Name: In vitro Analiza makromolekularnych kompleksów sygnalizacyjnych CFTR zależnych od PDZ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metodę in vitro do montażu makromolekularnych kompleksów sygnalizacyjnych CFTR zależnych od PDZ. Technika umożliwia bezpośrednią detekcję i wizualizację formowania się złożonych białkowych struktur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Nasza praca była wspierana przez granty z American Heart Association (Greater Southeast Affiliate) Beginning-grant-in-aid 0765185B, grant badawczy Elsa U. Pardee Foundation, wewnętrzne fundusze startowe Wayne State University oraz nagrodę Isis Initiative z Cardiovascular Research Institute. Ta metoda składania makromolekularnego kompleksu CFTR in vitro została pierwotnie opracowana przez dr. A.P. Narena (University of Tennessee Health Science Center).

1. Ekspresja i oczyszczanie rekombinowanych białek fuzyjnych z przyłączoną etykietą w bakteriach
<ol>
	<li>Wzmocnić określone regiony końcówek C (ostatnie 50-100 aminokwasów zawierające motywy PDZ na końcu C-terminalnym) dla CFTR, LPA2, MRP2, MRP4, β2AR oraz NHERF (pełnej długości lub domen PDZ1 lub PDZ2) za pomocą metody PCR.</li>
	<li>Sklonować produkty PCR do wektora pGEX4T-1 dla białek fuzji z GST (takich jak GST-NHERF, GST-MRP4 CT), wektora pMAL-C2 dla białek fuzji z MBP (takich jak MBP-β2AR CT, MBP-CFTR CT) oraz pET30 dla białek fuzji z His-S (takich jak His-S-CFTR CT, His-S-PDZK1).</li>
	<li>Przeprowadzić transformację w szczepie E. coli pozbawionym proteaz (BL21-DE3), aby zminimalizować możliwą degradację rekombinowanego białka.</li>
	<li>Hodować kulturę przez noc w temperaturze 37 °C w medium Luria-Bertani (pH 7.0) zawierającym odpowiednie antybiotyki (takie jak ampicylina lub kanamycyna). Rozcieńczyć kulturę nocną w stosunku 1:10 i hodować przez kolejne 2 hr w temperaturze 37 °C. Indukować 0,5-1 mM IPTG przez następne 4 hr w temperaturze 30 °C. Osadzić komórki poprzez wirowanie przy 8 000 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zlizować komórki w buforze sacharozowym (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF i 10% sacharozy) zawierającym lizozym (1 mg/ml), 0,2% Triton X-100 oraz inhibitory proteaz. Użyć 20 ml na osad komórkowy pochodzący z 1 L kultury.</li>
	<li>Mieszać na wstrząsarce rotacyjnej przez 30 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wirować przy 20 000 × g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Zebrać klarowny supernatant.</li>
	<li>Do klarownego supernatantu dodać 1 ml następujących kulek żywicznych/agarozowych (50% zawiesina w buforze sacharozowym):
	<ul>
		<li>kulki agarozowe z glutationem dla białek fuzji GST.</li>
		<li>kulki Talon dla białek fuzji His-S.</li>
		<li>żywicę amylozową dla białek fuzji MBP.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Mieszać przez 4 hr w temperaturze 4 °C na wstrząsarce rotacyjnej.</li>
	<li>Przemyć kulki, resuspendując je w 1x PBS (15 ml), mieszając przez 2 min, wirowaniu przy 800 × g przez 2 min i odrzucając supernatant. Powtórzyć ten krok 6 razy.</li>
	<li>Eluować białko z kulek, używając odpowiedniego buforu do elucji (2 ml buforu do elucji na 1 ml kulek).
	<ul>
		<li>Bufor do elucji dla białek fuzji GST: 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 140 mM NaCl i 20 mM zredukowanego glutationu.</li>
		<li>Bufor do elucji dla białek fuzji His: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl i 200 mM imidazolu.</li>
		<li>Bufor do elucji dla białek fuzji MBP: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT i 10 mM maltozy.</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Dializować eluoowane białka przeciwko 2 L 1x PBS w temperaturze 4 °C (aby uniknąć możliwej degradacji białek). Wymieniać PBS co 4 hr przez 4 razy. Skoncentrować białko za pomocą filtra Centricon (odcięcie 10 000 MW, Millipore) i przechowywać w małych alikwotach w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Wyznaczyć stężenie białka metodą Bradforda. Ocenić jakość białka za pomocą SDS-PAGE, używając BSA jako wzorca. Jeśli integralność białka jest niesatysfakcjonująca, można zastosować wtórne procedury oczyszczania, takie jak filtracja żelowa lub wymiana jonowa (np. użyliśmy kolumny G-75 Sepharose do dalszego oczyszczania białka fuzji GST).</li>
</ol>
2. Hodowla komórek i przygotowanie lizatu komórkowego
<ol>
	<li>Hodować komórki nerki młodych chomików (BHK) stabilnie nadekspresujące CFTR-wt i CFTR-his10 lub komórki BHK przejściowo nadekspresujące Flag-LPA2-wt lub Flag-LPA2-ΔSTL, a także komórki nerki psa Madin-Darby (MDCK) stabilnie nadekspresujące MRP2 w minimalnym podłożu niezbędnym Eagle'a (MEM) zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej oraz penicylinę/streptomycynę w kolbach polistyrenowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Hodować ludzkie komórki embrionalne nerki 293 (HEK293) stabilnie nadekspresujące CFTR-wt i CFTR-his10 w modyfikowanym podłożu Eagle'a według Dulbecco (DMEM) uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz penicylinę/streptomycynę w kolbach polistyrenowych w temperaturze 37 °C przy 5% CO2.</li>
