Name: Metoda wytłaczania ze stałym sterowanym ciśnieniem do otrzymywania nanopęcherzyków lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Poznaj metodę wytłaczania ze stałym sterowanym ciśnieniem do otrzymywania nanopęcherzyków lipidowych. Technika zapewnia wysoką jednorodność rozmiarów i wykorzystuje kontrolowany przepływ azotu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantu Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. L. A. M. otrzymał wsparcie w ramach grantu szkoleniowego National Institute of Health w zakresie sygnalizacji i regulacji komórkowej (T32 GM008759) oraz stypendium przeddoktorskiego NIH Ruth L. Kirschstein (CA165349-01). Dziękujemy prof. Michaelowi Stowellowi (CU Boulder), prof. Douglasowi Reesowi oraz prof. Robowi Phillipsowi (Caltech) za ich nieocenione uwagi.

1. Przygotowanie liposomów
<ol>
	<li>Przygotować szklaną fiolkę o pojemności 20 mL z nakrętką wyłożoną teflonem.</li>
	<li>Przed użyciem oczyścić całe szkło laboratoryjne i strzykawki chloroformem, aby zapobiec kontaminacji.</li>
	<li>Przenieść 100 μL chloroformu czystości reagentowej do szklanej fiolki, używając szczelnej szklanej strzykawki o pojemności 250 μL.</li>
	<li>Dodać 30 μL metanolu czystości reagentowej do tej samej szklanej fiolki, używając szczelnej szklanej strzykawki o pojemności 100 μL.</li>
	<li>Aby przygotować 2 mM roztwór lipidowy o stosunku 7:1.5:1.5 fosfatydylocholiny (POPC): fosfatydyloetanolaminy (POPE): cholesterolu, przenieść 216 μL roztworu POPC o stężeniu 10 mg/mL, 42 μL roztworu POPE o stężeniu 10 mg/mL oraz 20 μL roztworu cholesterolu o stężeniu 11 mg/mL w CHCl3 do szklanej fiolki o pojemności 20 mL.</li>
	<li>Odparować rozpuszczalniki organiczne, przepływając powoli gaz argonu lub azotu, aż do momentu zaobserwowania cienkiej warstwy lipidów na dnie fiolki.</li>
	<li>Umieścić otwartą szklaną fiolkę w desykanatorze próżniowym na co najmniej 30 minut, aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika.</li>
	<li>Przenieść 2 mL buforu, uprzednio przepuszczonego przez filtr 0,2 mikrona, do szklanej fiolki w celu hydratacji lipidów.</li>
	<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 4 °C przez noc i zużyć w ciągu 48 godzin.</li>
</ol>
2. Zamrażanie i rozmrażanie: tylko dla liposomów o rozmiarach 30 – 100 nm
<ol>
	<li>Zamrozić zawiesinę liposomów w ciekłym azocie przez 15 sekund.</li>
	<li>Odmrozić zawiesinę liposomów, używając bloku grzejnego w temperaturze 42 °C przez około 3 minuty.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.1 i 2.2 łącznie 5 razy.</li>
</ol>
3. Ekstruzja
Postępuj zgodnie z instrukcjami firmy Avestin, aby prawidłowo złożyć ekstruder Liposofast LF-50, korzystając ze schematu instrumentu zamieszczonego w ich podręczniku.
<ol>
	<li>Umieścić sitko wspierające z dużymi otworami (z otworami okrągłymi) w podstawie filtra wspierającego, a następnie okrągły spiekany dysk (bez otworów), jedną płytkę odpływową (o średnicy 25 mm) oraz jedną membranę poliwęglanową (o średnicy 25 mm).</li>
	<li>Umieścić mały, czarny pierścień O-ring na membranie, aby przymocować ją do podstawy filtra wspierającego.</li>
	<li>Zamocować górną część wytłaczarki filtra, dokręcając 4 śruby w 4 odpowiadających im otworach.</li>
	<li>Zmontować jednostkę wytłaczarki filtra pod dużym cylindrem wytłaczarki. Dodać roztwór liposomów do cylindra. Na górze cylindra wytłaczarki umieścić w następującej kolejności: duży okrągły pierścień O-ring, wąską nasadkę, duży okrągły pierścień O-ring oraz okrągłą nasadkę.</li>
	<li>Przyłączyć regulator gazu do górnej części cylindra wytłaczarki i zamknąć wszystkie zawory, w tym zawór bezpieczeństwa, aby zapobiec wyciekom powietrza. Pod jednostką filtra wytłaczarki umieścić szklaną fiolkę o pojemności 20 mL lub kolbę Erlenmeyera o pojemności 50 mL. Do regulatora podłączony jest zawór bezpieczeństwa, który zwolni ciśnienie, jeśli przekroczy ono 600 psi. Włączyć dopływ azotu i otworzyć zawór gazowy podłączony do wytłaczarki.</li>
	<li>Zwiększyć ciśnienie azotu do 25 psi dla liposomów o rozmiarze 400 nm, 125 psi dla liposomów o rozmiarze 100 nm oraz 400-500 psi dla liposomów o rozmiarze 30 nm.</li>
	<li>Obserwować zawiesinę liposomów podczas jej wypływania do naczynia pod wpływem ciśnienia azotu. Utrzymywać przepływ azotu do momentu, aż ciecz przestanie przechodzić przez filtr wytłaczarki do szklanej fiolki.</li>
</ol>
4. Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
<ol>
	<li>Przygotować 50 μL roztworu liposomów o stężeniu 20 μM.</li>
	<li>Włączyć zasilanie oraz źródło światła lampy.</li>
