Name: Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w celu zbadania funkcji genów w raku (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: Poznaj metodę interferencji RNA opartą na wektorach DNA do badania funkcji genów w raku. Technika ta umożliwia długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów w komórkach nowotworowych oraz modelach zwierzęcych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo wspierana przez granty Research Scholar Grants (116403-RSG-09-082-01-MGO) z American Cancer Society oraz fundusze wewnętrzne Wake Forest University Health Sciences przyznane GS. DBS otrzymał wsparcie z grantu szkoleniowego NCI 5T32CA079448.

<ol><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncog%22%5BJournal%5D)">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li>
<li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li>
<li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+%28MOI%29+for+predicting+gene+transfer+events%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6(2004).</li>
<li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Niniejszy protokół opisuje metodę wyciszania genu za pomocą shRNA oraz wizualizacji jego efektu biologicznego przy użyciu obrazowania bioluminescencyjnego wzrostu komórek nowotworowych in vivo. Miejsce docelowe shRNA nie powinno zawierać żadnego z trzech miejsc restrykcyjnych (BamHI, HindIII oraz EcoRI) wykorzystywanych do subklonowania. W rzadkich przypadkach, gdy którekolwiek z tych miejsc jest obecne, do stworzenia konstruktu można użyć dodatkowego enzymu restrykcyjnego w celu jego zastąpienia.
<p class="...

<table><tbody><tr><td colspan="4">Oprócz powszechnie stosowanego wyposażenia laboratoryjnego do analiz RNA i białek oraz hodowli komórkowych, do wykonania niniejszego protokołu wymagane są następujące materiały i odczynniki.</td></tr><tr><td>dygestorium z laminarnym przepływem powietrza odpowiednie dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora indukcji znieczulenia z systemem odsysania izofluranu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy suwmiarka noniuszowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>system obrazowania IVIS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wysoce kompetentne szczepy E. coli DH5a</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoRI, BamHI, &amp;enzymy restrykcyjne amp; HindIII</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmidy pakujące trzeciej generacji lentiwirusowe VSV-G, pRSV-Rev i pMDLg/pRRE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Lista materiałów&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

interferencja rna oparta na wektorach dna w badaniu funkcji genów w nowotworach

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

Interferencja RNA (RNAi) hamuje ekspresję genów poprzez specyficzną degradację docelowych cząsteczek mRNA. Od czasu odkrycia dwuniciowych krótkich interferujących RNA (siRNA) w procesie wyciszania genów1, RNAi stało się potężnym narzędziem badawczym w studiach nad funkcjami genów. W porównaniu z delecją genetyczną, wyciszanie genów za pośrednictwem RNAi posiada wiele zalet, takich jak łatwość przeprowadzenia oraz odpowiedniość dla większości linii komórkowych. Liczne badania wykazały zastosowania technologii RNAi w badaniach nad nowotworami. W szczególności opracowanie technologii opartej na wektorach DNA do produkcji krótkich rybich RNA (shRNA) sterowanych przez promotor U6 lub H1 umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów2,3. Jej zastosowanie w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi wektorami wirusowymi, takimi jak lentiwirusy, ułatwia wysoką wydajność dostarczania shRNA i/lub jego integrację z DNA genomowym w celu stabilnej ekspresji shRNA.
Opisujemy szczegółową procedurę z wykorzystaniem technologii RNAi opartej na wektorach DNA w celu określenia funkcji genów, obejmującą konstrukcję wektorów lentiwirusowych wykazujących ekspresję shRNA, produkcję lentiwirusów i infekcję komórek, a także badania funkcjonalne z wykorzystaniem modelu ksenoprzeszczepu mysiego. 
W literaturze opisano różne strategie generowania konstruktów shRNA. Protokół opisany w niniejszej pracy, wykorzystujący amplifikację PCR oraz ligację trzech fragmentów, może być użyty do bezpośredniego i wydajnego generowania konstruktów lentiwirusowych zawierających shRNA, bez pozostawiania dodatkowych nukleotydów sąsiadujących z sekwencją kodującą shRNA. Ponieważ kasety ekspresyjne shRNA utworzone za pomocą tej strategii mogą być wycinane enzymami restrykcyjnymi, mogą być one łatwo przenoszone do innych wektorów z różnymi markerami fluorescencyjnymi lub antybiotykowymi. Większość komercyjnych odczynników do transfekcji może być stosowana w produkcji lentiwirusów. W niniejszym raporcie przedstawiamy jednak ekonomiczną metodę z wykorzystaniem wytrącania fosforanu wapnia, która pozwala osiągnąć ponad 90% wydajności transfekcji w komórkach 293T. W porównaniu z wektorami do konstytutywnej ekspresji shRNA, indukowalny system shRNA jest szczególnie odpowiedni do wyciszania genów niezbędnych dla proliferacji komórek. Demonstrujemy wyciszenie genu Yin Yang 1 (YY1), potencjalnego onkogenu w raku piersi4,5, za pomocą indukowalnego systemu shRNA Tet-On oraz jego wpływ na tworzenie nowotworów. Badania z wykorzystaniem lentiwirusów wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu bezpieczeństwa biologicznego przez Komitet Bezpieczeństwa Biologicznego w instytucji badawczej. Badania z wykorzystaniem modeli zwierzęcych wymagają przeglądu i zatwierdzenia protokołu zwierzęcego przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (ACUC) w instytucji badawczej.

