Name: Pobieranie próbek ludzkiej rdzennej peptydome śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej lizak: uprość i ulepsz wykrywanie peptydów w klinicznej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę pobierania próbek ludzkiej śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej LLUF, która upraszcza wykrywanie peptydów w spektrometrii mas. Technika ta usprawnia diagnostykę kliniczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była finansowana z grantów National Institutes of Health (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 oraz R21-I58002-01). Dziękujemy C. Niemeyer za krytyczną lekturę manuskryptu.

<ol><li>Denny, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteomes+of+human+parotid+and+ubmandibular%2Fsublingual+gland+salivas+collected+as+the+ductal+secretions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions.</a> J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).</li>
<li>Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Human saliva proteome analysis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).</li>
<li>Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+storage+conditions+on+the+extraction+of+PCR-quality+genomic+DNA+from+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva.</a> Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).</li>
<li>Wade, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oral-diffusion-sink+device+for+extended+sampling+of+multiple+steroid+hormones+from+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva.</a> Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).</li>
<li>Hu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+identification+of+proteins+in+human+salivary+proteome+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+and+two-dimensional+gel+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry.</a> Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+analysis+of+human+whole+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic analysis of human whole saliva.</a> Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).</li>
<li>Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+monobuffer+multidimensional+chromatography+for+high-throughput+proteome+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation.</a> J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+sodium+lauryl+sulfate+enhances+skin+vaccination%3A+molecular+characterization+via+a+novel+technique+using+ultrafiltration+capillaries+and+mass+spectrometric+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics.</a> Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+sampling+using+capillary+ultrafiltration+semi-permeable+hollow+fiber+and+protein+identification+via+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics.</a> J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).</li>
<li>Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+detection+of+secreted+proteins+from+wounded+skin+using+capillary+ultrafiltration+probes+and+mass+spectrometric+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics.</a> Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometric+proteomics+profiles+of+in+vivo+tumor+secretomes%3A+capillary+ultrafiltration+sampling+of+regressive+tumor+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses.</a> Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).</li>
<li>Ahmed, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+remove+albumin+for+the+proteomic+analysis+of+low+abundance+biomarkers+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum.</a> Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).</li>
<li>Michishige, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+saliva+collection+method+on+the+concentration+of+protein+components+in+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva.</a> J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).</li>
<li>Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Problems+with+salivary+17-hydroxyprogesterone+determinations+using+the+Salivette+device%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Chem.+Clin.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device.</a> Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).</li>
<li>Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+serum%2Fplasma+profiling+and+biomarker+identification+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry.</a> J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).</li>
<li>Ramstrom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+high-abundant+proteins+in+body+fluids+prior+to+liquid+chromatography+fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).</li>
<li>Messana, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+salivary+basic+proline-rich+protein+complex+by+a+proteomic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome.+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach.</a> J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).</li>
<li>Li, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+release+of+an+ArgGlyArgProGln+pentapeptide+with+innate+immunity+properties+from+acidic+proline-rich+proteins+by+proteolytic+activity+in+commensal+streptococcus+and+actinomyces+species%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species.</a> Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).</li>
<li>Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+proline-rich+polypeptide+is+a+regulator+of+oxidative+burst+in+human+neutrophils+and+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimmunomodulation%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes.</a> Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).</li>