	<li>Uruchomić oprogramowanie DynaPro.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybrać model algorytmu MS/X do detekcji liposomów o rozmiarach 30 nm i 100 nm oraz model algorytmu MS800 do detekcji liposomów o rozmiarach &gt;100 nm.</li>
	<li>Połączyć się z urządzeniem.</li>
	<li>Pipetować 14 μL próbki liposomów do kuwety kwarcowej i umieścić ją w uchwycie na kuwetę.</li>
	<li>Nacisnąć start.</li>
	<li>Nacisnąć stop po wykonaniu około 20 - 30 pomiarów.</li>
	<li>Przeanalizować piki średniej średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie.</li>
</ol>
5. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
<ol>
	<li>Przygotować 500 μL roztworu liposomów o stężeniu 0,1 μM.</li>
	<li>Przepłukać komorę na próbkę wodą i etanolem.</li>
	<li>Osuszyć komorę na próbkę ręcznikiem papierowym beztroskowym.</li>
	<li>Włączyć źródło zasilania laser oraz komputer.</li>
	<li>Nanieść 300 μL roztworu liposomów o stężeniu 0,1 μM do komory na próbkę.</li>
	<li>Uruchomić sterownik temperatury oraz oprogramowanie do analizy śledzenia nanocząstek (Nanoparticle Tracking Analysis).</li>
	<li>Nacisnąć przycisk Capture, aby włączyć laser.</li>
	<li>Za pomocą regulacji poziomej i pionowej przesunąć stoлик i ustawić ostrość mikroskopu.</li>
	<li>Ustawić żądaną temperaturę (20 °C) oraz czas rejestracji (co najmniej 30 sekund).</li>
	<li>Nacisnąć przycisk Record, aby wykonać serię klatek obrazu cząsteczek liposomów przez określony czas. Przeanalizować piki odpowiadające średnicom liposomów na histogramie, który rejestruje ruch każdej cząsteczki.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Schemat przedstawiający metodę ekstruzji zaprezentowano na Rysunku 1. Aby uzyskać optymalne wyniki, przygotowanie liposomów o średnicy 30 nm wymaga wysokiego ciśnienia rzędu ~ 500 psi, natomiast średnica 100 nm wymaga ciśnienia 125 psi w celu osiągnięcia szybkiej prędkości filtracji. W przypadku średnic 400 nm zaleca się niskie ciśnienie ~ 25 psi, aby uzyskać wolniejszą prędkość filtracji, co pozwala pęcherzykom na wydłużenie się i utworzenie większych, jednorodnych liposomów. Przeprowadziliśmy serię eksperymentów, aby określić optymalne ciśnienie dla produkcji powtarzalnych rozmiarów pęcherzyków submikronowych. Zmienialiśmy ciśnienie oraz liczbę przejść ekstruzyjnych przez filtry poliwęglanowe o rozmiarach porów 30, 100 i 400 nm, co pozwoliło ustalić odpowiednie ciśnienie dla każdego pożądanego rozmiaru. Dla porów 30 nm ciśnienie poniżej 500 psi zmniejszy prędkość przepływu, powodując wydłużenie i tym samym zwiększenie rozmiarów pęcherzyków. Dla porów 100 nm stały przepływ uzyskano przy 125 psi. W przypadku porów 400 nm niskie ciśnienie (25 psi) pozwala pęcherzykom wydłużyć się do większych rozmiarów. Powolny, kroplowy przepływ filtracyjny jest optymalny dla tworzenia większych pęcherzyków submikronowych13.
Wykonaliśmy DLS w celu określenia rozmiarów liposomów przeciskanych przez membrany o trzech różnych średnicach, tj. 30, 100 i 400 nm. DLS to uznana metoda, która polega na pomiarze światła rozproszonego w celu wyznaczenia średnicy cząstek. Nawodnione liposomy o stężeniu 2 mM przeciskaliśmy przez membranę poliwęglanową 30 nm pod ciśnieniem 500 psi (5 przejść przez pory filtra), membranę poliwęglanową 100 nm pod ciśnieniem 125 psi (5 przejść przez pory filtra) oraz membranę poliwęglanową 400 nm pod ciśnieniem 25 psi (2 przejścia przez pory filtra). Średnice liposomów zmierzone metodą DLS dla rozmiarów porów 30, 100 i 400 nm wyniosły odpowiednio 66 ± 28, 138 ±18 i 360 ± 25 nm (Rysunek 2). Jako standard kalibracyjny wykorzystano zawiesinę kulek polistyrenowych o średnicy 50 nm, co przedstawiono na Rysunku 2, gdzie odnotowano średnicę 47 ± 16 nm. Procent polidyspersyjności wskazuje na brak nakładania się rozmiarów liposomów. W analizie DLS typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nm ze względu na znaną tendencję tego instrumentu do faworyzowania większych cząstek12. Intensywności rozproszenia światła z dużych i małych cząstek są zbierane jednocześnie za pomocą jednej metody detekcji, co utrudnia rozdzielenie liposomów w zawiesinie12. Pomimo tego ograniczenia instrumentalnego, krzywa kalibracyjna wykazuje niemal liniową korelację.
