Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w celu zbadania funkcji genów w raku

Ogólnym celem tej procedury jest określenie funkcji genu poprzez zastosowanie interferencji RNA opartej na wektorze DNA. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie i wygenerowanie konstruktów S-H-R-N-A, które są ukierunkowane na określone geny. Drugim krokiem jest wyprodukowanie lentiwirusa przenoszącego kasetę ekspresji SH RNA.

Następnie stabilne linie komórkowe są generowane przez zakażenie komórek lentiwirusem, a komórki zakażone lentiwirusem są wykorzystywane w różnych testach in vitro i in vivo w celu określenia skutków wyciszenia genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ostatecznie, w zależności od zastosowanych testów, wyniki mogą wykazać zmiany w genowości guza komórek w wyniku knockdownu genów poprzez zastosowanie testów proliferacji, migracji i inwazji in vitro, a także modeli tworzenia ksenoprzeszczepów in vivo. Procedurę zademonstruje Daniel Stowell, ma Juan, a Daniel jest doktorantem w moim laboratorium, a Ma Ma jest technikiem.

Chang jest adiunktem. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak to, czy określony gen odgrywa rolę w rozwoju i progresji raka oraz dla jakich aspektów tych procesów może być ważny. Aby rozpocząć, zaprojektuj i uporządkuj oligonukleotydy w oparciu o opisane kryteria, Anil dwa odwrotne komplementarne oligonukleotydy, które zawierają od 20 do 23 nukleotydów docelowych sekwencji w genie docelowym.

Na dwóch końcach utworzą one trzy lokalizacje w wersji eco R i trzy w języku hindi. Po uklęczeniu, inny oligo zawiera odwrotną sekwencję komplementarną do sekwencji docelowej i jej trzy główne końce. Neils do trzech głównych końców promotora H jeden lub U sześć z podkładem upstream.

Użyj PCR, aby utworzyć fragment, który ma BAM H jedno i hindi trzy miejsca na obu końcach. W międzyczasie trawić wektor lentiwirusa i fragment PCR. Następnie przeprowadzić reakcję ligacji trzech fragmentów między wektorem, fragmentem PCR i oligonukleotydami anilu.

Przy stosunku molowym od jednego do 10 do 10 wynikowy wektor wytworzy interesujące HRNA z trzema sekwencjami hindi w regionie pętli. Jeśli zostanie użyty wektor indukowalny, produkcja HRNA będzie zależeć od obecności cząsteczki induktora, takiej jak doksycyklina dla systemu Tet on. Teraz przekształć wysoce wydajne, kompetentne komórki alfa E coli DH za pomocą ligowanego produktu i zidentyfikuj dodatnie wektory za pomocą badania przesiewowego PCR opartego na kolonii.

Amplifikuj produkt, który obejmuje wektor i miejsce podwiązania indukowalnego promotora. Przygotuj DNA osocza z dodatnich kolonii za pomocą zestawu komercyjnego. Następnie potwierdzić obecność insertu poprzez trawienie BAM H one i ECO R one oraz elektroforezę agarozy DNA.

Dodatkowo zsekwencjonuj region zawierający promotor i S-H-R-N-A za pomocą nukleotydu LIGA P pięć. Korzystając z zestawu przygotowawczego MIDI lub maxi bez endotoksyn, przygotuj DNA lentiwirusa przenoszące kasetę ekspresji HRNA. Określić stężenie DNA, mierząc absorpcję światła przy 260 nanometrach i upewnić się, że czystość DN a, sprawdzając, czy stosunek absorpcji światła 260 do 280 nanometrów wynosi od 1,8 do 2,0.

Na koniec uruchom plazmid lentiwirusa na aerożelu, aby upewnić się, że jest zwinięty w kształcie litery S Przed transfekcją przygotuj się do transfekcji, najpierw powoli wrzucając 0,9 mililitra roztworu A do 0,9 mililitra roztworu B, jednocześnie bulgocząc powietrzem przez roztwór B za pomocą pipety. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie powoli upuść 0,6 mililitra mieszaniny na trzy różne 10-centymetrowe płytki z komórkami T HEK 2 93.

