Name: Izolacja mysiej wysepek Langerhansa przy użyciu kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Poznaj metodę izolacji wysepek Langerhansa z trzustki myszy przy użyciu oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej. Technika zapewnia wysoką wydajność, optymalną morfologię i zmniejszoną zmienność między partiami enzymów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była częściowo finansowana z grantów NIH R01 DK060581 oraz R01 DK083583 (oba przyznane RGM).

A. Potrzebne materiały: Przed przygotowaniem zapoznaj się z Tabelą 1 (odczynniki)
<ol>
 <li>HBSS(P/S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H20 + 1% Penicillin/Streptomycin (przechowywać w lodówce lub w lodu).</li>
 <li>Roztwór stokowy 20% BSA przygotowuje się w wodzie, rozdziela na aliquoty i przechowuje w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>HBSS(BSA): 200 ml 1X HBSS(P/S) + 3 ml 20% BSA (końcowe stężenie BSA wynosi 0,3%)</li>
 <li>Pożywka dla wysepek: RPMI + 10% FBS + 1% glutaminy + 1% Penicillin/Streptomycin</li>
 <li>Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque</li>
 <li>Szew 4-0 (McKesson): pocięty na kawałki o długości 2 ¾ cala i przechowywany w 10 cm szalce Petriego</li>
 <li>Instrumenty: Pęsetę firmy Fine Science Tools należy zgiąć pod kątem 90°, a ząbkowane końce wszystkich trzech par pęset należy spiłować. Celem jest stępienie zębów, a nie ich całkowite usunięcie.</li>
 <li>Kaniula do podawania mieszaniny kolagenazy/proteazy: igła 27G ½ cala, igła 30G ½ cala, rurka PE50 pocięta na kawałki o długości 12 cali. Obie igły należy spiłować do uzyskania gładkiego, zaokrąglonego końca bez ostrych krawędzi. Wprowadzić igłę 27G do jednego końca 12-calowego odcinka rurki PE50. Wyjąć igłę 30G z obudowy, rozgniatając obudowę kombinerkami i obracając ją o ¼ obrotu przy każdym ruchu. Za pomocą kombinerek wyjąć igłę z obudowy i wprowadzić ją do drugiego końca rurki PE50 pod mikroskopem sekcyjnym. Należy uważać, aby nie zagiąć rurki podczas wprowadzania igły do rurki PE50. Igła 27G stanowi koniec, do którego zostanie przymocowana strzykawka z kolagenazą.</li>
 <li>Kolagenaza (CIzyme MA) i proteaza neutralna (CIzyme BP). Rekonstytuować TDE zgodnie z instrukcją producenta. Należy odnieść się do specyficznego dla partii Certyfikatu Analizy, aby obliczyć stężenie aktywności enzymu. Przenieść łącznie 350 000 jednostek aktywności degradującej kolagen (CDA) zrekonstytuowanej kolagenazy oraz 100 000 jednostek proteazy neutralnej zrekonstytuowanej proteazy BP do probówki stożkowej i rozcieńczyć do całkowitej objętości 15 ml w HBSS(P/S).</li>
</ol>
B. Protokół krok po kroku
1. Pompowanie trzustki mieszaniną kolagenazy i proteazy
<ol>
 <li>Uśmierć mysz poprzez zwichnięcie szyi, nasącz tułów myszy 70% EtOH, a następnie całkowicie otwórz jamę brzuszną od odbytu do przepony za pomocą nożyczek i pęsety sekcyjnej.</li>
 <li>Umieść mysz na platformie mikroskopu sekcyjnego. </li>
 <li>Wyciągnij kątnicę i okrężnicę wstępującą, kładąc je poza jamą ciała po lewej stronie. Podsumowanie kolejnych kroków przedstawia Rysunek 1. </li>
 <li>Ustaw płaty wątroby przy przeponie; powinny one tam pozostać, jeśli jama ciała jest wystarczająco otwarta. Znajdź pęczek tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i przewodu żółciowego prowadzący do wątroby, chwytając dwunastnicę zakrzywioną pęsetą. Drugą zakrzywioną pęsetą podsuń pod pęczek tętnicy, żyły i przewodu, przeciągnij pod nimi odcinek nici chirurgicznej 4-0 o długości 2¾ in., zawiąż jeden węzeł i zaciśnij go jak najbliżej wątroby.</li>
 <li>Używając dwóch par zakrzywionych pęset, ostrożnie uchwyć dwunastnicę i zlokalizuj przewód żółciowy przyczepiony do dwunastnicy w miejscu brodawki. Użyj ramienia pęsety, aby przebić się przez trzustkę i tkankę łączną bezpośrednio pod przewodem żółciowym, blisko brodawki. Szybkim ruchem przebij organ pęsetą, aby wykonać otwór, a następnie przełóż oba ramiona pęsety, przeciągnij kolejny odcinek nici 4-0 o długości 2¾ in., zawiąż jeden węzeł i zaciśnij go do postaci małego okręgu, ale NIE zaciągaj go mocno. </li>
 <li>Zmień narzędzia na pęsetę 90 ° oraz nożyczki Superfine Vannas. Za pomocą pęsety 90 ° ostrożnie ściśnij i pociągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy będzie napięty. Wykonaj jedno poziome cięcie przez brodawkę za pomocą nożyczek, wbijając otwarte nożyczki w jelito, a następnie przecinając je jednym ruchem. Postaraj się wykonać tylko jedno cięcie przez brodawkę, nie odrywając przewodu żółciowego od brodawki. </li>
 <li>Trzymając nadal jelito pęsetą 90 °, wprowadź kaniulę do przewodu żółciowego na połowę jego długości, a następnie delikatnie zaciśnij nić wokół kaniuli. </li>
 <li>Napełnij strzykawkę 3 ml 2,0 ml mieszaniny kolagenazy/proteazy i wstrzyknij ją przez kaniulę powolnym, stałym strumieniem. </li>
 <li>Po całkowitym nadmuchaniu trzustki wyjmij kaniulę z przewodu żółciowego i za pomocą zakrzywionej pęsety oraz zakrzywionych nożyczek sprężynowych wyjmij nadmuchaną trzustkę, zaczynając od okrężnicy zstępującej i odcinając tkankę łączną podczas podciągania jelit. Kontynuuj oddzielanie trzustki od jelit, aż dotrzesz do przewodu żółciowego, następnie oddziel trzustkę od śledziony, żołądka i pozostałych trzewi jamy brzusznej. Zakończ usuwanie, przecinając nici. 
 Przenieś trzustkę do probówki 50 ml zawierającej 5 ml HBSS(P/S). Probówka ta powinna znajdować się w lodzie. </li>
 <li>Powtórz powyższą procedurę dla każdego zwierzęcia, maksymalnie do czterech osobników. Dla uzyskania optymalnych wyników dysocjuj tylko cztery trzustki jednocześnie. Zazwyczaj w czasie, gdy pierwsze cztery znajdują się w kąpieli wodnej 37 °C, nadmuchujemy kolejne cztery trzustki. </li>
</ol>
2. Dysocjacja trzustki
<ol>
 <li>Umieścić probówki 50 ml zawierające trzustki w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 15 min. </li>
 <li>Delikatnie kołysać probówką i sprawdzić, czy tkanka uległa dysocjacji; upewnić się, że tkanka łatwo się rozdziela, a następnie 12 razy zakręcić zawartością probówek, trzymając je za zakrętki.</li>
 <li>Dodać nie więcej niż 30 ml HBSS(BSA) (ilość ta może być mniejsza, w zależności od tego, ile jest wymagane do zrównoważenia probówek przed etapem wirowania) i wirować przy 290 x g przez jedną min.</li>
 <li>Ostrożnie odessać nadsącz, pozostawiając na dnie niewielką jego ilość (2-3 ml), aby nie naruszyć pelletu komórkowego.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 30 ml z igłą 14G dodać nie więcej niż 10 ml HBSS(BSA) i dwukrotnie pobrać oraz wypchnąć zawiesinę (pipetowanie w górę i w dół).</li>
 <li>Przefiltrować mieszaninę komórkową przez plastikowe sitko do herbaty do probówki 50 ml i wypłukać kolejnymi 10 ml HBSS(BSA).</li>
 <li>Wirować przy 330 x g przez 2 min.</li>
 <li>Odlać nadsącz i odwrócić probówki do spłycia na chłonny ręcznik papierowy na 1 min.</li>
 <li>Resuspendować zawartość każdej probówki w 10 ml zimnego roztworu 1100 histopaque.</li>
 <li>Nałożyć na histopaque warstwę 10 ml HBSS(BSA) i wirować przy 900 x g przez 18 min.</li>
 <li>Usunąć całe 20 ml nadsączu za pomocą pipety 25 ml o dużym prześwicie i przepuścić nadsącz przez odwrócony filtr 70 μm.</li>
