Name: Tworzenie zdefiniowanych środowisk gazowych w celu zbadania wpływu hipoksji na C. elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę ciągłego przepływu do tworzenia zdefiniowanych warunków hipoksji w komorze badawczej. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę stężenia tlenu w badaniach z użyciem C. elegans.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy członkom laboratorium Millera za dyskusje oraz krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta była wspierana przez grant dla nowych badaczy z Nathan Shock Center of Excellence in the Basic Biology of Aging przyznany DLM oraz grant National Institutes of Health R00 AG030550 przyznany DLM.

1. Budowa komór środowiskowych
<ol>
	<li>Wybierz najmniejszą rozsądną objętość komory wymaganą dla zakresu Twojego projektu. Komora musi być wykonana z materiału nieprzepuszczalnego dla gazu (O2). Można zastosować szklane naczynia krystalizacyjne Pyrex, pudełka Anaeropack lub duże pudełka z odlewu akrylowego (Ellard Instrumentation). Ustalono, że w naczyniu krystalizacyjnym Kimex o wymiarach 100 x 50 mm można zmieścić 9 płytek 50 mm. Jako pokrywki do naczyń krystalizacyjnych Pyrex można wykorzystać szklane płytki.</li>
	<li>Wywierć otwór w wybranej komorze i zamontuj plastikową złączkę Luer (męską) z kolcem do węża (Cole Parmer). Złączki można zabezpieczyć za pomocą opasek zaciskowych lub żywicy epoksydowej. Zamontuj podobną złączkę po przeciwnej stronie pojemnika, aby umożliwić przepływ gazu do wnętrza i na zewnątrz komory. Jeśli to możliwe, otwory powinny być przesunięte względem siebie, aby zwiększyć mieszanie turbulentne.</li>
	<li>Należy pozyskać butle z gazem pod ciśnieniem o określonych stężeniach O2 (zbilansowanych N2), które posiadają certyfikat standardu zawartości O2 lub, w przypadku warunków anoksycznych, czysty N2 (&lt;10 ppm O2). W badaniach długoterminowych należy stosować automatyczne regulatory przełączające, aby uniknąć zakłócenia poziomu tlenu w komorach.</li>
	<li>Wykazano, że odpowiedź organizmu na hipoksję jest zależna od temperatury15. Poprzez umieszczenie komory w inkubatorze można utrzymać różne temperatury. Temperatury wewnątrz inkubatora mogą być nierównomierne, dlatego zaleca się stosowanie rejestratora danych temperaturowych do ciągłego pomiaru temperatury wewnątrz komory.</li>
</ol>
2. Podłączenie gazu do komory środowiskowej
<ol>
	<li>We wszystkich połączeniach należy zastosować rurki o średnicy zewnętrznej 1/8 cala, połączone za pomocą szybkozłączek lub złączy kompresyjnych. Rurki powinny być nieprzepuszczalne i nieaktywne w kontakcie z O2, np. z fluoretylenu propylenu (FEP) lub nylonu (Cole Parmer). Schemat gotowej instalacji przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Butle ze sprężonym gazem należy podłączyć do urządzenia sterującego przepływem, takiego jak masowy przepływomierz (Sierra Instruments) lub rotametr (Aalborg). Należy upewnić się, że ciśnienie przed urządzeniem przepływowym i złączkami z kolcami mieści się w dopuszczalnym zakresie. Zazwyczaj stosuje się reduktory dwustopniowe, przy czym drugi stopień ustawia się na pożądane ciśnienie [Patrz sekcja trzecia w celu wyboru odpowiedniego natężenia przepływu]</li>
	<li>Gaz należy nawilżyć poprzez przepuszczanie go przez wodę destylowaną w butelce zmywacza gazu z filtrem spiekanym, a następnie skierować do jednego z przyłączy komory środowiskowej, pozostawiając drugie przyłącze otwarte dla odpływu gazu (patrz Rysunek 1). W badaniach krótkoterminowych nawilżanie gazu chroni przed wysychaniem płytek, jednak w badaniach długoterminowych może być konieczne monitorowanie wilgotności.</li>
	<li>Do uszczelnienia komory można użyć smaru próżniowego Dow Corning. Na pokrywie komory należy położyć obciążniki, aby zapewnić szczelność powietrzną. Aby potwierdzić szczelność i odpowiedni przepływ, należy przyłożyć niewielką ilość wody w dłoni w rękawiczce do przyłącza wylotowego komory i sprawdzić, czy pojawiają się pęcherzyki powietrza.</li>
</ol>
3. Wybór szybkości przepływu
<ol>
	<li>Zakładając idealne mieszanie, przy każdej wymianie objętości komory następuje 90% wymiana gazowa atmosfery gazowej (prawo Ficka). Na przykład w komorze o objętości 100 cc przy przepływie 100 cc/min pierwotne powietrze w komorze zostanie zastąpione w 90% pożądanym gazem po 1 minucie, a następnie będzie asymptotycznie dążyć do pełnej wymiany o 90% w każdej kolejnej minucie.</li>
	<li>Wyższe natężenia przepływu i mniejsze pojemniki pozwolą szybciej osiągnąć pożądane stężenie tlenu. W przypadku pojemników Kimex 100 x 50 (400 cc) przepływ 120 cc/min pozwoli osiągnąć 99,9% wymiany w ciągu 10 minut (3 wymiany). Takie natężenie przepływu jest odpowiednie dla większości warunków natlenienia. Z naszej wiedzy nie przeprowadzono systematycznych badań nad tym, jak szybkość zmiany stężenia O2 wpływa na odpowiedź u C. elegans.</li>