Następnie włóż komórki z powrotem do inkubatora cztery do sześciu godzin później. Zastąp pożywkę siedmioma mililitrami kompletnej pożywki DMEM. Po 24 godzinach dodaj pięć kolejnych mililitrów pożywki, a po kolejnych 24 godzinach zbierz podłoże zawierające lentiwirusa.

Wirować zebrane podłoże z prędkością 1500 obr./min w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przefiltrować supernatant za pomocą filtra 0,45 mikrometra. Odwirować przepływ przez pożywkę zawierającą lentiwirusa przez ultra odwirowanie.

Zdekantować supernatant do pojemnika na odpady zawierającego 5% wybielacza. Zawiesić osad lentiwirusa w połowie do jednego mililitra zimnego XPBS. Następnie podzielić roztwór lentiwirusa na 50 do 100 mikrolitrów podwielokrotności do przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Na koniec określ miano lentiwirusa za pomocą niezawodnej techniki. Zazwyczaj 10-centymetrowa miska hodowlana wytwarza od 50 do 100 milionów jednostek zakaźnych przed przystąpieniem do infekcji komórek. Określ MOI miana lentiwirusa za pomocą zestawu lub R-T-P-C-R do tej procedury.

Zalecany jest MOI niższy niż cztery. Zacznij od wysiewu komórek, które mają być zainfekowane, na płytce sześciodołkowej do płynności 30 do 40% co i hoduj je przez noc. Następnego dnia.

Zastąp pożywkę jednym mililitrem świeżej, pożywki zawierającej poli mózg lub protaminę. Następnie dodaj od jednego do 2 milionów j.m. lentiwirus zawierający marker fluorescencyjny lub antybiotykowy.

Powoli potrząsaj płytką przez 10 sekund, aby wymieszać i inkubować przez sześć godzin. Po sześciu godzinach zastąp pożywkę normalną, kompletną pożywką i rozmnażaj komórki przez dwa dni. Pożywka nie powinna zawierać antybiotyków ani induktorów, niezależnie od lentiwirusa użytego po dwóch dniach.

Dodać odpowiedni antybiotyk, jeśli lentiwirus zawiera marker antybiotykowy. Podobnie, dodaj induktor do połowy kultur, jeśli lentiwirus jest indukowalny. Po hodowli komórek przez kolejne dwa lub trzy dni za pomocą antybiotyków i induktorów, przeprowadź zachodnią analizę krwi, aby przetestować knockdown docelowego genu przed ksenoprzeszczepem trypsyny w oczach.

Komórki z dużych naczyń do hodowli komórkowych i ponownie zawieś je w oryginalnym podłożu zawierającym 50% matrigelu. Niezbędne jest utrzymanie ponownego zawieszenia komórek rakowych i w 50% matrigelu i strzykawce na lodzie. W przeciwnym razie istnieje ryzyko, że matrigel stwardnieje, a infekcja będzie musiała o tym wiedzieć.

Przygotuj miejsce operacji, dokładnie oczyszczając je 70% etanolem i przeprowadź znieczulenie z doskonałą wentylacją i filtrem przedmuchiwającym fluor dołączonym do komory indukcyjnej. Znieczulenie nagich myszy grasicy za pomocą 2% izofluoru zmieszanego z 1,5% tlenu na trzy do pięciu minut przed inokulacją komórek. Następnie utrzymuj znieczulenie za pomocą 2% izofu zmieszanego z tlenem przez stożek nosowy.

Umieść mysz na poduszce grzewczej ustawionej na 30 stopni Celsjusza. Załaduj komórki do strzykawek z igłami o rozmiarze 25 i pół do wstrzyknięć podskórnych lub igłami o rozmiarze od 28 do 30 do iniekcje ortotopowe. Pięć minut po indukcji znieczulenia w jednym lub dwóch miejscach wstrzyknij od jednego do 10 milionów komórek w 200 mikrolitrowych bolusach.

Liczba komórek zależy od złośliwości lub agresywności komórek rakowych. W przypadku konstytutywnie aktywnych wektorów należy wykorzystać dwie grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki wyrażające docelowy gen S-H-R-N-A lub zaszyfrowany fortet S-H-R-N-A na wektorach. Użyj tych samych dwóch grup i podziel je na podgrupy, które są lub nie mają induktora w swojej wodzie.

Wymieniaj dokumenty zawierające wodę dwa razy w tygodniu. Monitoruj objętość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą C. Upewnij się, że objętość guza nie przekracza limitu instytucjonalnego lub A CUC i poddaj eutanazji wszystkie zwierzęta, które wykazują rozległe owrzodzenie, martwicę, oczywistą infekcję, niekontrolowane krwawienie lub schyłkową fazę choroby. Aby monitorować wzrost guza i przerzuty za pomocą markera bioluminescencyjnego, należy zdezynfekować obszar roboczy i znieczulić myszy w komorze obrazowania ze znieczuleniem gazowym.

Najpierw wykonaj ekspozycję od dwóch do pięciu minut i sprawdź intensywność sygnału, a następnie odpowiednio dostosuj. Jeśli rozmiar guza przekracza 1000 milimetrów sześciennych lub instytucjonalny limit wielkości, należy poddać zwierzę eutanazji po złożeniu ofiary, udokumentować rozmiar guza i zachować go do dalszej analizy. Protokół ten został wykorzystany do zbadania wpływu Y one knockdown na tworzenie się guza ksenoprzeszczepu lucyferazy wyrażającej ludzkie komórki gruczolakoraka piersi wszczepione atymicznym nagim myszom.

Przetestowano docelową sekwencję S-H-R-N-A ludzkiej YY i zakodowaną kontrolną S-H-R-N-A, która nie miała znaczącego podobieństwa do żadnego znanego ludzkiego transkryptu. W rezultacie skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe, które wykorzystano do produkcji dwóch lentiwirusów. Oba zostały użyte do zakażenia dwóch różnych populacji komórek i uzyskano populacje komórek poliklonalnych.

Po selekcji pur mycyny. Zachodnia analiza krwi potwierdziła, że DS wywołał YY jeden knockdown w tych zakażonych liniach komórkowych. Następnie populacja komórek poliklonalnych klonu trzeciego, który został zakażony indukowalnym YY jeden S-H-R-N-A i kontrola. S-H-R-N-A.

LENTIWIRUSY wykorzystano do przetestowania wpływu wyczerpania YY one na inwazję. Zaobserwowaliśmy, że YY jedno zubożenie zmniejszyło inwazyjność komórek. Zachodnia analiza krwi potwierdziła, że lekarze wyciszyli YY w komórkach z indu YY jednym S-H-R-N-A, podczas gdy komórki zawierające kontrolę.

S-H-R-N-A nie wykazywała tego efektu. Komórki te zostały następnie wykorzystane w badaniu na mysim modelu ksenoprzeszczepu w porównaniu z grupami kontrolnymi indu, YY jedna myszy z implantacją S-H-R-N-A zaopatrzone w dos zawierające wodę wykazały znacznie zmniejszone tworzenie się guza podczas wizualizacji za pomocą bioluminescencji i gdy masa guza była mierzona zgodnie z oczekiwaniami. YY jedno wyciszenie w tych guzach ksenoprzeszczepu zostało łatwo potwierdzone przez western blot.

Badania Nie zapominaj, że praca z lentiwirusem może być niezwykle niebezpieczna zgodnie z zasadami bezpieczeństwa NIHB w przypadku badań z wektorami lentiwirusowymi o podwyższonym poziomie bezpieczeństwa B: we wszystkich warunkach laboratoryjnych wymagane są dwie procedury przechowawcze.