L dH2O</td >
			<td >1 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CoCl2• 6H2O</td >
			<td >1 x 10-9 M</td >
			<td >10.0 g/L dH2O</td >
			<td >1 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MnCl2 • 4H2O</td >
			<td >1 x 10-8 M</td >
			<td >180.0 g/L dH2O</td >
			<td >1 mL</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CuSO4• 5H2O</td >
			<td >1 x 10-8 M</td >
			<td >9.8 g/L dH2O</td >
			<td >1 mL</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2. Roztwór pierwiastków śladowych11,12. Dopełnić do objętości 1 litra w dH2O i podgrzać do rozpuszczenia. Roztwór podzielić na alykwoaty i zamrozić do przechowywania. Podane stężenia końcowe odnoszą się do końcowego medium, a nie do roztworu pierwiastków śladowych.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>Stężenie końcowe</td>
			<td>Roztwór stokowy</td>
			<td>Ilość na 1 litr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Witamina B12</td>
			<td>1 x 10-10 M</td>
			<td>1 g/L dH2O</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotyna</td>
			<td>1 x 10-9 M</td>
			<td>0.1 g/L dH2O</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiamina • HCl</td>
			<td>1 x 10-7 M</td>
			<td> </td>
			<td>200 mg</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Roztwór witamin f/211. Dopełnić do objętości 1 litra w dH2O, wysterylizować przez filtrację, podzielić na alikwoty i zamrozić. Podane stężenia końcowe odnoszą się do gotowego medium, a nie do roztworu witamin.
<img alt="Schemat procesu edycji genów: klonowanie, linearyzacja, elektroporacja, inkubacja w celu wzrostu kolonii." src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Graficzny przegląd procedury transformacji. Schematyczny opis procedury genetycznej transformacji Ostreococcus tauri metodą elektroporacji.
<img alt="Eksperyment wzrostu drobnoustrojów, dni po inokulacji, obraz z lapse'em czasowym, butelki z kulturą ze skalą." src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wzrost kultury. Komórki są podkultur现实owane aseptycznie w rozcieńczeniu 1 /100 w świeżym ASW co 7 dni i hodowane przy stałym oświetleniu w inkubatorze do roślin wyposażonym w filtr Moonlight Blue. Natężenie światła powinno wynosić około 20 μmol m-2s-1, a temperatura jest utrzymywana na poziomie 20 °C. Komórki nie wymagają ciągłego mieszania, lecz są wstrząsane raz na 2 do 3 dni w celu zapobiegania agregacji.
<img alt="Eksperyment na szalce Petri pokazujący wzrost kultury bakterii; obserwacja naukowa w warunkach laboratoryjnych." src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Tworzenie kolonii na 0,2% agarozie LMP. Przenieś 4 płytki do dużej kwadratowej szalki Petri i uszczelnij parafilmem (lewy górny róg). Po uformowaniu się kolonii należy wybrać wolne kolonie (idealnie o kształcie stożkowym) (prawy górny róg) i odessać je z płytki za pomocą pipety p200. Na kontroli negatywnej nie powinny pojawić się żadne kolonie (prawy dolny róg).