	<li>Lizować komórki w buforze do lizy (PBS – 0,2% Triton-X-100 uzupełniony mieszaniną inhibitorów proteaz zawierającą 1 mM fluorek fenylometylosulfonylowy, 1 μg/ml aprotyniny, 1 μg/ml leupeptyny, 1 μg/ml pepstatyny); użyć 500 μl buforu do lizy na każdą płytkę Petriego o średnicy 60 mm oraz 1000 μl buforu do lizy na każdą płytkę Petriego o średnicy 100 mm.</li>
	<li>Wstrząsać lizatami komórkowymi przez 20 min w 4 °C, a następnie usunąć materiał nierozpuszczalny poprzez wirowanie przy 16 000 × g przez 15 min w 4 °C. Określić stężenie białka za pomocą metody Bradforda.</li>
</ol>
3. Montaż makromolekularnego kompleksu zawierającego CFTR (CFTR-PDZK1-MRP4) in vitro
<ol>
	<li>Do 200 μl buforu do lizy (PBS – 0,2% Triton-X 100 + inhibitory proteaz), dodać 20 μg oczyszczone białko fuzyjne GST-MRP4-końcówka C 50 a.a. (CT50).</li>
	<li>Dodaj różne ilości (0-40 μg) oczyszczonego białka fuzyjnego His-S-PDZK1.</li>
	<li>Wymieszaj oba białka na mieszalniku rotacyjnym przy 22 °C przez 1–2 h.</li>
	<li>Dodaj 20 μl kulki z glutationem (zawiesina 50%) do mieszaniny białek i kontynuuj mieszanie przez kolejną 1 godzinę. Krok ten nazywany jest również wiązaniem parowym.</li>
	<li>W tym czasie należy przygotować lizaty komórek HEK293 wykazujących nadekspresję Flag-CFTR (wt), zgodnie z opisem w kroku 2).</li>
	<li>Przemyj kompleks dwukrotnie buforem lizującym. Wirować przy 800 × g przez 1 min podczas każdego płukania, a po każdym płukaniu ostrożnie odessać nadsącz. Należy zachować ostrożność, aby nie odessać kulek znajdujących się na dnie.</li>
	<li>Dodaj przygotowane wcześniej lizaty komórek HEK293 do kulek i delikatnie wymieszaj w 4 °C przez 3 h (lub przez noc).</li>
	<li>Kuleczki należy dokładnie przemyć 3 razy buforem lizującym, zgodnie z opisem w kroku 3.6).</li>
	<li>Eluuj białka za pomocą 30 μl Bufor do próbek (5×): 0,6 M Tris-HCl (pH 6,8), 50% glicerolu, 2% SDS i 0,1% błękitu bromofenolowego; zawierający 5% β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Inkubować w 37 °C kąpiel wodna przez 10–15 min, a następnie wirowanie przy 5 000 × g przez 30 s, aby wytrącić kuleczki.</li>
	<li>Nałóż cały eluat na żel 4-15%.</li>
	<li>Przeprowadź elektroforezę SDS-PAGE przez około 30–40 min.</li>
	<li>Przenieś prążki białkowe na membranę PVDF przez 1,5 h.</li>
	<li>Zablokować membranę w buforze TBS-Tween zawierającym 5% odtłuszczonego mleka.</li>
	<li>Inkubować membranę z przeciwciałem pierwszorzędowym (np. anty-CFTR IgG, R1104) w 4 °Cprzez noc.</li>
	<li>Przemyj membranę roztworem TBS-Tween przez 5 min, powtarzając tę czynność 6 razy.</li>
	<li>Inkubować membranę z przeciwciałem wtórnym (takim jak przeciwciało kozie anty-mysie sprzężone z HRP 2nd przeciwciało) przez 45 min w 22 °C.</li>
	<li>Przemyj membranę roztworem TBS-Tween przez 5 min, powtórzone 6 razy.</li>
	<li>Wizualizuj prążki białkowe za pomocą ECL.</li>
	<li>Reprezentatywne dane przedstawiono na Rysunek 1.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Przykład makromolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego zawierającego CFTR, który został zmontowany in vitro, przedstawiono na Rysunku 1. Kompleks makromolekularny utworzył się pomiędzy 50 aminokwasami końca C-końcowego MRP4 (MRP4-CT50), PDZK1 a pełnowymiarowym białkiem CFTR (Rysunek 1, dół). Formowanie kompleksu wzrastało w sposób zależny od dawki wraz ze zwiększaniem ilości białka pośredniczącego, PDZK1 (Rysunek 1, dół)18.
<img alt="Interakcja Flag-CFTR; analiza diagramu i blotu; kompleks makromolekularny; gradient His-PDZK1." src="/files/ftp_upload/4091/4091fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczny przedstawienie testu kompleksu makromolekularnego (góra). Kompleks makromolekularny wykryto in vitro z udziałem trzech białek (GST-MRP4-CT50, His-S-PDZK1 oraz Flag-CFTRwt) w sposób zależny od dawki (dół)18.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>CFTR-NHERF1-β2AR (ref.14)</td>
			<td>CFTR-NHERF2-LPA2 (ref. 15)</td>
			<td>Białka CFTR-PDZ-MRP2 (ref. 17)</td>
			<td>CFTR-PDZK1-MRP4 (ref. 16)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kuleczki powinowactwa</td>
			<td>Żywica amylozowa</td>
			<td>agaroza z białkiem S</td>
			<td>Żywica amylozowa</td>
			<td>Agaroza z glutationem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczone białko-1</td>
			<td>MBP-β2CT AR</td>
			<td>His-S-CFTR CT</td>
			<td>CT MBP-CFTR</td>
			<td>GST-MRP4 CT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczone białko-2</td>
			<td>GST-NHERF1</td>
			<td>GST-NHERF2</td>
			<td>białka GST-PDZ</td>
			<td>His-S-PDZK1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczone białko-3 (lub lizaty komórkowe)</td>
			<td>CFTR-wt lub CFTR-his10 (lizaty komórek BHK lub HEK)</td>
			<td>Flag-LPA2-wt lub Flag-LPA2-ΔSTL (lizaty komórek BHK)</td>
			<td>MRP2 (lizaty komórek MDCK)</td>
			<td>Oczyszczone białko Flag-CFTR-wt lub CFTR-his10 (lub lizatów komórkowych)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Przeciwciało</td>
			<td>anty-CFTR IgG</td>
			<td>anty-Flag HRP</td>
			<td>Przeciwciała IgG przeciwko MRP2</td>
			<td>anty-Flag HRP</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Podsumowanie różnych kompleksów makromolekularnych zawierających CFTR, zmontowanych in vitro.