</ol>
4. Przygotowanie próbek do testu żywotności
<ol>
	<li>Robaki poddane warunkom hipoksji często uciekają z powierzchni płytek z agarem. Aby temu zapobiec, należy nanieść pierścień z kwasu palmitynowego (10 mg/ml w etanolu) wokół krawędzi płytek. Kwas palmitynowy wytrąci się z roztworu w miarę odparowywania etanolu, tworząc barierę fizyczną. Bariery z kwasu palmitynowego nie wpływają na tempo składania jaj, płodność ani długość życia C. elegans16. Drążenie nie występuje częściej w warunkach hipoksji, więc dodatkowe środki zapobiegawcze zazwyczaj nie są wymagane.</li>
	<li>
	<ol>
		<li>Uzyskaj zsynchronizowane populacje poprzez wybielanie dorosłych osobników z zapłodnionymi jajami w małej kropli alkalicznego roztworu wybielacza na niezasianych płytkach z pożywką do wzrostu nicieni (NGM)17. W przeciwieństwie do standardowych protokołów wybielania dużych partii podchlorynem, przenieś 1-100 zwierząt w kropli roztworu wybielacza na powierzchnię płytki NGM, a następnie pozwól roztworowi wybielacza wchłonąć się w płytkę17. Po co najmniej 12 godzinach przenieś zsynchronizowane larwy L1 na płytki zasiane żywymi bakteriami OP50. Alternatywnie można pozwolić dorosłym osobnikom z zapłodnionymi jajami składać jaja na płytce przez 2-3 godziny, aby uzyskać grupę robaków, które będą rozwijać się synchronicznie, lub wybrać larwy L4 z mieszanej populacji.</li>
		<li>Unikaj poddawania wybielonych embrionów hipoksji, ponieważ może to zmniejszyć ich żywotność13. W celu zebrania młodych embrionów (2-4 komórki), dorosłe osobniki z zapłodnionymi jajami można posiekać żyletką w małej objętości wody, a następnie przenieść embriony na płytki za pomocą pipety ustnej w celu późniejszego poddania ich hipoksji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uszczelnij płytki w komorze środowiskowej. Zwierzęta kontrolne powinny być utrzymywane w normoksji (powietrze pokojowe) w tej samej temperaturze co robaki poddane działaniu czynnika. Nie obserwuje się różnic między próbkami pozostawionymi w powietrzu pokojowym a tymi utrzymywanymi w identycznej komorze z przepływem powietrza pokojowego. Uruchom przepływ gazu i utrzymuj ekspozycję przez pożądany czas. Aby zapewnić jednorodność narastania, upewnij się, że wymieniłeś wodę w butelce do płukania gazu przed ekspozycją.</li>
	<li>Aby ocenić przeżywalność embrionów, pozwól robakom rozwijać się przez 48 h po powrocie do powietrza pokojowego; w tym momencie powinny być one larwami w czwartym stadium/dorosłymi w pierwszym dniu. Oceń przeżywalność, cenzurując wszelkie robaki, których nie można zlokalizować.</li>
	<li>Aby zwizualizować zwierzęta poddane hipoksji, przenieś robaki do kropli M9 na szkiełku nakrywkowym o rozmiarze 22 mm2 i odwróć na podkładkę z 2% agarozy w M917. W razie potrzeby jako anestetyk można zastosować lewamizol (25 mM) lub azotek sodu (10 mM). Azotek sodu i lewamizol mogą zakłócać niektóre obserwacje ze względu na toksyczność i powinny być stosowane z rozwagą18.</li>
</ol>
5. Szybki zbiór nicieni eksponowanych na hipoksję (Przykład: Przygotowanie próbek do analizy Western blot białka HIF-1)
Wiele efektów indukowanych przez hipoksję zostaje szybko odwróconych po powrocie do powietrza pokojowego, w tym wznowienie produkcji jaj12, fosforylacja epitopów mitotycznych w embriogenezie13 oraz degradacja białka HIF-19,19. Aby uzyskać powtarzalne efekty w tych warunkach, wymagana jest szybka izolacja zwierząt poddanych hipoksji. Dzięki tej konfiguracji zwierzęta mogą zostać pobrane i zamrożone w ciekłym azocie w czasie krótszym niż dwie minuty. Choć komory hipoksyjne z rękawicami pozwalają na manipulację próbkami w warunkach anoksji, ich koszt oraz brak praktyczności w warunkach innych niż anoksja ograniczają ich użyteczność.
<ol>
	<li>Hodować nicienie Bristol N2 na 4 płytkach wysokiego wzrostu (HG) o średnicy 10 cm, aż większość osobników osiągnie stadium dorosłych samic z jajami (gravid adults)17. Przemyć nicienie do probówki stożkowatej 15 mL zawierającej roztwór alkalicznego wybielacza w stosunku 1:5 i inkubować z rotacją do momentu rozpoczęcia rozpadu nicieni, nie dłużej niż przez 5 minut9. Przemyć nicienie trzykrotnie buforem M9, wirując przy 1500 x g po każdym płukaniu bez użycia hamulca.</li>
	<li>Wysiać wybielone embriony na 8 płytkach NGM 150 mm i pozwolić im rozwijać się do stadium larw L4 (~48 godzin dla Bristol N2 w temperaturze 22 °C). Przenieść płytki do komór środowiskowych i poddać działaniu warunków hipoksycznych (1 000 ppm, 5 000 ppm) oraz anoksycznych (N2) przez 4 godziny. Czasy ekspozycji będą się różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. Podczas gdy hipoksja ma natychmiastowy wpływ na tempo składania jaj, embriony dwukomórkowe obumierają po 16–18 godzinach ekspozycji12. W tej konfiguracji komory hipoksycznej dolna granica ekspozycji jest ograniczona przez szybkość wymiany atmosfery niezbędną do osiągnięcia stanu równowagi.</li>
