Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie funkcji genu przy użyciu interferencji RNA opartej na wektorach DNA. Jest to osiągane poprzez projektowanie i generowanie konstruktów shRNA celujących w specyficzne geny, a następnie produkcję lentiwirusa przenoszącego kasetę ekspresyjną shRNA.

Następnie tworzy się stabilne linie komórkowe poprzez zakażenie komórek lentiwirusem, a komórki te są wykorzystywane w różnych analizach in vitro i in vivo w celu określenia efektów wyciszenia badanego genu. W zależności od zastosowanych analiz, wyniki mogą wykazać zmiany w geniczności nowotworowej komórek w wyniku knockdownu genu, co ocenia się za pomocą testów proliferacji, migracji i inwazji in vitro, a także w modelach tworzenia ksenoprzeszczepów in vivo. Procedurę zaprezentują Daniel Stowell oraz Ma Juan; Daniel jest doktorantem w moim laboratorium, a Ma jest technikiem.

Chang jest stypendystą postdoc. Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad nowotworami, takie jak to, czy konkretny gen odgrywa rolę w rozwoju i progresji raka oraz dla których aspektów tych procesów może on być istotny. Aby rozpocząć, należy zaprojektować i zamówić oligonukleotydy zgodnie z opisanymi kryteriami – Anil, dwa odwrotne komplementarne oligo zawierające docelową sekwencję od 20 do 23 nukleotydów w genie docelowym.

Na obu końcach utworzą one miejsca restrykcyjne dla EcoRI oraz HindIII. Po wyżarzaniu inny oligonukleotyd, zawierający sekwencję odwrotno-dopełniającą do sekwencji docelowej, przyłącza się swoim końcem 3' do końca 3' promotora H1 lub U6 za pomocą startera upstream.

Wykorzystaj technikę PCR do przygotowania fragmentu posiadającego miejsca rozpoznawane przez enzymy BAM H I oraz Hind III na obu końcach. W międzyczasie przeprowadź trawienie wektora lentiwirusowego oraz fragmentu PCR. Następnie przeprowadź reakcję ligacji trzech fragmentów: wektora, fragmentu PCR oraz oligonukleotydów Anil.

Przy stosunku molowym 1:10:10 otrzymany wektor będzie produkował interesujący hRNA z sekwencją Hindi III w regionie pętli. W przypadku zastosowania wektora indukowalnego, produkcja hRNA będzie zależeć od obecności cząsteczki induktora, takiej jak doksycyklina w systemie Tet on. Następnie przeprowadź transformację wysokowydajnych, kompetentnych komórek E. coli DH5α za pomocą produktu ligacji i zidentyfikuj pozytywne wektory, stosując screening PCR kolonii.

Należy przeprowadzić amplifikację produktu obejmującego wektor oraz miejsce ligacji indukowalnego promotora. DNA plazmidowe z dodatnich kolonii należy wyizolować za pomocą komercyjnego zestawu. Następnie należy potwierdzić obecność insertu poprzez trawienie enzymami BAM H one i ECO R one oraz elektroforezę DNA w żelu agarozowym.

Dodatkowo należy przeprowadzić sekwenconowanie regionu zawierającego promotor i S-H-R-N-A przy użyciu startera LIGA nucleotide P five. Korzystając z zestawu do midi- lub maxi-preparatyki pozbawionego endotoksyn, należy przygotować DNA lentiwirusa zawierające kasetę ekspresyjną HRNA. Stężenie DNA należy określić poprzez pomiar absorbancji przy 260 nm, a czystość DNA potwierdzić, sprawdzając, czy stosunek absorbancji przy 260 do 280 nm mieści się w zakresie od 1,8 do 2,0.

Na koniec przeprowadź elektroforezę plazmidu lentiwirusowego na żelu agarozowym, aby upewnić się, że jest on w formie superzwiniętej. Przed transfekcją przygotuj mieszaninę do procesu, powoli dodając 0,9 ml roztworu A do 0,9 ml roztworu B, jednocześnie napowietrzając roztwór B za pomocą pipety. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Potem powoli nanieś po 0,6 ml mieszaniny na trzy różne płytki 10 centymetrowe z komórkami HEK 293T.

Następnie po czterech do sześciu godzinach przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Wymień pożywkę na 7 ml pełnej pożywki DMEM. Po 24 godzinach dodaj kolejne 5 ml pożywki, a po kolejnych 24 godzinach zbierz pożywkę zawierającą lentiwirusa.

Wiruj zebraną pożywkę z prędkością 1500 RPM w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przefiltruj nadsącz za pomocą filtra o rozmiarze porów 0,45 mikrometra. Wiruj przefiltrowaną pożywkę zawierającą lentiwirusa za pomocą ultrawirowania.

Zlej supernatant do pojemnika na odpady zawierającego 5% bleach. Resuspenduj osad lentiwirusa w ilości od pół do jednego mililitra zimnego 1x PBS. Następnie podziel roztwór lentiwirusa na aliquoty po 50 do 100 µL do przechowywania w temperaturze -80 °C.

Na koniec należy oznaczyć miano lentiwirusa, wykorzystując wiarygodną metodę. Typowo szalka hodowlana o średnicy 10 centymetrów pozwala uzyskać od 50 do 100 milionów jednostek zakaźnych przed przystąpieniem do infekcji komórek. W tej procedurze należy określić MOI miana lentiwirusa, używając odpowiedniego zestawu lub metody R-T-P-C-R.

Zaleca się stosowanie MOI niższego niż cztery. Należy rozpocząć od wysiania komórek do zakażenia na płytkę sześciodołkową do 30 do 40% konfluencji i inkubowania ich przez noc. Następnego dnia.

Wymień pożywkę na 1 ml świeżej pożywki zawierającej poly-brene lub protaminę. Następnie dodaj od 1 do 2 milionów j.m. lentiwirusa zawierającego marker fluorescencyjny lub antybiotykowy.

Powoli potrząsaj płytką przez 10 sekund w celu wymieszania zawartości, a następnie inkubuj ją przez sześć godzin. Po sześciu godzinach wymień pożywkę na zwykłą pożywkę kompletną i propaguj komórki przez dwa dni. Po dwóch dniach pożywki nie powinny zawierać antybiotyków ani induktorów, niezależnie od rodzaju użytego lentiwirusa.

Dodaj odpowiedni antybiotyk, jeśli lentiwirus zawiera marker antybiotykowy. Podobnie, dodaj induktor do połowy kultur, jeśli lentiwirus jest indukowalny. Po hodowaniu komórek przez kolejne dwa lub trzy dni z antybiotykami i induktorami, przeprowadź analizę western blot, aby sprawdzić knockdown genu docelowego przed trypsynizacją komórek do ksenoprzeszczepu.

Przenieś komórki z dużych naczyń hodowlanych i resuspenduj je w oryginalnym medium zawierającym 50% matrigelu. Niezbędne jest utrzymywanie resuspendowanych komórek nowotworowych w 50% matrigelu oraz strzykawki w lodzie. W przeciwnym razie istnieje ryzyko, że matrigel stężeje, co zmusi do ponownego wykonania procedury.

Przygotować pole operacyjne, dokładnie oczyszczając je 70% ethanol, a następnie przeprowadzić znieczulenie przy zapewnieniu doskonałej wentylacji i z filtrem pochłaniającym izofluran zamontowanym do komory indukcyjnej. Znieczulić myszy nude (bez grasicy) przy użyciu 2% isof fluorine zmieszanego z 1,5% oxygen na trzy do pięciu minut przed inokulacją komórek. Następnie podtrzymać znieczulenie, podając 2% isof fluorine zmieszany z oxygen za pomocą maski nosowej.

Umieść mysz na podgrzewaczu ustawionym na 30 °C. Przenieś komórki do strzykawek z igłami o rozmiarze 25,5 G do iniekcji podskórnych lub 28–30 G do iniekcji ortotopowych. Pięć minut po indukcji znieczulenia, w jednym lub dwóch miejscach, wstrzyknij od 1 do 10 milionów komórek w bolusach o objętości 200 µL.