<ol><li>Anderson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+that+CFTR+is+a+chloride+channel+by+alteration+of+its+anion+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Demonstration that CFTR is a chloride channel by alteration of its anion selectivity.</a> Science. 253, 202-205 (1991).</li>
<li>Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR.</a> Cell. 68, 809-818 (1992).</li>
<li>Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloride+impermeability+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chloride impermeability in cystic fibrosis.</a> Nature. 301, 421-422 (1983).</li>
<li>Cheng, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+intracellular+transport+and+processing+of+CFTR+is+the+molecular+basis+of+most+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Defective intracellular transport and processing of CFTR is the molecular basis of most cystic fibrosis.</a> Cell. 63, 827-834 (1990).</li>
<li>Gabriel, S. E., Brigman, K. N., Koller, B. H., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+heterozygote+resistance+to+cholera+toxin+in+the+cystic+fibrosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis heterozygote resistance to cholera toxin in the cystic fibrosis mouse model.</a> Science. 266, 107-109 (1994).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+chloride+channel+in+the+apical+compartments%3A+spatiotemporal+coupling+to+its+interacting+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">CFTR chloride channel in the apical compartments: spatiotemporal coupling to its interacting partners.</a> Integr. Biol (Camb). 2, 161-177 (2010).</li>
<li>Chao, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+intestinal+CFTR+Cl-+channel+by+heat-stable+enterotoxin+and+guanylin+via+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Activation of intestinal CFTR Cl- channel by heat-stable enterotoxin and guanylin via cAMP-dependent protein kinase.</a> Embo. J. 13, 1065-1072 (1994).</li>
<li>Gabriel, S. E., Clarke, L. L., Boucher, R. C., Stutts, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+and+outward+rectifying+chloride+channels+are+distinct+proteins+with+a+regulatory+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CFTR and outward rectifying chloride channels are distinct proteins with a regulatory relationship.</a> Nature. 363, 263-268 (1993).</li>
<li>McNicholas, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+a+renal+K%2B+channel+%28ROMK2%29+to+the+inhibitory+sulfonylurea+compound+glibenclamide+is+enhanced+by+coexpression+with+the+ATP-binding+cassette+transporter+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of a renal K+ channel (ROMK2) to the inhibitory sulfonylurea compound glibenclamide is enhanced by coexpression with the ATP-binding cassette transporter cystic fibrosis transmembrane regulator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 8083-8088 (1996).</li>
<li>Schreiber, R., Nitschke, R., Greger, R., Kunzelmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+activates+aquaporin+3+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator activates aquaporin 3 in airway epithelial cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 11811-11816 (1999).</li>
<li>Shumaker, H., Amlal, H., Frizzell, R., Ulrich, C. D. 2nd, Soleimani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+drives+Na%2B-nHCO-3+cotransport+in+pancreatic+duct+cells%3A+a+basis+for+defective+HCO-3+secretion+in+CF%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">CFTR drives Na+-nHCO-3 cotransport in pancreatic duct cells: a basis for defective HCO-3 secretion in CF.</a> Am. J. Physiol. 276, 16-25 (1999).</li>
<li>Ahn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interaction+between+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+and+HCO3-+salvage+mechanisms+in+model+systems+and+the+mouse+pancreatic+duct%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulatory interaction between the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator and HCO3- salvage mechanisms in model systems and the mouse pancreatic duct.</a> J. Biol. Chem. 276, 17236-17243 (2001).</li>
<li>Sugita, M., Yue, Y., Foskett, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+Cl-+channel+and+CFTR-associated+ATP+channel%3A+distinct+pores+regulated+by+common+gates%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">CFTR Cl- channel and CFTR-associated ATP channel: distinct pores regulated by common gates.</a> Embo. J. 17, 898-908 (1998).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CFTR+chloride+channels+by+syntaxin+and+Munc18+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of CFTR chloride channels by syntaxin and Munc18 isoforms.</a> Nature. 390, 302-305 (1997).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syntaxin+1A+is+expressed+in+airway+epithelial+cells%2C+where+it+modulates+CFTR+Cl%28-%29+currents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Syntaxin 1A is expressed in airway epithelial cells, where it modulates CFTR Cl(-) currents.</a> J. Clin. Invest. 105, 377-386 (2000).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+macromolecular+complex+of+beta+2+adrenergic+receptor%2C+CFTR%2C+and+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin-binding+phosphoprotein+50+is+regulated+by+PKA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A macromolecular complex of beta 2 adrenergic receptor, CFTR, and ezrin/radixin/moesin-binding phosphoprotein 50 is regulated by PKA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 342-346 (1073).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+inhibits+cholera+toxin-induced+secretory+diarrhea+through+CFTR-dependent+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid inhibits cholera toxin-induced secretory diarrhea through CFTR-dependent protein interactions.</a> J. Exp. Med. 202, 975-986 (2005).</li>
