C. elegans (C. elegans) Śledzenie i pomiar behawioralny

Fenotypowanie. Lokomocja morskiej elegancji jest ważnym narzędziem w odkrywaniu genów i neuronów zaangażowanych w zachowanie morskiej elegancji. Morska elegancja ulega stereotypowym zachowaniom lokomotorycznym, takim jak ruchy do przodu i do tyłu oraz różnego rodzaju skręty, zmieniając ich kształt. Aby określić ilościowo te ruchy na duże odległości i w wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, zbudowaliśmy urządzenie do śledzenia robaków, aby uchwycić ruch morskiej elegancji, gdy pełza po powierzchni płytki agarowej.

Opracowaliśmy również oprogramowanie do ilościowego izolowania i analizowania tych ruchów za pomocą niestandardowych programów napisanych w widoku laboratorium i matlabie. Wyzwaniem dla wszystkich systemów śledzenia wideo jest to, że generują one ogromną ilość danych, które są bardzo wymiarowe. Nasz program do przetwarzania obrazów i analizy danych w związku z tym wyzwaniem polegającym na zredukowaniu kształtów robaków do zestawu niezależnych komponentów, kompleksowo zrekonstruowaliśmy zachowanie robaka jako funkcję tylko trzech do czterech wymiarów.

Płytka agarowa jest oświetlana przez światłowodowe źródło światła i obrazowana za pomocą kamery. System ten jest zamontowany na stoliku translacyjnym XY. Stopień poruszany jest za pomocą standardowych silników krokowych, które są połączone ze sterownikiem silnika krokowego.

Kontroler i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą niestandardowych programów napisanych w widoku laboratoryjnym. Kamera obrazuje powierzchnię płytki agarowej i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle. Znak kalibracji dla procesu automatycznej kalibracji jest wykonywany poprzez szturchanie powierzchni agaru.

Za pomocą wykałacza ślimakowego jakość obrazu jest dostosowywana tak, aby program komputerowy mógł określać ilościowo obiekty w czasie rzeczywistym. Wzmocnienie, jasność i czas otwarcia migawki aparatu można regulować, aby uzyskać ciemny obiekt na białym tle. Przefiltrowany obraz binarny, który jest używany przez program śledzący, można sprawdzić.

Oprogramowanie posiada funkcję automatycznej kalibracji, która oblicza matrycę kalibracji poprzez przesuwanie badanego obiektu. Stała odległość. Odległości w pikselach są kalibrowane do kroków pokonywanych przez silnik krokowy przez matrycę kalibracyjną.

Po kalibracji system jest gotowy do pracy i nie trzeba go ponownie kalibrować, chyba że zmieni się powiększenie lub zmieni się położenie kamery. Miedziany pierścień zostanie użyty do zagrodzenia robaków i powstrzymania ich przed migracją na krawędź płyty. Najpierw podgrzej pierścień, umieszczając go na bloku grzewczym lub równoważnym.

Pierścień należy podgrzewać przez około minutę. Umieść pierścień na świeżej płytce agarowej i lekko dociśnij, aby osadzić go na powierzchni agaru. A płytka agarowa wypełniona buforem NGM zostanie użyta do umycia L 4 i młodych dorosłych robaków z resztek jedzenia.

Po zebraniu robaków do bufora NGM pozwól im pływać przez kilka minut. Ostrożnie umieść jeden z umytych robaków na płytce śledzącej w pobliżu środka pierścienia. Ta tabliczka będzie później używana do śledzenia robaków.

Umieść przygotowaną płytkę na stoliku do śledzenia robaków. Uruchom program widoku laboratorium i w razie potrzeby wybierz opcje, takie jak lokalizacja obrazów, typy obrazów, pomiary i ustawienia kamery. Za pomocą joysticka przesuwaj mikroskop, aż obraz robaka znajdzie się w polu view na ekranie komputera.

Następnie naciśnij ścieżkę, aby włączyć program śledzący. Tutaj pokazujemy robaka śledzonego w czasie rzeczywistym. Program komputerowy mierzy ruchy obrazów z filtrem binarnym, jak pokazano, i może dokonywać pomiarów tego obrazu w czasie rzeczywistym.

Po śledzeniu można dokonać rekonstrukcji globalnej trajektorii na podstawie ruchów silnika krokowego, podczas gdy lokalne zmiany kształtu ślimaka można zobaczyć szczegółowo. Robaki pełzają, wykonując ruchy falowe. Rejestrujemy te ruchy, szkieletując robaka w pojedynczą krzywą środkową, a następnie opisując tę krzywą jako zestaw kątów.

Następnie rozkładamy szkielety na ich podstawowe kształty, zwane inaczej wektorami własnymi. Dzięki tym modom własnym możemy zrekonstruować kształty robaka i określić ilościowo ruchy robaka. Korzystając z pierwszych dwóch trybów, możemy konkretnie uchwycić pozycję fazową cyklu falowego robaka, jak widać na drugim panelu.

Pierwszy panel przedstawia łączny rozkład modów pierwszego i drugiego, podkreślając kołowy cykl graniczny. Ruch fazowy w jednym kierunku odpowiada ruchowi do przodu, a ruch fazowy w drugim kierunku odpowiada ruchowi do tyłu. Zatem prędkość fazowa odpowiada prędkości robaka.

W przestrzeni rzeczywistej silną korelację między fazą a prędkością rzeczywistą można zobaczyć na ostatnim panelu. Korzystając z prędkości fazowej wyprowadzonej w trybie Eigen, możemy odkryć subtelne szczegóły zachowania morskiej elegancji, które zostałyby pominięte przez oko. Na przykład łączny rozkład prędkości fazowej i fazy wyraźnie wskazuje, że robaki opuszczają i wchodzą w stan do przodu preferencyjnie w określonych fazach ruchu.

Tutaj zademonstrowaliśmy łatwy w użyciu system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania krzemów jako pełzania po powierzchni i płytach ACA. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wysoce wymiarowa, dlatego stworzyliśmy również metodę zmniejszania wymiarowości danych w czterech podstawowych miarach. Środki te są łatwe do zinterpretowania w odniesieniu do zachowania robaka.

Praca ta jest generowana w celu pomiaru behawioralnych robaków przy niższych modyfikacjach, a system może być również używany do pomiaru aktywności neuronalnej przy użyciu genetycznie i powlekanych regionów. System jako całość jest elastyczny w konstrukcji i może być używany z innymi systemami pełzającymi, takimi jak Doof law, LOEs.