	<li>Oznakować jedną probówkę do mikrocentryfugi 1,5 mL oraz jedną probówkę stożkową 15 mL dla każdej próbki eksperymentalnej. Nicienie poddane hipoksji częściej przywierają do ścianek probówki podczas zbioru. Aby temu zapobiec, należy wlać 100 μL 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) do każdej probówki stożkowej 15 mL. Jeśli SDS hamuje dalsze analizy, można zastosować albuminę surowiczą bydlęcą (BSA), aby zapobiec przywieraniu. Rutynowe stosowanie SDS lub BSA nie wykazuje istotnych różnic. Do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL dodać 50 μl 2x buforu do ładowania białek (4% SDS, 10% 2-merkaptoetanolu oraz śladową ilość błękitu bromofenolowego w 30% glicerolu (w/v)). Przygotować naczynie Dewar z ciekłym azotem.</li>
	<li>Pomiar czasu rozpocząć po wyjęciu nicieni z warunków hipoksji i zapisywać wyniki. Zdjąć pokrywę komory hipoksycznej, pobrać jedną płytkę z próbką i ponownie zamknąć komorę. Użyć wody destylowanej, aby spłukać nicienie na filtr nylonowy, a następnie przelać je do probówki stożkowej 15 mL. Odwiruj nicienie w wirówce laboratoryjnej przy 1500 x g przez 15–20 sekund z użyciem hamulca.</li>
	<li>Użyć próżni, aby usunąć większość supernatantu z probówki, nie naruszając osadu z nicieni.</li>
	<li>Za pomocą pipety przenieść osad z nicieniami w 50 μL do probówki do mikrocentryfugi 1,5 mL. Zamknąć probówkę i zanurzyć w ciekłym azocie.</li>
	<li>Powtórzyć czynność, aż wszystkie próbki zostaną wyizolowane. W celu zapewnienia spójności postępować zgodnie z tymi procedurami również w przypadku próbek kontrolnych z powietrzem pokojowym. Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Wpływ hipoksji na organizm można zaobserwować, badając zdolność C. elegans do osiągnięcia wieku dorosłego (Rycina 2). Zarówno embriony typu dzikiego Bristol (N2), jak i mutanty z delecją hif-1(ia04) przeżywają w powietrzu o stężeniu O2 typowym dla pomieszczeń (210 000 ppm O2). Nicienie N2 są w stanie zaadaptować się i przeżyć do wieku dorosłego w stężeniu 5 000 ppm O2, podczas gdy embriony hif-1 nie są żywotne. Dowodzi to, że HIF-1 jest niezbędny do adaptacji do zmieniających się poziomów tlenu dostępnego w środowisku10. Ani zwierzęta N2, ani hif-1 nie są w stanie przeżyć ekspozycji na 1 000 ppm O2.
Wizualizacja nicieni bezpośrednio w warunkach hipoksji jest możliwa dzięki zastosowaniu stereomikroskopu i przezroczystego pojemnika (Rysunek 3). Umieszczając komorę hipoksyjną bezpośrednio na stereomikroskopie, nie ma potrzeby wyjmowania nicieni z warunków niedotlenienia w celu obserwacji reakcji organizmu. Mikroskop może być wyposażony w oświetlenie fluorescencyjne (jak na Rysunku 3), co dodatkowo rozszerza zakres możliwych obserwacji w warunkach hipoksji.
<img alt="Schemat systemu chromatografii gazowej ze strzałkami przepływu, manometrami i układem wtryskiwacza próbek." src="/files/ftp_upload/4088/4088fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przykład komory hipoksji. Kierunek przepływu gazu zaznaczono strzałkami. Gaz jest przechowywany w butlach z gazem sprężonym o określonych stężeniach O2 (1), do których przymocowano dwustopniowy regulator (2). Gaz wpływa do dolnej części rurki przepływowej (3) i opuszcza ją górą z odpowiednią prędkością przepływu. Następnie gaz przepływa do kolby z bąbelkami (4), gdzie ulega nawilżeniu (poprawność podłączenia kolby należy potwierdzić, obserwując bąbelki). Nawilżony gaz przedostaje się następnie do komory hipoksji przez zawór wlotowy (5), wystawiając próbki na działanie hipoksji. Na koniec gaz jest odprowadzany do pomieszczenia przez otwór wylotowy wykonany w komorze.
<img alt="Wykres słupkowy, wpływ tlenu na żywotność, N2 vs hif-1, poziomy przy 1000 ppm, 5000 ppm, normoksja." src="/files/ftp_upload/4088/4088fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Żywotność embrionów eksponowanych na 1 000 ppm O2, 5 000 ppm O2 oraz normoksję (~210 000 ppm O2). Embriony były eksponowane na poszczególne warunki utlenienia przez 24 godziny w komorach tlenowych z ciągłym przepływem. Nicienie przeniesiono do warunków normoksji, pozwolono im rozwijać się do stadium dorosłego przez 48 godzin, a następnie oceniono żywotność do osiągnięcia wieku dorosłego. n&gt;50, N=5.
<img alt="Układ mikroskopowy, stereomikroskop na stole laboratoryjnym, butla z gazem, sprzęt do obserwacji naukowych." src="/files/ftp_upload/4088/4088fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wizualizacja C. elegans w warunkach hipoksji za pomocą mikroskopii. Nicienie są poddawane hipoksji zgodnie z opisanymi metodami. Przezroczysta komora środowiskowa (wykonana z pyrexowej naczyń do krystalizacji i szklanej płyty) jest umieszczona bezpośrednio na stoliku mikroskopu dissecting. Przedstawiono dwa widoki: jeden obejmujący cały układ przepływu gazu, a drugi samą komorę na stoliku mikroskopu.

