Mikrodializa etanolu podczas samodzielnego podawania etanolu i oznaczanie etanolu metodą chromatografii gazowej

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie poziomu etanolu w dializacie mózgu podczas sesji samodzielnego podawania etanolu. Aby porównać tę miarę z synchronicznymi zachowaniami samodzielnego podawania, osiąga się to najpierw poprzez chirurgiczne wszczepienie przewodnika do mikrodializy, kaniuli i mocującej, a następnie przeszkolenie szczurów w zakresie samodzielnego podawania etanolu. Drugim krokiem jest przyzwyczajenie szczurów do uwięzi stopnia głównego, tak aby nie utrudniało to samodzielnego podawania etanolu podczas mikrodializy.

Następnie przeprowadza się mikrodializę podczas sesji samodzielnego podawania etanolu, podczas której przygotowuje się porcję dialatu do analizy etanolu. Następnie próbki dialatu są analizowane pod kątem stężenia etanolu za pomocą chromatografu gazowego z detekcją płomieniowo-jonizacyjną. Ostatecznie uzyskane wyniki pokazują przebieg czasowy, w którym etanol dociera do obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania podczas sesji samodzielnego podawania etanolu.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak nakłucie ogona lub żyły odpiszczelowej, jest to, że procedura ta jest minimalnie uciążliwa w momencie pobierania próbki i pozwala na pomiar leku w czasie w obszarze mózgu będącym przedmiotem zainteresowania, podczas gdy zwierzę wykonuje zadanie behawioralne. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wymaga ona wielu specjalistycznych umiejętności, z których wiele można zdobyć tylko poprzez wielokrotne ćwiczenia lub doświadczenie. Procedurę zademonstruje również Jeffrey Dilley, asystent naukowy w naszym laboratorium.

Wszystkie przedstawione procedury na zwierzętach są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu w Teksasie i są zgodne ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. University of Texas w Austin jest akredytowaną przez ALAC placówką, w której do tych behawioralnych eksperymentów mikrodializy wykorzystywane są dobrze obsługiwane długie szczury Evans, którym chirurgicznie wszczepiono kaniulę o rozmiarze 21 powyżej obszaru mózgu. Wszystkie zwierzęta powinny otrzymać co najmniej tygodniową opiekę pooperacyjną i rekonwalescencję oraz być zdrowe przed rozpoczęciem kolejnych zabiegów.

Umieść szczura w komorze operacyjnej med associates, wyposażonej w wysuwaną dźwignię lichter i rurkę wywrotki i naucz go, aby naciskał dźwignię, aby uzyskać dostęp do 10% roztworu sacharozy. Po tym, jak szczur zostanie przeszkolony w reagowaniu na roztwór sacharozy, rozpocznij go zgodnie z odpowiednim harmonogramem treningowym, podczas którego etanol jest stopniowo dodawany do roztworu przez wiele sesji picia w noc poprzedzającą przedostatnią sesję operacyjną. Po znieczuleniu zwierzęcia i sprawdzeniu poziomu uspokojenia, przymocuj sprężynę mocującą do mocującej na stopniu głowy szczura, aby przyzwyczaić ją do aparatu, który składa się z dźwigni przeciwwagi, ramienia, uwięzi obrotowej, sprężyny i stojaka na pierścienie.

Pozwól szczurowi spędzić noc w pomieszczeniu operacyjnym w swojej domowej klatce z ad lido, jedzeniem i wodą, a następnie zakończ sesję treningową następnego dnia z uwięzią i towarzyszącym sprzętem na miejscu dzień przed eksperymentem mikrodializy. Po znieczuleniu szczura izofluorem sprawdź, czy nie ma sedacji, wykonując szczypanie palca u nogi i włóż sondę do mikrodializy wypełnioną sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym. Odpowiednio zabezpiecz sondę, a następnie dostosuj natężenie przepływu sondy do 0,2 mikrolitra na minutę.

Umieść szczura w jego domowej klatce w pomieszczeniu operacyjnym, aby spędził noc z całym sprzętem do dializy na miejscu i dodaj lib, jedzenie i wodę. Dzień po włożeniu sondy, co najmniej dwie godziny przed rozpoczęciem eksperymentu, zwiększ prędkość przepływu sondy do jej roboczego natężenia przepływu. Za pomocą strzykawki Hamilton sprawdź, czy natężenie przepływu sondy jest stałe i wynosi co najmniej 90% ustawionego natężenia przepływu.

W przypadku oceny neuroprzekaźników w próbkach dializowanych, należy pobrać próbki we wszystkich fazach eksperymentu. Zacznij od pobrania próbek do dializy, gdy zwierzę przebywa w klatce domowej. Próbki należy przechowywać w odpowiedni sposób do późniejszej analizy.