Liczba komórek zależy od stopnia złośliwości lub agresywności komórek nowotworowych. W przypadku wektorów konstytutywnie aktywnych należy wykorzystać dwie grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki wykazujące ekspresję odpowiednio genu docelowego S-H-R-N-A lub sekwencji kontrolnej (scrambled) S-H-R-N-A na wektorach. Tych samych dwie grupy należy podzielić na podgrupy, którym podawano induktor w wodzie do picia lub go nie podawano.

Wymieniaj wodę w poidłach dwa razy w tygodniu. Monitoruj objętość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą suwmiarki. Upewnij się, że objętość guza nie przekracza limitów instytucjonalnych lub ACUC i poddaj eutanazji wszystkie zwierzęta wykazujące rozległe owrzodzenia, martwicę, oczywistą infekcję, niekontrolowane krwawienie lub chorobę w stadium terminalnym. Aby monitorować wzrost guza i przerzuty za pomocą markera bioluminescencyjnego, zdezynfekuj obszar roboczy i znieczul myszy w komorze obrazującej za pomocą znieczulenia gazowego.

W pierwszej kolejności należy wykonać naświetlanie od dwóch do pięciu minut, sprawdzić intensywność sygnału, a następnie odpowiednio ją dostosować. Jeśli rozmiar guza przekroczy 1000 mm³ lub limit wielkości przyjęty w danej instytucji, należy poddać zwierzę eutanazji w momencie uboju, udokumentować wielkość guza i zachować go do dalszych analiz. Niniejszy protokół został zastosowany w celu zbadania wpływu wyciszenia genu why Y one na tworzenie ksenoprzeszczepów guzów z ludzkich komórek gruczolakoraka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy, wszczepionych beztymusowym myszom nago.

Przetestowano sekwencję docelową S-H-R-N-A dla ludzkiego YY1 oraz kontrolne, wymieszane S-H-R-N-A, które nie wykazywało istotnego podobieństwa do żadnego znanego ludzkiego transkryptu. W wyniku tego skonstruowano dwa wektory lentiwirusem, które wykorzystano do wytworzenia dwóch lentiwirusów. Oba posłużyły do zainfekowania dwóch różnych populacji komórek, w wyniku czego uzyskano poliklonalne populacje komórek.

Po selekcji puromycyną analiza Western blot potwierdziła wywołany przez doksycyklinę knockdown YY1 w tych zakażonych liniach komórkowych. Następnie wykorzystano poliklonalną populację komórek klonu trzeciego, który został zakażony indukowalnym YY1 shRNA oraz kontrolnym shRNA.

Do zbadania wpływu deplecji YY1 na inwazję wykorzystano LENTIWIRUSY. Zaobserwowaliśmy, że deplecja YY1 zmniejszyła inwazyjność komórek. Analiza Western blot potwierdziła indukowane wyciszenie YY1 w komórkach z indukowanym shRNA przeciwko YY1, podczas gdy komórki zawierające kontrolę.

W przypadku S-H-R-N-A efekt ten nie wystąpił. Komórki te zostały następnie wykorzystane w badaniu z użyciem modelu ksenoprzeszczepu u myszy w porównaniu z grupami kontrolnymi indu, YY jeden; u myszy z implantowanymi komórkami S-H-R-N-A, którym podawano wodę, zaobserwowano znacząco zredukowane tworzenie guzów w obrazowaniu bioluminescencyjnym oraz w pomiarach masy guza, zgodnie z oczekiwaniami. Wyciszenie YY jeden w tych guzach ksenoprzeszczepionych zostało potwierdzone za pomocą analizy western blot.

Badania Należy pamiętać, że praca z lentiwirusami może być niezwykle niebezpieczna zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa NIHB dotyczącymi badań z wektorami lentiwirusowymi; we wszystkich warunkach laboratoryjnych wymagane jest stosowanie procedur zabezpieczających odpowiadających drugiemu poziomowi bezpieczeństwa biologicznego (BSL-2).