Transfer genów do starszych zarodków kurcząt za pomocą elektroporacji ex ovo

Opisano metodę transferu genów do zarodków kurczaków w późniejszych fazach inkubacji (starszych niż stadium Hamburgera i Hamiltona (HH) 22). Metoda ta przezwycięża wady elektroporacji in ovo stosowanej do starszych zarodków kurcząt i jest użyteczną techniką do badania funkcji i regulacji genów na starszych etapach rozwoju.

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie transferu genów do starszych zarodków kurczaków in vivo w celu zbadania funkcji i regulacji genów na starszych etapach rozwoju. Osiąga się to poprzez najpierw rozbicie jaja około 2,5 dnia inkubacji i przeniesienie całego zarodka do systemu szalki Petriego. Drugim krokiem jest wstrzyknięcie plazmidu, kodującego interesujący nas gen w odpowiedniej części zarodka.

Po wstrzyknięciu plazmidu umieść elektrody obok zarodka i wykonaj elektroporację X ovo, ostatnim krokiem jest pobranie elektroporowanych zarodków do analizy. Ostatecznie immunohistochemia służy do wykrywania ekspresji przenoszonych genów w zarodku. Dzisiaj pokażemy Ci, jak wykonać owalną elektroporację X za pomocą BUL z kurczaka.

Główną zaletą tej techniki jest to, że X nadmierna elektroporacja może przezwyciężyć problemy związane z nadmierną elektroporacją stosowaną do transferu genów w starszych zarodkach kurczaków. Udana hodowla X ovo zarodków kurczaków wymaga użycia świeżych zapłodnionych jaj. Nie używaj jaj przechowywanych w temperaturze 12 stopni Celsjusza dłużej niż tydzień.

Ułóż jaja na dłuższych bokach w inkubatorze z wymuszonym ciągiem w temperaturze 37,5 stopni Celsjusza i wilgotności 60% po inkubacji przez 2,5 dnia. Kiedy zarodki są w pobliżu hamburgera i Hamiltona. Etap 17, wyjmij jaja z inkubatora.

Oznacz wierzch każdego jajka ołówkiem, aby wskazać kierunek pękania każdego jajka. Wlej około 20 mililitrów sterylnej wody destylowanej do czystej, dużej szalki Petriego o średnicy 145 milimetrów. Umieść małą sterylną szalkę Petriego o średnicy 94 milimetrów w dużej szalce Petriego.

Następnie rozbij każde jajko na dnie o ostrą metalową krawędź. Ostrożnie otwórz jajko i przenieś całą jego zawartość na małą szalkę Petriego. Aby zapewnić dobrą jakość zarodka, cała zawartość komórki jajowej powinna być przechowywana w normalnie okrągłej formie na szalce Petriego bez uszkodzenia błony komórkowej.

Po przeniesieniu zawartości każdego jajka do małego naczynia, przykryj duże naczynie pokrywką. Umieść systemy szalek Petriego w innym inkubatorze w celu dalszej hodowli w temperaturze 37,5 stopnia Celsjusza i wilgotności około 60% przed elektroporacją X ovo. Użyj polarnej mikroelektrody, aby wyciągnąć szklane kapilary ze szklanych rurek o średnicy 1,0 milimetra.

Rozbij końcówkę szklanych kapilar na odpowiednią średnicę. Następnie ustaw odpowiednie parametry do elektroporacji, takie jak różne napięcia dla odrębnej tkanki i wielkości zarodków. Podłącz odpowiednie elektrody do elektro zgodnie z tkanką docelową i wielkością zarodków.

Przygotuj roztwór plazmidu zawierający plazmidy, kodujący gen docelowy i gen markerowy. W tej demonstracji kadheryna siódma lub CAD siódma jest celem, a białko zielonej fluorescencji lub GFP jest markerem. Dodaj szybką zieleń do końcowego stężenia 0,1%, aby oznaczyć roztwór plazmidu na zielono.

Na koniec użyj pipety doustnej, aby napełnić szklaną kapilarnę roztworem plazmidu. Do elektroporacji X ovo wykorzystuje się zarodki kurcząt z hodowli X ovo, które były inkubowane przez sześć dni. Aby rozpocząć tę procedurę, za pomocą cienkich kleszczy ostrożnie rozerwij błony tylenowe i owodniowe nad osłoną nerwu wzrokowego i dodaj trzy krople sterylnego 0,9% roztworu chlorku sodu na powierzchnię tectum.

Za pomocą pipety doustnej wstrzyknąć roztwór plazmidu ze szklanej kapilary do jamy tectum. Umieść elektrody z katodą wolframową igłową i anodą z prostokątną płytką obok tectum. Natychmiast użyj elektro, aby przyłożyć impulsy elektryczne do tectum.

Przykryj dużą szalkę Petriego pokrywką i włóż ją z powrotem do inkubatora dwa lub trzy dni po elektroporacji plazmidów kodujących GFP i CAD siedem w tectum kurczaka w E six, tectum zbiera się i utrwala do barwienia immunologicznego. Wyniki przedstawiono na tym rysunku w punkcie E ósemka. Białko GFP ulega silnej ekspresji w guzie, na co wskazują te całe obrazy mocowania.

Panel A to obraz w jasnym polu. Panel B jest obrazem GFP, a panel C jest wyłaniany. Obraz ponadto, w sekcjach tectum w E dziewięć białek GFP wizualizowanych na zielono w panelu D i CAD siedem białek wizualizowanych na czerwono w panelu E jest kowyrażonych, jak reprezentowany przez żółty kolor w panelu F. Przy prawidłowym wykonaniu wydajność elektroporacji X ovo wynosi od 60 do 100%Wyniki te sugerują, że elektroporacja X ovo jest skuteczną metodą transferu genów do starszych zarodków kurczaków in vivo.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić transfer genów do starszych zarodków kurczaka i życzyć powodzenia w swoim eksperymencie.