Izolacja mysiej wysepek Langerhansa przy użyciu kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy

Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne odizolowanie oczek od trzustki myszy. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie trzustki od otaczającej tkanki. Następnie przewód żółciowy jest kaniulowany, aby trzustka mogła zostać napompowana mieszaniną proteazy kolagenazy.

Po napompowaniu trzustka jest usuwana, a oczka są ostrożnie rozdzielane. Na koniec izolowane oczka są filtrowane i powlekane do wykorzystania w przyszłości. Ostatecznie ta metoda izolacji oczek za pomocą oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy jest stosowana w celu uzyskania maksymalnej wydajności oczek i optymalnej morfologii oczek.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami izolacji oczek jest to, że wyeliminowaliśmy zmienność między partiami dzięki zastosowaniu oczyszczonych enzymów. Ponadto zmieniliśmy lub ulepszyliśmy niektóre protokoły, aby poprawić morfologię oczek. Po eutanazji przykryj tułów 70% etanolem przed całkowitym otwarciem jamy brzusznej od odbytu do przepony.

Następnie umieść mysz na platformie mikroskopu preparacyjnego. Wyciągnij jelito ślepe i okrężnicę wstępującą i ustaw je na zewnątrz jamy ciała po lewej stronie, przesuń płaty wątroby o przeponę. Jeśli nie pozostaną tam same, zwiększ otwór jamy ciała.

Chwyć dwunastnicę zakrzywionymi kleszczami i zlokalizuj żyłę wrotną tętnicy wątrobowej i pęczek dróg żółciowych prowadzący do wątroby. Z kolejną parą zakrzywionych kleszczy. Wprowadzić szew pod żyłę tętniczą i wiązkę przewodów i zacisnąć go jak najbliżej wątroby.

Używając dwóch par zakrzywionych kleszczy, ostrożnie chwyć dwunastnicę i znajdź przewód żółciowy przyczepiony do brodawki użyj jednego szczypiec kleszczy, aby przebić się przez trzustkę i tkankę łączną tuż pod przewodem żółciowym i w pobliżu brodawki. Szybko umieść kleszcze przez otwór i włóż szew. Luźno. Zawiąż szew wokół przewodu żółciowego, aby utworzyć mały okrąg za pomocą kleszczy 90 stopni.

Pociągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy znajdzie się w tau. Wykonaj jedno poziome cięcie w poprzek brodawki bardzo cienkimi nożyczkami, nie usuwając przewodu żółciowego z brodawki, trzymając jelito. Wprowadź kaniulę do przewodu żółciowego, a następnie delikatnie mocno naciągnij szew wokół kaniuli.

Następnie napełnij trzymililitrową strzykawkę 2,0 mililitrami mieszaniny proteazy kolagenazy. Wstrzyknąć tę mieszaninę do kaniuli w powolnym, stałym tempie. Po zakończeniu pompowania trzustki wyjmij kaniulę z przewodu żółciowego.

Zaczynając od okrężnicy zstępującej, odetnij tkankę łączną, jednocześnie ciągnąc jelita w górę, aż do przewodu żółciowego. Następnie oddziel trzustkę od śledziony i otaczających tkanek. Na koniec odetnij szwy i usuń trzustkę.

Po wyjęciu umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów HBSS na lodzie. Po zebraniu wszystkich próbek umieść dowolne 50-mililitrowe probówki zawierające tkankę trzustki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przez 15 minut delikatnie kołysz rurką i sprawdź, czy nie ma dysocjacji tkanek.

Upewnij się, że chusteczka łatwo się rozpada, trzymając probówkę za pokrywkę. Zawiruj 12 razy, aby jeszcze bardziej zdysocjować tkankę. Dodaj nie więcej niż 30 mililitrów HBSS i wirówki.

Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić niewielką ilość supernatantu na dnie, aby nie naruszyć palety komórek. Używając 30-mililitrowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 14, dodaj nie więcej niż 10 mililitrów HBSS i zasysaj zawiesinę dwa razy w górę iw dół. Przefiltruj mieszaninę komórek przez plastikowe sitko T do 50-mililitrowej probówki.

Spłucz kolejnymi 10 mililitrami, HBSS i odwiruj. Zdekantować supernatant i odwrócić probówki, aby spłynęły na chłonnym ręczniku papierowym na jedną minutę. Zawieś każdą tubkę w 10 mililitrach.

Zimno 1100. Jego nieprzezroczysta nakładka, jego nieprzezroczysta Z 10 mililitrami, HBSS i wirówką. Usuń całe 20 mililitrów supernatantu za pomocą pipety o dużym otworze i pojemności 25 mililitrów i przepuść supernatant przez odwrócony filtr o średnicy 70 mikronów.

Przefiltrować oczka bezpośrednio na szalkę Petriego i spłukać, pipetując 10 mililitrów pożywki oczkowej przez kulturę filtracyjną. Oczka w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będą gotowe do eksperymentów. Wydajność oczek, morfologia i jakość to ogólne parametry używane do oceny sukcesu izolacji oczek.

Pokazano tutaj typową morfologię oczek. Oczka mają kształt od okrągłego do podłużnego o stosunkowo jednolitym rozmiarze. Tu. Izolowane oczka analizowano pod kątem stymulowanego glukozą wydzielania insuliny.

Stymulacja insuliną była podobna pomiędzy oczkami przygotowanymi przez Sigma Type 11 w porównaniu z ci zyme TM, MABP, co wskazuje na wysoką jakość przygotowania oczek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kaniulować przewód żółciowy myszy. Pracuj z kolagenazą zymu i proteazami neutrowy, aby wyizolować powieki do dowolnego testu.