In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Ogólnym celem niniejszej procedury jest in vitro złożenie makromolekularnego kompleksu sygnałowego regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), zależnego od domeny PDZ. W tym celu rekombinowane białka fuzyjne z tagiem są ekspresowane w bakteriach, a następnie oczyszczone. Następnie uzyskuje się lizaty komórkowe z kultur wykazujących ekspresję CFTR lub białek wiążących CFTR.

Następnie białka CFTR i białka wiążące są łączone in vitro w celu złożenia makromolekularnego kompleksu sygnałowego zawierającego CFTR. Przeprowadzany jest następnie western blotting, który wykazuje tworzenie się makromolekularnych kompleksów CFTR i jest on następnie oceniany za pomocą tej metody. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość bezpośredniego wykrycia i wizualizacji tworzenia się pojedynczego białkowego kompleksu makromolekularnego zawierającego CFTR.

Zatem metoda ta może dostarczyć informacji na temat powstawania kompleksu makromolekularnego zawierającego CT R. Można ją również zastosować przy składaniu kompleksów niebiałkowych niewiążących CFTR, takich jak makromolekularny kompleks sygnalizacyjny sex C two. Niedawno, stosując tę samą metodę, wykazaliśmy, że nasz chemoreceptor CXCR two fizycznie tworzy kompleks białkowy z efektorem downstream.

Badanie interakcji białka PRC beta 3 z białkiem wild nerve 1 w neutrofilach przy użyciu PCR. Należy przeprowadzić amplifikację DNA kodującego ostatnie 50 do 100 aminokwasów zawierających motywy PDZ na koniec C. Dotyczy to transportera cAMP, MRP 4 oraz domeny PDZ 1 czynnika regulacyjnego wymiennika sodowo-wodorowego (N-H-E-R-F).

Następnie należy sklonować produkty PCR dla RP4 do wektora pGEX-4T-1 w celu wytworzenia białek fuzyjnych GST oraz domenę PDZ1 białka NHERF do wektora pET-30. Aby wytworzyć białka fuzyjne z His-tagiem, należy przeprowadzić transformację bakterii metodą szoku termicznego. Kulturę w szczepie E. coli pozbawionym proteaz należy hodować przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze z wytrząsaniem, w 50 mL pożywki LB zawierającej odpowiednie antybiotyki dla danego wektora, z zastosowaniem pożywki SOC.

Następnego dnia rozcieńczyć kulturę w stosunku 1:10 w 500 mililitrach pożywki Luria-Bertani, następnie ponownie inkubować kulturę z wstrząsaniem w temperaturze 37 °C. Po dwóch godzinach indukowano transkrypcję białka rekombinowanego przy użyciu 0,5 do 1 milimola IPTG przez cztery godziny w temperaturze 30 °C.

Po inkubacji przenieść hodowle do probówek wirówkowych o pojemności 250 ml i odwirować komórki z prędkością 8 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu odlać nadsącz i dodać 20 ml buforu sacharozowego zawierającego lizozym w stężeniu 1 mg/ml, 0,2% Triton X 100 oraz inhibitory proteaz w celu lizy komórek, a następnie przenieść zawiesinę bakteryjną do czystej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.

Mieszaj na wytrząsarce rotacyjnej przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Następnie wiruj z prędkością 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu nadnadział będzie klarowny, a na dnie probówki znajdzie się nierozpuszczalny pellet APP.

Przenieś przejrzysty nadsącz do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Następnie do nadsączu dodaj jeden mililitr odpowiedniej żywicy. Aero beads w formie 50% zawiesiny w buforze sacharozowym z glutationem.

Do białek fuzyjnych GST należy używać kulek Aero, a do białek fuzyjnych HisS – kulek Talon. Mieszano przez cztery godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce rotacyjnej. Następnie kulki wirowano przy 800 ×g przez dwie minuty.

Następnie należy je przemyć, zawieszając w 15 mililitrach PBS i mieszając na rotatorze przez dwie minuty. Na koniec odlej nadsącz. Powtórz ten krok sześć razy po szóstym przemyciu.

Aby wyeluować białko z kulek, należy dodać dwa mililitry odpowiedniego buforu elucyjnego na każdy jeden mililitr kulek i mieszać przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Całe wyeluowane białko wraz z kulkami przelać do kolumny i zebrać filtrat jako wyeluowane białko. Następnie przenieść białko UD do tuby dializacyjnej.

Dializować eluowane białka przeciwko dwóm litrom PBS, mieszając w temperaturze czterech stopni Celsiusza. Wymieniać PBS co cztery godziny, powtarzając ten proces cztery razy po dializie. Skoncentrować białko do objętości od 0,5 do jednego mililitra.

Używając filtra odśrodkowego z progiem odcięcia 10 000 Da, podziel próbkę na aliquoty po 200 µL każda. Jedną porcję zachowaj do analizy, a pozostałe przechowuj w temperaturze -80 °C.