<ol><li>Danovaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+metazoa+living+in+permanently+anoxic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">The first metazoa living in permanently anoxic conditions.</a> BMC Biology. 8, 30(2010).</li>
<li>Birner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+Hypoxia-inducible+Factor+1+alpha+Is+a+Marker+for+an+Unfavorable+Prognosis+in+Early-Stage+Invasive+Cervical+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Cervical Cancer.</a> Cancer Research. 60, 4693-4696 (2000).</li>
<li>Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+-+a+key+regulatory+factor+in+tumour+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 38-47 (2002).</li>
<li>Ramirez-Bergeron, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+affects+mesoderm+and+enhances+hemangioblast+specification+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hypoxia affects mesoderm and enhances hemangioblast specification during early development.</a> Development. 131, 4623-4634 (2004).</li>
<li>Staff, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wheel-well+Stowaways+Risk+Lethal+Levels+of+Hypoxia+and+Hypothermia%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Factors+and+Aviation%22%5BJournal%5D)">Wheel-well Stowaways Risk Lethal Levels of Hypoxia and Hypothermia.</a> Human Factors and Aviation. 44, 1-5 (1997).</li>
<li>Shen, C., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Analysis+of+Hypoxia+Signaling+and+Response+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic Analysis of Hypoxia Signaling and Response in C. elegans.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 995, 191-199 (2003).</li>
<li>Shen, C., Nettleton, D., Jiang, M., Kim, S. K., Powell-Coffman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+the+HIF-1+Hypoxia-inducible+Factor+during+Hypoxia+Response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of the HIF-1 Hypoxia-inducible Factor during Hypoxia Response in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280, 20580-20588 (2005).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92, 5510-5514 (1995).</li>
<li>Epstein, A. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+EGL-9+and+Mammalian+Homologs+Define+a+Family+of+Dioxygenases+that+Regulate+HIF+by+Prolyl+Hydroxylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C. elegans EGL-9 and Mammalian Homologs Define a Family of Dioxygenases that Regulate HIF by Prolyl Hydroxylation.</a> Cell. 107, 43-54 (2001).</li>
<li>Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suspended+Animation+in+C.+elegans+Requires+the+Spindle+Checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Suspended Animation in C. elegans Requires the Spindle Checkpoint.</a> Science. 302, 1038-1041 (2003).</li>
<li>Gray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430, 317-322 (2004).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+Elegans+Are+Protected+from+Lethal+Hypoxia+by+an+Embryonic+Diapause%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">C. Elegans Are Protected from Lethal Hypoxia by an Embryonic Diapause.</a> Current Biology. 19, 1233-1237 (2009).</li>
<li>Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+Cell+Cycle-regulated+Proteins+Correlates+with+Anoxia-induced+Suspended+Animation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Biology of the Cell. 13, 1473-1483 (2002).</li>
<li>Hu, C. -J., Wang, L. -Y., Chodosh, L. A., Keith, B., Simon, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Roles+of+Hypoxia-Inducible+Factor+1%7Balpha%7D+%28HIF-1%7Balpha%7D%29+and+HIF-2%7Balpha%7D+in+Hypoxic+Gene+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Roles of Hypoxia-Inducible Factor 1{alpha} (HIF-1{alpha}) and HIF-2{alpha} in Hypoxic Gene Regulation.</a> Molecular and Cellular Biology. 23, 9361-9374 (2003).</li>
<li>Treinin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1+is+required+for+heat+acclimation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">HIF-1 is required for heat acclimation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Genomics. 14, 17-24 (2003).</li>
<li>Miller, D. L., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+sulfide+increases+thermotolerance+and+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Hydrogen sulfide increases thermotolerance and lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 104, 20618-20622 (2007).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Salceda, S., Caro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+Factor+1%CE%B1+%28HIF-1%CE%B1%29+Protein+Is+Rapidly+Degraded+by+the+Ubiquitin-Proteasome+System+under+Normoxic+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) Protein Is Rapidly Degraded by the Ubiquitin-Proteasome System under Normoxic Conditions.</a> Journal of Biological Chemistry. 272, 22642-22647 (1997).</li>
<li>Theilacker, J. C., White, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+Gases+in+Air+and+Its+Affect+on+Oxygen+Deficiency+Hazard+Abatement%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Diffusion of Gases in Air and Its Affect on Oxygen Deficiency Hazard Abatement.</a> AIP Conference Proceedings. 823, 305-312 (2006).</li>
<li>Chua, B., Kao, R. L., Rannels, D. E., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+degradation+by+anoxia+and+ischemia+in+perfused+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein degradation by anoxia and ischemia in perfused rat hearts.</a> Journal of Biological Chemistry. 254, 6617-6623 (1979).</li>
<li>Probst, G., Riedinger, H. Jr, Martin, P., Engelcke, M., Probst, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Control+of+DNA+Replication+in+Response+to+Hypoxia+and+to+Inhibited+Protein+Synthesis+in+CCRF-CEM+and+HeLa+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast Control of DNA Replication in Response to Hypoxia and to Inhibited Protein Synthesis in CCRF-CEM and HeLa Cells.</a> Biological Chemistry. 380, 1371-1382 (1999).</li>
<li>Semenza, G. L., Sen, C. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSemenza%2C+GL+%22Oxygen+Sensing%22">Oxygen Sensing</a>. 381, Academic Press. (2004).</li>
<li>Chan, K., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxia-Induced+Suspended+Animation+in+Budding+Yeast+as+an+Experimental+Paradigm+for+Studying+Oxygen-Regulated+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Anoxia-Induced Suspended Animation in Budding Yeast as an Experimental Paradigm for Studying Oxygen-Regulated Gene Expression.</a> Eukaryotic Cell. 7, 1795-1808 (2008).</li>
<li>Nystul, T. G., Roth, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+monoxide-induced+suspended+animation+protects+against+hypoxic+damage+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Carbon monoxide-induced suspended animation protects against hypoxic damage in Caenorhabditis elegans.</a> PNAS. 101, 9133-9136 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Niniejsza metoda przedstawia strategię tworzenia środowiska hipoksycznego, która umożliwia utrzymanie w laboratorium precyzyjnych stężeń tlenu. Komory te stanowią prosty sposób na narażenie organizmów na określone niskie stężenia O2 oraz monitorowanie efektów molekularnych i fizjologicznych. Opisana komora środowiskowa jest montowana w laboratorium, a nie kupowana komercyjnie, dzięki czemu może być modyfikowana w celu dostosowania jej do potrzeb eksperymentu.
Wyraźną zaletą tej meto...