 <li>Wypłukać wysepki do 10 cm płytki Petriego, pipetując 10 ml medium do wysepek przez filtr, trzymając go stroną górną do góry nad płytką.</li>
 <li>Kultywować wysepki w inkubatorze do kultur tkankowych przy 37 °C i 5% CO2 do czasu rozpoczęcia eksperymentów. Zazwyczaj przed eksperymentami wysepki są ręcznie wyselekcjonowane i policzone.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Wydajność izolacji, morfologia i jakość wyizolowanych wysepek są ogólnymi parametrami służącymi do oceny sukcesu izolacji wysepek. W naszych doświadczeniach, przy zastosowaniu tego protokołu, wydajność izolacji z przeciętnej myszy C57BL/6 mieści się w zakresie 150-250 wysepek (patrz Tabela 2), co jest porównywalne z danymi uzyskanymi przy użyciu zoptymalizowanej kolagenazy Sigma typu XI. Jednakże wydajność może się różnić w zależności od użytej linii myszy oraz wieku zwierzęcia. Większość wykorzystywanych przez nas zwierząt znajduje się w przedziale wiekowym 8-16 tygodni. Niniejszy protokół został przetestowany na wielu liniach myszy, w tym: C57BL/6 (180-250 wysepek/mysz), CD1 (200-300 wysepek/mysz), 129/B6 (200-300 wysepek/mysz), BLKS-db/db (120-200 wysepek/mysz), NOD (10-tygodniowe, 100-150 wysepek/mysz) oraz NOD-SCID (100-150 wysepek/mysz). Typowa morfologia wysepek przedstawiona jest na Rysunku 2, gdzie wysepki mają kształt od okrągłego do wydłużonego i relatywnie jednolity rozmiar (choć jednolitość rozmiaru może różnić się w zależności od linii). Rysunek 3 przedstawia naszą typową analizę wydzielania insuliny stymulowanego glukozą w wysepkach myszy C57BL/6 izolowanych przy użyciu oczyszczonych TDE w porównaniu do kolagenazy Sigma typu XI. Zazwyczaj wysokiej jakości preparat wysepek skutkuje stymulacją wydzielania insuliny przy stężeniu glukozy 25 mM, która jest od 6 do 20 razy większa niż obserwowana przy stężeniu 2,5 mM glukozy. Do oceny jakości wyizolowanych wysepek można zastosować również inne metody, w tym między innymi techniki perifuzji, obrazowanie Ca2+ (z użyciem Fura2) oraz RT-PCR11.
<img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Schemat techniki aseptycznej; proces nacięcia w linii środkowej w anatomii gryzonia; etapy chirurgiczne." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Podsumowanie kanulacji przewodu żółciowego. 
<img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Struktury komórkowe pod mikroskopem; hodowla tkankowa; technika mikroskopii w polu jasnym; biologia." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Typowy wygląd wysepek C57BL/6 24 h po izolacji. Obrazy wykonano za pomocą mikroskopu odwróconego przy powiększeniu 40X.
<img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Wykres słupkowy porównujący wydzielanie insuliny z użyciem Sigma typu XI oraz CIzyme MA/BP przy różnych stężeniach glukozy." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Stymulowane glukozą wydzielanie insuliny z wysepek C57BL/6. 24 h po izolacji 100 wysepek inkubowano w płytce 12-dołkowej przez 1 h w temperaturze 37 °C w roztworze Krebsa-Ringera buforowanym HEPES zawierającym 2.5 mM glukozy. Następnie wysepki przeniesiono do roztworu Krebsa-Ringera z HEPES o stężeniu 2.5 mM glukozy na kolejną godzinę, po czym zebrano nadsącz do pomiaru poziomu insuliny za pomocą dwumiejscowego immunospecyficznego enzymatycznego testu immunoabsorpcyjnego (ELISA) (Crystal Chem). Te same wysepki przeniesiono następnie do roztworu Krebsa-Ringera buforowanego HEPES zawierającego 25 mM glukozy, a uwalnianie insuliny do medium zmierzono testem ELISA po 1 h inkubacji.

<ol><li>Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li>
<li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , Forthcoming (2012).</li>
<li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li>
<li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li>
<li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li>
<li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics%3A+comparison+study+with+Ficoll%2C+iodixanol+and+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li>
<li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li>
<li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR-%7Bgamma%7D+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li>
</ol>

NDS, SAT i RGM nie mają żadnych informacji do ujawnienia. Autor AGB jest zatrudniony przez VitaCyte. Autor RCM posiada udziały w VitaCyte.

W niniejszym protokole opisano procedurę kanulacji, perfuzji kolagenazą oraz dysocjacji trzustki mysiej w celu wyizolowania wysepek Langerhansa. Technicznie, po opanowaniu tej metody, izolacja trzustki powinna zająć do 4 min od eutanazji zwierzęcia, a izolacja wysepek z jednego osobnika powinna zostać zakończona w ciągu 1 hr. Szybkość tej techniki pozwala nam na izolację wysepek od maksymalnie 12 myszy podczas jednej serii, co skutkuje uzyskaniem do 3000 wysepek.
W przeciwieństwie do innych protokołów wykorzystujących surowe preparaty kolagenazy, nasz protokół opiera się na zastosowaniu oczyszczonych proteaz: CIzyme Collagenase MA oraz CIzyme BP Protease. Zmienność w spójności dostępnych komercyjnie preparatów TDE wymaga, aby każda partia została indywidualnie przetestowana i zoptymalizowana przed ogólnym zastosowaniem. Ta zmienność między partiami skłoniła nas do rozważenia użycia oczyszczonych TDE firmy VitaCyte. Te wysokookreślone TDE są charakteryzowane za pomocą wielu metod, w tym z użyciem czułych testów z podłożem znakowanym fluorescencyjnie. Test fluorescencyjny CDA jest bardziej czuły na różne formy molekularne kolagenazy, które wykazują odmienną kinetykę w degradacji natywnego kolagenu. Historyczne testy z podłożem peptydowym zapewniają niepełną ocenę kolagenazy. Charakteryzacja kolagenazy za pomocą wielu metod gwarantuje większą aktywność enzymatyczną pomiędzy partiami.
W oparciu o nasze wewnętrzne testy z wykorzystaniem różnych dostępnych komercyjnie preparatów kolagenazy stwierdziliśmy, że oczyszczone kombinacje enzymów dawały powtarzalne wyniki między partiami. Główną zaletą stosowania silnie oczyszczonych i rygorystycznie scharakteryzowanych TDE w tym zastosowaniu jest zapewnienie spójności działania między partiami po zdefiniowaniu optymalnego składu enzymów. Spójność ta eliminuje pracochłonny proces kwalifikacji partii, zazwyczaj wymagany w przypadku surowych lub wzbogaconych produktów kolagenazy. Oczyszczone TDE umożliwiają również dodatkowe modyfikacje składu w celu zwiększenia wydajności i jakości wyizolowanych wysepek trzustkowych z różnych szczepów myszy. Pozwala to na bardziej efektywne przekazywanie informacji o optymalnych składach enzymów do izolacji wysepek z różnych szczepów myszy. Prowadzi to z kolei do bardziej produktywnego wykorzystania zasobów i zwiększenia elastyczności w projektowaniu eksperymentów.
W naszym protokole istnieje wiele krytycznych etapów, które mogą wpłynąć na wynik izolacji wysepek. Pierwszym z nich jest konieczność uzyskania skutecznego nadmuchania trzustki podczas perfuzji preparatu enzymatycznego. Ważne jest, aby rozpocząć nadmuchiwanie, przykładając niewielką siłę do strzykawki, a następnie stopniowo ją zwiększać w miarę wypełniania się narządu. Pomocne jest odsuwanie jelit i unoszenie trzustki podczas nadmuchiwania, aby kolagenaza przeperfudowała cały organ. Kolejnym krytycznym krokiem jest siła, z jaką potrząsa się probówkami po inkubacji w 37 °C (krok 2.2). Stwierdziliśmy, że zbyt mocne potrząsanie trzustką o zakrętkę probówki powoduje fragmentację wysepek, jednak całkowity brak mechanicznej dysocjacji na tym etapie może drastycznie obniżyć wydajność uzyskiwania wysepek. Niezbędne jest również, aby podczas etapu dysocjacji za pomocą strzykawki (krok 2.5) stosować umiarkowaną siłę podczas ruchu tłoka w górę i w dół; zapewnia to odpowiednią dysocjację tkanki przed etapem filtrowania (2.6), podczas którego na sicie kuchennym powinno pozostać bardzo mało tkanki. Ostatnim krokiem wymagającym szczególnej uwagi jest aspiracja całej 20 ml frakcji wysepek w Histopaque. Choć wysepki znajdują się zazwyczaj na granicy faz Histopaque i HBSS, zauważyliśmy, że próba usunięcia tylko tej warstwy prowadzi do utraty wysepek; obecnie usuwamy całe 20 ml za pomocą pipety o dużej średnicy 25 ml. Wprowadziliśmy filtrację przez odwrócony filtr 70 μm (krok 2.11), aby wyeliminować konieczność wielokrotnego wirowania wysepek w celu wypłukania Histopaque.

<table><tbody><tr><td>10X HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14065</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-040</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>jakiekolwiek</td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Nić chirurgiczna 4-0, rolka 100 yd</td><td>McKesson</td><td>451521</td><td></td></tr><tr><td>igła stępiona 14 G</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-8216M</td><td></td></tr><tr><td> Nożyczki Vannasa Superfine</td><td>Fisher Scientific</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione nożyczki sprężynowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14127</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona (2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15914G</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta zakrzywiona (do 90 &amp;deg;)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>igła 27G 1/2 cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>igła 30G 1/2 cala</td><td>Fisher Scientific</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>przewody PE</td><td>Becton Dickinson</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td> Kolagenaza MA</td><td>VitaCyte, LLC</td><td>001-2030</td><td></td></tr><tr><td>Proteaza BP</td><td>VitaCyte, LLC</td><td>003-1000</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 3 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 30 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;filtr m</td><td>Fisher Scientific</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>351005</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe sitko do herbaty</td><td>Dowolne akcesoria kuchenne</td><td></td><td> </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;W ciągu ostatnich lat analiza ekspresji genów i funkcji komórek beta in vitro ewoluowała z badań nad gryzoniimi liniami komórkowymi o charakterze tumorigenicznym w stronę badań nad izolowanymi wysepkami trzustkowymi gryzoni. Wysepki pierwotne dają wyraźną korzyść w postaci wierniejszego odzwierciedlenia biologii wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych oraz odpowiedzi wydzielniczych. Choć metoda izolacji wysepek z użyciem preparatów enzymów dysocjujących tkankę (TDE) jest dobrze ugruntowana w wielu laboratoriach1-4, różnice w powtarzalności wydajności i jakości wysepek uzyskiwanych z konkretnych szczepów gryzoni ograniczają zakres i wykonalność badań na pierwotnych wysepkach. Rozbieżności te wynikają często ze stosowania w procedurze izolacji nieoczyszczonych, częściowo oczyszczonych enzymów TDE; preparaty TDE często wykazują różnice w aktywności między poszczególnymi partiami i często wymagają korekty dawki stosowanego enzymu. W niewielkiej liczbie doniesień wykorzystano oczyszczone TDE do izolacji komórek gryzoni5, 6, jednak praktyka ta nie jest powszechna pomimo rutynowego stosowania i zalet wynikających z użycia oczyszczonych TDE w izolacjach ludzkich wysepek. We współpracy z VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) opracowaliśmy zmodyfikowany protokół izolacji wysepek mysich oparty na metodzie opisanej przez Gotoha7, 8, w której TDE są perfundowane bezpośrednio do przewodu trzustkowego myszy, po czym następuje wstępne frakcjonowanie tkanki za pomocą gradientu Histopaque9 oraz izolacja oczyszczonych wysepek. Istotną różnicą w naszym protokole jest zastosowanie kombinacji oczyszczonej kolagenazy (CIzyme MA) i proteazy neutralnej (CIzyme BP). Kolagenaza została scharakteryzowana przy użyciu fluorescencyjnego testu aktywności degradującej kolagen (CDA) a6, w którym jako substrat wykorzystano znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne fibryle skóry cielęcej6. Substrat ten pozwala na lepsze przewidywanie kinetyki degradacji kolagenu w macierzy tkankowej, ponieważ opiera się na natywnym kolagenie. Proteazę scharakteryzowano za pomocą czułego fluorescencyjnego testu kinetycznego10. Wykorzystanie tych ulepszonych testów wraz z tradycyjną analizą biochemiczną umożliwia bardziej powtarzalną produkcję TDE, co prowadzi do poprawy spójności działania między partiami. Protokół opisany w niniejszym opracowaniu został zoptymalizowany pod kątem maksymalnej wydajności i optymalnej morfologii wysepek z użyciem myszy C57BL/6. Podczas opracowywania tego protokołu oceniono kilka kombinacji kolagenazy i proteaz neutralnych w różnych stężeniach; końcowy stosunek kolagenazy do proteazy neutralnej wynoszący 35:10 zapewnia działanie enzymu porównywalne z Sigma Type XI. Ponieważ zgłaszano znaczną zmienność średnich wydajności wysepek u różnych szczepów szczurów i myszy, należy wprowadzić dodatkowe modyfikacje składu TDE w celu poprawy wydajności i jakości wysepek odzyskiwanych z różnych gatunków i szczepów.&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Odczynniki i sprzęt&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;tabela cellpadding=&quot;0&quot; cellspacing=&quot;0&quot; szerokość=&quot;510&quot; border=&quot;1&quot;&gt; &lt;tbody&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;Sigma typu XI &lt;br/&gt; (l010M8618)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;MA (100615) &lt;br/&gt; BP (110329)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;MA (081104)&lt;br/&gt; BP (100823)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;td&gt;&lt;strong&gt;MA (091211)&lt;br/&gt; BP (101109)&lt;/strong&gt;&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;tr&gt; &lt;td&gt;216 (&amp;#177;74)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;260 (&amp;#177;45)&lt;/td&gt; &lt;td&gt; 157 (&amp;#177;37)&lt;/td&gt; &lt;td&gt;200 (&amp;#177;4)&lt;/td&gt; &lt;/tr&gt; &lt;/tbody&gt; &lt;/table&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Średnie wydajności izolacji wysepek (&amp;#177;(SD) z zastosowaniem różnych partii TDE*&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;*Dane przedstawiają średnie wydajności izolacji wysp z co najmniej 10 myszy. Numery partii w nawiasach&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja wysepek langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Analiza ekspresji genów i funkcji komórek beta in vitro ewoluowała na przestrzeni lat, przechodząc od badań nad tumorigenicznymi liniami komórkowymi gryzoni do badań nad izolowanymi wysepkami trzustkowymi gryzoni. Wysepki pierwotne oferują istotną zaletę w postaci bardziej wiernego odzwierciedlenia biologii wewnątrzkomórkowych szlaków sygnalizacyjnych i odpowiedzi wydzielniczych. Chociaż metoda izolacji wysepek z wykorzystaniem preparatów enzymów dysocjujących tkankę (TDE) jest dobrze ugruntowana w wielu laboratoriach1-4, różnice w powtarzalności wydajności i jakości wysepek uzyskiwanych z danej szczepu gryzoni ograniczają zakres i wykonalność badań na wysepkach pierwotnych. Zmienność ta często wynika z zastosowania w procedurze izolacji wysepek surowych, częściowo oczyszczonych enzymów TDE; preparaty TDE często wykazują różnice w aktywności między partiami i często wymagają korekty dawki stosowanego enzymu. Nieliczne raporty opisują użycie oczyszczonych TDE do izolacji komórek gryzoni5, 6, lecz praktyka ta nie jest rozpowszechniona pomimo rutynowego stosowania i zalet oczyszczonych TDE w izolacji wysepek ludzkich. We współpracy z VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) opracowaliśmy zmodyfikowany protokół izolacji wysepek mysich w oparciu o metodę opisaną przez Gotoha7, 8, w której TDE są perfundowane bezpośrednio do przewodu trzustkowego myszy, po czym następuje surowe frakcjonowanie tkanki za pomocą gradientu Histopaque9 oraz izolacja oczyszczonych wysepek. Istotną różnicą w naszym protokole jest zastosowanie kombinacji oczyszczonej kolagenazy (CIzyme MA) i proteazy neutralnej (CIzyme BP). Kolagenaza została scharakteryzowana przy użyciu testu aktywności degradacji kolagenu (CDA) z wykorzystaniem fluorescencji6, w którym jako substrat zastosowano znakowane fluorescencyjnie rozpuszczalne fibryle ze skóry cielęcej6. Substrat ten lepiej pozwala przewidzieć kinetykę degradacji kolagenu w macierzy tkankowej, ponieważ opiera się na natywnym kolagenie jako substracie. Proteaza została scharakteryzowana za pomocą czułego fluorescencyjnego testu kinetycznego10. Wykorzystanie tych ulepszonych testów wraz z tradycyjną analizą biochemiczną pozwala na bardziej powtarzalną produkcję TDE, co prowadzi do poprawy spójności działania między partiami. Protokół opisany w niniejszej pracy został zoptymalizowany pod kątem maksymalnej wydajności i optymalnej morfologii wysepek z wykorzystaniem myszy C57BL/6. Podczas opracowywania tego protokołu oceniono kilka kombinacji kolagenazy i proteaz neutralnych w różnych stężeniach, a końcowy stosunek kolagenazy do proteazy neutralnej wynoszący 35:10 reprezentuje wydajność enzymu porównywalną z Sigma Type XI. Ze względu na raportowaną znaczną zmienność średnich wydajności wysepek u różnych szczepów szczurów i myszy, należy wprowadzić dodatkowe modyfikacje składu TDE, aby poprawić wydajność i jakość wysepek odzyskiwanych z różnych gatunków i szczepów.

Szczegółowy opis izolacji wysepek trzustkowych myszy został przedstawiony z wykorzystaniem techniki kanulacji przewodu trzustkowego in situ oraz perfuzji mieszaniną oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Analiza ekspresji genów i funkcji komórek beta in vitro uległa na przestrzeni lat wyraźnemu przesunięciu – od badań nad gryzoniimi liniami komórkowymi o charakterze tumorigennym...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomyślne wyizolowanie wysepek trzustkowych z trzustki myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw wyizolowanie trzustki z otaczających ją tkanek. Następnie przeprowadza się kaniulację przewodu żółciowego, aby umożliwić wypełnienie trzustki mieszaniną kolagenazy i proteazy.Po nadmuchaniu trzustkę usuwa się, a wyspki są ostrożnie dysocjowane. Na koniec wyizolowane wyspki są filtrowane i wysiewane do późniejszego wykorzystania. Ostatecznie ta metoda izolacji wyspek z użyciem oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej jest stosowana w celu uzyskania maksymalnej wydajności oraz optymalnej morfologii wyspek.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do istniejących metod izolacji wysepek trzustkowych jest wyeliminowanie zmienności między partiami dzięki zastosowaniu oczyszczonych enzymów. Ponadto zmodyfikowano lub ulepszono niektóre protokoły w celu poprawy morfologii wysepek. Po eutanazji należy pokryć tułów 70% ethanol, a następnie całkowicie otworzyć jamę brzuszną, od odbytu do przepony.Następnie umieść mysz na platformie mikroskopu sekcyjnego. Wyciągnij kątnicę oraz okrężnicę wstępującą i ułóż je poza jamą ciała po lewej stronie, odsuwając płaty wątroby w kierunku przepony. Jeśli nie pozostaną one w tej pozycji, powiększ otwór jamy ciała.Chwyć dwunastnicę zakrzywioną pęsetą i zlokalizuj wiązkę tętnicy wątrobowej, żyły wrotnej i przewodu żółciowego prowadzącą do wątroby. Za pomocą drugiej zakrzywionej pęsety wprowadź szew pod wiązkę tętnicy, żyły i przewodu, a następnie zaciśnij go jak najbliżej wątroby.Używając dwóch par zakrzywionych pęset, ostrożnie uchwyć dwunastnicę i zlokalizuj przewód żółciowy przyłączony do brodawki. Jednym ramieniem pęsety przebij trzustkę oraz tkankę łączną bezpośrednio pod przewodem żółciowym i w pobliżu brodawki. Szybko wprowadź pęsetę przez otwór i przełóż szew. Luźno zawiąż szew wokół przewodu żółciowego, tworząc małą pętlę za pomocą pęsety kątowej 90 stopni.Odciągnij jelito cienkie, aż przewód żółciowy zostanie napięty. Wykonaj jedno poziome cięcie przez brodawkę za pomocą superprecyzyjnych nożyczek, nie przesuwając przewodu żółciowego względem brodawki i trzymając jednocześnie jelito. Wprowadź kaniulę do przewodu żółciowego, a następnie delikatnie zaciśnij szew wokół kaniuli.Następnie należy napełnić strzykawkę o pojemności 3 ml 2,0 ml mieszaniny proteazy kolagenazy. Wstrzyknij tę mieszaninę do kaniuli w powolnym, stałym tempie. Po całkowitym nadmuchaniu trzustki usuń kaniulę z przewodu żółciowego.Zaczynając od okrężnicy zstępującej, wycinaj tkankę łączną, jednocześnie odsuwając jelita w górę, aż do momentu dotarcia do przewodu żółciowego. Następnie oddziel trzustkę od śledziony i otaczających ją tkanek. Na koniec przetnij szwy i wyjmij trzustkę.Po wyjęciu umieść trzustkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml HBSS w lodzie. Po zebraniu wszystkich próbek umieść wszystkie probówki 50 ml z tkanką trzustki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przez 15 minut delikatnie kołysz probówką, sprawdzając stopień dysocjacji tkanki.Upewniając się, że tkanka łatwo się rozpada, trzymając probówkę za zakrętkę, wykonaj 12 okrężnych ruchów, aby dodatkowo zdysocjować tkankę. Dodaj nie więcej niż 30 milliliters HBSS i odwiruj w wirówce.Ostrożnie odessaj nadsącz, pozostawiając na dnie niewielką jego ilość, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Za pomocą strzykawki o pojemności 30 ml z igłą 14 G dodaj nie więcej niż 10 ml HBSS i dwukrotnie odessij zawiesinę, wykonując ruchy góra-dół. Przefiltruj mieszaninę komórek przez plastikowe sitko w kształcie litery T do probówki o pojemności 50 ml.Przepłukać kolejnymi 10 mililitrami HBSS i odwirować. Odlać nadsącz i odwrócić probówki, aby odciekły na chłonnym ręczniku papierowym przez jedną minutę. Każdą zawartość probówek zawiesić ponownie w 10 mililitrach.Schłodzić do 1100. Jego nieprzezroczysta nakładka, jego nieprzezroczysta z 10 mililitrami HBSS i wirować. Usunąć całe 20 mililitrów supernatantu za pomocą pipety o szerokim wylocie 25 mililitrów i przepuścić supernatantu przez odwrócony filtr 70 mikronów.Przefiltruj eyelety bezpośrednio do szalki Petriego i wypłucz, pipetując 10 milliliters pożywki do eyeletów przez kulturę na filtrze. Przechowuj eyelety w inkubatorze do hodowli tkankowych do momentu rozpoczęcia eksperymentów. Wydajność, morfologia i jakość eyeletów są ogólnymi parametrami służącymi do oceny skuteczności izolacji eyeletów.Typowa morfologia wysepek jest tutaj pokazana. Wysepki mają kształt od okrągłego do wydłużonego i cechują się stosunkowo jednolitym rozmiarem. Tutaj. Izolowane wysepki zostały poddane analizie w celu oceny wydzielania insuliny stymulowanego glukozą.Stymulacja insuliną była podobna w przypadku wysepek przygotowanych za pomocą Sigma Type 11 w porównaniu do ci zyme TM, MABP, co wskazuje na wysoką jakość preparacji wysepek. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić kaniulację przewodu żółciowego myszy. Do izolacji wysepek do dowolnego badania należy użyć kolagenazy zyme oraz neutroproteaz.

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wyspa trzustki Langerhansa Izolowana za pomocą kombinacji oczyszczonej kolagenazy i neutralnej proteazy

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Wyspy trzustkowe, zwane również wysepkami Langerhansa, to skupisko komórek endokrynnych, które produkują hormony do regulacji poziomu glukozy i innych ważnych funkcji biologicznych. Ten protokół wyjaśnia metodę izolowania wysp trzustkowych poprzez najpierw perfuzję kolagenazy przez Ampulla Vatera w celu trawienia zewnątrzwydzielniczej tkanki trzustki i uproszczone wirowanie gradientu gęstości w celu oczyszczenia wysp trzustkowych od myszy.

Izolacja wysp trzustkowych poprzez perfuzję kolagenazy: enzymatyczna metoda izolowania komórek wysp trzustkowych

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Ten protokół izolacji wysp opisał nową drogę wstrzykiwania kolagenazy w celu trawienia tkanki zewnątrzwydzielniczej oraz uproszczoną procedurę gradientu do oczyszczania wysp trzustkowych z myszy. Obejmuje trawienie enzymatyczne, gradientową separację/oczyszczanie i ręczne zbieranie wysepek. Udana izolacja może dać 250–350 wysokiej jakości i w pełni funkcjonalnych wysepek na mysz.

Prosty protokół o wysokiej skuteczności izolacji wysp trzustkowych od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

W tym protokole opisana jest metoda izolacji i przeszczepu mysich wysp trzustkowych do pachwinowej podskórnej białej tkanki tłuszczowej. Izolowane syngeniczne mysie wysepki są przeszczepiane mysiemu biorcy za pomocą hydrożelu z błony podstawnej. Monitorowany jest poziom glukozy we krwi biorców i przeprowadzana jest analiza histologiczna przeszczepów wysp trzustkowych.

Pachwinowy podskórny model przeszczepu białej tkanki tłuszczowej (ISWAT) mysich wysp trzustkowych

Tutaj przedstawiamy i demonstrujemy protokół izolacji pierwotnych komórek śródbłonka sinusoidalnego wątroby myszy (LSEC). Protokół opiera się na perfuzji kolagenazy wątrobowej, oczyszczaniu komórek niemiąższowych przez wirowanie z niską prędkością oraz selekcji kulek magnetycznych CD146. Zajmujemy się również fenotypowaniem i charakteryzacją tych izolowanych LSEC za pomocą cytometrii przepływowej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych sinusoidalnych komórek śródbłonka wątroby myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Poznaj metodę izolacji wysepek Langerhansa z trzustki myszy przy użyciu oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej. Technika zapewnia wysoką wydajność, optymalną morfologię i zmniejszoną zmienność między partiami enzymów.

Izolacja wysepek Langerhansa myszy z wykorzystaniem kombinacji oczyszczonej kolagenazy i proteazy neutralnej

Przeglądaj więcej filmów