<li>Jonsson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gln-Gly+cleavage%3A+correlation+between+collision-induced+dissociation+and+biological+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).</li>
<li>Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+a+segment+of+adsorbed+salivary+acidic+proline-rich+proteins+which+promotes+adhesion+of+Streptococcus+gordonii+to+apatitic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces.</a> Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).</li>
<li>Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+of+Actinomyces+naeslundii+and+Actinomyces+viscosus+exhibit+structurally+variant+fimbrial+subunit+proteins+and+bind+to+different+peptide+motifs+in+salivary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins.</a> Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).</li>
<li>Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+defining+the+human+parotid+gland+salivary+proteome+and+peptidome%3A+identification+and+characterization+using+2D+SDS-PAGE%2C+ultrafiltration%2C+HPLC%2C+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).</li>
<li>Wilmarth, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+liquid+chromatography+study+of+the+human+whole+saliva+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome.</a> J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).</li>
<li>Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+amino+acid+sequence+of+a+basic+proline-rich+peptide%2C+P-D%2C+from+human+parotid+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva.</a> J. Biochem. 93, 495-502 (1983).</li>
<li>Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+salivary+mucin+bacterial+aggregating+activity+with+caries+status%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status.</a> Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).</li>
<li>Juarez, Z. E., Stinson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+protease+of+Streptococcus+gordonii+hydrolyzes+type+IV+collagen+and+collagen+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues.</a> Infect Immun. 67, 271-278 (1999).</li>
<li>Lo, C. S., Hughes, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+protease+from+Streptococcus+oralis+C104%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104.</a> Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).</li>
<li>Harrington, D. J., Russell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterisation+of+two+extracellular+proteases+of+Streptococcus+mutans%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans.</a> FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).</li>
<li>Huang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+secretome+sampling+technology+for+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin.+Appl%22%5BJournal%5D)">In vivo secretome sampling technology for proteomics.</a> Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).</li>
<li>Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+modeling+of+proline+rich+protein+1+%28PRP-1%29+in+bulk+solution+and+adsorbed+to+a+negatively+charged+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem.+B%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface.</a> J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).</li>
<li>Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+of+diatom+frustules%3A+potential+nanostructured+membranes+for+molecular+and+particle+separations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).</li>
<li>Linhares, M. C., Kissinger, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetic+monitoring+in+subcutaneous+tissue+using+in+vivo+capillary+ultrafiltration+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes.</a> Pharm Res. 10, 598-602 (1993).</li>
<li>Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intact+proteins+in+mixtures+by+alternated+capillary+liquid+chromatography+electrospray+ionization+and+LC+ESI+infrared+multiphoton+dissociation+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).</li>
<li>Whitelegge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Sequence+Polymorphisms+and+Post-translational+Modifications+in+Proteins+from+Human+Saliva+using+Top-Down+Fourier-transform+Ion+Cyclotron+Resonance+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).</li>
<li>Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Streptococcus+mutans+to+salivary+proteins+in+caries-free+and+caries-susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Odontol.+Latinoam%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals.</a> Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).</li>
<li>Challacombe, S. J., Sweet, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+immunity+and+HIV+infection%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal immunity and HIV infection: current status.</a> Oral Dis. 8, 55-62 (2002).</li>
<li>Jensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+acidic+proline-rich+proteins+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Odkryliśmy, że w nieprzetrawionej ślinie ludzkiej występuje wiele fragmentów peptydowych. Fragmenty te są pochodnymi różnych form białek bogatych w prolinę, aktyny, alfa-amylazy, alfa-1-globiny, beta-globiny, histainy 1, keratyny 1, mucyny 7, polimerycznego receptora immunoglobulin, sateryny oraz S100A9. Wiele czynników może przyczyniać się do powstawania peptydów o nieokreślonych miejscach cięcia. Na przykład niektóre fragmenty peptydowe mogą występować naturalnie w pełnej ślinie ludzkiej. Zidentyfikowano wiele peptydów...