<table><tbody><tr><td>Przewody (FEP i PTFE)</td><td>Cole Parmer Tygon</td><td>YO-95821-00 (1/8&quot; FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8&quot; PTFE)&amp;#8217; R-3603</td><td></td></tr><tr><td>Złączki zaciskowe</td><td>Seattle Fluid Systems</td><td>06363-58 (Złączka M. 1/16&quot;) 06363-62 (złączka F 1/16&quot;) 06363-60 (złączka M 1/8&quot;) 06363-61 (złącze F 1/8&quot;)</td><td></td></tr><tr><td>Rura przepływowa</td><td>Aalborg</td><td>PMR3-010073 (3 wyjścia) PMR1-013520 (1 wyjście)</td><td></td></tr><tr><td>Regulator przepływu masowego</td><td>Sierra Instruments</td><td>810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Mass Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)</td><td></td></tr><tr><td>Butla z gazem sprężonym</td><td>AirGas</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe złączki Luer męskie z kolcem do węża</td><td>Cole Parmer</td><td>45505-41 (seria 500 1/16&quot;)</td><td></td></tr><tr><td>Odlewane pudełka akrylowe</td><td>Ellard Instrumentation</td><td>Na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Złączki rur (mosiężne lub ze stali nierdzewnej)</td><td>Seattle Fluid Systems</td><td>B-402-1 (1/4&quot; nakrętka) B-200-3 (1/8&quot; trójnik łączący) B-400-set (1/4&quot; tulejki) B-QM2-B1-200 (korpus QM QC) B-200-1-2 (1/8 x 1/8&quot; złącze męskie)</td><td></td></tr><tr><td>Smar próżniowy Dow Corning</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554</td><td></td></tr><tr><td>pojemnik AnaeroPack</td><td>Mitsubishi Gas Chemical Company</td><td>R684004 (0,4 litra) R685025 (2,5 litra) R685070 (7,0 litrów)</td><td></td></tr><tr><td>butelka zmywająca Pyrex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml)</td><td></td></tr><tr><td>Kwas palmitowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową</td><td>Southern Biotechnology Associates</td><td>1032-05</td><td></td></tr><tr><td>Substrat chemiluminescencyjny SuperSignal West Pico</td><td>Pierce Chemical</td><td>34077</td><td></td></tr><tr><td>szklane szalki krystalizacyjne 100 x 50</td><td>Kimax Kimble</td><td>23000</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na c. elegans

