Name: Pobieranie próbek ludzkiej rdzennej peptydome śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej lizak: uprość i ulepsz wykrywanie peptydów w klinicznej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę pobierania próbek ludzkiej śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej LLUF, która upraszcza wykrywanie peptydów w spektrometrii mas. Technika ta usprawnia diagnostykę kliniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 oraz R21-I58002-01). Dziękujemy C. Niemeyer za krytyczną lekturę manuskryptu.

<ol><li>Denny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomes+of+human+parotid+and+ubmandibular%2Fsublingual+gland+salivas+collected+as+the+ductal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions.</a> J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).</li>
<li>Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Human saliva proteome analysis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).</li>
<li>Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+conditions+on+the+extraction+of+PCR-quality+genomic+DNA+from+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva.</a> Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).</li>
<li>Wade, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oral-diffusion-sink+device+for+extended+sampling+of+multiple+steroid+hormones+from+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva.</a> Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).</li>
<li>Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+proteins+in+human+salivary+proteome+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+and+two-dimensional+gel+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry.</a> Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+analysis+of+human+whole+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic analysis of human whole saliva.</a> Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).</li>
<li>Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+monobuffer+multidimensional+chromatography+for+high-throughput+proteome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation.</a> J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+sodium+lauryl+sulfate+enhances+skin+vaccination%3A+molecular+characterization+via+a+novel+technique+using+ultrafiltration+capillaries+and+mass+spectrometric+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+sampling+using+capillary+ultrafiltration+semi-permeable+hollow+fiber+and+protein+identification+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics.</a> J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+secreted+proteins+from+wounded+skin+using+capillary+ultrafiltration+probes+and+mass+spectrometric+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics.</a> Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+proteomics+profiles+of+in+vivo+tumor+secretomes%3A+capillary+ultrafiltration+sampling+of+regressive+tumor+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses.</a> Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).</li>
<li>Ahmed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+remove+albumin+for+the+proteomic+analysis+of+low+abundance+biomarkers+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum.</a> Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).</li>
<li>Michishige, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+saliva+collection+method+on+the+concentration+of+protein+components+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva.</a> J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).</li>
<li>Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+with+salivary+17-hydroxyprogesterone+determinations+using+the+Salivette+device%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device.</a> Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).</li>
<li>Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+serum%2Fplasma+profiling+and+biomarker+identification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).</li>
<li>Ramstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+high-abundant+proteins+in+body+fluids+prior+to+liquid+chromatography+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).</li>
<li>Messana, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+salivary+basic+proline-rich+protein+complex+by+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach.</a> J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).</li>
<li>Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+release+of+an+ArgGlyArgProGln+pentapeptide+with+innate+immunity+properties+from+acidic+proline-rich+proteins+by+proteolytic+activity+in+commensal+streptococcus+and+actinomyces+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species.</a> Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).</li>
<li>Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proline-rich+polypeptide+is+a+regulator+of+oxidative+burst+in+human+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimmunomodulation%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes.</a> Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).</li>
<li>Jonsson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gln-Gly+cleavage%3A+correlation+between+collision-induced+dissociation+and+biological+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).</li>
<li>Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+a+segment+of+adsorbed+salivary+acidic+proline-rich+proteins+which+promotes+adhesion+of+Streptococcus+gordonii+to+apatitic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces.</a> Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).</li>
<li>Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+of+Actinomyces+naeslundii+and+Actinomyces+viscosus+exhibit+structurally+variant+fimbrial+subunit+proteins+and+bind+to+different+peptide+motifs+in+salivary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins.</a> Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).</li>
<li>Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+defining+the+human+parotid+gland+salivary+proteome+and+peptidome%3A+identification+and+characterization+using+2D+SDS-PAGE%2C+ultrafiltration%2C+HPLC%2C+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).</li>
<li>Wilmarth, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+liquid+chromatography+study+of+the+human+whole+saliva+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome.</a> J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+amino+acid+sequence+of+a+basic+proline-rich+peptide%2C+P-D%2C+from+human+parotid+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva.</a> J. Biochem. 93, 495-502 (1983).</li>
<li>Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+salivary+mucin+bacterial+aggregating+activity+with+caries+status%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status.</a> Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).</li>
<li>Juarez, Z. E., Stinson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+protease+of+Streptococcus+gordonii+hydrolyzes+type+IV+collagen+and+collagen+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues.</a> Infect Immun. 67, 271-278 (1999).</li>
<li>Lo, C. S., Hughes, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+protease+from+Streptococcus+oralis+C104%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104.</a> Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).</li>
<li>Harrington, D. J., Russell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+two+extracellular+proteases+of+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+secretome+sampling+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">In vivo secretome sampling technology for proteomics.</a> Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).</li>
<li>Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+proline+rich+protein+1+%28PRP-1%29+in+bulk+solution+and+adsorbed+to+a+negatively+charged+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).</li>
<li>Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+of+diatom+frustules%3A+potential+nanostructured+membranes+for+molecular+and+particle+separations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).</li>
<li>Linhares, M. C., Kissinger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+monitoring+in+subcutaneous+tissue+using+in+vivo+capillary+ultrafiltration+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes.</a> Pharm Res. 10, 598-602 (1993).</li>
<li>Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intact+proteins+in+mixtures+by+alternated+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+and+LC+ESI+infrared+multiphoton+dissociation+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).</li>
<li>Whitelegge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Sequence+Polymorphisms+and+Post-translational+Modifications+in+Proteins+from+Human+Saliva+using+Top-Down+Fourier-transform+Ion+Cyclotron+Resonance+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).</li>
<li>Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Streptococcus+mutans+to+salivary+proteins+in+caries-free+and+caries-susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Odontol.+Latinoam%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals.</a> Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).</li>
<li>Challacombe, S. J., Sweet, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+immunity+and+HIV+infection%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal immunity and HIV infection: current status.</a> Oral Dis. 8, 55-62 (2002).</li>
<li>Jensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+acidic+proline-rich+proteins+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Odkryliśmy, że w nieprzetrawionej ślinie ludzkiej występuje wiele fragmentów peptydowych. Fragmenty te są pochodnymi różnych form białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. Wiele czynników może przyczyniać się do powstawania peptydów o nieokreślonych miejscach cięcia. Na przykład niektóre fragmenty peptydowe mogą występować naturalnie w pełnej ślinie ludzkiej. Zidentyfikowano wiele peptydów...