<table><tbody><tr><td>Membrany z polietersulfonu </td><td>Pall Corporation</td><td></td><td>30 kDa MWCO </td></tr><tr><td>Rurka z fluorowanego etylenu propylenu Teflon </td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Niebieski dekstran </td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System Nano LC</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolumna pułapkowa C18 </td><td>Agilent</td><td>5065-9913</td><td></td></tr><tr><td>Liniowy spektrometr mas z pułapką jonową LTQ </td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorcerer 2</td><td>Sage-N Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl-0,1% kwasu mrówkowego</td><td>J.T. Baker</td><td>9832-03</td><td>stopień LC/MS</td></tr><tr><td>Woda-0,1% kwasu mrówkowego</td><td>J.T. Baker</td><td>9834-03</td><td>stopień LC/MS</td></tr></tbody></table>

próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

Mimo że proteom i peptydom śliny ludzkiej zostały opisane 1-2, zostały one w znacznym stopniu zidentyfikowane na podstawie trawienia białek śliny trypsyną. Identyfikacja rodzimego peptydomu śliny ludzkiej bez uprzedniego trawienia egzogennymi enzymami staje się niezbędna, ponieważ natywne peptydy w ślinie ludzkiej mają potencjalną wartość w diagnostyce chorób, przewidywaniu postępu choroby oraz monitorowaniu skuteczności terapeutycznej. Odpowiednie pobieranie próbek jest krytycznym krokiem w celu zwiększenia możliwości identyfikacji rodzimego peptydomu śliny ludzkiej. Tradycyjne metody pobierania śliny ludzkiej, obejmujące wirowanie w celu usunięcia zanieczyszczeń 3-4, mogą być zbyt czasochłonne, aby znaleźć zastosowanie w praktyce klinicznej. Ponadto usuwanie zanieczyszczeń poprzez wirowanie może nie być wystarczające do oczyszczenia większości zainfekowanych patogenów oraz usunięcia białek o wysokiej zawartości, które często utrudniają identyfikację niskonakładowego peptydomu.
Konwencjonalne podejścia proteomiczne, wykorzystujące przede wszystkim dwuwymiarową elektroforezę żelową (2-DE) w połączeniu z trawieniem w żelu, pozwalają na identyfikację wielu białek śliny 5-6. Jednak podejście to zazwyczaj nie jest wystarczająco czułe, aby wykryć peptydy i białka występujące w niskich stężeniach. Alternatywą jest proteomika oparta na chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas (LC-MS), która umożliwia identyfikację białek bez wcześniejszej separacji metodą 2-DE. Chociaż metoda ta zapewnia wyższą czułość, zazwyczaj wymaga wcześniejszego rozfrakcjonowania próbki 7 oraz trawienia trypsyną, co utrudnia jej zastosowanie w praktyce klinicznej.
Aby uniknąć utrudnień w spektrometrii mas wynikających z przygotowania próbek, opracowaliśmy technikę zwaną sondami do kapilarnej ultrafiltracji (CUF) 8-11. Dane z naszego laboratorium wykazały, że sondy CUF są w stanie wychwytywać białka in vivo z różnych mikrośrodowisk organizmów zwierzęcych w sposób dynamiczny i małoinwazyjny 8-11. Wirowanie nie jest konieczne, ponieważ podciśnienie jest wytwarzane poprzez proste zasysanie strzykawką podczas pobierania próbki. Sondy CUF w połączeniu z LC-MS pozwoliły na pomyślną identyfikację białek poddanych trawieniu trypsyną 8-11. W niniejszej pracy udoskonaliliśmy technikę pobierania próbek metodą ultrafiltracji, tworząc sondę do ultrafiltracji o kształcie lizaka (LLUF), która może z łatwością zmieścić się w ludzkiej jamie ustnej. Bezpośrednia analiza LC-MS bez trawienia trypsyną wykazała, że ludzka ślina naturalnie zawiera wiele fragmentów peptydowych pochodzących z różnych białek. Pobieranie śliny za pomocą sond LLUF pozwoliło uniknąć wirowania, a jednocześnie skutecznie usunęło wiele większych i wysokobobilnych białek. Wyniki spektrometrii mas wykazały, że wiele peptydów o niskiej obfitości stało się wykrywalnych po odfiltrowaniu większych białek za pomocą sond LLUF. Detekcja niskobobilnych peptydów śliny była niezależna od wieloetapowej separacji próbek za pomocą chromatografii. W zastosowaniach klinicznych sondy LLUF zintegrowane z LC-MS mogłyby w przyszłości służyć do monitorowania progresji chorób na podstawie analizy śliny.

Biorąc pod uwagę pobieranie próbek śliny do przyszłych zastosowań klinicznych, opracowano sondę ultrafiltracyjną w formie lizaka (LLUF), dopasowaną do ludzkiej jamy ustnej. Bezpośrednia analiza niestrawionej śliny za pomocą spektrometrii mas NanoLC-LTQ wykazała zdolność sond LLUF do usuwania dużych białek oraz białek o wysokiej zawartości, co zwiększyło wykrywalność peptydów o niskiej zawartości.

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Choć proteom i peptydom białek śliny człowieka zostały opisane 1-2, zidentyfikowano je głównie na podstawie trawienia trypsynowego białek śliny. Identyfikacja ...

Niniejsze badanie peptydów śliny wykorzystuje sondę do ultrafiltracji typu „lollipop” (LLUF), a następnie bezpośrednią analizę nano LC-LTQ MS. Najpierw należy złożyć sondę LLUF, używając membrany z polieterosulfonu oraz rurki z etylenu i propylenu. Następnie należy pobrać próbki śliny od ochotników i przetworzyć je za pomocą sondy LLUF w celu pobrania próbki śliny.Następnie należy przejść bezpośrednio do nano L-C-L-T-Q spektrometrii mas i przeanalizować dane z próbek śliny z zastosowaniem oraz bez zastosowania sondy LLUF. Ostatecznie peptyd śliny można uzyskać poprzez analizę danych L-C-M-S-S i porównanie zidentyfikowanych peptydów między obiema próbkami. To podejście, wykorzystujące ultrafiltracyjną sondę w kształcie lizaka w połączeniu z bezpośrednią analizą nano lc LTQ spektrometrią mas, oferuje kluczowe zalety w porównaniu z innymi metodami, takimi jak trawienie białek śliny do peptydów.Następnie przeprowadzono analizę spektrometrią mas. LUF PRO upraszcza i oczyszcza ślinę, a także zwiększa detekcję peptydów metodą MS w całej ślinie do zastosowań klinicznych. Za pomocą kleju epoksydowego przyklejono membrany polieterowe do krawędzi trójkątnych łopatek z polipropylenu. Następnie

