Name: Mikrodializa etanolu podczas samodzielnego podawania etanolu i oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: Poznaj mikrodializę mózgu u szczurów podczas samodzielnego podawania etanolu z analizą chromatograficzną. Ta metoda umożliwia ciągłe monitorowanie stężenia alkoholu w czasie rzeczywistym podczas zadań behawioralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badanie to zostało sfinansowane z grantów NIH/NIAAA (AA11852 oraz AA007471).

<ol><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880(2008).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li>
<li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li>
<li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li>
<li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+The+Rat+Forebrain%22">Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain</a>. , Academic Press Inc. (1998).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press Inc. (1986).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Principles+of+Instrumental+Analysis%22">Principles of Instrumental Analysis</a>. , 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).</li>
<li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+operant+self-administration+of+10%25+ethanol+plus+10%25+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li>
<li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li>
<li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li>
<li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li>
</ol>

Niniejszy artykuł został sfinansowany przez Med Associates, Inc.

Zastosowania i ograniczenia
Samopodawanie leków jest wykorzystywane u gryzoni do modelowania uzależnienia od substancji. Wiele nadużywanych substancji modelowanych w ten sposób może być podawanych dożylnie, co pozwala na dostarczenie leku bezpośrednio do przedziału centralnego. Umożliwia to ścisłe monitorowanie dawki podczas sesji samopodawania. Ponieważ etanol jest zazwyczaj podawany doustnie, monitorowanie jego poziomu jest znacznie trudniejsze ze względu na indywidualne różnice w wchłanianiu i metabolizmie. Dzięki zastosowaniu mikrodializy do pobierania próbek z interesującego regionu mózgu, jesteśmy w stanie nie tylko monitorować wzorzec docierania etanolu do tego obszaru, ale także jednocześnie śledzić zmiany w poziomie neurotransmiterów w tym samym regionie w czasie, podczas każdej fazy samopodawania.
Zmiany neurochemiczne i odpowiedzi indukowane lekami w mózgu są powiązane z nadużywaniem substancji i uzależnieniem; zatem możliwość jednoczesnego pomiaru stężeń substancji neurochemicznych i leków podczas konkretnych faz samopodawania stanowi niezwykle potężne i unikalne narzędzie. Kwestią, którą należy wziąć pod uwagę przy korelowaniu stężeń analitów w dializacie z zachowaniem, są właściwości fizyczne układu mikrodializacyjnego. W szczególności krytyczny jest czas transportu płynu z światła sondy do mikrodializy do probówki zbiorczej, przy czym krótszy czas jest korzystniejszy. W naszym laboratorium konstruujemy sondy w taki sposób, aby czas ten wynosił około 90 sec. W tych warunkach stwierdziliśmy wzrost poziomu dopaminy w jądrze półleżącym przy rozpoczęciu spożywania etanolu, który następnie spada w trakcie picia oraz w okresach po piciu, w miarę jak wzrasta stężenie etanolu w dializacie.2,3,8,9 Eksperymenty te, w połączeniu z danymi z badań farmakologicznych, pozwoliły nam wyodrębnić ściśle farmakologiczne efekty etanolu oraz wpływ sygnałów środowiskowych związanych z samopodawaniem na zmiany stężeń neuroprzekaźników.
Należy zauważyć, że to konkretne zastosowanie połączonych technik behawioralnych i mikrodializy jest dostosowane do aktualnych zainteresowań badawczych naszego laboratorium. Zostało ono zaprojektowane w celu oceny wzorca czasowego docierania etanolu do mózgu w porównaniu do wzorca zmian neuroprzekaźników w tym samym obszarze, co pozwala nam powiązać te pomiary z synchronicznymi zachowaniami samopodawania. Uzyskane stężenia etanolu w dialyzacie nie są korygowane o odzysk sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgowej. Jeśli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, frakcję ekstrakcji etanolu dyfundującego z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy należy wyznaczyć doświadczalnie. Metody i dalsza dyskusja znajdują się w poprzednich publikacjach naszego laboratorium.10,11,12 
Choć niniejszy protokół ilustruje zastosowanie chromatografii gazowej wraz z mikroekstrakcją w fazie stałej etanolu z przestrzeni nadpróbkowej próbek z mikrodializy, do analizy zawartości etanolu w próbkach z mikrodializy można zastosować inne metody. Metody alternatywne mogą jednak wiązać się z pewnymi wadami. Na przykład mniej czułe metody analityczne mogą wymagać większej objętości próbki, co wymusza wydłużenie czasu pobierania poza przedział 5-7 min przedstawiony w niniejszym opracowaniu. Opisany tutaj typ systemu wykorzystuje mikroekstrakcję w fazie stałej, która zagęszcza etanol w fazie par w zamkniętej fiolce z próbką poprzez absorpcję na włóknie umieszczonym w przestrzeni nadpróbkowej fiolki. Poprawia to granicę wykrywalności w porównaniu z bezpośrednim pobieraniem z przestrzeni nadpróbkowej, w którym zazwyczaj wstrzykuje się 50-100 μl par. Inną istotną zaletą metody analizy przestrzeni nadpróbkowej jest fakt, że próbka wstrzykiwana do analizy jest niezwykle czysta i wolna od soli. Można również zastosować bezpośredni wtrysk ciekłej próbki z mikrodializy, co pozwala na uzyskanie wyższej czułości, jednak będzie to wymagać częstszych przestojów urządzenia ze względu na regularną konserwację niezbędną do usunięcia wstrzykniętych soli.
Rozwiązywanie problemów i inne uwagi
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem eksperymentu zarezerwuj wystarczająco dużo czasu, aby sprawdzić, czy zestawy do mikrodializy funkcjonują prawidłowo, oraz aby rozwiązać ewentualne problemy. Sugerujemy przygotowanie dodatkowego zestawu, perfundowanego ACSF, który można będzie szybko zamienić z niesprawnym urządzeniem w celu zaoszczędzenia czasu, ponieważ większość sesji operacyjnych odbywa się zazwyczaj o określonej godzinie każdego dnia.</li>
 <li>Należy upewnić się, że sondy do mikrodializy są wprowadzane w czasie około 5 min, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki spowodowane jej rozrywaniem podczas penetracji mózgu przez sondę.</li>
 <li>Przy przenoszeniu szczura do komory operacyjnej pomoc drugiej osoby jest przydatna, aby linia transferowa (część zestawu do mikrodializy) nie zaplątała się, a program operacyjny mógł zostać uruchomiony punktualnie.</li>
 <li>Należy zapewnić odpowiednią ilość czasu na osiągnięcie właściwej temperatury w łaźni wodnej autosamplera. Nasz system zazwyczaj wymaga dwóch hr, aby osiągnąć 50 °C. Należy również upewnić się, że próbki są całkowicie odparowane przed ich analizą. Zazwyczaj potwierdzamy to wizualnie przed rozpoczęciem analizy próbek.</li>
 <li>Należy przestrzegać standardowych zasad dobrej praktyki chemii analitycznej. Obejmują one między innymi walidację personelu, sprzętu i procedur. W skrócie stosujemy następujące wytyczne: poszczególni użytkownicy powinni wykazać zdolność do generowania powtarzalnych wartości wysokości piku dla stężeń wzorców oraz liniowych krzywych wzorcowych (R2 ≥ 0.99) w ciągu wielu dni. Aby zweryfikować prawidłowe działanie systemu GC-FID, wzorce powinny być zawsze analizowane przed wstrzyknięciem jakichkolwiek próbek dialyzatu. Wygenerowana krzywa wzorcowa powinna mieć R2 ≥ 0.99.</li>
 <li>Większość używanego przez nas sprzętu została zakupiona w Varian, Inc., która w 2010 r. została przejęta przez Agilent Technologies. W tym czasie Bruker Scientific Instruments przejął działalność Varian w zakresie laboratoryjnych instrumentów do chromatografii gazowej. W przypadku przyszłych zakupów należy skonsultować się z którąkolwiek z tych firm.</li>
 <li>Niniejszy protokół przedstawia zachowanie operacyjne u szczurów, jednak widz powinien mieć świadomość, że w przypadku mniejszego modelu mysiego prawdopodobne jest wystąpienie większych zaburzeń zachowania. Innym aspektem, na który należy zwrócić uwagę, jest fakt, że umieszczenie sondy do mikrodializy w obszarach mózgu innych niż przyśrodkowa kora przedczołowa lub jądro półleżące może zaburzyć zachowanie operacyjne w większym stopniu niż pokazano tutaj. Ważne jest dokładne zbadanie licznych parametrów behawioralnych, aby ustalić, czy uszkodzenia spowodowane umieszczeniem sondy wywołują poważne zmiany w zachowaniu.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>95% etanol</td><td>AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY</td><td>E190, 111000190</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza ultra-czysta</td><td>MP Biomedicals, LLC, Solon, OH</td><td>821721</td><td></td></tr><tr><td>Hel o ultra-wysokiej czystości</td><td>Air Gas</td><td>HE UHP300</td><td></td></tr><tr><td>Powietrze</td><td>Air Gas</td><td>AIZ300</td><td></td></tr><tr><td>Wodór</td><td>Air Gas</td><td>AIZ300</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki do GC 2 ml</td><td>Agilent Technologies</td><td>#8010-0015</td><td></td></tr><tr><td>Nakrętki do fiolek GC z septami PTFE/silikonowymi</td><td>Agilent Technologies</td><td>#8010-0084</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki</td></tr></tbody></table>

mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Metody operantowej samopodaży są powszechnie stosowane do badania efektów behawioralnych i farmakologicznych wielu substancji psychoaktywnych, w tym etanolu. Jednak etanol jest zazwyczaj podawany drogą doustną, a nie dożylną, jak ma to miejsce w przypadku wielu innych narkotyków. Farmakokinetyka leków podawanych doustnie jest bardziej złożona niż w przypadku leków podawanych dożylnie. Ponieważ zrozumienie związku między efektami farmakologicznymi a behawioralnymi etanolu wymaga wiedzy na temat przebiegu czasowego przenikania etanolu do mózgu w trakcie i po piciu, stosujemy mikrodializę in vivo oraz chromatografię gazową z detekcją zapłonową w celu monitorowania stężeń etanolu w dialyzacie mózgowym w czasie.
Połączone eksperymenty behawioralne i mikrodializacyjne obejmują zastosowanie kilku technik. W niniejszym artykule zabieg stereotaksyczny, trening behawioralny oraz mikrodializa, które mogą być dostosowane do testowania wielu hipotez dotyczących samopodawania i neurochemii, zostały ujęte jedynie w celu zilustrowania ich związku z późniejszymi etapami pobierania próbek i analizy etanolu w dializacie. Szczegółowo opisano analizę stężenia etanolu w dializacie za pomocą chromatografii gazowej z detekcją jonizacji płomieniowej, która jest specyficzna dla badań nad etanolem. Dane uzyskane tymi metodami ujawniają wzorzec przenikania etanolu do mózgu podczas procedury samopodawania, a w połączeniu z analizą neurochemiczną tych samych próbek dializatu pozwalają na wyciągnięcie wniosków dotyczących efektów farmakologicznych i behawioralnych etanolu.

Opisano metodę określania przebiegu czasowego stężenia etanolu w mózgach szczurów podczas operantowej samopodaży etanolu. Do ilościowego oznaczenia etanolu w próbkach dialyzatu zastosowano chromatografię gazową z detekcją płomieniowo-jonizacyjną, ponieważ charakteryzuje się ona czułością wymaganą dla generowanych małych objętości.

Mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Metody operacyjnego samozapomagania są powszechnie stosowane do badania efektów behawioralnych i farmakologicznych wielu substancji nadużywanych, w tym etanolu.