Creating Defined Gaseous Environments to Study the Effects of Hypoxia on C. elegans

Tlen jest niezbędny do przetrwania wszystkich metazoa, z jednym znanym wyjątkiem1. Zmniejszona dostępność O2 (hipoksja) może wystąpić w stanach chorobowych, podczas prawidłowego rozwoju lub w wyniku zmian warunków środowiskowych2-5. Zrozumienie szlaków sygnalizacji komórkowej zaangażowanych w odpowiedź na hipoksję mogłoby dostarczyć nowych informacji na temat strategii leczenia różnych patologii u ludzi, od udaru po nowotwory. Realizacja tego celu była utrudniona, przynajmniej częściowo, przez trudności techniczne związane z kontrolowaną ekspozycją na hipoksję w organizmach modelowych podatnych na modyfikacje genetyczne.
Nematoda Caenorhabditis elegans jest idealnie dopasowanym organizmem modelowym do badania odpowiedzi na hipoksję, ponieważ jest łatwa w hodowli i manipulacjach genetycznych. Ponadto możliwe jest badanie odpowiedzi komórkowych na konkretne stężenia tlenu (O2) w warunkach hipoksji bez efektów zakłócających, ponieważ C. elegans pobiera O2 (oraz inne gazy) drogą dyfuzji, w przeciwieństwie do organizmów posiadających wyspecjalizowany układ oddechowy6. Czynniki znane z udziału w odpowiedzi na hipoksję są konserwatywne u C. elegans. Rzeczywista odpowiedź na hipoksję zależy od konkretnego dostępnego stężenia O2. U C. elegans ekspozycja na umiarkowaną hipoksję wywołuje odpowiedź transkrypcyjną pośredniczoną głównie przez hif-1, silnie konserwatywny czynnik transkrypcyjny indukowany przez hipoksję6-9. Zarodki C. elegans wymagają hif-1 do przetrwania przy stężeniu 5,000-20,000 ppm O27,10. Hipoksja jest ogólnym określeniem na stan „niższego niż normalnie poziomu O2”. Normoksja (normalny poziom O2) również może być trudna do zdefiniowania. Zazwyczaj przyjmuje się, że powietrze pokojowe, zawierające 210,000 ppm O2, stanowi normoksję. Wykazano jednak, że C. elegans wykazuje behawioralną preferencję dla stężeń O2 w zakresie 5-12% (50,000-120,000 ppm O2)11. U larw i osobników dorosłych hif-1 zapobiega indukowanej hipoksją diapauzie przy 5,000 ppm O212. Jednakże hif-1 nie odgrywa roli w odpowiedzi na niższe stężenia O2 (anoksja, definicja operacyjna &lt;10 ppm O2)13. W warunkach anoksji C. elegans wchodzi w odwracalny stan zawieszenia funkcji życiowych, w którym ustaje wszelka aktywność obserwowalna mikroskopowo10. Fakt, że w różnych warunkach występują różne odpowiedzi fizjologiczne, podkreśla znaczenie posiadania eksperymentalnej kontroli nad hipoksycznym stężeniem O2.
W niniejszej pracy przedstawiamy metodę konstrukcji i wdrażania komór środowiskowych, które wytwarzają wiarygodne i powtarzalne warunki hipoksji z określonymi stężeniami O2. Metoda ciągłego przepływu zapewnia szybkie wyrównanie parametrów w komorze i zwiększa stabilność systemu. Ponadto przezroczystość i dostępność komór umożliwiają bezpośrednią wizualizację zwierząt poddanych hipoksji. Prezentujemy również skuteczną metodę szybkiego pobierania próbek C. elegans bezpośrednio po ekspozycji na hipoksję, co jest niezbędne do obserwacji wielu szybko odwracalnych zmian zachodzących w warunkach niedotlenienia10,14. Metoda ta stanowi podstawę, którą można łatwo dostosować do indywidualnych potrzeb laboratoryjnych, w tym do różnych systemów modelowych i różnych rodzajów gazów.

Niniejsza praca szczegółowo opisuje sposób wykorzystania komór hipoksji z przepływem ciągłym do generowania atmosfer o określonych stężeniach O2 w celu zrozumienia reakcji biologicznych na obniżone stężenie O2. System ten jest łatwy w konfiguracji i konserwacji oraz wystarczająco elastyczny, aby dostosować go do szerokiego zakresu stężeń O2 oraz różnych systemów modelowych

Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans

Tlen jest niezbędny do przeżycia wszystkich metazoa, z jednym znanym wyjątkiem1. Zmniejszona dostępność O2 (hipoksja) może wystąpić w stanach chorobowych, ...

Celem następnego eksperymentu jest przygotowanie i utrzymanie komory hipoksji z wykorzystaniem metody przepływu ciągłego. Osiąga się to poprzez pozyskanie i wykonanie niezbędnych rurek, kolb i komór do przeprowadzenia procedury. W drugim kroku należy podłączyć butlę z tlenem i dobrać szybkość przepływu, aby uzyskać pożądany poziom hipoksji.Nawilż gaz, przepuszczając go przez kolbę do bąbelkowania wypełnioną wodą dejonizowaną. Podłącz nawilżony gaz do komory hipoksji i umieść próbki testowe w komorze, aby poddać je warunkom niedotlenienia. Otrzymane wyniki wykazują zależną od Hi F1 letalność zarodkową w warunkach hipoksji na podstawie obserwacji przeżywalności do wieku dorosłego.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak komory rękawicowe, jest łatwość i niski koszt wykonania w warunkach laboratoryjnych, a także zapewnienie dokładnego i powtarzalnego stężenia gazów w komorze środowiskowej. Choć metoda ta pozwala na badanie odpowiedzi na hipoksję u nicienia C. elegance, może ona zostać zaadaptowana do innych układów, w tym większych organizmów modelowych oraz hodowli komórkowych. Dodatkowo może być wykorzystywana do badania innych gazów, w tym dwutlen

creating-defined-gaseous-environments-to-study-effects-hypoxia-on-c

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tworzenie zdefiniowanych środowisk gazowych do badania wpływu niedotlenienia na C. elegans