sampling-human-indigenous-saliva-peptidome-using-lollipop-like

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pobieranie próbek peptidomu śliny ludzkich rdzennych gatunków za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej sliwkę: uproszczenie i ulepszenie wykrywania peptydów dla spektrometrii masowej klinicznej

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Przedstawiono metodę analizy spektrometrycznej endogennych peptydów w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Dzięki zastosowaniu filtracji odcięcia masy cząsteczkowej, wstępnego frakcjonowania chromatograficznego, analizy spektrometrii mas i późniejszej kombinacji strategii identyfikacji peptydów, możliwe było prawie dziesięciokrotne rozszerzenie znanego peptydomu płynu mózgowo-rdzeniowego w porównaniu z poprzednimi badaniami.

Przygotowanie próbki do analizy endopeptydomicznej w ludzkim płynie mózgowo-rdzeniowym

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ten artykuł przedstawia metody przygotowania próbek dla unikalnej metody analitycznej w czasie rzeczywistym opartej na spektrometrii mas otoczenia. Metoda ta pozwala nam na przeprowadzanie analizy cząsteczek biologicznych in vivo w czasie rzeczywistym bez konieczności przeprowadzania specjalnych zabiegów wstępnych.

Przygotowanie próbki do spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania sondy

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Modyfikacje potranslacyjne (PTM) zmieniają struktury i funkcje białek. Metody jednoczesnego wzbogacania wielu typów PTM mogą maksymalizować pokrycie w analizach. Przedstawiamy protokół wykorzystujący dwufunkcyjną chromatografię powinowactwa do metali immobilizowaną Ti(IV), a następnie spektrometrię mas do jednoczesnego wzbogacania i analizy N-glikozylacji i fosforylacji białek w tkankach trzustki.

Strategia wzbogacania spin-tip do jednoczesnej analizy N-glikopeptydów i fosfopeptydów z ludzkich tkanek trzustki

Przedstawiono protokół do oznaczania biomarkerów o niskiej obfitości z wysuszonych próbek surowicy, czego przykładem jest biomarker peptydu uwalniającego progastrynę (ProGRP). Kulki magnetyczne pokryte przeciwciałami są używane do selektywnego oczyszczania i wzbogacania proteotypowego peptydu ProGRP. Wychwycony peptyd jest następnie analizowany za pomocą chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas.

Mikropróbkowanie w ukierunkowanej analizie białek o niskiej liczebności opartej na spektrometrii mas

Szczegółowy protokół jest dostarczony do czyszczenia i ponownego użycia probówek ultrawirówek z poliwęglanu do przeprowadzenia izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych odpowiednich do eksperymentów proteomicznych.

Ponowne wykorzystanie probówki ultrawirówkowej z poliwęglanu w analizach proteomicznych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Niniejsza praca przedstawia innowacyjne podejście wizualne (fotogłos lub fotoelicytacja), mające na celu zapewnienie sprawiedliwego procesu opieki klinicznej nad pacjentami z przewlekłymi schorzeniami, naświetlenie luk w wiedzy klinicznej, budowanie lepszych relacji terapeutycznych oraz identyfikację celów zorientowanych na pacjenta i możliwości leczenia.

Wykorzystanie metod wizualnych i narracyjnych w celu zapewnienia sprawiedliwego procesu w opiece klinicznej

Poznaj metodę pobierania próbek ludzkiej śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej LLUF, która upraszcza wykrywanie peptydów w spektrometrii mas. Technika ta usprawnia diagnostykę kliniczną.

Pobieranie próbek ludzkiej rdzennej peptydome śliny za pomocą sondy ultrafiltracyjnej przypominającej lizak: uprość i ulepsz wykrywanie peptydów w klinicznej spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal

Próbkowanie peptydomu ludzkiej śliny z wykorzystaniem sondy ultrafiltracyjnej o kształcie lizaka: uproszczenie i usprawnienie detekcji peptydów w klinicznej spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów