Metoda wytłaczania ze stałym sterowanym ciśnieniem do otrzymywania nanopęcherzyków lipidowych

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przedstawienie solidnej metody przygotowania biologicznie istotnych pęcherzyków lipidowych. Osiąga się to poprzez mieszanie i przenoszenie fosfolipidów do szklanych fiolek i nawilżanie ich wodnym buforem w celu wytworzenia wielolamelowej zawiesiny SLE. W drugim etapie przeprowadza się metodę zamrażania i rozmrażania, w wyniku której następnie powstaje Ella Vesicles z pęcherzyków wieloblaszkowych.

Następnie zawiesina liposomowa jest przepuszczana przez wytłaczarkę przy użyciu określonego optymalnego ciśnienia w celu wytworzenia jednorodnych pęcherzyków lipidowych o pożądanej wielkości. Uzyskano wyniki, które pokazują spójne rozmiary pęcherzyków submikronowych w oparciu o dynamiczne rozpraszanie światła i analizę śledzenia nanocząstek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sonikacja i sedymentacja, jest to, że metoda ta wykorzystuje system kontroli ciśnienia z optymalnymi określonymi natężeniami przepływu azotu w celu wydajnego przygotowania wielkości pęcherzyków lipidowych.

Aby rozpocząć tę procedurę, wyjmij szklaną fiolkę o pojemności 20 mililitrów z nakrętką wyłożoną teflonem, przed użyciem wyczyść wszystkie szklane naczynia i strzykawki chloroformem, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Przenieść 100 mikrolitrów chloroformu klasy odczynnikowej do szklanej fiolki za pomocą hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 250 mikrolitrów. Dodaj 30 mikrolitrów metanolu z odczynnikiem do tej samej szklanej fiolki za pomocą 100-mikrolitrowej hermetycznej szklanej strzykawki.

Przygotuj dwumilimolowy roztwór lipidowy cholesterolu makowego pop C, przenosząc 216 mikrolitrów po 10 miligramów na mililitr pop C 42 mikrolitry po 10 miligramów na mililitr. Pop e i 20 mikrolitrów po 11 miligramów na mililitr. Roztwory cholesterolu do szklanej fiolki o pojemności 20 mililitrów odparować rozpuszczalniki organiczne za pomocą argonu lub azotu o wolnym przepływie, aż na dnie fiolki pojawi się cienka warstwa lipidów, umieść niezakorkowaną szklaną fiolkę w próżniowym wysuszaczu na co najmniej 30 minut.

Aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika, przenieś dwa mililitry buforu przepuszczonego wcześniej przez filtr 0,2 mikrona do szklanej fiolki w celu uwodnienia lipidów. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i użyj w ciągu 48 godzin dla liposomów o rozmiarach od 30 do 100 nanometrów. Uwolnij zawiesinę liposomów w ciekłym azocie na 15 sekund.

Następnie rozmrażaj zawiesinę liposomów za pomocą bloku grzewczego w temperaturze 42 stopni SIU przez około trzy minuty. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania, w sumie przez pięć cykli. Zamrażanie, a następnie rozmrażanie wytwarza Ella Les z wieloblaszkowych pęcherzyków i zwiększa skuteczność zatrzymywania lipidów podczas wytłaczania.

Następnie przygotuj się do wytłaczania, postępując zgodnie z instrukcjami Avastin, aby ostrożnie złożyć lipo tak szybko. Prawidłowy montaż ekstrudera LF 50 ma kluczowe znaczenie dla zapobiegania wyciekom azotu, który wpływa na pożądane natężenia przepływu. Aby zapewnić powodzenie, wykonaj dokładnie następujące kroki.

Aby uzyskać hermetyczne uszczelnienie. Umieść sitko nośne z dużym otworem w podstawie filtra nośnego, a następnie okrągłe naczynie środkowe, jedną tarczę odpływową i jedną membranę poliwęglanową. Umieść mały O-ring na górze membrany i przymocuj go do podstawy filtra nośnego.

Zamocuj górną wytłaczarkę filtra, dokręcając cztery w czterech odpowiednich otworach. Zamontuj ekstruder z filtrem pod dużą beczką ekstrudera. Dodaj roztwór liposomu do cylindra na górze cylindra do wytłaczania.

Umieść duży okrągły O-ring, wąską nasadkę, duży okrągły O-ring i okrągłą nasadkę. Przymocuj regulator gazu do górnej części cylindra ekstrudera i zamknij wszystkie zawory, aby zapobiec wyciekowi powietrza, w tym zawór bezpieczeństwa. Umieść 20-mililitrową szklaną fiolkę lub 50-mililitrową kolbę Erlenmeyera pod jednostką filtrującą wytłaczarki.

Zawór bezpieczeństwa jest podłączony do regulatora i zwolni się, jeśli ciśnienie przekroczy 600 PS. Włączam gazowy azot i otwieram zawór gazowy podłączony do ekstrudera. Zwiększ ciśnienie azotu do 25 PSI dla liposomów 400 nanometrów do 125 PSI dla liposomów 100 nanometrów i do 400 do 500 PSI dla liposomów 30 nanometrów. Obserwuj zawiesinę liposomów, aż zostanie wyrzucona do pojemnika, gdy będzie popychana przez azot.