<table><tbody><tr><td>Membrany z polietersulfonu </td><td>Pall Corporation</td><td></td><td>30 kDa MWCO </td></tr><tr><td>Rurka z fluorowanego etylenu propylenu Teflon </td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieski dekstran </td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Nano LC</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna pułapkowa C18 </td><td>Agilent</td><td>5065-9913</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy spektrometr mas z pułapką jonową LTQ </td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer 2</td><td>Sage-N Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl-0,1% kwasu mrówkowego</td><td>J.T. Baker</td><td>9832-03</td><td>stopień LC/MS</td></tr><tr><td>Woda-0,1% kwasu mrówkowego</td><td>J.T. Baker</td><td>9834-03</td><td>stopień LC/MS</td></tr></tbody></table>

próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Mimo że proteom i peptydom śliny ludzkiej zostały opisane 1-2, zostały one w znacznym stopniu zidentyfikowane na podstawie trawienia białek śliny trypsyną. Identyfikacja rodzimego peptydomu śliny ludzkiej bez uprzedniego trawienia egzogennymi enzymami staje się niezbędna, ponieważ natywne peptydy w ślinie ludzkiej mają potencjalną wartość w diagnostyce chorób, przewidywaniu postępu choroby oraz monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Odpowiednie pobieranie próbek jest krytycznym krokiem w celu zwiększenia możliwości identyfikacji rodzimego peptydomu śliny ludzkiej. Tradycyjne metody pobierania śliny ludzkiej, obejmujące wirowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń 3-4, mogą być zbyt czasochłonne, aby znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej. Ponadto usuwanie zanieczyszczeń poprzez wirowanie może nie być wystarczające do oczyszczenia większości zainfekowanych patogenów oraz usunięcia białek o wysokiej zawartości, które często utrudniają identyfikację niskonakładowego peptydomu.
Konwencjonalne podejścia proteomiczne, wykorzystujące przede wszystkim dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) w połączeniu z trawieniem w żelu, pozwalają na identyfikację wielu białek śliny 5-6. Jednak podejście to zazwyczaj nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć peptydy i białka występujące w niskich stężeniach. Alternatywą jest proteomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), która umożliwia identyfikację białek bez wcześniejszej separacji metodą 2-DE. Chociaż metoda ta zapewnia wyższą czułość, zazwyczaj wymaga wcześniejszego rozfrakcjonowania próbki 7 oraz trawienia trypsyną, co utrudnia jej zastosowanie w praktyce klinicznej.
Aby uniknąć utrudnień w spektrometrii mas wynikających z przygotowania próbek, opracowaliśmy technikę zwaną sondami do kapilarnej ultrafiltracji (CUF) 8-11. Dane z naszego laboratorium wykazały, że sondy CUF są w stanie wychwytywać białka in vivo z różnych mikrośrodowisk organizmów zwierzęcych w sposób dynamiczny i małoinwazyjny 8-11. Wirowanie nie jest konieczne, ponieważ podciśnienie jest wytwarzane poprzez proste zasysanie strzykawką podczas pobierania próbki. Sondy CUF w połączeniu z LC-MS pozwoliły na pomyślną identyfikację białek poddanych trawieniu trypsyną 8-11. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy technikę pobierania próbek metodą ultrafiltracji, tworząc sondę do ultrafiltracji o kształcie lizaka (LLUF), która może z łatwością zmieścić się w ludzkiej jamie ustnej. Bezpośrednia analiza LC-MS bez trawienia trypsyną wykazała, że ludzka ślina naturalnie zawiera wiele fragmentów peptydowych pochodzących z różnych białek. Pobieranie śliny za pomocą sond LLUF pozwoliło uniknąć wirowania, a jednocześnie skutecznie usunęło wiele większych i wysokobobilnych białek. Wyniki spektrometrii mas wykazały, że wiele peptydów o niskiej obfitości stało się wykrywalnych po odfiltrowaniu większych białek za pomocą sond LLUF. Detekcja niskobobilnych peptydów śliny była niezależna od wieloetapowej separacji próbek za pomocą chromatografii. W zastosowaniach klinicznych sondy LLUF zintegrowane z LC-MS mogłyby w przyszłości służyć do monitorowania progresji chorób na podstawie analizy śliny.

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Choć proteom i peptydom białek śliny człowieka zostały opisane 1-2, zidentyfikowano je głównie na podstawie trawienia trypsynowego białek śliny. Identyfikacja ...