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie poziomu etanolu w dializacie mózgowym podczas sesji samopodawania etanolu. Aby porównać ten pomiar z jednoczesnymi zachowaniami związanymi z samopodawaniem, w pierwszej kolejności chirurgicznie implantuje się prowadnicę do mikrodializy, kaniulę oraz śrubę mocującą, a następnie szkoli szczury w operacyjnym samopodawaniu etanolu. Drugim krokiem jest habituacja szczurów do uwięzi etapu głowowego, aby nie utrudniała ona samopodawania etanolu podczas mikrodializy.Następnie przeprowadza się mikrodializę podczas sesji samopodawania etanolu, w trakcie której przygotowywana jest część dializatu do analizy zawartości etanolu. Następnie próbki dializatu analizuje się pod kątem stężenia etanolu przy użyciu chromatografu gazowego z detekcją podczas jonizacji płomieniowej. Ostatecznie otrzymane wyniki obrazują przebieg czasowy docierania etanolu do badanego obszaru mózgu podczas sesji samopodawania etanolu.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakłucie ogona lub żyły saphrenous, jest to, że procedura ta jest minimalnie inwazyjna w momencie pobierania próbek i pozwala na pomiar stężenia leku w czasie w badanym obszarze mózgu, podczas gdy zwierzę wykonuje zadanie behawioralne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą będą napotykać trudności, ponieważ wymaga ona szeregu specjalistycznych umiejętności, z których wiele można nabyć jedynie poprzez wielokrotną praktykę lub doświadczenie. Procedurę będzie demonstrował Jeffrey Dilley, student wspierający badania w naszym laboratorium.Wszystkie przedstawione procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Teksańskiego i są zgodne ze wszystkimi regulacjami dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi i ich wykorzystania. Uniwersytet Teksański w Austin jest placówką akredytowaną przez ALAC; do tych eksperymentów z mikrodializą behawioralną wykorzystuje się szczury linii Long Evans, którym chirurgicznie wszczepiono kaniulę o rozmiarze 21 G nad odpowiednim obszarem mózgu. Wszystkie zwierzęta powinny przejść co najmniej tydzień opieki i rekonwalescencji po operacji i być zdrowe przed rozpoczęciem następujących procedur.Umieść szczura w komorze operantowej Med Associates, wyposażonej w chowany dźwignia Lichter oraz rurkę z dozownikiem, i wytrenuj go w naciskaniu dźwigni w celu uzyskania dostępu do 10% roztworu sacharozy. Po wytrenowaniu szczura w reagowaniu na roztwór sacharozy, wprowadź go na odpowiedni schemat treningowy, podczas którego etanol jest stopniowo dodawany do roztworu w trakcie wielu sesji picia w noc poprzedzającą przedostatnią sesję operantową. Po znieczuleniu zwierzęcia i sprawdzeniu stopnia sedacji, przymocuj sprężynę wiązania do śruby wiązania na etapie głowowym szczura, aby przyzwyczaić go do aparatury, która składa się z dźwigni przeciwwagi, ramienia, obrotowego wiązania, sprężyny i statywu z pierścieniem.Pozostaw szczura na noc w pomieszczeniu operacyjnym w jego domowej klatce z dostępem do ściółki, pokarmu i wody, a następnie następnego dnia przeprowadź sesję treningową z użyciem uwięzi i towarzyszącego sprzętu w dniu poprzedzającym eksperyment z mikrodializy. Po znieczuleniu szczura izofluranem sprawdź stopień sedacji, wykonując ucisk palca u nogi, a następnie wprowadź sondę do mikrodializy perfundowaną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Odpowiednio przymocuj sondę, a następnie ustaw szybkość przepływu sondy na 0,2 µL na minutę.Umieść szczura w jego domowej klatce w pomieszczeniu z aparaturą do warunkowania instrumentalnego, aby spędził tam noc z zainstalowanym całym sprzętem do dializy oraz z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Dzień po wprowadzeniu sondy, co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, zwiększ przepływ sondy do wartości roboczej. Za pomocą strzykawki Hamiltona sprawdź, czy szybkość przepływu sondy jest stabilna i wynosi co najmniej 90% ustawionego przepływu.W przypadku oceny neuroprzekaźników w próbkach z dializy, należy pobierać próbki podczas wszystkich faz eksperymentu. Rozpocznij od zbierania próbek z dializy, gdy zwierzę znajduje się w klatce domowej. Próbki należy przechowywać w odpowiedni sposób do późniejszej analizy.Ostrożnie przenieś szczura do komory operantowej i uruchom program operantowy sterujący komorą. Kontynuuj pobieranie próbek, podczas gdy szczur czeka na wysunięcie dźwigni do komory, pobierając dwie próbki przed wysunięciem dźwigni. Rozpocznij pobieranie części każdej próbki dializatu do analizy etanolu, pipetując odpowiednią alikwotę dializatu do szklanej fiolki o objętości 2 ml i zamykając fiolkę szczelnym septem; próbki etanolu pipetuj i zamykaj szybko.Ponieważ etanol jest lotny, a objętość próbki jest niewielka, niespójne lub powolne przygotowanie próbek doprowadzi do nieprawidłowych wyników. Pozostałą część należy przechowywać do analizy neuroprzekaźników. 