NTA to nowa technologia, która mierzy rozmiar każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w medium ciekłym, niezależnie od współczynnika załamania światła lub gęstości cząstki. Ta technika o wysokiej rozdzielczości może być stosowana jako uzupełnienie pomiaru liposomów za pomocą DLS. NTA zarejestrowała średnice 95 ± 48 oraz 356 ± 51 nm; do kalibracji wykorzystano dwa roztwory polistyrenu o rozmiarach 100 nm i 400 nm. Zaobserwowano, że roztwory lipidowe o rozmiarach 30 nm i 100 nm mają średnice bardziej porównywalne z wynikami DLS, co pokazano na Rysunku 3, dając średnie rozmiary 29 ± 14, 95 ± 17 oraz 359 ± 73 nm. NTA może być bardziej uniwersalną techniką charakteryzacji służącą do ilościowego oznaczania cząstek mikroskopowych, ponieważ jej czułość pozwala na pomiar cząstek o rozmiarach od 50 do 1000 nm. Krzywa kalibracyjna wykazuje liniową korelację między porami membrany z poliwęglanu a zarejestrowaną średnicą NTA.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Rozmiary liposomów</td>
			<td >Próg detekcji</td>
			<td >Oczekiwany minimalny rozmiar cząsteczek (nm)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >30 nm</td>
			<td >11</td>
			<td >30</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >100 nm</td>
			<td >11</td>
			<td >100</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >400 nm</td>
			<td >21</td>
			<td >400</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1. Parametry Nanosight.
<img alt="Schemat procesu ekstruzji liposomów; różnice ciśnień; filtr; SUV w 100-500 psi; LUV w 25 psi." src="/files/ftp_upload/4151/4151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat metody ekstruzji, opisujący wpływ ciśnienia i przepływu azotu na homogeniczność liposomów o różnych średnicach. Po hydratacji liposomów, pęcherzyki jednowarstwowe o różnych rozmiarach są ekstrudowane przez pory filtrów z membran poliwęglanowych o różnych wielkościach przy różnym ciśnieniu.
<img alt="Analiza średnicy DLS; wykres słupkowy (2A) i wykres liniowy (2B) wielkości cząstek w funkcji wielkości porów polimeru." src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Dane dynamicznego rozpraszania światła (DLS) opisujące ilościowe rozmiary liposomów po ekstruzji. (a) Przedstawiono wykresy słupkowe opisujące średnice trzech próbek liposomów. Jako odnośnik wykorzystano wzorzec kalibracyjny w postaci kulek polistyrenowych (PS) o rozmiarze 50 nm. Średnie średnice liposomów są wskazane nad słupkiem dla każdej próbki. Oś x opisuje wielkości porów, przez które ekstrudowano roztwory. Oś y opisuje średnicę zarejestrowaną przez DLS. Chociaż dla rozmiarów 30 nm i 100 nm zarejestrowano wartości wyższe niż wielkość porów, a dla największego rozmiaru 400 nm zarejestrowano wartość nieco niższą, krzywa kalibracyjna (b) wykazuje niemal liniową korelację, gdzie oś x wyraża wielkości porów membrany poliwęglanowej, a oś y opisuje średnicę liposomów zarejestrowaną przez DLS.
<img alt="Wyniki NTA; wykres słupkowy i liniowy przedstawiający średnicę z NanoSight w zależności od próbki i wielkości porów membrany." src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Dane z analizy śledzenia nanocząstek (NTA) opisujące rozmiary liposomów po ekstruzji. (a) Wykresy słupkowe przedstawiają średnicę każdej próbki liposomów. Oś X opisuje wielkość porów, przez które ekstrudowano roztwory. Oś Y opisuje średnicę rozmiaru zarejestrowaną przez NTA. Średnie średnice liposomów są oznaczone nad każdą próbką. (b) Krzywa kalibracyjna NTA wykazuje bardziej liniową korelację między wielkością porów membrany filtracyjnej a zarejestrowaną średnicą niż krzywa kalibracyjna DLS. Oś X opisuje wielkość porów membrany poliwęglanowej. Oś Y opisuje średnicę liposomów zarejestrowaną przez NTA.
<img alt="Porównanie wielkości nanocząstek za pomocą mikroskopii elektronowej: mikrografie przy 30 nm, 100 nm i 400 nm." src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) z barwieniem negatywowym, przedstawiające każdą wielkość liposomów (500 μM) po ekstruzji. Siatki z Formvaru na podłożu węglowym zostały rozładowane negatywnie przed barwieniem próbek, do czego użyto 1% octanu uranylu w wodzie, a następnie próbki wysuszono i obrazowano przy powiększeniu 34 000×. Wielkości 30, 100 i 400 nm są wyraźnie od siebie odróżnialne. Powiększenie ustawiono na 25 000×. Pasek skali odpowiada 0,5 μm.
<img alt="Wyniki dynamicznego rozpraszania światła; wykres słupkowy rozmiarów cząstek z słupkami błędów; pomiar natychmiastowy i po całej nocy." src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przeprowadzono eksperyment w zależności od czasu dla trzech rozmiarów liposomów. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) mierzono dla każdego roztworu liposomów bezpośrednio po ekstruzji. Wszystkie roztwory liposomów przechowywano w 4 °C przez noc. Ich średnice zarejestrowano za pomocą DLS po inkubacji przez noc. Po 16-godzinnym okresie inkubacji nie zaobserwowano niemal żadnych zmian.