<ol><li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li>
<li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+ultrastructure+of+O.+tauri%3A+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749(2007).</li>
<li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li>
<li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li>
<li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li>
<li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+in+the+green+lineage%3A+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li>
<li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li>
<li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light%2Fdark+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).</li>
<li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li>
<li>Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).</li>
<li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li>
<li>Djouani-Tari, elB. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus%3A+Application+to+circadian+clock+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471(2011).</li>
<li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Stan komórek oraz akseniczność hodowli mają kluczowe znaczenie dla procedury transformacji. Chociaż komórki są zazwyczaj utrzymywane w cyklach 12 godzin światła i 12 godzin ciemności, stwierdzono, że wydajność transformacji w komórkach hodowanych w tych warunkach jest niewystarczająca. Podczas powtarzanych etapów wirowania i resuspensji komórki powinny zawsze łatwo ulegać resuspensji. Jeśli komórki agregują lub obecna jest substancja przypominająca śluz, lepiej rozpocząć procedurę od początku. Zazwyczaj na każdej płytce transformacyjnej można spodziewać się ~50 kolonii, w przeciwieństwie do braku kolonii na płytce kontrolnej negatywnej. W przypadku niskiej wydajności transformacji należy zmienić warunki hodowli, aby upewnić się, że komórki znajdują się w optymalnym stanie. Zmienne wpływające na wydajność transformacji obejmują temperaturę otoczenia w laboratorium (powinna wynosić blisko 20 °C) oraz szybkość postępowania (procedura od wirowania komórek [2.3] do regeneracji [2.7] powinna trwać ~1 godzinę). Ważne jest również, aby wszystkie roztwory były przygotowywane na świeżo przed każdą transformacją. W przypadku wlewania na płytki kluczowe jest stężenie agarozy LMP. Komórki Ostreococcus nie będą rosnąć przy wysokich stężeniach agarozy i będą dyfundować przy niskich stężeniach.
Wcześniej opublikowano trzy wektory transformacyjne dla Ostreococcus6, a w najbliższym czasie spodziewane jest opracowanie i publikacja kolejnych. Istniejący wektor Pot-Luc6 umożliwia zastosowanie wybranego promotora w połączeniu z C-końcowym znacznikiem lucyferazy świetlika, co pozwala na szybszą selekcję linii transgenicznych oraz uzyskanie przejrzystych wzorców ekspresji, podczas gdy wektor Potox6 niesie silny promotor indukowalny13 pochodzący z genu transportera fosforanów o wysokim powinowactwie (HAPT) Ostreococcus, służący do nadekspresji genu zainteresowania. Wektor Potox-Luc pochodzi od Potox i zawiera dodatkowy marker lucyferazy, który może być wykorzystany do pośredniej selekcji linii z nadekspresją14. Skutecznymi markerami selekcyjnymi w tych wektorach są nourseotrycina i G148. Jednakże komórki Ostreococcus wykazują wysoką odporność na wiele antybiotyków, a stężenia związków niezbędne do selekcji transgenicznych komórek Ostreococcus są wyższe niż w przypadku konwencjonalnych systemów modelowych (2 mg/ml).
Mimo że proces ten wydaje się mało wydajny, duża liczba komórek i plazmidowego DNA wymagana do tej procedury nie stanowi znaczącej przeszkody. Większym ograniczeniem jest fakt, że każda wygenerowana linia oporna na marker selekcyjny musi zostać przeanalizowana indywidualnie w celu sprawdzenia, czy cały konstrukt został zintegrowany z DNA. Zaobserwowaliśmy przypadki, w których pomyślna ekspresja markera selekcyjnego nie odpowiadała insercji właściwego genu zainteresowania; innymi słowy, mogą wystąpić integracje częściowe. Ewidentnie, losowa insercja do genomu oznacza również brak kontroli nad miejscem insercji przy użyciu tej metody, a obecnie opracowywane są metody oparte na rekombinacji homologicznej. Niemniej jednak, opisana tutaj metoda jest, według naszej najlepszej wiedzy, obecnie jedyną scharakteryzowaną metodą generowania genetycznie zmodyfikowanych komórek Ostreococcus.
Ponieważ Ostreococcus tauri stał się organizmem modelowym w badaniach eksperymentalnych stosunkowo niedawno, większość metod pracy z tymi komórkami prawdopodobnie będzie ewoluować i być udoskonalana przez rozrastającą się społeczność badawczą. Niniejszy protokół ma na celu pomóc w rozpoczęciu pracy z Ostreococcus, jednak w żadnym stopniu nie pretenduje do opisania całej wiedzy na temat transformacji genomicznej tej mikroalgi. Autorzy wierzą, że czytelnicy będą w stanie dostosować ten protokół do własnych potrzeb, ponieważ wystąpią niewielkie różnice w inkubatorach (poziom lub jakość światła) oraz innych parametrach, które prawdopodobnie będą wymagały optymalizacji w każdym konkretnym laboratorium, aby uzyskać zdrowe kultury niezbędne do realizacji tego protokołu. Po opanowaniu opisanych tutaj technik można konstruować wektory w celu generowania linii fuzyjnych luminescencyjnych, fluorescencyjnych lub z innymi znacznikami, pod kontrolą różnych promotorów. Ta ekscytująca, nowa platforma eksperymentalna będzie przydatna do badania sposobu rozwiązywania złożonych problemów biochemicznych w eukarioncie o zredukowanej złożoności, w którym podejścia farmakologiczne są znacznie ułatwione3.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Składniki pożywki&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól morska Instant Ocean Marine Salt</td><td>z &lt;a href=&quot;http://amazon.co.uk&quot; target=&quot;_blank">amazon.co.uk&lt;/a&gt; lub &lt;a href=&quot;http://rocketaquatics.co.uk&quot; target=&quot;_blank">rocketaquatics.co.uk&lt;/a&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>S5506-250G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>A9434-500G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Hydrat soli disodowej 2-fosforanu glicerolu</td><td>G9422-100G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SeO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>84920-250G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysty tris</td><td>15504-020</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>BPE120-500G</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>FeCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>157740</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>31439-100G-R</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Z0251</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>31277</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>MnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8729;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>203734-5G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8729;5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>C8027</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Witamina B&lt;sub&gt;12&lt;/sub&gt; (cyjanokobalamina)</td><td>V2876</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Biotyna </td><td>47868</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina &amp;#8729; HCl </td><td>T4625</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>A9518-25G</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Neomycyna</td><td>N6386</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>K4000</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materiały eksploatacyjne do hodowli&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T25 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1810.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T75 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1813.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T175 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1812.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Filtry nakręcane na butelkę TPP, 1L, kompletne</td><td>99950T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>Filtry nakręcane na butelkę TPP, 500ml,</td><td>99500T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>Filtry nakręcane na butelkę TPP, 250ml,</td><td>99250T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>Filtry nakręcane na butelkę TPP, 150ml,</td><td>99150T</td><td>Helena Bioscience</td><td></td></tr><tr><td>Salinometr do akwariów morskich</td><td>DSG-10</td><td>Daeyoon</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odczynniki do transformacji&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>S6021-1KG</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Pluronic F-68</td><td>P5556-100ML</td><td>Sigma</td><td></td></tr><tr><td>ClonNat</td><td>51000</td><td>Werner</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>16520-050</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materiały eksploatacyjne do transformacji&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T25 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1810.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T75 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1813.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli tkankowych T175 do hodowli w zawiesinie, wentylowana z kanałem wylewowym</td><td>83.1812.502</td><td>Starstedt</td><td></td></tr><tr><td> Probówki wirówkowe Greiner 50ml</td><td>227261</td><td>GBO</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety Gene Pulser/MicroPulser, przerwa 0.2 cm, 50 szt.</td><td>165-2086</td><td>Bio-Rad</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petri okrągła PS 3 otwory wentylacyjne H14.2 &amp;#934;55 </td><td>391-0895</td><td>VWR International</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petri kwadratowa z czterema otworami wentylacyjnymi, polistyrenowa, sterylna przez naświetlanie, przezroczysta, 120mm</td><td>FB51788</td><td>Fisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Filtr światła niebieskiego Moonlight Blue light filter</td><td>183</td><td>Lee Lighting</td><td></td></tr></tbody></table>