<li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+coupling+of+cAMP+transporter+to+CFTR+chloride+channel+function+in+the+gut+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal coupling of cAMP transporter to CFTR chloride channel function in the gut epithelia.</a> Cell. 131, 940-951 (2007).</li>
<li>Li, C., Schuetz, J. D., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+carcinogen+NNK+transporter+MRP2+regulates+CFTR+function+in+lung+epithelia%3A+implications+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Tobacco carcinogen NNK transporter MRP2 regulates CFTR function in lung epithelia: implications for lung cancer.</a> Cancer Lett. 292, 246-253 (2010).</li>
<li>Hall, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C-terminal+motif+found+in+the+beta2-adrenergic+receptor%2C+P2Y1+receptor+and+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+determines+binding+to+the+Na%2B%2FH%2B+exchanger+regulatory+factor+family+of+PDZ+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A C-terminal motif found in the beta2-adrenergic receptor, P2Y1 receptor and cystic fibrosis transmembrane conductance regulator determines binding to the Na+/H+ exchanger regulatory factor family of PDZ proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 8496-8501 (1998).</li>
<li>Short, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apical+PDZ+protein+anchors+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An apical PDZ protein anchors the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator to the cytoskeleton.</a> J. Biol. Chem. 273, 19797-19801 (1998).</li>
<li>Wang, S., Yue, H., Derin, R. B., Guggino, W. B., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessory+protein+facilitated+CFTR-CFTR+interaction%2C+a+molecular+mechanism+to+potentiate+the+chloride+channel+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accessory protein facilitated CFTR-CFTR interaction, a molecular mechanism to potentiate the chloride channel activity.</a> Cell. 103, 169-179 (2000).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3KARP+mediates+the+association+of+ezrin+and+protein+kinase+A+with+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+airway+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">E3KARP mediates the association of ezrin and protein kinase A with the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in airway cells.</a> J. Biol. Chem. 275, 29539-29546 (2000).</li>
<li>Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Golgi-associated+PDZ+domain+protein+modulates+cystic+fibrosis+transmembrane+regulator+plasma+membrane+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Golgi-associated PDZ domain protein modulates cystic fibrosis transmembrane regulator plasma membrane expression.</a> J. Biol. Chem. 277, 3520-3529 (1074).</li>
<li>Scott, R. O., Thelin, W. R., Milgram, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+PDZ+protein+regulates+the+activity+of+guanylyl+cyclase+C%2C+the+heat-stable+enterotoxin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">A novel PDZ protein regulates the activity of guanylyl cyclase C, the heat-stable enterotoxin receptor.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 22934-22941 (1074).</li>
<li>Lee, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+by+competitive+interactions+of+molecular+adaptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator by competitive interactions of molecular adaptors.</a> The Journal of biological chemistry. 282, 10414-10422 (2007).</li>
<li>Gee, H. Y., Noh, S. H., Tang, B. L., Kim, K. H., Lee, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+DeltaF508-CFTR+trafficking+via+a+GRASP-dependent+unconventional+secretion+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rescue of DeltaF508-CFTR trafficking via a GRASP-dependent unconventional secretion pathway.</a> Cell. 146, 746-760 (2011).</li>
<li>Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+intermolecular+and+intramolecular+interactions+regulating+CFTR+function%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of intermolecular and intramolecular interactions regulating CFTR function.</a> Met. Molecul. Med. 70, 175-186 (2002).</li>
<li>Li, C., Roy, K., Dandridge, K., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+assembly+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular assembly of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in plasma membrane.</a> The Journal of biological chemistry. 279, 24673-24684 (2004).</li>
<li>Li, C., Naren, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+CFTR+Interactome+in+the+Macromolecular+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of CFTR Interactome in the Macromolecular Complexes.</a> Met. Molecul. Med. 741, 255-270 (2011).</li>
<li>Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine+receptor+CXCR2+macromolecular+complex+regulates+neutrophil+functions+in+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A chemokine receptor CXCR2 macromolecular complex regulates neutrophil functions in inflammatory diseases.</a> J. Biol. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym protokole zaprezentowano metodę składania in vitro oraz detekcji makromolekularnego kompleksu sygnalizacyjnego zawierającego białko CFTR, z wykorzystaniem oczyszczonych białek (lub fragmentów białek) i/lub lizatów komórkowych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami16-19,29,30. Aby uzyskać najlepsze wyniki, podczas procesu przygotowania szczególną uwagę należy zwrócić na następujące krytyczne punkty:
<ul>
	<li>Podczas oczyszczania białka fuzyjnego GST zgodnie z opisem w kroku 1), ważne...