Ostrożnie przenieś szczura do komory operacyjnej i uruchom program operacyjny, który steruje komorą. Kontynuuj pobieranie próbek, podczas gdy szczur czeka, aż dźwignia wysunie się do komory, dwie próbki, zanim dźwignia się wysunie. Pobieranie porcji każdej próbki dializatu do analizy etanolu należy rozpocząć od odpipetowania odpowiedniej porcji dializatu do szklanej fiolki o pojemności dwóch mililitrów i zamknięcia fiolki hermetyczną przegrodą, odpipetowania i szybkiego uszczelnienia próbek etanolu.

Ponieważ etanol jest lotny, a objętość próbki jest niewielka, niespójne lub powolne przygotowanie próbki doprowadzi do niedokładnych wyników. Pozostałą część należy przechowywać do analizy neuroprzekaźników. 20-minutowy okres picia rozpoczyna się po tym, jak program komputerowy Med Associates wysunie dźwignię do komory, a szczur naciśnie ją, aby uzyskać dostęp do butelki z roztworem do picia.

Kontynuuj pobieranie próbek przez cały okres picia po okresie picia, program komputerowy wycofuje butelkę z komory. Trzymaj zwierzę w komorze przez dodatkowe 20 minut po wypiciu po zakończeniu eksperymentu z mikrodializą. Po znieczuleniu szczura wyjmij sondę.

Jeśli zwierzę nie zostanie natychmiast humanitarnie poddane eutanazji, wymień obterator, aby zapewnić wizualizację przewodu sondy. Zbierz mózg w ciągu trzech dni od eksperymentu. Analizuj próbki wraz z zewnętrznymi wzorcami etanolu za pomocą chromatografu gazowego z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym, próbnika automatycznego w przestrzeni nad głową, podgrzanego do 50 stopni Celsjusza i kolumny kapilarnej z helem jako fazą ruchomą.

Do rejestracji i analizy chromatogramów należy użyć oprogramowania stacji chromatograficznej w celu przygotowania systemu do analizy etanolu. Użyj recyrkulacyjnej łaźni wodnej, aby podgrzać płytkę próbnika automatów i otworzyć zbiorniki powietrza i wodoru. Następnie zainicjuj program startowy.

Gdy będzie gotowy, zainicjuj 20-minutowe spalanie, które odkaża włókno. Wykonaj wzorce za pomocą kolby miarowej o pojemności 100 mililitrów, aby rozcieńczyć 238 mikrolitrów 95% etanolu wodą do końcowej objętości 100 mililitrów. Użyj rozcieńczenia szeregowego jeden do jednego, aby stworzyć standardy.

Odpipetować wzorce do szklanych fiolek i zamknąć je dokładnie tak, jak zostały przygotowane próbki. Pamiętaj, aby uruchomić półfabrykat wodny wraz ze swoimi standardami. Umieścić wzorce i próbki w tacce na próbnik automatyczny i podgrzewać je, aż cała płynna porcja zostanie odparowana.

Aby uruchomić wzorce i próbki, utwórz listę próbek, odnotowując, która próbka znajduje się w którym gnieździe automatycznego próbnika i zaznaczając, że każda próbka powinna zostać nakłuta. Następnie rozkieruj pliki danych do wybranego folderu, a następnie wybierz metodę wyboru dla próbek i rozpocznij uruchamianie. Po tym, jak system przepuści próbki przez próbki, sprawdź, czy program poprawnie zintegrował każdy pik.

Wykres, wysokość piku w funkcji każdego znanego standardu zewnętrznego. Stężenie etanolu. Użyj funkcji liniowej określonej przez punkty, aby interpolować stężenie etanolu w każdej próbce dializatu.

Rysunek przedstawia przykładowe chromatogramy dla trzech stężeń wzorców etanolu i jeden dla próbki dializatu szczura pobranej pod koniec sesji samodzielnego podawania etanolu. Piki etanolu powinny być względnie symetryczne, mieć stałe czasy retencji i stosunek sygnału do szumu większy niż 10. Niespełnienie tych kryteriów oznacza, że system wymaga konserwacji, wysokiej jakości chromatografii, a prawidłowe wzorce generują liniową krzywą wzorcową, która jest używana do obliczania stężenia etanolu w próbkach dializatu pobranych od zwierząt samodzielnie podając etanol w trakcie ich samodzielnego podawania.

Uzyskane stężenia etanolu w dializacie nie są korygowane pod kątem odzyskiwania sondy in vivo i stanowią jedynie ułamek stężenia etanolu w tkance mózgu. Jeśli wymagana jest ilościowa mikrodializa etanolu, eksperymentalnie określa się frakcję ekstrakcyjną etanolu, która dyfunduje z przestrzeni zewnątrzkomórkowej do sondy. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery do pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Będzie się to różnić w zależności od długości sesji behawioralnej. Pomyślne zakończenie fazy mikrodializy eksperymentu w dużej mierze zależy od jakości faz przygotowawczych. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby upewnić się, że szczury są dobrze traktowane i że przyzwyczaiłeś je do wszelkich potencjalnie rozpraszających bodźców, które mogą wystąpić podczas eksperymentu z dializą, aby nie wpłynęło to na zachowanie zwierzęcia podczas samodzielnego podawania.