Niniejsze badanie peptydów śliny wykorzystuje sondę do ultrafiltracji typu „lollipop” (LLUF), a następnie bezpośrednią analizę nano LC-LTQ MS. Najpierw należy złożyć sondę LLUF, używając membrany z polieterosulfonu oraz rurki z etylenu i propylenu. Następnie należy pobrać próbki śliny od ochotników i przetworzyć je za pomocą sondy LLUF w celu pobrania próbki śliny.Następnie należy przejść bezpośrednio do nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas i przeanalizować dane z próbek śliny z zastosowaniem oraz bez zastosowania sondy LLUF. Ostatecznie peptyd śliny można uzyskać poprzez analizę danych L-C-M-S-S i porównanie zidentyfikowanych peptydów między obiema próbkami. To podejście, wykorzystujące ultrafiltracyjną sondę w kształcie lizaka w połączeniu z bezpośrednią analizą nano lc LTQ spektrometrią mas, oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami, takimi jak trawienie białek śliny do peptydów.Następnie przeprowadzono analizę spektrometrią mas. LUF PRO upraszcza i oczyszcza ślinę, a także zwiększa detekcję peptydów metodą MS w całej ślinie do zastosowań klinicznych. Za pomocą kleju epoksydowego przyklejono membrany polieterowe do krawędzi trójkątnych łopatek z polipropylenu. Następnie do wylotu cylindra trójkąta przyłączono rurkę z fluorowanego etylenu propylenu (Teflon).Łopatki z polipropylenu. Sondy należy wysterylizować 70% alkoholem przez noc. Aby ocenić szczelność uszczelnienia, zanurzyć sondy LLUF w roztworze niebieskiego dekstranu o stężeniu 50 mg/mL na dwie godziny. Potwierdzić brak niebieskiego dekstranu w pobranych próbkach.Zrekrutuj zdrowych ochotników w wieku od 20 do 40 lat. Po przepłukaniu jamy ustnej wodą poproś badanego o wyplucie próbek śliny pełnej do naczynia chłodzonego w lodzie. Połącz wszystkie próbki i przechowuj je w lodzie.Bezpośrednio po pobraniu próbki należy przenieść 200 µL śliny do pomieszczenia o temperaturze 4 °C w celu przeprowadzenia pobierania próbek za pomocą sond LLUF. Następnie należy zanurzyć polieterową membranę do filtracji w ludzkiej ślinie w naczyniu hodowlanym. Aby zasymulować proces ultrafiltracji podczas pobierania próbki ze śliny, należy wytworzyć podciśnienie, odciągając tłok strzykawki.Następnie należy oznaczyć stężenia białek. Przygotować próbki białek ze śliny w stężeniu 1 µg/µL do analizy metodą nano LC-MS. Do analizy próbek wykorzystujemy system exigent nano LC sprzężony online ze spektrometrem mas Finnegan LTQ. W pierwszej kolejności należy za pomocą autosamplera nanieść 5 µL nieprzetrawionych próbek śliny na kolumnę pułapkową (trap column) systemu nano LC.Po etapie płukania przełącz zawór i podaj liniowy gradient buforu B od 0 do 50% na pułapkę oraz kolumnę rozdzielczą C 18. Korzystając z trybu zależnego od danych (data dependent mode) urządzenia Excalibur, zbierz widma ms ms dla czterech najsilniejszych jonów MS o intensywności powyżej 1×10⁴. Dla każdej próbki przeprowadź podwójne analizy trzech różnych, oddzielnych preparatów.Następnie zaimportuj plik z danymi do systemu Sequester Sorcerer 2, wybierając wyszukiwanie w odpowiedniej ludzkiej bazie białek NCBI z zastosowaniem opcji non-enzyme specificity. Po przeprowadzeniu wyszukiwania w programie Sequester wyniki są automatycznie filtrowane, walidowane i wyświetlane w profilach peptydowych (peptide profit) oraz białkowych (protein