Name: Wytwarzanie i użytkowanie mikromacierzy MicroEnvironment (MEArrays) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy ME do badania wpływu mikrośrodowiska na funkcje komórek. Technika umożliwia analizę adhezji, różnicowania i proliferacji w zdefiniowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ML jest wspierany przez NIA (R00AG033176 oraz R01AG040081) oraz przez Laboratory Directed Research and Development, kontrakt Departamentu Energii USA nr DE-AC02-05CH11231.

<ol><li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).</li>
<li>LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decsions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Kim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Annals of biomedical engineering. , (2012).</li>
<li>Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elastic+properties+of+polyacrylamide+gels%3A+implications+for+quantification+of+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces.</a> Biorheology. 46, 191-205 (2009).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+regulation+of+human+neural+precursor+cell+differentiation+using+arrays+of+signaling+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda MEArray umożliwia analizy funkcjonalne interakcji komórek i kombinatorycznych mikrośrodowisk4. Analiza MEArray łączy wykorzystanie podstawowych technologii mikrowzorowania, biologii komórki, robotów do drukowania macierzy mikroprzewodowych oraz urządzeń analitycznych dostępnych w wielu placówkach wieloużytkowych. Przesiewy MEArray są kompatybilne z większością typów komórek adherentnych, choć w niektórych przypadkach składy mediów bezsurowiczych mogą wymagać dostosowania poprzez doda...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka przedmiotowe 25 mm x 75 mm</td><td>VWR</td><td>48311-600</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki (nr 1) 24 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia (lub naczynie Coplana)</td><td>VWR</td><td>25461-003</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (15 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1,0 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567</td><td></td></tr><tr><td>APES (&amp;gt;98% (3-aminopropyl)trietoksysilan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td>50% w wodzie</td></tr><tr><td>APS (&amp;gt;98% nadsiarczan amonu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Przygotować 10% roztwór roboczy w ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid (40%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrylamid (2% m/v)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;Filtr strzykawkowy nylonowy 4 mm</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetylosiloksan)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Zestaw elastomeru Sylgard 184 od Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>szkiełka z 2 komorami</td><td>NUNC</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108</td><td>BASF</td><td>30089186</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do akwariów</td><td>Dow Corning</td><td>DAP 00688</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Southern Biotech&lt;silny&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kubki plastikowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki do badania gardła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki nitrylowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pudełka na preparaty mikroskopowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do nanoszenia warstw</td><td>WS-400B-6NPP/LITE</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Piec / Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa płyta grzejna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki 384-dołkowe</td><td></td><td></td><td>Marka odpowiednia dla robota do mikroarrayów</td></tr><tr><td>Robot do drukowania macierzy mikroprzepływowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy i fluorescencyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skanery mikroarray Axon</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Istnieje wiele konfiguracji</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (mearrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Interakcje między komórkami a ich otaczającym mikrośrodowiskiem mają funkcjonalne konsekwencje dla zachowania komórkowego. Na poziomie pojedynczej komórki odmienne mikrośrodowiska mogą wymuszać fenotypy różnicowania, migracji i proliferacji, a na poziomie tkanki mikrośrodowisko wpływa na procesy tak złożone jak morfogeneza i tumorigenesis1. Na komórki wewnątrz mikrośrodowiska wpływają nie tylko zawartości komórkowe i molekularne, ale także elastyczność2 i geometria3 tkanki. Mikrośrodowisko, definiowane jako suma interakcji między komórkami, między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz między komórkami a czynnikami rozpuszczalnymi, dodatkowo uwzględniając cechy fizyczne, jest układem złożonym. Fenotypy komórek w obrębie tkanki wynikają częściowo z ich zawartości genomicznej, a częściowo z kombinatorycznych interakcji z mikrośrodowiskiem. Głównym wyzwaniem jest powiązanie konkretnych kombinacji komponentów mikrośrodowiska z charakterystycznymi zachowaniami.
W niniejszej pracy przedstawiamy platformę mikrotablicową mikrośrodowiska (MEArray) do funkcjonalnego przesiewania interakcji z kombinatorycznymi mikrośrodowiskami opartych na komórkach4. Metoda ta umożliwia jednoczesną kontrolę składu molekularnego oraz modułu sprężystości, łącząc wykorzystanie powszechnie dostępnych technologii mikrotablic i mikrowzorowania. Przesiewy MEArray wymagają zaledwie 10 000 komórek na tablicę, co ułatwia badania funkcjonalne rzadkich typów komórek, takich jak dorosłe komórki progenitorowe. Ograniczeniem tej technologii jest fakt, że całe mikrośrodowiska tkankowe nie mogą zostać w pełni odwzorowane na MEArray. Niemniej jednak porównanie odpowiedzi tego samego typu komórek na liczne powiązane mikrośrodowiska, na przykład na pary kombinacji białek ECM charakterystycznych dla danej tkanki, pozwoli zrozumieć, w jaki sposób składniki mikrośrodowiska wywołują tkankowo specyficzne fenotypy funkcjonalne.
MEArrays można drukować, wykorzystując szeroką gamę rekombinowanych czynników wzrostu, cytokin i oczyszczonych białek ECM oraz ich kombinacje. Platforma ta jest ograniczona jedynie dostępnością konkretnych odczynników. MEArrays nadają się do analizy poklatkowej, jednak najczęściej stosuje się je do analiz końcowych funkcji komórkowych, które można zmierzyć za pomocą sond fluorescencyjnych. Przykładowo, powszechnie mierzy się syntezę DNA, apoptozę, nabywanie stanów zróżnicowanych lub produkcję specyficznych produktów genów. W skrócie, podstawowy przebieg eksperymentu z użyciem MEArray polega na przygotowaniu szkiełek pokrytych podłożami do druku oraz przygotowaniu płyty głównej z białkami przeznaczonymi do wydruku. Następnie macierze są drukowane za pomocą robota do mikromacierzy, po czym pozwala się komórkom przytwierdzić i rosnąć w kulturze, a po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu są one utrwalane chemicznie. Do ujawnienia odpowiednich fenotypów molekularnych i komórkowych wykorzystuje się testy fluorescencyjne lub kolorymetryczne, obrazowane za pomocą tradycyjnych mikroskopów lub skanerów do mikromacierzy (Rysunek 1).

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Interakcje między komórkami a otaczającym je mikrośrodowiskiem mają funkcjonalne konsekwencje dla zachowania komórkowego. Na poziomie pojedynczej komórki...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wpływu różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe adherentnych typów komórek poprzez ich równoległą ekspozycję na zróżnicowany zbiór mikrośrodowisk Combinator. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie podłoży do druku wspierających absorpcję mieszanin białek mikrośrodowiskowych. Następnie przygotowywane są płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi, które służą do drukowania macierzy ME przy użyciu robota do drukowania mikromacierzy z końcówkami typu quill lub kapilarnymi.Następnie przygotowuje się płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi. Potem komórki adherentne hoduje się na matrycy ME, z możliwością ograniczenia liczby komórek. Uzyskane wyniki, oparte na analizie immunofluorescence, wykazują wpływ różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe, takie jak różnicowanie lub proliferacja.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy ilościowo określić wpływ mikrośrodowisk tkankowych na decyzje dotyczące losów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, jednak zdaliśmy sobie sprawę, że praca in vivo jest niemożliwa. Po opracowaniu metoda ta znalazła wiele zastosowań w biologii komórki, badaniach oraz procesach odkrywania leków. PDMS jest wykorzystywany jako podłoże naśladujące sztywniejsze tkanki, ponieważ jest niedrogi, łatwy w przygotowaniu i prosty do drukowania.Jednakże hydrofobowość PDMS może sprawić, że będzie on niekompatybilny z niektórymi liniami komórkowymi podczas pracy z urządzeniami z PDMS. Należy używać rękawiczek bezlateksowych, ponieważ lateks może hamować polimeryzację PDMS. Aby rozpocząć, w jednorazowym plastikowym kubku połączyć bazę elastomeru silikonowego Sylgard 184 z czynnikiem sieciującym w stosunku 10:1 i energicznie wymieszać za pomocą drewnianego lub plastikowego szpatułki.Następnie odgazuj mieszaninę w dzwonie próżniowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz umieść standardne szkiełko przedmiotowe na napędzanym uchwycie próżniowym spin-coatera, a następnie nanieś 0,5 milliliters zmieszanego polimeru elastomerowego na środek powierzchni szkiełka i przeprowadź powlekanie wirowania z prędkością 6, 000 RPM przez 60 sekund. Utwardzaj szkiełka powleczone PDMS w temperaturze 70 degrees Celsius przez cztery godziny lub przez noc.Preparaty mogą być przechowywane szczelnie w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. PA jest hydrożelem, który może naśladować tkanki miękkie w zakresie, w którym komórki PA będą przylegać wyłącznie do miejsc zawierających białka wspierające adhezję komórkową. Należy rozpocząć od trawienia szkiełek wodorotlenkiem sodu.Umieścić preparaty na bloku grzejnym w temperaturze 80 °C. Nanieść 1 mL 0,1 N wodorotlenku sodu na każdy preparat. Należy upewnić się, że cała powierzchnia preparatu jest pokryta, w przeciwnym razie procedura PA nie powzie się.Pozostaw wodorotlenek sodu do odparowania, aż powstanie biała warstwa. Powtórz ten proces, jeśli powierzchnia nie została całkowicie pokryta. W razie potrzeby preparat można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni.Następnie, w dygestorium, pokryj preparaty PES. Umieść preparaty w naczyniu o pojemności 15 ml. Na każdy preparat trawiony wodorotlenkiem sodu nanieś 300 µl PES.Pozostaw A PES do reakcji z wodorotlenkiem sodu na szkiełkach przez dokładnie pięć minut. Nie dłużej. Dokładnie wypłucz A PES wodą dejonizowaną dwa do trzech razy z obu stron szkiełek.W przeciwnym razie utleni się, tworząc brązowy osad na szkiełkach w kolejnym kroku. Teraz odessij wszystkie roztwory z powierzchni szkiełek do odpowiednich naczyń. Dodaj 25 ml 0,5% glutaraldehydu w PBS.Umieść preparaty w ciemności i odczekaj 30 minut. Po 30 minutach odessaj cały roztwór glutaraldehydu z powierzchni preparatów. Następnie ostrożnie osusz preparaty, używając chłonnego papieru beztkaninowego.Slajdy można teraz przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, jeśli jest to konieczne. Po przygotowaniu i odgazowaniu mieszanin PA, należy umieścić je w lodzie, aby spowolnić ich polimeryzację. Bezpośrednio przed przygotowaniem slajdów, do każdej mieszaniny w lodzie należy dodać persiarczan amonu oraz TEMED i wymieszać je za pomocą pipety przez 5 do 10 sekund.Następnie nanieś pipetą mieszaninę PA na powierzchnie szkiełka. Ilość PA zależy od wymaganej twardości żelu. Następnie nałóż szkiełka nakrywki na PA, nie wywierając nacisku, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.Pozostawić żel PA do polimeryzacji na dwie godziny, a następnie usunąć szkiełka zakryjące pod strumieniem wody dejonizowanej. Myć slajdy z żelem PA w wodzie w dużych naczyniach typu Coplan przez całą noc. Aby usunąć nieprzereagowane akrylamidy następnego dnia, suszyć slajdy do momentu całkowitego stwardnienia żelu PA.Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4°C przez jeden miesiąc w szczelnym pudełku na szkiełka. Na początku plastikową komorę dopasowuje się tak, aby otaczała wydrukowaną macierz na szkiełku dwukomorowym. Należy zdjąć komory i przeciąć je na pół za pomocą żyletki.Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml nałóż cienką warstwę silikonu akwariowego na krawędź komory, a następnie dociśnij ją do powierzchni matrycy Emmy. Należy unikać kontaktu silikonu z jakimikolwiek elementami matrycy. Zapewnienie szczelnego przylegania ścianek hodowlanych do matrycy Emmy jest kluczowe, ponieważ nieszczelne ścianki umożliwiają wyciek pożywki z komór, co może prowadzić do masowego obumierania komórek.W przypadku szkiełek powlekanych PDMS, należy zablokować szkiełka poprzez ich inkubację w 1% wodnym roztworze Pluronic F 108 przez 15 minut w próżni dla obu typów żelu, a następnie przemyć matryce trzykrotnie po pięć minut każdorazowo, używając pożywki do hodowli komórek z antybiotykami. Pozwala to na usunięcie nieprzereagowanych monomerów, które w przypadku żeli PA mogą być toksyczne dla komórek. Po trzecim przemyciu należy pozostawić próbki na dodatkowe 30 minut inkubacji w pożywce w celu rehydratacji żelu.Następnie umieść od czterech do pięciu matryc w sterylnym szalce Petriego o średnicy 15 centymetrów. Do