Tworzenie zdefiniowanych środowisk gazowych w celu zbadania wpływu hipoksji na C. elegans

Celem poniższego eksperymentu jest założenie i utrzymanie komory hipoksji przy użyciu metody ciągłego przepływu. Osiąga się to poprzez uzyskanie i wyprodukowanie niezbędnych probówek, kolb i komór do zabiegu. W drugim kroku podłącz zbiornik tlenu i wybierz natężenie przepływu, aby uzyskać żądany poziom niedotlenienia.

Uwodnić gaz, przepuszczając go przez kolbę bąbelkową wypełnioną wodą dejonizowaną. Podłącz uwodniony gaz do komory hipoksji i umieść badane próbki w komorze, aby wystawić je na warunki niedotlenienia. Uzyskano wyniki, które wskazują na śmiertelność zarodka zależną od Hi F1 w niedotlenieniu na podstawie obserwacji żywotności do dorosłości.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komory rękawicowe, jest to, że jest łatwa i niedroga do wytworzenia w laboratorium oraz zapewnia dokładne i powtarzalne stężenie gazów w komorze środowiskowej. Chociaż metoda ta zapewnia wgląd w reakcję hipoksyjną nicieni C, można ją również dostosować do innych systemów, w tym większych organizmów modelowych i hodowli komórkowych. Dodatkowo może być używany do badania innych gazów, w tym dwutlenku węgla i siarkowodoru.

Protokół ten pokazuje, jak skonstruować komorę hipoksji. Gaz jest przechowywany w zbiornikach sprężonego gazu o określonych stężeniach tlenu i dołączony jest dwustopniowy reduktor. Gaz dostaje się do dolnej części rurki przepływowej, wychodząc z góry przy odpowiednim natężeniu przepływu.

Następnie gaz przepływa do kolby bąbelkowej, nawadniając gaz. Gaz wodny przechodzi następnie do komory hipoksji na zaworze dopływowym, narażając próbki na niedotlenienie. Gaz w końcu dostaje się do pomieszczenia przez otwór wydechowy wywiercony w komorze.

Naczynie krystalizacyjne Pyrex lub w pudełku ze strzałkami może być używane jako korpus komory środowiskowej. Objętość pojemnika powinna być ograniczona do minimum, a materiał musi być nieprzepuszczalny dla gazu. Wywierć otwór po jednej stronie pojemnika za pomocą końcówki węglowej lub diamentowej, wywierć i dopasuj do plastikowej złączki do węża.

Wymieszaj żywicę epoksydową przed nałożeniem na pudełko i dopasowaniem. Następnie powtórz tę samą procedurę po przeciwnej stronie pojemnika z drugim otworem przesuniętym od pierwszego. Aby zwiększyć mieszanie turbulentne, należy użyć rurki o średnicy zewnętrznej jednej ósmej cala, FEP lub nylonowej, aby podłączyć zbiorniki sprężonego gazu do urządzenia sterującego przepływem, takiego jak regulator przepływu masowego lub przepływomierz wirnikowy.

Zbiorniki gazu powinny mieć określone stężenia tlenu zrównoważone azotem, który jest certyfikowanym wzorcem zawartości tlenu lub warunków beztlenowych. Czysty azot Użyj dwustopniowego regulatora, przy czym drugi stopień jest ustawiony na żądane ciśnienie. Zapoznaj się z instrukcjami zawartymi w pisemnym protokole, aby uzyskać informacje na temat wyboru odpowiedniego natężenia przepływu.

Następnie podłącz rurkę z regulatora dwustopniowego do rurki przepływowej, która kontroluje natężenie przepływu gazu wchodzącego do komory. Wyloty rurki przepływowej są podłączone do butelki z gazem z cylindrem ze spiekanym cylindrem zawierającym wodę destylowaną. Następnie podłącz rurkę po drugiej stronie butelki do mycia do jednej ze złączek w komorze środowiskowej.

Spowoduje to uwodnienie gazu wchodzącego do komory środowiskowej. Użyj smaru próżniowego do uszczelnienia komory. Następnie umieść obciążniki na pokrywie komory, aby zapewnić hermetyczne uszczelnienie.

Przetestuj uszczelkę, przytrzymując niewielką ilość wody w dłoni w rękawiczce do złączki wydechu gazu na komorze i sprawdzając, czy nie ma pęcherzyków. Najpierw wygeneruj zsynchronizowane populacje morskiego Elgana. Umieść od jednego do 100 dorosłych osobników w kropli alkalicznego roztworu wybielacza na powierzchni niewysiewanej pożywki hodowlanej nicieni.

Pozostawić roztwór wybielacza do wchłonięcia się w płytkę po okresie inkubacji trwającym co najmniej osiem godzin. Przenieś zsynchronizowaną larwę L one na płytkę obsianą żywymi bakteriami OP 50. Alternatywnie, pozwól dorosłym GRA złożyć jaja na talerzu przez dwie do trzech godzin, aby wytworzyć grupę robaków, które będą rozwijać się synchronicznie lub wybierz L cztery larwy z mieszanej populacji, aby zebrać młode zarodki.

