Izolacja mysiej wysepek Langerhansa przy użyciu kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy
September 7th, 2012
Szczegółowy opis izolacji mysich wysp trzustkowych jest opisany za pomocą techniki in-situ kanulacji przewodowej trzustki i perfuzji kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy.
Ogólnym celem tej procedury jest skuteczne odizolowanie oczek od trzustki myszy. Osiąga się to poprzez najpierw odizolowanie trzustki od otaczającej tkanki. Następnie przewód żółciowy jest kaniulowany, aby trzustka mogła zostać napompowana mieszaniną proteazy kolagenazy.
Po napompowaniu trzustka jest usuwana, a oczka są ostrożnie rozdzielane. Na koniec izolowane oczka są filtrowane i powlekane do wykorzystania w przyszłości. Ostatecznie ta metoda izolacji oczek za pomocą oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy jest stosowana w celu uzyskania maksymalnej wydajności oczek i optymalnej morfologii oczek.
Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami izolacji oczek jest to, że wyeliminowaliśmy zmienność między partiami dzięki zastosowaniu oczyszczonych enzymów. Ponadto zmieniliśmy lub ulepszyliśmy niektóre protokoły, aby poprawić morfologię oczek. Po eutanazji przykryj tułów 70% etanolem przed całkowitym otwarciem jamy brzusznej od odbytu do przepony.
Następnie umieść mysz na platformie mikroskopu preparacyjnego. Wyciągnij jelito ślepe i okrężnicę wstępującą i ustaw je na zewnątrz jamy ciała po lewej stronie, przesuń płaty wątroby o przeponę. Jeśli nie pozostaną tam same, zwiększ otwór jamy ciała.
Chwyć dwunastnicę zakrzywionymi kleszczami i zlokalizuj żyłę wrotną tętnicy wątrobowej i pęczek dróg żółciowych prowadzący do wątroby. Z kolejną parą zakrzywionych kleszczy. Wprowadzić szew pod żyłę tętniczą i wiązkę przewodów i zacisnąć go jak najbliżej wątroby.
Używając dwóch par zakrzywionych kleszczy, ostrożnie chwyć dwunastnicę i znajdź przewód żółciowy przyczepiony do brodawki użyj jednego szczypiec kleszczy, aby przebić się przez trzustkę i tkankę łączną tuż pod przewodem żółciowym i w pobliżu brodawki. Szybko umieść kleszcze przez otwór i włóż szew. Luźno. Zawiąż szew wokół przewodu żółciowego, aby utworzyć mały okrąg za pomocą kleszczy 90 stopni.
Pociągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy znajdzie się w tau. Wykonaj jedno poziome cięcie w poprzek brodawki bardzo cienkimi nożyczkami, nie usuwając przewodu żółciowego z brodawki, trzymając jelito. Wprowadź kaniulę do przewodu żółciowego, a następnie delikatnie mocno naciągnij szew wokół kaniuli.
Następnie napełnij trzymililitrową strzykawkę 2,0 mililitrami mieszaniny proteazy kolagenazy. Wstrzyknąć tę mieszaninę do kaniuli w powolnym, stałym tempie. Po zakończeniu pompowania trzustki wyjmij kaniulę z przewodu żółciowego.
Zaczynając od okrężnicy zstępującej, odetnij tkankę łączną, jednocześnie ciągnąc jelita w górę, aż do przewodu żółciowego. Następnie oddziel trzustkę od śledziony i otaczających tkanek. Na koniec odetnij szwy i usuń trzustkę.
Po wyjęciu umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce zawierającej pięć mililitrów HBSS na lodzie. Po zebraniu wszystkich próbek umieść dowolne 50-mililitrowe probówki zawierające tkankę trzustki w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przez 15 minut delikatnie kołysz rurką i sprawdź, czy nie ma dysocjacji tkanek.
Upewnij się, że chusteczka łatwo się rozpada, trzymając probówkę za pokrywkę. Zawiruj 12 razy, aby jeszcze bardziej zdysocjować tkankę. Dodaj nie więcej niż 30 mililitrów HBSS i wirówki.
Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić niewielką ilość supernatantu na dnie, aby nie naruszyć palety komórek. Używając 30-mililitrowej strzykawki przymocowanej do igły o rozmiarze 14, dodaj nie więcej niż 10 mililitrów HBSS i zasysaj zawiesinę dwa razy w górę iw dół. Przefiltruj mieszaninę komórek przez plastikowe sitko T do 50-mililitrowej probówki.
Spłucz kolejnymi 10 mililitrami, HBSS i odwiruj. Zdekantować supernatant i odwrócić probówki, aby spłynęły na chłonnym ręczniku papierowym na jedną minutę. Zawieś każdą tubkę w 10 mililitrach.
Zimno 1100. Jego nieprzezroczysta nakładka, jego nieprzezroczysta Z 10 mililitrami, HBSS i wirówką. Usuń całe 20 mililitrów supernatantu za pomocą pipety o dużym otworze i pojemności 25 mililitrów i przepuść supernatant przez odwrócony filtr o średnicy 70 mikronów.
Przefiltrować oczka bezpośrednio na szalkę Petriego i spłukać, pipetując 10 mililitrów pożywki oczkowej przez kulturę filtracyjną. Oczka w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż będą gotowe do eksperymentów. Wydajność oczek, morfologia i jakość to ogólne parametry używane do oceny sukcesu izolacji oczek.
Pokazano tutaj typową morfologię oczek. Oczka mają kształt od okrągłego do podłużnego o stosunkowo jednolitym rozmiarze. Tu. Izolowane oczka analizowano pod kątem stymulowanego glukozą wydzielania insuliny.
Stymulacja insuliną była podobna pomiędzy oczkami przygotowanymi przez Sigma Type 11 w porównaniu z ci zyme TM, MABP, co wskazuje na wysoką jakość przygotowania oczek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak kaniulować przewód żółciowy myszy. Pracuj z kolagenazą zymu i proteazami neutrowy, aby wyizolować powieki do dowolnego testu.
Przegląd
Ten artykuł opisuje szczegółową procedurę izolację wysepek z trzustki myszy przy użyciu in situ kanulacji przewodów trzustkowych i mieszanki kolagenazy i proteazy. Metoda ma na celu poprawę wydajności i morfologii wysepek, minimalizując różnorodność.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Endokrynologia
Tło
- Komórki wysepek są kluczowe dla produkcji insuliny.
- Tradycyjne metody izolacji mogą prowadzić do zmienności wyników.
- Użycie oczyszczonych enzymów może poprawić jakość izolowanych wysepek.
- Ulepszone protokoły mogą prowadzić do lepszej morfologii wysepek.
Cel badania
- Izolacja wysepek z trzustki myszy w sposób efektywny.
- Zmniejszenie zmienności między partiami preparatów enzymów.
- Optymalizacja morfologii wysepek dla zastosowań badawczych.
Stosowane metody
- Izolacja trzustki myszy od otaczających tkanek.
- Kanulacja dróg żółciowych do infuzji enzymów.
- Nadmuchiwanie trzustki mieszaniną kolagenazy i proteazy.
- Filtracja i sadzenie izolowanych wysepek na potrzeby eksperymentów.
Główne wyniki
- Udana dysocjacja i izolacja wysepek.
- Poprawiona morfologia wysepek zaobserwowana po izolacji.
- Wysokiej jakości preparaty wysepek potwierdzone testami wydzielania insuliny.
- Metoda wykazała zmniejszoną zmienność w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
Wnioski
- Opisana metoda jest skuteczna w izolowaniu wysokiej jakości wysepek.
- Użycie oczyszczonych enzymów poprawia niezawodność wyników.
- Ta technika może być przydatna dla różnych assayów z udziałem wysepek.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