<ol><li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes%3A+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li>
<li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li>
<li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca%282%2B%29-regulated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li>
<li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li>
<li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+polymorphism%3A+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li>
<li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li>
<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li>
<li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li>
<li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li>
<li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li>
<li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wykorzystując ekstruder Avestin Liposofast LF-50, zaprezentowaliśmy sposób przygotowania syntetycznych liposomów o małych rozmiarach za pomocą systemu z kontrolowanym ciśnieniem. Należy zauważyć, że pęcherzyki wielowarstwowe tworzą się samoistnie po hydratacji liposomów, co może prowadzić do powstania mniejszych nanocząstek. Te małe pęcherzyki wielowarstwowe nieuchronnie przenikną przez pory membrany poliwęglanowej o większym rozmiarze, co spowoduje heterogeniczność roztworów pęcherzyków jednowarstwowych otrzymywanych pr...

<table><tbody><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>02432-25ML</td><td>95% stabilizatory</td></tr><tr><td>Metanol wysokiej czystości</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ekstruder Liposofast LF-50</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfolipidy</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrany poliwęglanowe</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td>średnica 25 mm</td></tr><tr><td>Tarcze odpływowe PE</td><td>Avestin, Inc.</td><td>230600</td><td>średnica 25 mm</td></tr></tbody></table>

metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomy to sztucznie przygotowane pęcherzyki składające się z naturalnych i syntetycznych fosfolipidów, które są powszechnie wykorzystywane jako platformy naśladujące błony komórkowe do badania oddziaływań białko-białko i białko-lipid3, monitorowania dostarczania leków4,5 oraz enkapsulacji4. Fosfolipidy naturalnie tworzą zakrzywione dwuwarstwy lipidowe, co odróżnia je od miceli.6 Liposomy są tradycyjnie klasyfikowane według rozmiaru i liczby dwuwarstw, tj. duże pęcherzyki jednowarstwowe (LUVs), małe pęcherzyki jednowarstwowe (SUVs) oraz pęcherzyki wielowarstwowe (MLVs)7. W szczególności przygotowanie jednorodnych liposomów o różnych rozmiarach jest istotne dla badania zakrzywienia błony, które odgrywa kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej, endocytozie i egzocytozie, fuzji błon oraz transporcie białek8. Kilka grup badawczych analizuje, w jaki sposób białka są wykorzystywane do modulowania procesów związanych z zakrzywieniem błony i w związku z tym przygotowuje liposomy o średnicach &lt;100 - 400 nm, aby badać ich wpływ na funkcje komórkowe3. Inne koncentrują się na enkapsulacji leków w liposomach, badając je jako nośniki służące do transportu i dostarczania interesującego leku9. Enkapsulację leku można osiągnąć, jak wykazano, podczas tworzenia liposomów9. Nasz etap ekstruzji nie powinien wpływać na enkapsulowany lek z dwóch powodów: (1) enkapsulacja leku powinna zostać przeprowadzona przed tym etapem i (2) liposomy powinny zachować swoją naturalną stabilność biofizyczną, bezpiecznie przenosząc lek w wodnistym rdzeniu. Cele badawcze te dodatkowo wskazują na potrzebę zoptymalizowanej metody projektowania stabilnych submikronowych pęcherzyków lipidowych.
Niemniej jednak, obecne technologie przygotowywania liposomów (sonikacja10, zamrażanie i rozmrażanie10, sedymentacja) nie pozwalają na otrzymywanie liposomów o silnie zakrzywionej powierzchni (t.j. średnicy &lt;100 nm) z wysoką powtarzalnością i wydajnością10,5, co ogranicza badania biofizyczne w rozwijającej się dziedzinie detekcji zakrzywienia błon. W niniejszej pracy przedstawiamy niezawodną metodę przygotowania różnych biologicznie istotnych liposomów.
Ręczna ekstruzja przy użyciu strzykawek szczelnych dla gazów i membran poliwęglanowych10,5 jest powszechną praktyką, jednak przy rozmiarach porów &lt;100 nm często obserwuje się heterogeniczność wynikającą ze zmienności przykładanego ciśnienia ręcznego. Zastosowaliśmy aparat do ekstruzji ze stałym, kontrolowanym ciśnieniem w celu przygotowania syntetycznych liposomów o średnicach w zakresie od 30 do 400 nm. Do ilościowego określenia rozmiarów liposomów, zgodnie z opisem w naszym protokole, wykorzystano dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)10, mikroskopię elektronową11 oraz analizę śledzenia nanocząsteczek (NTA)12, stosując komercyjne kuleksy polistyrenowe (PS) jako wzorzec kalibracyjny. Zaobserwowano niemal liniową korelację pomiędzy zastosowanymi rozmiarami porów a eksperymentalnie określonymi rozmiarami liposomów, co wskazuje na wysoką precyzję naszej metody przygotowania liposomów z kontrolą ciśnienia. Ponadto wykazaliśmy, że ta metoda przygotowania pęcherzyków lipidowych jest ogólnie stosowalna, niezależnie od różnych rozmiarów liposomów. Na koniec, w badaniu przebiegu czasowego, wykazaliśmy, że przygotowane liposomy były stabilne przez maksymalnie 16 godzin. Poniżej przedstawiono reprezentatywny protokół przygotowania liposomów o rozmiarach nanometrycznych.