Utrzymuj przepływ azotu, aż nie zaobserwuje się żadnej cieczy. Przejście przez filtr ekstrudera do szklanego pliku w celu przeprowadzenia analizy DLS. Najpierw przygotuj 50 mikrolitrów 20-mikromolowego roztworu liposomu rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS.

Następnie włącz źródło zasilania i źródło lampy. Kontynuuj, aby otworzyć oprogramowanie dynapro. Ustaw oprogramowanie zgodnie z modelem algorytmu, aby wykrywać liposomy w żądanym rozmiarze.

Po podłączeniu do pipety sprzętowej 14 mikrolitrów próbki liposomu do kwarcu i włożeniu do uchwytu na komórkę, naciśnij start po około 20 do 30 akwizycjach, naciśnij stop. Przeanalizuj średnie piki średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie. Analiza śledzenia nanocząstek rozpoczyna się od przygotowania 500 mikrolitrów 0,1 mikromolowego roztworu liposomowego rozpuszczonego w PBS, przepłukania komory próbki wodą i etanolem.

Następnie osusz komorę na próbkę niestrzępiącym się ręcznikiem papierowym. Włącz źródło zasilania lasera, a komputer dostarczy 300 mikrolitrów 0,1-molowego roztworu liposomu do komory próbki. Otwórz kontrolę temperatury i oprogramowanie do analizy śledzenia nanocząstek.

Naciśnij przycisk przechwytywania, aby włączyć laser. Użyj regulacji w poziomie i pionie, aby przesunąć stolik i dostosować ostrość mikroskopu. Ustaw żądaną temperaturę i czas nagrywania.

Naciśnij przycisk nagrywania, aby zrobić wiele klatek zdjęć cząstek liposomów przez określony czas. Przeanalizuj piki odpowiadające rozmiarom liposomów o średnicy na histogramie, ponieważ śledzi on ruch każdej cząstki. DLS to uznana metoda, która zbiera rozproszone światło w celu określenia średnicy cząstek i została przeprowadzona w celu określenia rozmiarów liposomów.

Uwodnione liposomy wytłaczano przez membrany poliwęglanowe w różnych rozmiarach i ciśnieniach, jak opisano w pisemnym protokole. Średnice liposomów zmierzone za pomocą DLS dla wielkości porów 30 nanometrów wynosiły 66 plus minus 28 nanometrów. Dla 100 nanometrów wielkość porów wynosiła 138 plus minus 80 nanometrów, a dla 400 nanometrów rozmiar porów wynosił 360 plus minus 25 nanometrów.

Jako wzorzec kalibracyjny użyto zawiesiny polerowanych kulek Irene o grubości 50 nanometrów, w której zarejestrowano średnicę 47 plus minus 16 nanometrów. Procentowa dyspersyjność poli pokazuje, że rozmiary liposomów nie nakładają się na siebie. Typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nanometrów podczas korzystania z analizy DLS ze względu na znaną skłonność tego instrumentu do większych cząstek.

Pomimo tego instrumentalnego ograniczenia, krzywa kalibracyjna opisuje korelację liniową. Analiza śledzenia nanocząstek to nowa technologia, która mierzy wielkość każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w ciekłym ośrodku, niezależnie od współczynnika załamania światła lub gęstości cząstek. Ta technika o wysokiej rozdzielczości może być wykorzystana do uzupełnienia pomiaru liposomów za pomocą DLS, do kalibracji użyto zarejestrowanych przez NTA średnic 95 plus minus 48 nanometrów i 356 plus minus 51 nanometrów dla dwóch roztworów polistyrenu o długości 100 nanometrów i 400 nanometrów.

Roztwory lipidowe mają bardziej porównywalną średnicę w stosunku do DLS, wytwarzając średnie rozmiary 29 plus minus 14 nanometrów dla 30 nanometrów wielkości porów, 95 plus minus 17 nanometrów dla 100 nanometrów wielkości porów i 359 plus minus 73 nanometrów dla wielkości porów 400 nanometrów. NTA może być bardziej ogólną techniką charakterystyki do ilościowego określania mikroskopijnych cząstek, ponieważ jej czułość pozwala na pomiary cząstek o wielkości od 50 do 1000 nanometrów. Krzywa kalibracyjna pokazuje liniową korelację między pauzą membrany poliwęglanowej a zarejestrowaną transmisją ujemnego barwnika o średnicy NTA Obrazy z mikroskopii elektronowej pokazują każdy rozmiar liposomu po rozmiarach wytłaczania 3, 100 i 400 nanometrów, wyraźnie różniących się od siebie.

Powiększenie zostało ustawione na 25 000 razy, a podziałka odpowiadała 0,5 mikrona. Przeprowadzono eksperyment z kursem czasowym z trzema rozmiarami liposomów. DLS mierzono dla każdego roztworu liposomowego bezpośrednio po ekstruzji.

Wszystkie roztwory liposomów przechowywano przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ich średnice zostały ponownie zarejestrowane przez DLS po całonocnej inkubacji. Po 60-godzinnym okresie inkubacji zaobserwowano niewielkie lub żadne zmiany Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wielokrotne przejścia przez filtr do wytłaczania poprawią jednorodność roztworu Vesco.

Należy również pamiętać, aby do przygotowania próbki używać szklanych fiolek i strzykawek, aby zapobiec zanieczyszczeniu przez wypłukiwanie przez rurki polipropylenowe z chloroformu.