<table><tbody><tr><td>wektor pGEX4T-1</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9545-49</td><td>dawniej Amersham Biosciences</td></tr><tr><td>wektor pMAL-C2</td><td>New England BioLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>wektor pET30</td><td>EMD Chemicals</td><td>69077-3</td><td>dawniej Novagen</td></tr><tr><td>Kuleczki agarozowe z glutationem</td><td>BD Biosciences</td><td>554780</td><td></td></tr><tr><td>Żywica amylozowa</td><td>New England BioLabs</td><td>E8021S</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki Talon</td><td>Clontech</td><td>635501</td><td></td></tr><tr><td>zredukowany glutation</td><td>BD Biosciences</td><td>554782</td><td></td></tr><tr><td>imidazol</td><td>Fisher</td><td>BP305-50</td><td></td></tr><tr><td>maltoza</td><td>Fisher</td><td>BP684-500</td><td></td></tr><tr><td>agaroza z białkiem S</td><td>EMD Chemicals</td><td>69704-3</td><td>dawniej Novagen</td></tr><tr><td>anty-Flag HRP</td><td>Sigma</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała anty-CFTR IgG</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td>R1104</td><td>przeciwciało monoklonalne (mAb) rozpoznające epitop CFTR w obrębie aminokwasów 722-734</td></tr><tr><td>Przeciwciała IgG przeciwko MRP2</td><td>Chemicon International</td><td>MAB4148</td><td>Obecnie część firmy Millipore</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę dostarczyć tekst źródłowy do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy do przetłumaczenia materiałów na język polski zgodnie z Twoimi wytycznymi dotyczącymi rejestru akademickiego, precyzji terminologicznej i naturalnego stylu protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

in vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych cftr zależnych od domen pdz

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), kanał chlorkowy zlokalizowany głównie w błonach apikalnych komórek nabłonkowych, odgrywa kluczową rolę w transepitelialnej homeostazie płynów1-3. CFTR jest powiązany z dwiema głównymi chorobami: mukowiscydozą (CF)4 oraz biegunką wydzielniczą5. W mukowiscydozie synteza lub aktywność funkcjonalna kanału Cl- CFTR jest obniżona. Zaburzenie to dotyczy około 1 na 2 500 osób rasy białej w Stanach Zjednoczonych6. Nadmierna aktywność CFTR jest również powiązana z przypadkami toksycznie indukowanej biegunki wydzielniczej (np. wywołanej przez toksynę choleryczną i ciepłostabilną enterotoksynę E. coli), która stymuluje produkcję cAMP lub cGMP w jelitach7.
Narastające dowody sugerują istnienie interakcji fizycznych i funkcjonalnych między CFTR a coraz większą liczbą innych białek, w tym transporterami, kanałami jonowymi, receptorami, kinazami, fosfatazami, cząsteczkami sygnałowymi i elementami cytoszkieletu, a wykazano, że interakcje te między CFTR a białkami wiążącymi odgrywają kluczową rolę w regulacji zależnego od CFTR transepitelowego transportu jonów in vitro oraz in vivo8-19. W niniejszym protokole skupiamy się wyłącznie na metodach pomocnych w badaniu interakcji między karboksylowym końcem ogona CFTR, który posiada motyw wiążący białka [określany jako motyw PSD95/Dlg1/ZO-1 (PDZ)], a grupą białek rusztowaniowych zawierających specyficzny moduł wiążący określany jako domeny PDZ. Do tej pory opisano kilka różnych białek rusztowaniowych PDZ, które wiążą się z końcem karboksylowym CFTR z różnym powinowactwem, takich jak NHERF1, NHERF2, PDZK1, PDZK2, CAL (ligand związany z CFTR), Shank2 i GRASP20-27. Motyw PDZ w obrębie CFTR rozpoznawany przez białka rusztowaniowe PDZ to cztery ostatnie aminokwasy na końcu C (tj., 1477-DTRL-1480 w ludzkim CFTR)20. Co ciekawe, CFTR może wiązać więcej niż jedną domenę PDZ zarówno NHERF-ów, jak i PDZK1, choć z różnym powinowactwem22. Wykazano, że ta wielowartościowość w odniesieniu do wiązania CFTR ma znaczenie funkcjonalne, co sugeruje, że białka rusztowaniowe PDZ mogą ułatwiać tworzenie makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR w celu zapewnienia specyficznego/selektywnego i wydajnego sygnalizowania w komórkach16-18.
Opracowano wiele analiz biochemicznych do badania oddziaływań białkowych z udziałem CFTR, takich jak ko-immunoprecypitacja, test pull-down, analiza wiązania par białek, kolorymetryczna analiza wiązania par białek oraz analiza montażu kompleksów makromolekularnych16-19,28,29. W niniejszym opracowaniu skupiamy się na szczegółowych procedurach składania in vitro kompleksu makromolekularnego zawierającego CFTR, zależnego od motywu PDZ, który jest szeroko wykorzystywany w naszym laboratorium do badania oddziaływań białko-białko lub domena-domena z udziałem CFTR16-19,28,29.