Wyznacz stężenie białka metodą Bradforda. Oceń jakość białka za pomocą elektroforezy SDS-PAGE, wykorzystując standardy BSAS. Jeśli integralność białka będzie niesatysfakcjonująca, można zastosować wtórne procedury oczyszczania, takie jak filtracja żelowa lub wymiana jonowa.

Komórki HEK 293 exprimujące CFTR typu dzikiego z tagiem flag należy hodować zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Usunąć medium z komórek i przemyć je PBS. Następnie, aby przeprowadzić lizę komórek, dodać 500 µL buforu do lizy do każdej 60 mm szalki hodowlanej i inkubować lizaty komórkowe w ruchu kołyszącym przez 20 minut w temperaturze 4 °C.

Przenieś lizaty do nowych probówek do mikrocentryfugi. Następnie, aby usunąć białka nierozpuszczalne, odwiruj próbki przy 16 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zbierz nadsączniki. Wyznacz stężenie białka metodą Bradforda w celu złożenia makromolekularnych kompleksów zawierających CFTR in vitro.

Zacznij od połączenia 20 µg oczyszczonego białka fuzyjnego G-S-T-M-R-P four C terminal 50 amino acid oraz zwiększających się ilości oczyszczonego białka fuzyjnego hiss S PD zk one w zakresie od 0 do 40 µg w 200 µL buforu do lizy w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Mieszaj oba białka na mieszalniku obrotowym w temperaturze 22 °C przez jedną do dwóch godzin. Następnie dodaj 20 µL 50% zawiesiny kulek z glutationem do mieszaniny białek i kontynuuj mieszanie przez kolejną jedną godzinę.

Ten etap określa się również jako wiązanie parzyste, podczas którego G-S-T-M-R-P four CT 50 wiąże się z SPD zk one. W tym czasie należy przygotować lizaty komórek HEK 2 93 nadmiernie ekspresujących flag CFTR typu dzikiego, zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji filmu, po etapie wiązania parzystego. Kompleks należy przemyć dwukrotnie buforem do lizy, wirując przy 800 ×g przez jedną minutę podczas każdego przemycia, a po każdym etapie ostrożnie odessać nadsącz.

Należy zachować ostrożność, aby nie odessać kulek z dna. Dodać lizaty komórkowe HT K 2 93 do kulek i delikatnie mieszać na mieszalniku rotacyjnym w temperaturze four degree Celsius przez trzy godziny lub przez noc po inkubacji. Przemyć kulki trzy razy buforem do lizy, przeprowadzając wirowanie po każdym przemyciu, analogicznie jak wcześniej, również po ostatnim przemyciu.

Aby eluować białka, należy dodać 30 µL pięciokrotnego buforu do próbek i inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut. Następnie wirować z prędkością 5 000 ×g przez jedną minutę, aby wytrącić kuleczki. Potem cały eluat należy nanieść na żel SDS-PAGE o stężeniu 4–15% i prowadzić elektroforezę przy napięciu 200 V aż do końca żelu. Po zakończeniu rozdziału przenieść prążki białkowe na membranę PVDF przez 1,5 godziny przy napięciu 60 V, korzystając z aparatury do transferu BioRad.

Po zakończeniu transferu zablokować membranę w buforze TBS tween z dodatkiem 5% odtłuszczonego mleka przez jedną godzinę. Przystąpić do analizy western blotting zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie, aby zwizualizować białka oddziałujące z CFTR. Makromolekularny kompleks sygnalizacyjny zawierający A-C-F-T-R został zmontowany in vitro zgodnie z opisem w tym filmie, co przedstawiono na poniższym schemacie.

Kompleks makromolekularny utworzony pomiędzy 50 aminokwasami C-końca Mr.RRP four PD zk one a pełnowymiarowym CFTR w celu określenia zależności dawka-odpowiedź tworzenia kompleksu makromolekularnego. Zastosowano zwiększające się ilości białka pośredniczącego PD ZK one, jak pokazano tutaj. Ilość kompleksu wzrastała w sposób zależny od dawki, co sugeruje, że białko pośredniczące PD ZK one mediowało oddziaływanie pomiędzy CCF TR a Mr.Rrp four.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie doprowadzać do wrzenia próbek kompleksów mikrocząsteczek z pojemnika FTR przygotowanych do western blottingu, ponieważ agregacja FTR jest częstym problemem. Zamiast tego, zgodnie z niniejszą procedurą, próbki powinny być ogrzewane w temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut przed nałożeniem na żel. W celu oceny endogennych kompleksów CFTR w komórkach, takich jak komórki nabłonka dróg oddechowych i komórki nabłonka jelitowego, można zastosować inne metody, np. koimmunoprecypitację.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak złożyć in vitro makromolekularny kompleks sygnalizacyjny CFDR zależny od PTC.