profit) na podstawie uzyskanych rezultatów. Profil peptydowy szacuje kompleksowy wynik prawdopodobieństwa P (P score), określający, czy przypisanie peptydów jest poprawne, czy błędne, a także identyfikuje dodatkowe informacje dotyczące każdej sekwencji peptydowej.Protein profit oblicza wynik prawdopodobieństwa od zera do jednego dla każdego białka na podstawie peptydów przypisanych do widm Ms.Ms. Niniejsza sekcja określa zdolność sond LLUF do usuwania bakterii jamy ustnej w celu hodowli do detekcji bakteryjnej; próbki śliny przed i po pobraniu sondą LLUF nanosi się na płyty agarowe w celu testu bakterii tlenowych. W przypadku bakterii tlenowych należy stosować płyty z agarem LB bez antybiotyków w temperaturze 37 °C przez jedną dobę, a w przypadku bakterii beztlenowych należy do hodowli wykorzystać system gas pack.Próbkę inkubowano na pożywce BRU, na płytkach z agarem w warunkach beztlenowych w temperaturze 37 °C przez jeden dzień. Konstrukcja urządzeń do ultrafiltracji przypominających lizaka ułatwia pobieranie próbek śliny w symulowanym środowisku jamy ustnej. W tym systemie ujemnie naładowana membrana z polieterosulfonu o progu odcięcia masy cząsteczkowej 30 kDa jest przyklejona do polipropylenowej łopatki i umieszczona przed sondą LLUF w celu odfiltrowania większych białek zawartych w ślinie.Aby naśladować środowisko jamy ustnej człowieka, gąbkę nasącza się śliną za pomocą strzykawki. Ślina jest filtrowana i zbierana przez podłączony przewód. Porównanie chromatogramów lc śliny przed i po pobieraniu prób LLUF pozwoliło na identyfikację endogennych peptydów śliny za pomocą nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas.Ponieważ te chromatogramy różnicowe są uzyskiwane bez trawienia chemicznego lub enzymatycznego, upraszczają one przygotowanie próbek do celów klinicznych. W tej próbce, po wyjaśnieniu LLUF w odniesieniu do różnych składów białkowych, zidentyfikowano 131 peptydów w nietrawionej ślinie.Peptydy te są fragmentami pochodzącymi z różnych białek bogatych w prolinę. Aktyna, amylaza alfa, globin alfa-1, globina beta, histona 1, keratyna 1, mucyna 7, polimeryczny receptor immunoglobuliny serynowej oraz S 100. Unikalne peptydy zidentyfikowane w ślinie po filtrowaniu za pomocą sond LLUF to fragmenty pochodzące głównie z różnych białek bogatych w prolinę.Ten peptyd pochodzący z alfa-amylazy został wykryty wyłącznie w próbce śliny pobranej bez użycia sond LLUF, co obrazuje zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek. Co najbardziej interesujące, po usunięciu większych białek, w ślinie pobranej za pomocą sondy LLUF można było wykryć kilka sekwencji peptydowych; w szczególności w próbkach po ultrafiltracji sondami LLUF zidentyfikowano peptydy z bogatymi w prolinę końcami C. Powinni Państwo teraz posiadać wystarczającą wiedzę na temat tego, jak wykorzystać A-L-L-L-L-U-F PRO do analizy masy w prostych próbkach śliny.Właściwa analiza jest bardzo ważna dla pobrania i prostego przygotowania śliny w jednolitych warunkach. Uważam, że po opanowaniu tej techniki może ona być prawidłowo wykonana w ciągu trzech godzin. Takie podejście z wykorzystaniem sondy do ultrafiltracji w formie lizaka, połączone z bezpośrednią analizą nano L-C-L-T-Q-M-S i spektrometrią masową, ułatwia zastosowania kliniczne biomarkerów w diagnostyce chorób ludzkich.