Niniejszy protokół opisuje metodę ekstruzji służącą do przygotowania pęcherzyków lipidowych o rozmiarach submikronowych i wysokim stopniu jednorodności. Metoda ta wykorzystuje system z kontrolą ciśnienia i regulowanym przepływem azotu do przygotowania liposomów. W opracowaniu przedstawiono przygotowanie lipidów1,2, ekstruzję liposomów oraz charakterystykę ich rozmiaru.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Liposomy to sztucznie przygotowane pęcherzyki składające się z naturalnych i syntetycznych fosfolipidów, które są powszechnie wykorzystywane jako platforma imitująca błonę komórkową...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest przedstawienie solidnej metody przygotowania biologicznie istotnych pęcherzyków lipidowych. Osiąga się to poprzez mieszanie i przenoszenie fosfolipidów do fiolek szklanych i ich hydratację buforem wodnym w celu utworzenia wielowarstwowej zawiesiny SLE. W drugim kroku przeprowadza się metodę zamrażania i rozmrażania, co w konsekwencji prowadzi do powstania pęcherzyków Ella z pęcherzyków wielowarstwowych.Następnie zawiesinę liposomów przepuszcza się przez ekstruder, stosując określone optymalne ciśnienie w celu wytworzenia jednorodnych pęcherzyków lipidowych o pożądanej wielkości. Otrzymane wyniki wykazały spójne submikronowe rozmiary pęcherzyków w analizie dynamicznego rozpraszania światła oraz analizie śledzenia nanocząstek. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak sonikacja i sedymentacja, jest zastosowanie systemu kontroli ciśnienia z określonymi optymalnymi przepływami azotu w celu efektywnego przygotowania pęcherzyków lipidowych o określonej wielkości.Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować szklaną fiolkę o pojemności 20 ml z nakrętką wyłożoną teflonem; przed użyciem całe szkło laboratoryjne oraz strzykawki należy oczyścić chloroformem, aby zapobiec kontaminacji. Za pomocą hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 250 µL przenieść 100 µL chloroformu czystości reagentowej do szklanej fiolki. Następnie, używając hermetycznej szklanej strzykawki o pojemności 100 µL, dodać 30 µL metanolu czystości reagentowej do tej samej szklanej fiolki.Przygotuj 2 mM roztwór lipidowy POPC, POPE i cholesterolu, przenosząc 216 µL roztworu POPC o stężeniu 10 mg/mL, 42 µL roztworu POPE o stężeniu 10 mg/mL oraz 20 µL roztworu cholesterolu o stężeniu 11 mg/mL do szklanej fiolki o pojemności 20 mL. Odparuj rozpuszczalniki organiczne, stosując powolny przepływ argonu lub azotu, aż do powstania cienkiej warstwy lipidów na dnie fiolki. Umieść otwartą szklaną fiolkę w deskrykatorze próżniowym na co najmniej 30 minut.Aby usunąć pozostałości rozpuszczalnika, przenieś dwa mililitry buforu, który wcześniej przeszedł przez filtr 0,2 mikrona, do szklanej fiolki w celu hydratacji lipidów. Inkubuj mieszaninę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc i wykorzystaj w ciągu 48 godzin dla liposomów o rozmiarach od 30 do 100 nanometrów. Zamroź zawiesinę liposomów w ciekłym azocie przez 15 sekund.Następnie rozmroź zawiesinę liposomów, używając bloku grzewczego w temperaturze 42 °C przez około trzy minuty. Powtórz proces zamrażania i rozmrażania łącznie pięć razy. Zamrażanie, a następnie rozmrażanie, prowadzi do powstania jednobłonowych pęcherzyków (ULV) z pęcherzyków wielobłonowych i zwiększa wydajność zatrzymywania lipidów podczas ekstruzji.Następnie przygotuj układ do ekstruzji, postępując zgodnie z instrukcjami Avastin, aby starannie zmontować ekstruder lipo so fast LF 50. Prawidłowy montaż jest kluczowy, aby zapobiec wyciekom azotu, co wpływa na pożądane szybkości przepływu. Aby zapewnić powodzenie procesu, dokładnie wykonaj następujące kroki.Aby zapewnić szczelność, umieść sitko wspierające z dużym otworem w podstawie filtra wspierającego, a następnie nałóż okrągły wkład centralny, jeden dysk odpływowy i jedną membranę poliwęglanową. Na membranie umieść mały czarny pierścień O-ring i zamocuj go do podstawy filtra wspierającego.Przymocuj górny wycisk filtracyjny, dokręcając cztery śruby w czterech odpowiadających im otworach. Zamontuj jednostkę wyciskania filtra pod dużym cylindrem wyciskowym. Dodaj roztwór liposomów do cylindra znajdującego się nad cylindrem wyciskowym.Umieść duży okrągły pierścień O-ring, wąską nakrętkę, duży okrągły pierścień O-ring i okrągłą nakrętkę. Przymocuj regulator gazu do górnej części cylindra ekstrudera i zamknij wszystkie zawory, w tym zawór bezpieczeństwa, aby zapobiec wyciekom powietrza. Pod jednostką filtra ekstrudera ustaw szklaną fiolkę o pojemności 20 milliliter lub kolbę Erlenmeyera o pojemności 50 milliliter.Do regulatora podłączony jest zawór bezpieczeństwa, który otwiera się, gdy ciśnienie przekroczy 600 PSI. Włączam dopływ azotu i otwieram zawór gazowy podłączony do ekstrudera. Zwiększam ciśnienie azotu do 25 PSI dla liposomów o rozmiarze 400 nanometrów, do 125 PSI dla liposomów o rozmiarze 100 nanometrów oraz do 400–500 PSI dla liposomów o rozmiarze 30 nanometrów. Obserwuję zawiesinę liposomów, aż zostanie wypchnięta przez azot do pojemnika.Kontynuuj przepływ azotu, aż do momentu, gdy nie będzie już widoczna ciecz. Przenieś materiał przez filtr ekstrudera do fiolki szklanej w celu przeprowadzenia analizy DLS. Najpierw przygotuj 50 µL roztworu liposomów o stężeniu 20 µM rozcieńczonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS).Następnie włącz zasilacz oraz źródło światła lampy. Uruchom oprogramowanie DynaPro. W ustawieniach oprogramowania wybierz model algorytmu służący do wykrywania liposomów o pożądanym rozmiarze.Po podłączeniu urządzenia, należy pipetować 14 µL próbki liposomów do kuwety kwarcowej i umieścić ją w uchwycie na próbkę, a następnie nacisnąć przycisk start; po wykonaniu około 20 do 30 pomiarów należy nacisnąć przycisk stop. Następnie należy przeanalizować piki średnicy liposomów zarejestrowane na histogramie. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) rozpoczyna się od przygotowania 500 µL 0,1 µM roztworu liposomów rozpuszczonych w PBS, a następnie przepłukania komory pomiarowej wodą i etanolem.Następnie osusz komorę próbkową za pomocą beztkankowego ręcznika papierowego. Włącz zasilacz lasera oraz komputer, a następnie wprowadź 300 µL 0,1 M roztworu liposomów do komory próbkowej. Uruchom system kontroli temperatury oraz oprogramowanie do analizy śledzenia nanocząstek.Naciśnij przycisk przechwytywania, aby włączyć laser. Użyj regulacji poziomej i pionowej, aby przesunąć stolik i ustawić ostrość mikroskopu. Ustaw żądaną temperaturę oraz czas rejestracji.Naciśnij przycisk nagrywania, aby zarejestrować wiele klatek obrazu cząsteczek liposomów przez określony czas. Przeanalizuj piki odpowiadające średnicom liposomów na histogramie, który śledzi ruch każdej cząsteczki. DLS jest uznaną metodą polegającą na zbieraniu rozproszonego światła w celu oznaczenia średnicy cząstek i została ona zastosowana do wyznaczenia wielkości liposomów.Nawodnione liposomy poddano ekstruzji przez membrany poliwęglanowe o różnych rozmiarach porów i pod różnymi ciśnieniami, zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Średnice liposomów zmierzone metodą DLS dla rozmiaru porów 30 nanometrów wynosiły 66 ± 28 nanometrów. Dla rozmiaru porów 100 nanometrów wynosiły 138 ± 80 nanometrów, a dla rozmiaru porów 400 nanometrów wynosiły 360 ± 25 nanometrów.Jako wzorzec kalibracyjny wykorzystano zawiesinę polerowanych kulek Irene o rozmiarze 50 nanometrów, dla których odnotowano średnicę 47 ± 16 nanometrów. Procent polidyspersyjności wskazuje na brak nakładania się rozmiarów liposomów. W analizie DLS typowe jest obserwowanie średnic większych niż 30 nanometrów ze względu na znaną tendencję tego przyrządu do faworyzowania większych cząstek.Pomimo tego ograniczenia instrumentalnego, krzywa kalibracyjna opisuje korelację liniową. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) to nowa technologia, która mierzy rozmiar każdej cząstki na podstawie bezpośrednich obserwacji dyfuzji w ośrodku ciekłym, niezależnie od współczynnika załamania światła lub gęstości cząstek. Tę technikę o wysokiej rozdzielczości można wykorzystać jako uzupełnienie pomiaru liposomów metodą DLS; w metodzie NTA zarejestrowano średnice 95 ± 48 nanometrów oraz 356 ± 51 nanometrów dla dwóch roztworów polistyrenu o rozmiarach 100 nanometrów i 400 nanometrów, które zostały użyte do kalibracji.Roztwory lipidów mają średnice bardziej porównywalne z wynikami DLS, które wykazały średnie rozmiary wynoszące 29 ± 14 nm dla rozmiaru porów 30 nm, 95 ± 17 nm dla rozmiaru porów 100 nm oraz 359 ± 73 nm dla rozmiaru porów 400 nm. NTA może być bardziej uniwersalną techniką charakteryzacji w celu ilościowego oznaczenia cząstek mikroskopowych, ponieważ jej czułość pozwala na pomiary cząstek o rozmiarach od 50 do 1000 nm. Krzywa kalibracyjna wykazuje liniową korelację między rozmiarem porów membrany poliwęglanowej a zarejestrowaną średnicą NTA. Obrazy z transmisyjnej mikroskopii elektronowej z barwieniem negatywowym pokazują, że rozmiary liposomów po ekstruzji przez pory o wielkości 3, 100 i 400 nm są wyraźnie od siebie odróżnialne.Powiększenie ustawiono na 25 000 razy, a pasek skali reprezentuje 0,5 mikrona. Przeprowadzono eksperyment z przebiegiem czasowym z wykorzystaniem trzech rozmiarów liposomów. Pomiar DLS wykonano dla każdego roztworu liposomów bezpośrednio po ekstruzji.Wszystkie roztwory liposomów przechowywano w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Ich średnice ponownie zmierzono za pomocą DLS po nocnej inkubacji. Po 60-godzinnym okresie inkubacji nie zaobserwowano niemal żadnych zmian. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wielokrotne przepuszczenie roztworu przez filtr ekstruzyjny poprawi homogeniczność roztworu pęcherzykowego.Należy również pamiętać o stosowaniu szklanych fiolek i strzykawek do przygotowania próbek, aby zapobiec zanieczyszczeniom wynikającym z wymywania składników z probówek polipropylenowych przez chloroform.

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Metoda wytłaczania o stałym ciśnieniu do przygotowywania nanowymiarowych pęcherzyków lipidowych

Biochemicznie zdefiniowane duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUVs) stanowią wygodny system modelowy do analizy oddziaływań białek z rodziny BCL-2, co ma bezpośrednie znaczenie dla lepszego zrozumienia mitochondrialnej ścieżki apoptozy. Przedstawiono metodę otrzymywania LUVs, wraz ze standardowymi kombinacjami białek z rodziny BCL-2 oraz kontrolami służącymi do badania permeabilizacji LUVs.

Badanie funkcji rodziny BCL-2 z wykorzystaniem dużych jednowarstwowych pęcherzyków lipidowych

Opisujemy protokół przygotowania dwuwarstw lipidowych i jego charakterystyki za pomocą mikroskopii sił atomowych i spektroskopii sił.

Obrazowanie mikroskopii sił atomowych i spektroskopia sił podpartych dwuwarstw lipidowych

Liposomy zawierające amfifile jednołańcuchowe, szczególnie kwasy tłuszczowe, wykazują odmienne właściwości w porównaniu do tych zawierających diacylofosfolipidy ze względu na unikalne właściwości chemiczne amfifilów jednołańcuchowych. Tutaj opisujemy techniki przygotowania, oczyszczania i stosowania liposomów składających się z części lub całości tych amfifilów.

Przygotowanie, oczyszczanie i stosowanie liposomów zawierających kwasy tłuszczowe

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

To badanie opisuje klasyczną hydratację przy użyciu metody cienkiego filmu lipidowego do przygotowania nanoliposomów, a następnie charakterystyki nanocząstek. Hydrofilowe i globularne białko o masie 47 kDa, taryna, jest z powodzeniem kapsułkowane jako strategia poprawiająca stabilność, unikająca szybkiego klirensu i promująca kontrolowane uwalnianie. Metoda może być dostosowana do enkapsulacji cząsteczek hydrofobowych.

Otrzymywanie i charakterystyka nanoliposomów do uwięzienia bioaktywnych hydrofilowych białek kulistych

Celem protokołu jest wiarygodny pomiar właściwości mechanicznych membrany gigantycznych pęcherzyków za pomocą aspiracji mikropipet.

Wykrywanie gigantycznych jednopłytkowych pęcherzyków hybrydowych przez elektroformację i pomiar ich właściwości mechanicznych za pomocą aspiracji mikropipetami

Ten artykuł opisuje protokoły przygotowania próbek, redukcji danych i analizy danych w badaniach neutronowego echa spinowego (NSE) błon lipidowych. Rozsądne znakowanie lipidów deuterem umożliwia dostęp do różnych dynamik błon w mezoskopowych skalach długości i czasu, w których zachodzą ważne procesy biologiczne.

Spektroskopia neutronowego echa spinowego jako unikalna sonda do badania dynamiki błony lipidowej i interakcji błona-białko

Ten protokół opisuje tworzenie się komórek naśladujących pęcherzyki jedno- i wielolipidowe, dwuwarstwy lipidowe wspierane i dwuwarstwy lipidowe zawieszone. Te modele in vitro można dostosować do różnych typów lipidów i można je wykorzystać do badania różnych interakcji molekuł i makrocząsteczek.

Montaż dwuwarstwowych modeli lipidowych naśladujących i zawieszonych w powietrzu do badania oddziaływań molekularnych

Tutaj opracowano dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach, aby zapewnić syntetyczną membranę o określonej krzywiźnie, która umożliwia charakteryzację białek z możliwością wykrywania krzywizny in vitro.

Dwuwarstwowy system lipidowy oparty na nanobarach do badania białek wykrywających krzywiznę błony in vitro

Przedstawiono protokół eksperymentalny do składania, stymulacji elektrycznej i analizy kropli dwuwarstwy lipidowych zmodyfikowanych gramicydyną A. Relacje struktura-funkcja lipidów i białek są ilościowo określane poprzez pomiar zmian w obszarze błony, przepływie jonowym i przewodnictwie pojedynczego kanału oraz odniesienie tych reakcji do zmian przypominających plasticzne zmiany w przewodnictwie jonowym w modelu błony inspirowanym synapsami elektrycznymi.

Charakterystyka struktury i funkcji błony lipidowo-białkowej z wykorzystaniem warstw dwubiegunowych interfejsu kropelkowego

Poznaj metodę wytłaczania ze stałym sterowanym ciśnieniem do otrzymywania nanopęcherzyków lipidowych. Technika zapewnia wysoką jednorodność rozmiarów i wykorzystuje kontrolowany przepływ azotu.

Metoda ekstruzji z kontrolowanym stałym ciśnieniem do przygotowania nano-rozmiarowych pęcherzyków lipidowych

Przeglądaj więcej filmów