transformacja genomiczna piko-eukarionta ostreococcus tauri

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Typowe problemy utrudniające szybki postęp w naukach o roślinach obejmują złożoność komórkową, tkankową i całego organizmu, a w szczególności wysoki poziom redundancji genomicznej wpływający na prostą genetykę roślin wyższych. Nowy organizm modelowy Ostreococcus tauri jest najmniejszym znanym do dziś wolnożyjącym eukariotą i charakteryzuje się znacznie zredukowaną wielkością genomu oraz złożonością komórkową1,2, co przejawia się obecnością tylko jednego egzemplarza większości organelli (mitochondrium, chloroplastu, stosu aparatu Golgiego) na komórkę oraz genomem zawierającym jedynie ok. 8000 genów. Ponadto połączenie jednokomórkowości i łatwości hodowli zapewnia platformę podatną na podejścia biologii chemicznej. Ostatnio Ostreococcus został z sukcesem wykorzystany do badania podstawowych mechanizmów leżących u podstaw regulacji rytmów okołodobowych3-6. Wyniki uzyskane z tego organizmu modelowego wpłynęły nie tylko na naukę o roślinach, ale także na biologię ssaków7. Przykład ten pokazuje, w jaki sposób szybkie eksperymentowanie na prostym eukariocie z linii zielonej może przyspieszyć badania nad bardziej złożonymi organizmami poprzez generowanie testowalnych hipotez z wykorzystaniem metod technicznie możliwych do zrealizowania jedynie w tym środowisku o zredukowanej złożoności. Znajomość genomu i możliwość modyfikacji genów są niezbędnymi narzędziami w przypadku każdego gatunku modelowego. Informacje genomiczne1, transkryptomiczne8 i proteomiczne9 dla tego gatunku są ogólnodostępne, podczas gdy wcześniej opisane metody6,10 transformacji genetycznej Ostreococcus są znane tylko nielicznym laboratoriom na całym świecie.
W niniejszym artykule szczegółowo opisano metody eksperymentalne służące do genetycznej transformacji tego nowego organizmu modelowego konstruktem nadekspresyjnym za pomocą elektroporacji, a także metodę zawieszania przekształconych komórek w niskoprocentowej agarozie w celu umożliwienia selekcji linii transformowanych wywodzących się z pojedynczej przekształconej komórki. W związku z sukcesami zastosowania Ostreococcus w badaniach nad rytmami okołodobowymi, można spodziewać się rosnącego zainteresowania Ostreococcus w różnych obszarach badawczych w obrębie i poza naukami o roślinach, w tym w dziedzinach biotechnologicznych. Badacze z szerokiego zakresu nauk biologicznych i medycznych, pracujący nad konserwowanymi szlakami biochemicznymi, mogą rozważyć prowadzenie badań na Ostreococcus, który jest wolny od złożoności genomowej i organizmalnej większych gatunków modelowych.

Niniejszy artykuł opisuje transformację genetyczną jednokomórkowej morskiej algi Ostreococcus tauri za pomocą elektroporacji. Ten organizm eukariotyczny stanowi efektywną platformę modelową dla roślin wyższych, posiadając znacznie zredukowaną złożoność genomową i komórkową oraz będąc łatwo podatnym na hodowlę komórkową i biologię chemiczną.

Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri

Powszechne problemy hamujące szybki postęp w naukach o roślinach obejmują złożoność komórkową, tkankową i całego organizmu, a w szczególności wysoki poziom genomicznej...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie i wyselekcjonowanie stabilnych linii transgenicznych nowego organizmu modelowego, Austria Occus Tori, który jest morskim pikoeukariotycznym gatunkiem glonów. Osiąga się to poprzez wstępne przygotowanie pelletów komórkowych z 50 ml gęstej kultury glonów na jedną transformację. Drugim krokiem jest zmieszanie komórek z liniowym DNA, a następnie przeprowadzenie elektroporacji.Po rozcieńczeniu transformowanych komórek w świeżym medium i inkubacji przez noc, należy dodać 0,2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia oraz czynnik selekcyjny, a następnie przelać mieszaninę do małych szalek Petriego. Ostatnim krokiem jest wyselekcjonowanie powstałych kolonii, które wyrosną po dwóch do trzech tygodniach inkubacji w stałym niebieskim świetle. Ostatecznie w celu potwierdzenia udanej integracji konstruktu z genomem wygenerowanych linii transgenicznych stosuje się selekcję w medium płynnym oraz kolejne analizy molekularne, takie jak PCR i southern blot.Główną zaletą wykorzystania tego organizmu w porównaniu do istniejących organizmów modelowych, takich jak Arabidopsis, jest znaczne zmniejszenie złożoności genomowej, co pozwala na badanie sieci regulacyjnych w warunkach praktycznego braku redundancji genetycznej. Chociaż w moim laboratorium wykorzystaliśmy osteo occus do badania roślinnego zegara okołodobowego, można go użyć do analizy wielu innych złożonych sieci komórkowych. Zatem zastosowania tej techniki wykraczają daleko poza obszar biologii roślin.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ mimo że poszczególne kroki wydają się dość proste, prawidłowa obsługa komórek i wydajny przebieg pracy są niezbędne do uzyskania dobrego wyniku. Część tej procedury zostanie zaprezentowana przez Culin Kish, asystentkę badawczą z laboratorium. Komórki Austria Occus są hodowane w sztucznej wodzie morskiej (SW); aby przygotować SW, należy rozpuścić 40 g/L.Sole morskie w wodzie dejonizowanej do zmierzonego zasolenia 30 części na tysiąc lub PPT. Używając salinometru, dodać wzbogacanie, mikroelementy metaliczne do pożywki oraz witaminy, a następnie przefiltrować przez filtr 0,22 mikrona i zaszczepić komórki *Austrobryopsis cocus* szczep O TT H 95 w SW pod stałym oświetleniem. W inkubatorze do wzrostu roślin wyposażonym w niebieski filtr światła księżycowego natężenie światła powinno wynosić około 20 mikromoli na metr kwadratowy na sekundę, a temperatura powinna być utrzymywana na poziomie 20 stopni Celsjusza. Komórki nie wymagają stałego mieszania, lecz są wstrząsane raz na dwa do trzech dni w celu zapobiegania agregacji.W celu utrzymania hodowli, co siedem dni należy aseptycznie pasażować komórki w rozcieńczeniu 1:100 w świeżej pożywce SW. Każda transformacja wymaga 50 mililitrów komórek o gęstości od 20 do 30 × 10⁶ komórek na mililitr. Gęstość ta powinna zostać osiągnięta od pięciu do siedmiu dni po pasażowaniu.Przybliżoną gęstość komórek oraz ich oś można oszacować za pomocą komory licznikowej przy powiększeniu co najmniej 40-krotnym lub preferencyjnie wyznaczyć metodą cytometrii przepływowej. Tutaj przedstawiono przykład kultur zdrowych w porównaniu do niezdrowych.Każdy wykres bioparametryczny przedstawia rozproszenie boczne (SSC) na osi y w stosunku do czerwonej fluorescencji na komórkę (FL3) na osi x. FL3 reprezentuje czerwoną fluorescencję chlorofilu, a SSC jest wskaźnikiem względnej wielkości komórek. Zdrowe komórki mieszczą się w oknie Austria Occus, natomiast obumierające komórki lub bakterie zanieczyszczające znajdują się poza tym oknem.Idealnie ponad 99% komórek powinno znajdować się w oknie Austria Occus. Do efektywnej transformacji genetycznej każda transformacja wymaga pięciu mikrogramów czystego linearyzowanego plazmidu, w postaci DNA o stężeniu jednego mikrograma na mikrolitr. Plazmid został zlinearyzowany w sterylnej wodzie dejonizowanej za pomocą enzymu, który tnie w szkielecie użytego wektora, ale nie w transgenie ani genie selekcyjnym.Przechowuj probówkę do mikrocentryfugi zawierającą DNA na lodzie wraz z dwumilimetrową elektroporacyjną kubettą dla każdej transformacji. Dla każdej linii komórek przeznaczonych do transformacji niezbędna jest kontrola bez DNA. Dla każdej transformacji przenieś 50 ml komórek do probówki z konicznym dnem, dodaj 0,1% kwasu onikowego F 68 i wiruj przez 10 minut przy 8 000 ×g w temperaturze 10 °C.Abyt wylegować komórki, należy natychmiast odlać supernatant i dodać do komórek jeden mililitr buforu do resuspensji Resus. Resuspender komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, przenieść