Na etapie od dwóch do czterech komórek użyj żyletki, aby posiekać dorosłe GR w małej objętości wody, a następnie przenieś zarodki za pomocą pipety doustnej przed przeniesieniem robaków na płytkę w celu wystawienia na warunki niedotlenienia. Umieść pierścień z 10 miligramami na mililitr kwasu palmitynowego w etanolu wokół krawędzi płytek. Aby zapobiec ucieczce robaków z powierzchni płytki agarowej.

Kwas palmitynowy wyjdzie z roztworu. Ponieważ etanol odparowuje, tworząc fizyczną barierę zapewniającą jednorodność, należy wymienić wodę w butelce z gazem przed wystawieniem na działanie w komorze środowiskowej. Po przeniesieniu robaków na płytki, uszczelnij płytki w komorze środowiskowej, zainicjuj przepływ gazu i utrzymuj ekspozycję przez żądany czas do oznaczenia.

Aby zarodki były zdolne do życia do dorosłości, pozwól robakom rozwinąć się 48 godzin po powrocie do powietrza w pomieszczeniu, w którym to momencie powinny się rozwinąć. Larwy czwartego stadium lub jednodniowe dorosłe osobniki zdobywają punkty za żywotność do dorosłości. Aby uwidocznić, że robaki są narażone na niedotlenienie, przenieś robaki do kropli M dziewięć na 22 milimetrowym kwadratowym szkiełku nakrywkowym i odwróć na podkładkę 2% aros w M dziewięć, jeśli to konieczne.

Jako środek znieczulający można zastosować 25 milimolów amolowego amolu lub 10-milimolowy azydek sodu. Alternatywnie, po wystawieniu na działanie hipoksji, przezroczystą komorę środowiskową można umieścić bezpośrednio na stoliku lunety prosektoryjnej. Pokazane są dwa widoki, jeden z nich obejmuje całą konfigurację przepływu gazu.

Drugi z samą komorą na stoliku mikroskopu. Wyhoduj dwa robaki Bristol N na czterech 10-centymetrowych płytkach wzrostu, aż większość robaków będzie dorosła GR. Umyj robaki w 15-mililitrowej stożkowej probówce z jednym do pięciu alkalicznych roztworów wybielacza i inkubuj z rotacją, aż robaki zaczną się rozpuszczać.

Nie więcej niż pięć minut. Umyj robaki trzy razy, obracając M dziewięć z prędkością 1 500 razy G między każdym praniem bez płytki łamiącej. Wybielone zarodki umieszcza się na 8 150-milimetrowych płytkach NGM i pozwala zarodkom rozwinąć się w larwy L four przez około 48 godzin.

W temperaturze 22 stopni Celsjusza przenieś płytki do komory środowiskowej i wystawij na działanie warunków hipoksyjnych i beztlenowych przez cztery godziny lub przez czas określony w projekcie eksperymentalnym. Aby szybko pobrać próbki, zdejmij pokrywę do komory hipoksyjnej. Weź jedną płytkę z próbką i ponownie zamknij komorę czas i zapisz kroki.

Po usunięciu robaków z niedotlenienia cały proces powinien zająć mniej niż dwie minuty. Użyj wody destylowanej, aby umyć robaki na nylonowym filtrze, a następnie wlej do oznakowanej 15-mililitrowej stożkowej probówki zawierającej 100 mikrolitrów wirówki 1% SDS. Robaki w SDS w wirówce stołkowej są 1,500 razy G przez 15 do 20 sekund.

Po przerwie użyj podciśnienia, aby usunąć większość supinatu z rurki, pozostawiając nietknięty granulat robaka. Za pomocą pipety przenieś granulkę robaka z określoną objętością płynu do oznaczonej 1,5 mikrorurki na śmieci. Jeśli próbka ma być użyta na stronie SDS, ta probówka może zawierać równą objętość dwukrotnie więcej barwnika obciążającego białko, uszczelnij probówkę i zanurz w ciekłym azocie.

Powtarzać tę czynność, aż wszystkie próbki zostaną wyizolowane. Postępuj zgodnie z poniższymi procedurami dla próbek kontrolnych powietrza w domu, ponieważ próbki konsystencji mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rysunek ten pokazuje żywotność zarodków narażonych na 1000 części na milion tlenu, 5 000 części na milion tlenu i normoksję około 210 000 części na milion tlenu.

Zarodki są wystawione na każdy stan przez 24 godziny w komorach tlenowych o ciągłym przepływie. Robaki przeniesiono do warunków normoksyjnych, pozwolono im rozwinąć się do dorosłości przez 48 godzin, a następnie oceniono je pod kątem żywotności do dorosłości. Po tej procedurze można pobrać próbki do późniejszej analizy za pomocą Western blot QPCR lub testów fizjologicznych, takich jak długość życia lub produkcja potomstwa.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobry pomysł, jak skonfigurować komorę do hipoksji z ciągłym przepływem we własnym laboratorium.