szalki dodaj połowę końcowej objętości medium zawierającego badane komórki w stężeniu wymaganym dla danej aplikacji. Matryce ME należy umieścić w inkubatorze odpowiednim do hodowli stosowanego typu komórek.Co 15–20 minut podczas obserwacji sprawdzać pod mikroskopem, czy komórki przylegają równomiernie do wydrukowanych struktur. Delikatnie potrząsnąć matrycami ME, aby odróżnić komórki przylegające od pływających. Czas adhezji może się różnić, ale zazwyczaj proces ten kończy się w ciągu dwóch godzin na matrycy ME kodowanej PA.Po osiągnięciu nasycenia adhezji lub upływie wyznaczonego czasu, odessaj niezwiązane komórki i dopełnij objętość w naczyniu do objętości końcowej w przypadku macierzy ME powlekanych PDMS. Usunięcie całego medium spowoduje śmierć komórek. Dlatego podczas wszystkich wymian medium na tych szkiełkach należy sukcesywnie wymieniać połowę objętości medium, a następnie dopełnić naczynie do objętości końcowej.Kultywacja może być kontynuowana przez wiele dni przy zachowaniu standardowych wymian pożywek. Powszechnie stosowane utrwalacze, takie jak paraformaldehyd, aldehyd oraz aceton z metanolem, są kompatybilne z systemami matryc Emmy. Należy pamiętać, że matryce ME powlekane PDMS muszą pozostać wilgotne, nawet podczas barwienia.Następnie należy kontynuować technikę wymiany połowy objętości w celu przygotowania preparatów z barwionych macierzy ME. Do usunięcia komór należy użyć żyletki, a szkiełka nakrywkowe przymocować za pomocą flora. Białko G zostało naniesione na wydrukowaną macierz ME kodowaną PDMS przy użyciu silikonowych pinów z kwadratową końcówką zamocowanych na trzpieniu.Naniesienie różnych białek przez robota do drukowania mikromacierzy zweryfikowano metodą immunofluorescencji z użyciem przeciwciał. Rozcieńczenia roztworów białek na płytce matrycowej odzwierciedlały ilość białka naniesioną na powierzchnię podłoża do drukowania; komórki przytwierdziły się do wydrukowanych punktów w wyraźny, wzorzysty sposób. Podobnie, ten sam wyraźny wzór przytwierdzania komórek występuje, gdy macierz Emmy jest drukowana w skali 40 000 przejść.Dwa białka mikrośrodowiskowe w żelu PA wywołały zależne od stężenia profile ekspresji keratyn w ludzkiej linii komórek progenitorowych nabłonka piersi o potencjale multipotentnym. Logarytmiczny stosunek sygnałów keratyny 8 do sygnałów keratyny 14 ilustruje zmienność i powtarzalność sygnału. Po 24 godzinach hodowli niezwiązane komórki zostają wypłukane w analizie 12 macierzy me.Zastosowano standardowe analizy statystyczne, aby określić, czy różne rozcieńczenia kolagenu typu I i rekombinowanej ludzkiej p-kadheryny powodują zmiany w ekspresji keratyny. Początkowo, bezpośrednio po adhezji, nie odnotowano różnic względem średniej wśród komórek na podłożach. Jednak po 24 godzinach wysokie stężenia kolagenu typu I wywołały znacząco wyższą ekspresję keratyny 8.Podczas gdy wysokie stężenia PCA wywołały silny sygnał keratyny 14. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami na temat bipotencjalnych komórek progenitorowych pamięci. Ze względu na dynamiczny i reciprokalny charakter oddziaływań tych komórek z mikrośrodowiskiem, komórki te mogą same zmieniać skład wydrukowanych mikrośrodowisk.Zatem, aby zrozumieć ostre skutki działania wydrukowanych mikrośrodowisk, czas ekspozycji po przeprowadzeniu tej procedury nie powinien przekraczać 48 godzin. Każdy proces teoretyczny, który można zmierzyć metodami fluorescencyjnymi lub barwnymi, może zostać oceniony w zależności od mikrośrodowiska, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób różne mikrośrodowiska zmieniają reakcje na leki w liniach nowotworowych? Można to ocenić poprzez zmiany w poziomie apoptozy i proliferacji.Lub w jaki sposób mikrośrodowiska zmieniają różnicowanie progenitorów.

fabrication-and-use-of-microenvironment-microarrays-mearrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja i użycie mikrośrodowiskowych mikroArray (MEArrays)

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Poznaj metodę mikromacierzy ME do badania wpływu mikrośrodowiska na funkcje komórek. Technika umożliwia analizę adhezji, różnicowania i proliferacji w zdefiniowanych warunkach.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Przeglądaj więcej filmów