je do probówki typu microcentrifuge i wirować przez 10 minut przy 8 000 ×g w temperaturze 10 °C. Pracując sprawnie, należy ponownie przemyć komórki po drugim wirowaniu.Obetnij końcówkę P 200, aby zawiesić każdy osad w 40 µL buforu Resus. Przenieś 40 µL zawiesiny komórek do każdej probówki z linearyzowanym DNA w lodzie. Delikatnie wymieszaj i przenieś do urządzenia do elektroporacji.Umieść kuwetę w urządzeniu do elektroporacji. Ustaw parametry na 6 kV/cm, 600 Ω oraz 25 ms. Po elektroporacji poddaj komórki inkubacji.Inkubuj komórki w kuwetach w temperaturze pokojowej przez 10 minut. W tym czasie opisz kolby do hodowli tkanek i dodaj do każdej z nich 30 mililitrów świeżego a SW. Pobierz jeden mililitr a SW z każdej kolby i ostrożnie dodaj go do odpowiedniej kuwety, a następnie inkubuj przez dwie minuty.Następnie ostrożnie wyjmij SW, w którym znajduje się skupisko komórek, a potem powoli i delikatnie przenieś je bezpośrednio do SW. W kolbie hodowlanej komórki zazwyczaj pozostają w jednym dużym skupisku. Należy uważać, aby w tym momencie nie potrząsać ani nie niepokoić zagregowanych komórek. Pozostaw komórki w inkubatorze na jedną lub dwie godziny w celu regeneracji.Na koniec resuspenduj komórki, potrząsając ręcznie kolbą. Na tym etapie komórki powinny swobodnie przejść w zawiesinę, a widoczne grudki nie powinny występować. Pozostaw kultury do regeneracji na noc w inkubatorze; w dniu następującym po elektroporacji autoklawuj roztwór 2,1% low melting point haase w wodzie dwukrotnie destylowanej w butelce zawierającej mieszadło magnetyczne.Utrzymywać w stanie stopionym w temperaturze od 65 do 90 °C w większym zlewce z wodą, umieszczonej na magnetycznej mieszalce z podgrzewaniem. Dla każdej transformacji przygotować osiem szalek Petriego o średnicy 50 mm oraz osiem probówek o pojemności 50 ml, z których każda zawiera 9 ml pożywki SW plus. Wymagany dobór.Wyjmij komórki po transformacji z inkubatora. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest wprowadzenie przekształconych komórek do niskoprocentowych żeli agarozowych w taki sposób, aby nie naruszyć ich integralności poprzez narażenie na zbyt wysoką temperaturę. Dlatego ważne jest, aby kolejne kroki procedury wykonać szybko i sprawnie, pracując w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.Dodaj jeden mililitr prawie wrzącej agarozy o niskiej temperaturze topnienia do dziewięciu mililitrów SW. W jednej z probówek zamknij naczynie i odwróć, aby wymieszać zawartość. Następnie dodaj 0,5 mililitra świeżo przekształconych komórek. Szybko zamknij i odwróć probówkę w celu wymieszania, a następnie wlej zawartość do szalki Petriego.Powtórz ten proces z pozostałymi siedmioma probówkami, a następnie przejdź do kolejnej kolby transformacyjnej. Pozostaw płytki otwarte w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez godzinę, aż układ stężeje. Następnie przykryj płytki i ostrożnie przenieś je do dużych kwadratowych szalek Petriego, z których każda mieści cztery płytki okrągłe.Ponieważ płytki nie zastygły całkowicie, żel jest bardzo kruchy. Należy uważać, aby nie uszkodzić żelu podczas przenoszenia płytek. Uszczelnić kwadratowe płytki parafilmem i umieścić je w inkubatorze.Po pojawieniu się kolonii, należy użyć pipety 200 µL z końcówkami z filtrem. Aby wyizolować kolonie w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, wystarczy wybrać oddzielne kolonie i odessać zieloną kolonię. Należy uważać, aby nie pobrać komórek z sąsiednich kolonii.Przenieś komórki do dwóch mililitrów medium płynnego zawierającego czynnik selekcyjny. W płytce 24-dołkowej wymieszaj zawiesinę, pipetując ją w górę i w dół. Po wybraniu 24 lub 48 kolonii z każdej transformacji, szczelnie zamknij płytki parafilmem i przenieś je do inkubatora.Po tygodniu przenieś 100 µL z każdej studzienki do 2 mL świeżego medium SW z selekcją. Hoduj w płytce 24-dołkowej przez kolejne siedem dni. Przeżyłe linie komórkowe można następnie wykorzystać do dalszych badań, transformując 5 µg linearyzowanego DNA.Stosując ten protokół, po dwóch do trzech tygodniach na każdej płytce transformacyjnej powinno pojawić się od 20 do 60 kolonii. Około 80% wybranych kolonii zostało pozytywnie wyselekcjonowanych pod kątem oporności na antybiotyk w medium płynnym i wykorzystano je w dalszych badaniach przeprowadzonych zgodnie z tą procedurą.W celu weryfikacji liczby oraz lokalizacji insercji genu po jego wprowadzeniu można następnie zastosować inne metody, takie jak PCR lub Southern blot. Technika ta pozwoliła badaczom z dziedziny zegara biologicznego i cyklu komórkowego zrozumieć złożone komponenty i mechanizmy działania ich systemów w nowym organizmie modelowym, Austria caucus. Tori. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat generowania transgenicznych linii Austria caucus.

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Transformacja genomowa pikоеукаriotu Ostreococcus tauri

Protokół opisuje ekspresję białek z wykorzystaniem drożdży metylotroficznych Pichia pastoris. Przeprowadzono również przygotowanie elektrokompetentnych komórek drożdży, transformację wektora z genem zainteresowania do P. pastoris oraz oczyszczanie DNA drożdży. Ostatnie etapy tego protokołu ekspresji białek stanowią analiza Western blot oraz oczyszczanie białek.

Ekspresja białek rekombinowanych w metylotropowych drożdżach Pichia pastoris

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Źródło: Stefan, A. i wsp., Wieloaspektowe korzyści z koekspresji białek w Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)Ten film przedstawia procedurę przekształcania Escherichia coli w plazmid przenoszący gen oporności na antybiotyki, w tym przygotowanie komórek, elektroporację, odzyskiwanie i selekcję transformantów.

Przygotowanie i przemiana bakterii za pomocą elektroporacji wysokonapięciowej

Enterobacter sp. YSU rośnie w pożywce z minimalnymi solami glukozy. Auksotrofy są generowane przez przekształcenie go w transposom, który losowo wstawia się do genomu gospodarza. Mutanty są znajdowane przez replikowanie posiewu ze złożonej pożywki do minimalnej pożywki. Przerwane geny są identyfikowane przez ratowanie genów i sekwencjonowanie.

Wytwarzanie auksotrofów Enterobacter sp. YSU z wykorzystaniem mutagenezy transpozonów

Współekspresja białek jest potężną alternatywą dla rekonstytucji in vitro kompleksów białkowych i jest pomocna w przeprowadzaniu testów biochemicznych i genetycznych in vivo. W tym artykule informujemy o wykorzystaniu koekspresji białek w Escherichia coli do uzyskania kompleksów białkowych i dostrojenia częstotliwości mutacji komórek.

Wieloaspektowe korzyści płynące z koekspresji białek w Escherichia coli

Transformacja biolistyczna to metoda używana do generowania stabilnej integracji DNA z genomem oportunistycznego patogenu Cryptococcus neoformans poprzez rekombinację homologiczną. Zademonstrujemy biolistyczną transformację konstruktu, który ma gen kodujący kinazę octanową połączony ze znacznikiem fluorescencyjnym mCherry w C. neoformans.

Biolistyczna transformacja genu znakowanego fluorescencyjnie w oportunistyczny patogen grzybowy Cryptococcus neoformans

Prezentowany tutaj jest ujednolicony opis technik, które mogą być użyte do rozwoju, transformacji, podawania i testowania ekspresji heterologicznego białka probiotycznych drożdży Saccharomyces boulardii.

Przemiana drożdży probiotycznych i ich odzyskiwanie z tkanek odpornościowych przewodu pokarmowego po zgłębniku doustnym u myszy

Biologia syntetyczna umożliwia inżynierię białek o niespotykanych dotąd właściwościach przy użyciu kotranslacyjnej insercji aminokwasów niekanonicznych. Tutaj przedstawiliśmy, w jaki sposób spektralnie przesunięty ku czerwieni wariant fluoroforu typu GFP o nowych właściwościach spektroskopowych fluorescencji, określany jako "złote" białko fluorescencyjne (GdFP), jest wytwarzany w E. coli poprzez selektywne włączenie ciśnienia (SPI).

Inżynieria "złotej" fluorescencji poprzez selektywne wprowadzanie ciśnieniowe aminokwasów niekanonicznych oraz analiza białek za pomocą spektrometrii mas i fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokoły pracy z DSM20016 Limosilactobacillus reuteri, szczegółowo opisując wzrost, transformację plazmidu, PCR kolonii, pomiar fluorescencyjnego białka reporterowego i ograniczone mini-przygotowanie plazmidu, a także typowe problemy i rozwiązywanie problemów. Protokoły te umożliwiają pomiar białek reporterowych w DSM20016 lub potwierdzenie za pomocą PCR kolonii, jeśli nie jest zaangażowany reporter.

Metody elektroporacji i potwierdzania przemian u Limosilactobacillus reuteri DSM20016

W tym manuskrypcie udostępniamy kompleksowy protokół oceny przeżywalności antybiotyków dla Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus, przekształcając plazmidy w P. aeruginosa i S. aureus w celu stworzenia szczepów reporterowych i wizualizacji wariantów fenotypowych, takich jak uporczywe, za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej.

Obrazowanie heterogenicznych fenotypów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus za pomocą poklatkowej mikroskopii epifluorescencyjnej

Ten protokół wykorzystuje bioluminescencyjny reporter, który umożliwia pomiary aktywności transkrypcyjnej u Saccharomyces eubayanus w celu monitorowania przejścia z glukozy do maltozy, umożliwiając analizę adaptacji metabolicznych w czasie rzeczywistym i wspierając optymalizację szczepu do fermentacji przemysłowej w różnych warunkach.

In vivo (in vivo) Monitorowanie aktywności transkrypcyjnej podczas przemiany metabolicznej za pomocą bioluminescencyjnego reportera w drożdżach

Poznaj metodę elektroporacji do transformacji genowej Ostreococcus tauri, morskiego pikoeukarionta o uproszczonej strukturze genomowej. Technika ta umożliwia generowanie stabilnych linii transgenicznych i badanie sieci regulacyjnych bez redundancji genetycznej.

Transformacja genomiczna piko-eukarionta Ostreococcus tauri

Przeglądaj więcej filmów