Interferencja RNA (RNAi) posiada wiele zalet w porównaniu z nokautem genów i jest szeroko stosowana jako narzędzie w badaniach nad funkcjami genów. Wynalezienie technologii RNAi opartej na wektorach DNA umożliwiło długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów, a także zwiększyło wykonalność wyciszania genów in vivo.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Interferencja RNA (RNAi) hamuje ekspresję genów poprzez specyficzną degradację docelowych mRNA. Od czasu odkrycia dwuniciowych krótkich interferencyjnych RNA ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie funkcji genów przy użyciu interferencji RNA opartej na wektorach DNA. Zostaje to osiągnięte poprzez zaprojektowanie i wygenerowanie konstruktów shRNA celujących w konkretne geny, a w drugim kroku poprzez wytworzenie lentiwirusa niosącego kasetę ekspresyjną shRNA.Następnie tworzy się stabilne linie komórkowe poprzez zakażenie komórek lentiwirusem, a komórki zakażone lentiwirusem wykorzystuje się w różnych testach in vitro i in vivo, aby określić efekty wyciszenia badanego genu. Ostatecznie, w zależności od zastosowanych testów, wyniki mogą wykazać zmiany w geniczności nowotworowej komórek w wyniku knockdownu genu, co potwierdzają testy proliferacji, migracji i inwazji in vitro, a także modele tworzenia ksenograftów in vivo. Procedurę zaprezentują Daniel Stowell oraz Ma Juan; Daniel jest studentem studiów doktoranckich w moim laboratorium, a Ma jest technikiem.Chang jest pracownikiem naukowym na stażu podoktorskim. Ta metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad rakiem, takie jak to, czy konkretny gen odgrywa rolę w rozwoju i progresji nowotworu oraz dla których aspektów tych procesów może być on istotny. Aby rozpocząć, należy zaprojektować i zamówić oligonukleotydy zgodnie z opisanymi kryteriami; Anil przygotował dwa rewersyjnie komplementarne oligonukleotydy zawierające docelową sekwencję od 20 do 23 nukleotydów w genie docelowym.Na obu końcach utworzą one miejsca Eco R I oraz Hind III. Po wyżarzaniu kolejny oligonukleotyd, zawierający sekwencję odwrotnie komplementarną do sekwencji docelowej, przyłącza się swoim końcem 3' do końca 3' promotora H1 lub U6 za pomocą startera upstream.Wykonaj reakcję PCR w celu otrzymania fragmentu posiadającego miejsca rozpoznawane przez enzymy BamHI oraz HindIII na obu końcach. Równocześnie przeprowadź trawienie wektora lentiwirusowego oraz fragmentu PCR. Następnie przeprowadź reakcję ligacji trzech fragmentów: wektora, fragmentu PCR oraz oligonukleotydów Anil.Przy stosunku molarnym 1:10:10 otrzymany wektor będzie produkował interesujące nas hRNA z sekwencją Hindi III w regionie pętli. W przypadku użycia wektora indukowalnego produkcja hRNA będzie zależeć od obecności cząsteczki induktora, takiej jak doksycyklina w systemie Tet on. Następnie należy przeprowadzić transformację wysoko wydajnych, kompetentnych komórek e coli DH5α za pomocą produktu ligacji i zidentyfikować pozytywne wektory, stosując przesiewową metodę PCR w koloniach.Przeprowadź amplifikację produktu obejmującego wektor oraz miejsce ligacji indukowalnego promotora. Wyizoluj plazmidowe DNA z dodatnich kolonii za pomocą komercyjnego zestawu. Następnie potwierdź obecność wstawki poprzez trawienie enzymami BamH I i EcoR I oraz za pomocą elektroforezy DNA w żelu agarozowym.Dodatkowo należy przeprowadzić sekwencjonowanie regionu zawierającego promotor i S-H-R-N-A przy użyciu LIGA nucleotide P five. Wykorzystując zestaw do MIDI lub maxi prep wolny od endotoksyn, należy przygotować DNA lentiwirusa zawierające kasetę ekspresyjną HRNA. Stężenie DNA należy określić poprzez pomiar absorbancji przy 260 nanometrach, a czystość DNA potwierdzić, sprawdzając, czy stosunek absorbancji przy 260 do 280 nanometrach mieści się w przedziale od 1,8 do 2,0.Na koniec przeprowadź elektroforezę plazmidu lentiwirusowego na żelu agarozowym, aby upewnić się, że posiada on formę superzwiniętą. Przed transfekcją przygotuj odpowiednie roztwory, powoli dodając 0,9 ml roztworu A do 0,9 ml roztworu B, jednocześnie napowietrzając roztwór B za pomocą pipety. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut. W kolejnym kroku powoli nanieś 0,6 ml mieszaniny na trzy różne płytki 10 cm z komórkami HEK 293 T.Następnie, po upływie od czterech do sześciu godzin, przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Wymień pożywkę na 7 ml pełnej pożywki DMEM. Po 24 godzinach dodaj kolejne 5 ml pożywki, a po kolejnych 24 godzinach zbierz pożywkę zawierającą lentiwirusa.Wiruj zebrany medium z prędkością 1500 RPM w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Przefiltruj nadsącz za pomocą filtra 0,45 mikrometra. Wiruj przefiltrowane medium zawierające lentiwirusa w ultrawirówce.Zlejcie supernatant do pojemnika na odpady zawierającego 5% wybielacza. Resuspendujcie osad z lentiwirusa w ilości od 0,5 do 1 ml zimnego 1x PBS. Następnie podzielcie roztwór lentiwirusa na alikwoty o objętości od 50 do 100 µL w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.Na koniec należy określić miano lentiwirusa za pomocą wiarygodnej techniki. Zazwyczaj naczynie hodowlane o średnicy 10 centymetrów pozwala uzyskać od 50 do 100 milionów jednostek zakaźnych przed przystąpieniem do infekcji komórek. W tej procedurze należy wyznaczyć MOI miana lentiwirusa, wykorzystując odpowiedni zestaw lub metodę R-T-P-C-R.Zaleca się stosowanie MOI niższego niż cztery. Należy rozpocząć od wysiania komórek przeznaczonych do infekcji na płytkę sześciodołkową do uzyskania 30 do 40% konfluencji i inkubowania ich przez noc. Następnego dnia.Wymień pożywkę na 1 ml świeżej pożywki zawierającej polybrain lub protaminę. Następnie dodaj od 1 do 2 milionów j.m. lentiwirusa zawierającego marker fluorescencyjny lub antybiotykowy.Powoli potrząsaj płytką przez 10 sekund w celu wymieszania i inkubuj ją przez sześć godzin. Po sześciu godzinach wymień pożywkę na zwykłą, kompletną pożywkę i propaguj komórki przez dwa dni. Po dwóch dniach pożywki nie powinny zawierać antybiotyków ani induktorów, niezależnie od zastosowanego lentiwirusa.Jeśli lentiwirus zawiera marker antybiotykowy, należy dodać odpowiedni antybiotyk. Podobnie, w przypadku lentiwirusów indukowalnych, należy dodać induktor do połowy kultur. Po hodowli komórek przez kolejne dwa lub trzy dni z antybiotykami i induktorami, należy przeprowadzić analizę Western blot w celu sprawdzenia wyciszenia docelowego genu przed przygotowaniem ksenoprzeszczepów za pomocą trypsyny.Zebrać komórki z dużych naczyń hodowlanych i zawiesić je w oryginalnym medium zawierającym 50% matrigelu. Niezbędne jest utrzymywanie zawiesiny komórek nowotworowych w 50% matrigelu oraz strzykawki w lodzie. W przeciwnym razie istnieje ryzyko, że matrigel stwardnieje i proces zostanie przerwany.Przygotować miejsce operacyjne, dokładnie oczyszczając je 70% ethanol i przeprowadzić znieczulenie przy zapewnieniu doskonałej wentylacji oraz z filtrem pochłaniającym isoflurane przymocowanym do komory indukcyjnej. Znieczulić myszy nago z deficytem grasicy, stosując 2% isoflurane zmieszany z 1,5% oxygen na trzy do pięciu minut przed inokulacją komórek. Następnie podtrzymywać znieczulenie, podając 2% isoflurane zmieszany z oxygen za pomocą maski nosowej.Umieść mysz na podkładce grzewczej ustawionej na 