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący kanałem chlorkowym zlokalizowanym głównie w błonach apikalnych komórek nabłonkowych, odgrywa...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest in vitro złożenie makromolekularnego kompleksu sygnałowego regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), zależnego od domeny PDZ. W tym celu rekombinowane białka fuzyjne z tagiem są ekspresowane w bakteriach, a następnie oczyszczone. Następnie uzyskuje się lizaty komórkowe z kultur wykazujących ekspresję CFTR lub białek wiążących CFTR.Następnie białka CFTR i białka wiążące są łączone in vitro w celu złożenia makromolekularnego kompleksu sygnałowego zawierającego CFTR. Przeprowadzany jest następnie western blotting, który wykazuje tworzenie się makromolekularnych kompleksów CFTR i jest on następnie oceniany za pomocą tej metody. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość bezpośredniego wykrycia i wizualizacji tworzenia się pojedynczego białkowego kompleksu makromolekularnego zawierającego CFTR.Zatem metoda ta może dostarczyć informacji na temat powstawania kompleksu makromolekularnego zawierającego CT R. Można ją również zastosować przy składaniu kompleksów niebiałkowych niewiążących CFTR, takich jak makromolekularny kompleks sygnalizacyjny sex C two. Niedawno, stosując tę samą metodę, wyk

in-vitro-analysis-pdz-dependent-cftr-macromolecular-signaling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vitro Analiza kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od PDZ

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Aby przetestować interakcję białka z jego docelowym lipidem, zastosowano system MACS oraz kule magnetyczne skoniugowane z Aneksyną V oraz pęcherzyki lipidowe zsyntetyzowane z lipidu docelowego i fosfatydyloseryny wiążącej Aneksynę V. Białka związane z lipidem docelowym są współoczyszczane i analizowane po elucji z kulek.

Chromatografia powinowactwa oparta na pęcherzykach lipidowych z wykorzystaniem magnetycznego sortowania komórek (LIMACS): nowatorska metoda analizy oddziaływań białko-lipid

Opisano wydajną procedurę oceny tendencji do oligomeryzacji pojedynczych domen transbłonowych (TMD). Białka chimeryczne, składające się z TMD połączonej z ToxR, są eksprymowane w szczepie reporterowym E. coli. Indukowana przez TMD oligomeryzacja powoduje dimeryzację ToxR, aktywację transkrypcji i produkcję białka reporterowego, -galaktozydazy.

Wyznaczanie skłonności do oligomeryzacji domeny transbłonowej za pomocą testu ToxR

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj opisujemy protokół dla ogólnej metody pościgu za impulsami, która pozwala na analizę kinetyczną fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach.

Analiza fałdowania, transportu i degradacji białek w żywych komórkach za pomocą pościgu impulsów radioaktywnych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę in vitro do montażu makromolekularnych kompleksów sygnalizacyjnych CFTR zależnych od PDZ. Technika umożliwia bezpośrednią detekcję i wizualizację formowania się złożonych białkowych struktur.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Przeglądaj więcej filmów