Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Niniejsze badanie peptydów w ślinie wykorzystuje ultrafiltracyjną sondę typu „lollipop” (LLUF), a następnie bezpośrednią analizę metodą nano-LC-LTQ-MS (spektrometria mas). Najpierw należy zmontować sondę LLUF, używając membrany z polieterosulfonu oraz rurki z etylenu i propylenu. Następnie należy pobrać próbki śliny od ochotników i poddać je procesowi filtracji za pomocą sondy LLUF w celu pobrania próbek śliny.

Następnie należy przejść bezpośrednio do nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas i przeanalizować dane z próbek śliny z zastosowaniem oraz bez zastosowania sondy LLUF. Ostatecznie peptydy śliny można uzyskać poprzez analizę danych L-C-M-S-S i porównanie zidentyfikowanych peptydów między obiema próbkami. Podejście polegające na wykorzystaniu sondy do ultrafiltracji typu „lollipop” sprzężonej z bezpośrednią analizą nano lc LTQ spektrometrią mas oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami, takimi jak trawienie białek śliny do peptydów.

Następnie, w ramach analizy spektrometrią mas, LUF PRO upraszcza i oczyszcza ślinę, a także zwiększa detekcję peptydów w pełnej ślinie do zastosowań klinicznych. Za pomocą kleju epoksydowego przyklej membrany z polieteru do krawędzi trójkątnych łopatek z polipropylenu. Następnie przymocuj rurkę z fluorowanego etylenu propylenu (Teflon) do wylotu cylindra trójkąta.

Sondy z polipropylenowego łopatka sterylizujemy 70% alkoholem przez noc. Aby ocenić szczelność uszczelnienia, sondy LLUF zanurza się w roztworze niebieskiego dekstranu o stężeniu 50 mg/mL na dwie godziny. Następnie potwierdza się brak niebieskiego dekstranu w zebranych próbkach.

Zrekrutuj zdrowych ochotników w wieku od 20 do 40 lat. Po wypłukaniu jamy ustnej wodą poproś badanego o splunięcie próbek śliny pełnej do naczynia chłodzonego w lodzie. Połącz wszystkie próbki i przechowuj je w lodzie.

Bezpośrednio po pobraniu przenieś 200 µL śliny do pomieszczenia o temperaturze 4 °C w celu przeprowadzenia próbkowania za pomocą sond LLUF. Następnie zanurz membranę polietrową w ślinie ludzkiej w naczyniu hodowlanym. Wywołaj podciśnienie za pomocą strzykawki, aby zasymulować proces ultrafiltracji podczas pobierania próbek ze śliny.

Następnie należy oznaczyć stężenia białek. Przygotuj próbki białek ze śliny o stężeniu 1 µg/µL do analizy metodą nano LC-MS. Do analizy próbek wykorzystujemy system exigent nano LC sprzężony online z spektrometrem mas Finnegan LTQ. W pierwszej kolejności za pomocą autosamplera nałóż 5 µL nieprzetrawionych próbek śliny na kolumnę pułapkową (trap column) systemu nano LC.

Po etapie płukania przełącz zawór i podaj liniowy gradient buforu B od 0 do 50% na pułapkę oraz kolumnę separacyjną C 18. Korzystając z trybu zależnego od danych (data dependent mode) w systemie Excalibur, zarejestruj widma ms/ms dla czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności przekraczającej 1 × 10⁴. Dla każdej próbki przeprowadź podwójne analizy trzech różnych, oddzielnych preparatów.

Następnie zaimportuj plik z danymi do systemu Sequester Sorcerer 2; wybierz przeszukiwanie w odpowiedniej ludzkiej bazie białek NCBI, stosując specyficzność dla białek niebędących enzymami. Po zakończeniu przeszukiwania w programie Sequester wyniki zostaną automatycznie przefiltrowane, zweryfikowane i wyświetlone w profilu peptydów oraz profilu białek na podstawie wyników z programu Sequester. Profil peptydów szacuje kompleksowy wynik prawdopodobieństwa P, określający, czy przypisanie peptydów jest prawidłowe czy błędne, a także identyfikuje dodatkowe informacje dotyczące każdej sekwencji peptydowej.

Protein profit oblicza wynik prawdopodobieństwa od zera do jeden dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm Ms.Ms. Niniejsza sekcja określa zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej w celu hodowli do detekcji bakteryjnej; próbki śliny pobrane przed i po zastosowaniu sondy LLUF nanosi się na płytki agarowe w celu testu bakterii tlenowych. Należy stosować płytki z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37°C przez jeden dzień, a w przypadku bakterii beztlenowych należy do hodowli użyć zestawu gas pack.

Próbkę inkubowano na pożywce bru broth, na płytkach z agarem w warunkach beztlenowych w temperaturze 37°C przez jeden dzień. Wykonanie urządzeń do ultrafiltracji o kształcie lizaka ułatwia pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej. W tym systemie ujemnie naładowana membrana polietersulfonowa o progu odcięcia masy cząsteczkowej 30 kilodaltonów jest przyklejona do polipropylenowego łopatkowatego uchwytu i umieszczona przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek zawartych w ślinie.

Aby odwzorować ludzkie środowisko jamy ustnej, gąbkę nasączono śliną przy użyciu strzykawki. Ślina została przefiltrowana i zebrana przez podłączoną rurkę. Porównanie chromatogramów lc śliny przed i po pobieraniu próbek metodą LLUF pozwoliło na identyfikację endogennych peptydów śliny za pomocą nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas.

Ponieważ te chromatogramy różnicowe są uzyskiwane bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego, upraszczają one przygotowanie próbek do celów klinicznych. W tej próbce, po wyjaśnieniu za pomocą LLUF, zróżnicowane składy białkowe pozwoliły na zidentyfikowanie 131 peptydów w nietrawionej ślinie.

Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę. Aktyna, amylaza alfa, globiny alfa i beta, histon 1, keratyna 1, mucyna 7, polimeryczny receptor immunoglobulin oraz seryna i białko S 100. Unikalne peptydy zidentyfikowane w ślinie po filtrowaniu za pomocą sond LLUF są fragmentami pochodzącymi głównie z różnych białek bogatych w prolinę.

Ten peptyd pochodzący z alfa-amylazy został wykryty wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF, co ilustruje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Co najbardziej intrygujące, po usunięciu większych białek, w ślinie pobranej za pomocą sond LLUF wykryto kilka peptydów sekwencyjnych; w szczególności w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF zidentyfikowano peptydy z bogatymi w prolinę końcami C. Powinni Państwo mieć teraz dobrą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać A-L-L-L-L-U-F PRO do analizy spektrometrią mas zwykłej śliny.

Lepsza analiza jest bardzo ważna dla gromadzenia i prostego pobierania śliny w spójnych warunkach. Wierzę, że po opanowaniu tej techniki można ją prawidłowo przeprowadzić w ciągu trzech godzin. To podejście z wykorzystaniem sondy do ultrafiltracji przypominającej lizaka, połączonej z bezpośrednią analizą nano LC-LT-QMS, ułatwia zastosowania kliniczne w zakresie biomarkerów w diagnostyce chorób ludzi.