Opisano tutaj technikę in vivo obrazowania struktur podkomórkowych u zwierząt poddanych anoksji, z wykorzystaniem komory mikroinkubacyjnej z przepływem gazu w połączeniu z konfokalnym mikroskopem z wirującym dyskiem. Metoda ta jest prosta i wystarczająco elastyczna, aby dostosować ją do różnych parametrów eksperymentalnych i systemów modelowych.

Wykorzystanie mikroskopii poklatkowej do wizualizacji anoksji-indukowanego stanu zawieszenia animacji w embrionach C. elegans

Ten film pokazuje metodę testowania niedotlenienia u larw Drosophila poprzez ocenę ich zdolności do kopania i drążenia tuneli. Korzystając z tej techniki, naukowcy mogą odróżnić larwy doświadczające niedoboru tlenu od tych z deficytami rozwojowymi. Przykładowy protokół przedstawia konfigurację tego testu.

Drosophila Test kopania i tunelowania: metoda oceny niedotlenienia tkanek u larw much

Opisano protokół, który wykorzystuje anoksję/głód u C. elegans do modelowania niedokrwienia/reperfuzji. Wyniki funkcjonalne obejmują zwiększoną śmiertelność, widoczne nieprawidłowości w procesach neuronalnych znakowanych GFP oraz upośledzone reakcje behawioralne, które wymagają funkcji neuronalnej.

Model niedokrwienia/reperfuzji beztlenowej u C. elegans

C. elegans jest zwykle uprawiany na solidnych płytkach agarowych lub w płynnych kulturach z wysiewem E. coli. Aby zapobiec zakłóceniom w badaniach toksykologicznych i żywieniowych bakteryjnych produktów ubocznych, wykorzystaliśmy płynne podłoże akseniczne, CeHR, do hodowli i synchronizacji dużej liczby robaków do szeregu dalszych zastosowań.

Hodowla Caenorhabditis elegans w płynnych pożywkach aksenicznych i tworzenie transgenicznych robaków przez bombardowanie mikrocząsteczkami

Tutaj szczegółowo opisujemy protokoły specjalnie zaprojektowane do monitorowania wad morfogenicznych, które występują podczas wczesnych i późnych faz wydłużania się embrionalnego nicienia Caenorhabditis elegans. Ostatecznie protokoły te mają na celu identyfikację genów, które regulują te fazy i scharakteryzowanie ich zróżnicowanych wymagań wzdłuż przednio-tylnej osi zarodka.

Nowe wskaźniki charakteryzujące wydłużenie embrionalne nicieni Caenorhabditis elegans

Wprowadzamy nowatorski system komór hipoksyjnych do użytku z organizmami wodnymi, takimi jak zarodki żab i danio pręgowanych. Nasz system jest prosty, solidny, ekonomiczny i umożliwia indukcję i utrzymanie hipoksji in vivo i do 48 godzin. Przedstawiamy 2 powtarzalne metody monitorowania skuteczności hipoksji.

Indukcja niedotlenienia w żywych zarodkach żab i danio pręgowanego

Protokół opisuje prosty test do identyfikacji larw Drosophila melanogaster, które doświadczają niedotlenienia przy normalnym poziomie tlenu w atmosferze. Protokół ten pozwala odróżnić niedotlenione larwy od innych mutantów, które wykazują nakładające się fenotypy, takie jak powolność lub powolny wzrost.

Test kopania/tunelowania w celu wykrycia niedotlenienia u larw Drosophila melanogaster

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Trans- i wielopokoleniowe skutki trwałych chemikaliów są niezbędne do oceny ich długoterminowych konsekwencji dla środowiska i zdrowia ludzkiego. Udostępniamy nowatorskie szczegółowe metody badania efektów trans- i wielopokoleniowych z wykorzystaniem wolno żyjących nicieni Caenorhabditis elegans.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans do badania trans- i wielopokoleniowych skutków substancji toksycznych

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę ciągłego przepływu do tworzenia zdefiniowanych warunków hipoksji w komorze badawczej. Technika ta umożliwia precyzyjną kontrolę stężenia tlenu w badaniach z użyciem C. elegans.

Tworzenie określonych środowisk gazowych w celu badania wpływu hipoksji na C. elegans

Przeglądaj więcej filmów