Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne wyizolowanie wysepek trzustkowych z trzustki myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw wyizolowanie trzustki z otaczających ją tkanek. Następnie przeprowadza się kaniulację przewodu żółciowego, aby umożliwić wypełnienie trzustki mieszaniną kolagenazy i proteazy.

Po nadmuchaniu trzustkę usuwa się, a wyspki są ostrożnie dysocjowane. Na koniec wyizolowane wyspki są filtrowane i wysiewane do późniejszego wykorzystania. Ostatecznie ta metoda izolacji wyspek z użyciem oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej jest stosowana w celu uzyskania maksymalnej wydajności oraz optymalnej morfologii wyspek.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod izolacji wysepek trzustkowych jest wyeliminowanie zmienności między partiami dzięki zastosowaniu oczyszczonych enzymów. Ponadto zmodyfikowano lub ulepszono niektóre protokoły w celu poprawy morfologii wysepek. Po eutanazji należy pokryć tułów 70% ethanol, a następnie całkowicie otworzyć jamę brzuszną, od odbytu do przepony.

Następnie umieść mysz na platformie mikroskopu sekcyjnego. Wyciągnij kątnicę oraz okrężnicę wstępującą i ułóż je poza jamą ciała po lewej stronie, odsuwając płaty wątroby w kierunku przepony. Jeśli nie pozostaną one w tej pozycji, powiększ otwór jamy ciała.

Chwyć dwunastnicę zakrzywioną pęsetą i zlokalizuj wiązkę tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i przewodu żółciowego prowadzącą do wątroby. Za pomocą drugiej zakrzywionej pęsety wprowadź szew pod wiązkę tętnicy, żyły i przewodu, a następnie zaciśnij go jak najbliżej wątroby.

Używając dwóch par zakrzywionych pęset, ostrożnie uchwyć dwunastnicę i zlokalizuj przewód żółciowy przyłączony do brodawki. Jednym ramieniem pęsety przebij trzustkę oraz tkankę łączną bezpośrednio pod przewodem żółciowym i w pobliżu brodawki. Szybko wprowadź pęsetę przez otwór i przełóż szew. Luźno zawiąż szew wokół przewodu żółciowego, tworząc małą pętlę za pomocą pęsety kątowej 90 stopni.

Odciągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy zostanie napięty. Wykonaj jedno poziome cięcie przez brodawkę za pomocą superprecyzyjnych nożyczek, nie przesuwając przewodu żółciowego względem brodawki i trzymając jednocześnie jelito. Wprowadź kaniulę do przewodu żółciowego, a następnie delikatnie zaciśnij szew wokół kaniuli.

Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml 2,0 ml mieszaniny proteazy kolagenazy. Wstrzyknij tę mieszaninę do kaniuli w powolnym, stałym tempie. Po całkowitym nadmuchaniu trzustki usuń kaniulę z przewodu żółciowego.

Zaczynając od okrężnicy zstępującej, wycinaj tkankę łączną, jednocześnie odsuwając jelita w górę, aż do momentu dotarcia do przewodu żółciowego. Następnie oddziel trzustkę od śledziony i otaczających ją tkanek. Na koniec przetnij szwy i wyjmij trzustkę.

Po wyjęciu umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml HBSS w lodzie. Po zebraniu wszystkich próbek umieść wszystkie probówki 50 ml z tkanką trzustki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przez 15 minut delikatnie kołysz probówką, sprawdzając stopień dysocjacji tkanki.

Upewniając się, że tkanka łatwo się rozpada, trzymając probówkę za zakrętkę, wykonaj 12 okrężnych ruchów, aby dodatkowo zdysocjować tkankę. Dodaj nie więcej niż 30 milliliters HBSS i odwiruj w wirówce.

Ostrożnie odessaj nadsącz, pozostawiając na dnie niewielką jego ilość, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml z igłą 14 G dodaj nie więcej niż 10 ml HBSS i dwukrotnie odessij zawiesinę, wykonując ruchy góra-dół. Przefiltruj mieszaninę komórek przez plastikowe sitko w kształcie litery T do probówki o pojemności 50 ml.

Przepłukać kolejnymi 10 mililitrami HBSS i odwirować. Odlać nadsącz i odwrócić probówki, aby odciekły na chłonnym ręczniku papierowym przez jedną minutę. Każdą zawartość probówek zawiesić ponownie w 10 mililitrach.

Schłodzić do 1100. Jego nieprzezroczysta nakładka, jego nieprzezroczysta z 10 mililitrami HBSS i wirować. Usunąć całe 20 mililitrów supernatantu za pomocą pipety o szerokim wylocie 25 mililitrów i przepuścić supernatantu przez odwrócony filtr 70 mikronów.

Przefiltruj eyelety bezpośrednio do szalki Petriego i wypłucz, pipetując 10 milliliters pożywki do eyeletów przez kulturę na filtrze. Przechowuj eyelety w inkubatorze do hodowli tkankowych do momentu rozpoczęcia eksperymentów. Wydajność, morfologia i jakość eyeletów są ogólnymi parametrami służącymi do oceny skuteczności izolacji eyeletów.

Typowa morfologia wysepek jest tutaj pokazana. Wysepki mają kształt od okrągłego do wydłużonego i cechują się stosunkowo jednolitym rozmiarem. Tutaj. Izolowane wysepki zostały poddane analizie w celu oceny wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.

Stymulacja insuliną była podobna w przypadku wysepek przygotowanych za pomocą Sigma Type 11 w porównaniu do ci zyme TM, MABP, co wskazuje na wysoką jakość preparacji wysepek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić kaniulację przewodu żółciowego myszy. Do izolacji wysepek do dowolnego badania należy użyć kolagenazy zyme oraz neutroproteaz.