20-minutowy okres picia rozpoczyna się po tym, jak program komputerowy Med Associates wysunie dźwignię do komory i szczur naciśnie ją, aby uzyskać dostęp do butelki z roztworem do picia.Nadal pobieraj próbki przez cały okres podawania napoju; po zakończeniu tego okresu program komputerowy wycofa butelkę z komory. Pozostaw zwierzę w komorze na dodatkowe 20 minut po zakończeniu podawania napoju, pod koniec eksperymentu z mikrodializy. Po znieczuleniu szczura usuń sondę.Jeśli zwierzę nie zostanie niezwłocznie poddane humanitarnej eutanazji, należy ponownie wprowadzić obturator, aby zapewnić wizualizację toru sondy. Mózg należy pobrać w ciągu trzech dni od zakończenia eksperymentu. Próbki należy przeanalizować wraz z zewnętrznymi wzorcami etanolu przy użyciu chromatografu gazowego z detektorem jonizacji płomieniowej, autosamplera headspace podgrzanego do 50 °C oraz kolumny kapilarnej z helem jako fazą ruchomą.Do rejestracji i analizy chromatogramów należy wykorzystać oprogramowanie stacji roboczej do chromatografii, aby przygotować system do analizy etanolu. Należy użyć cyrkulacyjnej łaźni wodnej do podgrzania płytki autosamplera oraz otworzyć butle z powietrzem i wodorem. Następnie należy uruchomić program startowy.Po przygotowaniu rozpocznij 20-minutowe wypalanie w celu dekontaminacji włókna. Przygotuj standardy, używając kolby miarowej o pojemności 100 ml, aby rozcieńczyć 238 µL 95% etanolu wodą do końcowej objętości 100 ml. Do utworzenia serii standardów zastosuj rozcieńczenia seryjne w stosunku jeden do jednego.Przenieś standardy pipetą do szklanych fiolek i zapieczętuj je w taki sam sposób, w jaki przygotowano próbki. Należy pamiętać o wykonaniu próby ślepej z wodą wraz ze standardami. Umieść standardy i próbki w tacy autosamplera i podgrzewaj je do czasu całkowitego odparowania całej alikwoty cieczy.Aby przeprowadzić analizę wzorców i próbek, należy sporządzić listę próbek z zaznaczeniem, która próbka znajduje się w którym gnieździe autosamplera, oraz z informacją, że każda próbka powinna zostać przebita. Następnie należy przekierować pliki z danymi do wybranego folderu, wybrać odpowiednią metodę analizy próbek i rozpocząć pomiar. Po zakończeniu analizy wszystkich próbek należy sprawdzić, czy program prawidłowo zintegrował każdy pik.Nanieś na wykres wysokość piku w funkcji każdego znanego wzorca zewnętrznego. Stężenie etanolu. Wykorzystaj funkcję liniową wyznaczoną przez te punkty, aby zinterpolować stężenie etanolu w każdej próbce dializatu.Na tej rycinie przedstawiono przykładowe chromatogramy dla trzech stężeń wzorców etanolu oraz jeden chromatogram dla próbki dialyzatu szczura pobranej na koniec sesji samopodawania etanolu. Piki etanolu powinny być względnie symetryczne, mieć spójne czasy retencji i stosunek sygnału do szumu większy niż 10. Niespełnienie tych kryteriów oznacza, że system wymaga konserwacji; prawidłowo przygotowane wzorce w wysokiej jakości chromatografii pozwalają uzyskać liniową krzywą wzorcową, która jest wykorzystywana do obliczenia stężenia etanolu w próbkach dialyzatu pobranych od zwierząt podających sobie etanol w trakcie procesu samopodawania.Obliczone stężenia etanolu w dializacie nie są korygowane o odzysk sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgowej. Jeśli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, eksperymentalnie wyznacza się frakcję ekstrakcji etanolu dyfundującego z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje około czterech do pięciu godzin.Będzie to zależeć od długości sesji behawioralnej. Pomyślne zakończenie fazy mikrodializy w eksperymencie w dużej mierze zależy od jakości faz przygotowawczych. Podczas próbowania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że szczury są dobrze oswojone i że przyzwyczajono je do wszelkich potencjalnie rozpraszających bodźców, które mogłyby wystąpić podczas eksperymentu z dializą, tak aby zachowanie zwierzęcia w zakresie samopodawania nie zostało zaburzone.