sampling-human-indigenous-saliva-peptidome-using-lollipop-like

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pobieranie próbek peptidomu śliny ludzkich rdzennych gatunków za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej sliwkę: uproszczenie i ulepszenie wykrywania peptydów dla spektrometrii masowej klinicznej

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół trawienia na filtrze ze szczegółowymi informacjami na temat: trawienie białek, oczyszczanie peptydów i analiza pozyskiwania niezależnie od danych. Strategia ta jest stosowana do analizy ekspresji wydzielin gruczołu krokowego - próbek moczu i umożliwia wysokie pokrycie proteomem oraz profilowanie proteomu moczu bez znaczników o niskiej brakującej wartości.

Profil proteomiczny EPS-moczu poprzez trawienie FASP i analizę niezależną od danych

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Niniejsza praca przedstawia innowacyjne podejście wizualne (fotogłos lub fotoelicytacja), mające na celu zapewnienie sprawiedliwego procesu opieki klinicznej nad pacjentami z przewlekłymi schorzeniami, naświetlenie luk w wiedzy klinicznej, budowanie lepszych relacji terapeutycznych oraz identyfikację celów zorientowanych na pacjenta i możliwości leczenia.

Wykorzystanie metod wizualnych i narracyjnych w celu zapewnienia sprawiedliwego procesu w opiece klinicznej

Poznaj metodę pobierania próbek ludzkiej śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej LLUF, która upraszcza wykrywanie peptydów w spektrometrii mas. Technika ta usprawnia diagnostykę kliniczną.

Pobieranie próbek ludzkiej rdzennej peptydome śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej lizak: uprość i ulepsz wykrywanie peptydów w klinicznej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów