Śledzenie i pomiar zachowania C. elegans

Fenotypowanie. Lokomocja C. elegans stanowi istotne narzędzie w odkrywaniu genów i neuronów zaangażowanych w zachowanie C. elegans. C. elegans wykazuje stereotypowe zachowania lokomotoryjne, takie jak ruchy do przodu i do tyłu oraz różne rodzaje skrętów, uzyskując je poprzez zmianę kształtu ciała. Aby ilościowo ocenić te ruchy na długich dystansach i z wysoką rozdzielczością przestrzenną oraz czasową, zbudowaliśmy system śledzenia nicieni (worm tracker), który rejestruje ruch C. elegans podczas pełzania po powierzchni płytki z agarem.

Opracowaliśmy również oprogramowanie do izolowania i ilościowej analizy tych ruchów, wykorzystując do tego celu własne programy napisane w środowiskach LabVIEW oraz MATLAB. Wyzwaniem w przypadku wszystkich systemów śledzenia wideo jest generowanie ogromnej ilości danych o wysokiej wymiarowości. Nasz program do przetwarzania obrazów i analizy danych radzi sobie z tym problemem poprzez redukcję kształtów nicieni do zestawu niezależnych komponentów, co pozwoliło nam na kompleksową rekonstrukcję zachowania nicieni jako funkcji zaledwie trzech lub czterech wymiarów.

Szalka z agarem jest oświetlana za pomocą światłowodowego źródła światła i obrazowana kamerą. System ten jest zamontowany na stole translacyjnym XY. Stół jest poruszany za pomocą standardowych silników krokowych, które są podłączone do sterownika silnika krokowego.

Sterownik i kamera są podłączone do komputera i sterowane za pomocą specjalistycznych programów napisanych w środowisku LabVIEW. Kamera obrazuje powierzchnię płytki z agarem i identyfikuje ciemne obiekty na jasnym tle. Znak kalibracyjny dla automatycznego procesu kalibracji wykonuje się poprzez nakłucie powierzchni agaru.

Za pomocą wybranego nicienia dostraja się jakość obrazu w taki sposób, aby program komputerowy mógł kwantyfikować obiekty w czasie rzeczywistym. Można dostosować wzmocnienie, jasność oraz czas naświetlania kamery, aby uzyskać ciemny obiekt na białym tle. Możliwa jest weryfikacja przefiltrowanego obrazu binarnego, z którego korzysta program śledzenia.

Oprogramowanie posiada funkcję autokalibracji, która oblicza macierz kalibracyjną poprzez przemieszczenie obiektu testowego na stałą odległość. Odległości wyrażone w pikselach są kalibrowane do kroków wykonanych przez silnik krokowy za pomocą macierzy kalibracyjnej.

Po kalibracji system jest gotowy do pracy i nie wymaga ponownej kalibracji, chyba że zmienione zostanie powiększenie lub kamera zostanie przesunięta. Do ograniczania ruchu nicieni i zapobiegania ich migrowaniu do krawędzi szalki zostanie użyty miedziany pierścień. Najpierw należy podgrzać pierścień, umieszczając go na bloku grzejnym lub urządzeniu o podobnym działaniu.

Pierścień należy podgrzewać przez około minutę. Umieść pierścień na nowej płytce z agarem i lekko dociśnij, aby osadzić go w powierzchni agaru. Płytka z agarem wypełniona buforem NGM zostanie wykorzystana do przemycia nicieni w stadium L4 i młodych dorosłych z resztek pożywki.

Po przeniesieniu nicieni do buforu NGM, należy pozostawić je w nim na kilka minut. Ostrożnie umieść jednego z wypłukanych nicieni na płytce do śledzenia, w pobliżu środka pierścienia. Płytka ta zostanie później wykorzystana w systemie do śledzenia nicieni.

Umieść przygotowaną płytkę na stoliku trackera do nicieni. Uruchom program LabVIEW i w razie potrzeby wybierz opcje, takie jak lokalizacja obrazów, rodzaje obrazów, pomiary oraz ustawienia kamery. Za pomocą dżojstika przesuwaj mikroskop, aż obraz nicienia pojawi się w polu widzenia na ekranie komputera.

Następnie należy nacisnąć przycisk track, aby uruchomić program śledzenia. Tutaj pokazujemy nicienia śledzonego w czasie rzeczywistym. Program komputerowy mierzy ruchy obrazów z filtrem binarnym, jak pokazano, i może dokonywać pomiarów tego obrazu w czasie rzeczywistym.

Po śledzeniu można odtworzyć globalną trajektorię na podstawie ruchów silnika krokowego, podczas gdy lokalne zmiany kształtu nicienia można zaobserwować szczegółowo. Nicienie pełzają, wykonując ruchy falowe. Rejestrujemy te ruchy poprzez szkieletyzację nicienia do pojedynczej krzywej centralnej, a następnie opisujemy tę krzywą jako zestaw kątów.

Następnie rozkładamy szkielety na ich podstawowe kształty, znane również jako wektory własne. Dzięki tym modom własnym możemy zrekonstruować kształty nicieni i ilościowo określić ich ruchy. Wykorzystując dwa pierwsze mody, możemy w szczególności uchwycić fazę cyklu falowania nicienia, co przedstawiono na drugim panelu.

Pierwszy panel przedstawia wspólny rozkład modów pierwszego i drugiego, uwidaczniając kolisty cykl graniczny. Przesunięcie fazowe w jednym kierunku odpowiada ruchowi do przodu, a przesunięcie fazowe w przeciwnym kierunku odpowiada ruchowi do tyłu. Zatem prędkość fazowa odpowiada prędkości robaka.

W przestrzeni rzeczywistej silna korelacja fazy i rzeczywistej prędkości jest widoczna na ostatnim panelu. Wykorzystując prędkość fazową pochodną z modu Eigen, możemy odkryć subtelne szczegóły zachowania elegancji morskiej, które mogłyby zostać pominięte przy obserwacji wzrokowej. Na przykład, wspólny rozkład prędkości fazowej i fazy wyraźnie wskazuje, że nicienie opuszczają i wchodzą w stan ruchu do przodu preferencyjnie w określonych fazach ruchu.

W niniejszej pracy zaprezentowaliśmy łatwy w użyciu system śledzenia, który rejestruje szczegółowe obrazy zachowania nicieni podczas pełzania po powierzchni i płytkach ACA. Ilość informacji zawartych w tych obrazach jest ogromna i wielowymiarowa, dlatego opracowaliśmy również metodę redukcji wymiarowości danych do czterech podstawowych parametrów. Parametry te są łatwe do interpretacji w odniesieniu do zachowania nicieni.

Niniejsza praca została opracowana w celu pomiaru zachowań nicieni przy niewielkich modyfikacjach, a system ten może być również wykorzystany do pomiaru aktywności neuronalnej z wykorzystaniem regionów modyfikowanych genetycznie i znakowanych. System jako całość charakteryzuje się elastyczną konstrukcją i może być stosowany z innymi systemami monitorowania ruchu, takimi jak Doof law czy LOEs.