30 °C. Przenieś komórki do strzykawek z igłami o rozmiarze 25,5 G do zastrzyków podskórnych lub igłami o rozmiarze 28–30 G do zastrzyków ortotopowych. Pięć minut po indukcji znieczulenia, w jednym lub dwóch miejscach, wstrzyknij od 1 do 10 milionów komórek w bolusach o objętości 200 µL.Liczba komórek zależy od złośliwości lub agresywności komórek nowotworowych. W przypadku wektorów konstytutywnie aktywnych należy wykorzystać dwie grupy myszy, którym wstrzyknięto komórki wykazujące ekspresję albo genu docelowego S-H-R-N-A, albo wektorów z sekwencją S-H-R-N-A typu scrambled. Te same dwie grupy należy podzielić na podgrupy, którym podawano lub nie podawano induktora w wodzie do picia.Wymieniaj wodę w poidłach dwa razy w tygodniu. Monitoruj objętość guzów co tydzień lub co dwa tygodnie za pomocą suwmiarki. Upewnij się, że objętość guza nie przekracza limitów instytucjonalnych lub ACUC i uśmierć wszystkie zwierzęta wykazujące rozległe owrzodzenie, martwicę, wyraźną infekcję, niekontrolowany krwotok lub chorobę w stadium końcowym. Aby monitorować wzrost guza i przerzuty za pomocą markera bioluminescencyjnego, zdezynfekuj obszar roboczy i znieczul myszy w komorze obrazującej za pomocą znieczulenia gazowego.Najpierw wykonaj ekspozycję od dwóch do pięciu minut, sprawdź intensywność sygnału, a następnie odpowiednio ją dostosuj. Jeśli rozmiar guza przekracza 1000 mm³ lub instytucjonalny limit wielkości, uśmierć zwierzę podczas poświęcenia, udokumentuj rozmiar guza i zachowaj go do dalszej analizy. Niniejszy protokół został zastosowany w celu zbadania wpływu wyciszenia genu why Y one na tworzenie ksenoprzeszczepów guzów z ludzkich komórek gruczolakoraka piersi wykazujących ekspresję lucyferazy, zaimplantowanych u myszy nude athymic.Przetestowano sekwencję docelową S-H-R-N-A dla ludzkiego YY1 oraz kontrolne, przetasowane S-H-R-N-A, które nie wykazywało istotnego podobieństwa do żadnego znanego ludzkiego transkryptu. W wyniku tego skonstruowano dwa wektory lentiwirusowe, które posłużyły do wytworzenia dwóch lentiwirusów. Oba zostały wykorzystane do zainfekowania dwóch różnych populacji komórek, w wyniku czego uzyskano poliklonalne populacje komórek.Po selekcji puromycyną analiza Western blot potwierdziła wywołany przez DS knockdown YY1 w tych zainfekowanych liniach komórkowych. Następnie wykorzystano poliklonalną populację komórek klonu trzeciego, która została zainfekowana indukowalnym shRNA przeciwko YY1 oraz kontrolnym shRNA.Do zbadania wpływu wyciszenia YY1 na inwazję wykorzystano LENTIWIRUSY. Zaobserwowano, że wyciszenie YY1 zmniejszyło inwazyjność komórek. Analiza Western blot potwierdziła indukowane wyciszenie YY1 w komórkach z indukowanym shRNA przeciwko YY1, podczas gdy komórki zawierające kontrolę.S-H-R-N-A nie wykazało tego efektu. Komórki te zostały następnie wykorzystane w badaniu na modelu mysim ksenoprzeszczepu w porównaniu z grupami kontrolnymi indu, YY one; myszy z implantowanymi komórkami S-H-R-N-A podawano wodę, co zgodnie z oczekiwaniami doprowadziło do istotnego zmniejszenia tworzenia się guzów, co wykazano w obrazowaniu bioluminescencyjnym oraz poprzez pomiar masy guzów. Wyciszenie YY one w tych ksenoprzeszczepach guzów zostało następnie potwierdzone za pomocą analizy western blot.Badania Nie należy zapominać, że praca z lentiwirusami może być niezwykle niebezpieczna zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa NIH dotyczącymi badań z wektorami lentiwirusowymi; we wszystkich warunkach laboratoryjnych wymagane jest zastosowanie procedur ograniczania zagrożeń na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA do badania funkcji genów w raku