microdialysis-ethanol-during-operant-ethanol-self-administration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikrodializa Etanolu Podczas Operacyjnego Samousuwania Etanol i Oznaczanie Etanol przez Chromatografię Gazową

Pokazujemy budowę komór parowych z użyciem łatwo dostępnych materiałów, które jednocześnie mieszczą 6 klatek dla myszy. Dalej opisujemy ich zastosowanie w mysim modelu ekspozycji płodu na alkohol równoważnej we wszystkich 3 trymestrzech ciąży ludzkiej. Ten paradygmat eksponuje zwierzęta w czasie ciąży i w dniach poporodowych 1-12.

Budowa komór parowych używanych do wystawiania myszy na działanie alkoholu w czasie odpowiednika wszystkich trzech trymestrów rozwoju człowieka

Proste testy do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u Drosophila ułatwiają wykorzystanie tego organizmu modelowego do badania tych ważnych zachowań związanych z etanolem. W tym miejscu opisano stosunkowo prosty, skalowalny test do pomiaru wrażliwości etanolu i szybkiej tolerancji u much.

Niedrogi, skalowalny test behawioralny do pomiaru wrażliwości i szybkiej tolerancji sedacji etanolem u Drosophila

Ten protokół opisuje nowatorską i efektywną metodę szybkiego inicjowania reakcji instrumentalnej na etanol u szczurów, która, w przeciwieństwie do standardowych metod, nie wymaga pozbawienia wody ani zaniku sacharyny/sacharozy, aby zainicjować odpowiedź.

Metoda oceny wzmacniających właściwości etanolu u szczurów bez niedoboru wody, blaknięcia sacharyny lub szkolenia o przedłużonym dostępie

Opisujemy protokół wywoływania nagradzających i nienagradzających doświadczeń u muszek owocowych (Drosophila melanogaster) przy użyciu dobrowolnego spożycia etanolu jako miary zmian w stanach nagrody.

Prosty sposób na zmierzenie zmian w zachowaniu związanym z poszukiwaniem nagrody za pomocą Drosophila melanogaster

Zaburzenie związane z używaniem alkoholu (AUD) jest poważnym problemem zdrowotnym w kraju i konieczne jest opracowanie bardziej skutecznych metod leczenia, aby zrównoważyć potrzeby tej populacji pacjentów. W tym celu poniższy protokół wykorzystuje dwa proste modele picia gryzoni do oceny przedklinicznej skuteczności ołowiowych związków przeciwalkoholowych.

Mysie modele picia w rozwoju farmakoterapii alkoholizmu: picie w ciemności i wybór dwóch butelek

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

To badanie ma na celu pokazanie, że paradygmat Progresywnego Proporcji Wspomaganego Komputerowo Systemu Infuzji Alkoholu (CAIS) jest wiarygodną i czułą metodą, która może być wykorzystana do zbadania motywujących właściwości związanych z samodzielnym podawaniem alkoholu u ludzi.

Motywacja do nagrody alkoholowej: predyktory samodzielnego podawania alkoholu w postępowym stosunku u ludzi

Prezentowany tutaj jest protokół dla modelu 2BC/CIE uzależnienia od alkoholu u myszy do badania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu.

Przewlekła przerywana ekspozycja na opary etanolu w połączeniu z wyborem dwóch butelek w celu modelowania zaburzeń związanych z używaniem alkoholu

Ten protokół opisuje standardowy paradygmat picia w domowej klatce z przerywanym dostępem do dwóch butelek do modelowania spożycia alkoholu u szczurów. Ponadto zawiera instrukcje krok po kroku, aby rozszerzyć standardowy protokół o system wykrywania lizawek DIY, który umożliwia analizę mikrostrukturalną zachowań związanych z piciem.

Modelowanie spożycia alkoholu u gryzoni przy użyciu dwóch butelek do wyboru w klatce domowej i analizy mikrostrukturalnej

Samopodawanie leku oraz wokalizacje ultradźwiękowe (USV) są wykorzystywane jako oceny behawioralne w badaniach na zwierzętach, lecz rzadko w połączeniu. Celem niniejszego artykułu jest opisanie zalet rejestrowania USV podczas procedur samopodawania leków w celu oceny odpowiedzi afektywnych na doświadczenie związane z przyjmowaniem substancji.

Ocena wokalizacji ultradźwiękowych podczas samopodawania leku u szczurów

Poznaj mikrodializę mózgu u szczurów podczas samodzielnego podawania etanolu z analizą chromatograficzną. Ta metoda umożliwia ciągłe monitorowanie stężenia alkoholu w czasie rzeczywistym podczas zadań behawioralnych.

Mikrodializa etanolu podczas operacyjnego samopodawania etanolu oraz oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Przeglądaj więcej filmów