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Wykazano, że interferencja RNA jest bardzo skuteczną metodą analizy funkcji genów w rozwoju tchawki Drosophila. Przedstawiono szczegółowy protokół stosowany w laboratorium Jiang do wstrzykiwania dsRNA do embrionów muchy w celu wyciszenia ekspresji genów. Technika ta daje możliwość przesiewania genów niezbędnych do rozwoju tkanek i narządów u Drosophila.

Interferencja RNAi poprzez wstrzykiwanie dsRNA do embrionów Drosophila

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Prezentujemy protokół demonstrujący nowatorski somatyczny system transferu genów wykorzystujący RIP-Tag; Mysi model RIP-tva do badania funkcji genów w przerzutach. Ptasie retrowirusy są dostarczane dosercowo, aby zapewnić transfer genów do przedzłośliwych, nieinwazyjnych zmian komórek β trzustki u dorosłych myszy.

Identyfikacja i charakterystyka czynników przerzutowych poprzez transfer genów do nowego RIP-Tag; Model mysi RIP-tva

Tutaj opisujemy protokół do wykorzystania wysokoprzepustowego badania przesiewowego RNAi w celu odkrycia celów gospodarza, które mogą być manipulowane w celu wzmocnienia terapii wirusami onkolitycznymi, w szczególności terapii wirusem rabodu i krowianki, ale można go łatwo dostosować do innych platform wirusów onkolitycznych lub do odkrywania genów gospodarza, które ogólnie modulują replikację wirusa.

Badania przesiewowe RNAi całego genomu w celu identyfikacji czynników gospodarza, które modulują terapię wirusem onkolitycznym

Opisany tutaj jest protokół charakteryzujący moduły biologicznie synergicznych miRNA i ich łączenie w krótkie transgeny, co pozwala na jednoczesną nadekspresję dla zastosowań terapii genowej.

Charakterystyka funkcjonalnie powiązanych miRNA w glejaku i ich inżynieria w sztuczne klastry do terapii genowej

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Wiele genów o podwyższonej regulacji stymuluje migrację i inwazję komórek nowotworowych, co prowadzi do złych rokowań. Określenie, które geny regulują migrację i inwazję komórek nowotworowych, ma kluczowe znaczenie. Protokół ten przedstawia metodę badania wpływu zwiększonej ekspresji genu na migrację i inwazję komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym.

Ilościowy pomiar migracji i inwazji komórek nowotworowych w czasie rzeczywistym po transfekcji syntetycznego mRNA

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Poznaj metodę interferencji RNA opartą na wektorach DNA do badania funkcji genów w raku. Technika ta umożliwia długotrwałe i indukowalne wyciszanie genów w komórkach nowotworowych oraz modelach zwierzęcych.

Interferencja RNA oparta na wektorach DNA w badaniu funkcji genów w nowotworach

Przeglądaj więcej filmów