Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wpływu różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe adherentnych typów komórek poprzez ich równoległą ekspozycję na zróżnicowany zbiór mikrośrodowisk Combinator. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie podłoży do druku wspierających absorpcję mieszanin białek mikrośrodowiskowych. Następnie przygotowywane są płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi, które służą do drukowania macierzy ME przy użyciu robota do drukowania mikromacierzy z końcówkami typu quill lub kapilarnymi.

Następnie przygotowuje się płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi. Potem komórki adherentne hoduje się na matrycy ME, z możliwością ograniczenia liczby komórek. Uzyskane wyniki, oparte na analizie immunofluorescence, wykazują wpływ różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe, takie jak różnicowanie lub proliferacja.

Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy ilościowo określić wpływ mikrośrodowisk tkankowych na decyzje dotyczące losów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, jednak zdaliśmy sobie sprawę, że praca in vivo jest niemożliwa. Po opracowaniu metoda ta znalazła wiele zastosowań w biologii komórki, badaniach oraz procesach odkrywania leków. PDMS jest wykorzystywany jako podłoże naśladujące sztywniejsze tkanki, ponieważ jest niedrogi, łatwy w przygotowaniu i prosty do drukowania.

Jednakże hydrofobowość PDMS może sprawić, że będzie on niekompatybilny z niektórymi liniami komórkowymi podczas pracy z urządzeniami z PDMS. Należy używać rękawiczek bezlateksowych, ponieważ lateks może hamować polimeryzację PDMS. Aby rozpocząć, w jednorazowym plastikowym kubku połączyć bazę elastomeru silikonowego Sylgard 184 z czynnikiem sieciującym w stosunku 10:1 i energicznie wymieszać za pomocą drewnianego lub plastikowego szpatułki.

Następnie odgazuj mieszaninę w dzwonie próżniowym w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Teraz umieść standardne szkiełko przedmiotowe na napędzanym uchwycie próżniowym spin-coatera, a następnie nanieś 0,5 milliliters zmieszanego polimeru elastomerowego na środek powierzchni szkiełka i przeprowadź powlekanie wirowania z prędkością 6, 000 RPM przez 60 sekund. Utwardzaj szkiełka powleczone PDMS w temperaturze 70 degrees Celsius przez cztery godziny lub przez noc.

Preparaty mogą być przechowywane szczelnie w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy. PA jest hydrożelem, który może naśladować tkanki miękkie w zakresie, w którym komórki PA będą przylegać wyłącznie do miejsc zawierających białka wspierające adhezję komórkową. Należy rozpocząć od trawienia szkiełek wodorotlenkiem sodu.

Umieścić preparaty na bloku grzejnym w temperaturze 80 °C. Nanieść 1 mL 0,1 N wodorotlenku sodu na każdy preparat. Należy upewnić się, że cała powierzchnia preparatu jest pokryta, w przeciwnym razie procedura PA nie powzie się.

Pozostaw wodorotlenek sodu do odparowania, aż powstanie biała warstwa. Powtórz ten proces, jeśli powierzchnia nie została całkowicie pokryta. W razie potrzeby preparat można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni.

Następnie, w dygestorium, pokryj preparaty PES. Umieść preparaty w naczyniu o pojemności 15 ml. Na każdy preparat trawiony wodorotlenkiem sodu nanieś 300 µl PES.

Pozostaw A PES do reakcji z wodorotlenkiem sodu na szkiełkach przez dokładnie pięć minut. Nie dłużej. Dokładnie wypłucz A PES wodą dejonizowaną dwa do trzech razy z obu stron szkiełek.

W przeciwnym razie utleni się, tworząc brązowy osad na szkiełkach w kolejnym kroku. Teraz odessij wszystkie roztwory z powierzchni szkiełek do odpowiednich naczyń. Dodaj 25 ml 0,5% glutaraldehydu w PBS.

Umieść preparaty w ciemności i odczekaj 30 minut. Po 30 minutach odessaj cały roztwór glutaraldehydu z powierzchni preparatów. Następnie ostrożnie osusz preparaty, używając chłonnego papieru beztkaninowego.

Slajdy można teraz przechowywać w temperaturze pokojowej przez noc, jeśli jest to konieczne. Po przygotowaniu i odgazowaniu mieszanin PA, należy umieścić je w lodzie, aby spowolnić ich polimeryzację. Bezpośrednio przed przygotowaniem slajdów, do każdej mieszaniny w lodzie należy dodać persiarczan amonu oraz TEMED i wymieszać je za pomocą pipety przez 5 do 10 sekund.

Następnie nanieś pipetą mieszaninę PA na powierzchnie szkiełka. Ilość PA zależy od wymaganej twardości żelu. Następnie nałóż szkiełka nakrywki na PA, nie wywierając nacisku, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.

Pozostawić żel PA do polimeryzacji na dwie godziny, a następnie usunąć szkiełka zakryjące pod strumieniem wody dejonizowanej. Myć slajdy z żelem PA w wodzie w dużych naczyniach typu Coplan przez całą noc. Aby usunąć nieprzereagowane akrylamidy następnego dnia, suszyć slajdy do momentu całkowitego stwardnienia żelu PA.

Preparaty można następnie przechowywać w temperaturze 4°C przez jeden miesiąc w szczelnym pudełku na szkiełka. Na początku plastikową komorę dopasowuje się tak, aby otaczała wydrukowaną macierz na szkiełku dwukomorowym. Należy zdjąć komory i przeciąć je na pół za pomocą żyletki.

Za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml nałóż cienką warstwę silikonu akwariowego na krawędź komory, a następnie dociśnij ją do powierzchni matrycy Emmy. Należy unikać kontaktu silikonu z jakimikolwiek elementami matrycy. Zapewnienie szczelnego przylegania ścianek hodowlanych do matrycy Emmy jest kluczowe, ponieważ nieszczelne ścianki umożliwiają wyciek pożywki z komór, co może prowadzić do masowego obumierania komórek.

W przypadku szkiełek powlekanych PDMS, należy zablokować szkiełka poprzez ich inkubację w 1% wodnym roztworze Pluronic F 108 przez 15 minut w próżni dla obu typów żelu, a następnie przemyć matryce trzykrotnie po pięć minut każdorazowo, używając pożywki do hodowli komórek z antybiotykami. Pozwala to na usunięcie nieprzereagowanych monomerów, które w przypadku żeli PA mogą być toksyczne dla komórek. Po trzecim przemyciu należy pozostawić próbki na dodatkowe 30 minut inkubacji w pożywce w celu rehydratacji żelu.

Następnie umieść od czterech do pięciu matryc w sterylnym szalce Petriego o średnicy 15 centymetrów. Do szalki dodaj połowę końcowej objętości medium zawierającego badane komórki w stężeniu wymaganym dla danej aplikacji. Matryce ME należy umieścić w inkubatorze odpowiednim do hodowli stosowanego typu komórek.

Co 15–20 minut podczas obserwacji sprawdzać pod mikroskopem, czy komórki przylegają równomiernie do wydrukowanych struktur. Delikatnie potrząsnąć matrycami ME, aby odróżnić komórki przylegające od pływających. Czas adhezji może się różnić, ale zazwyczaj proces ten kończy się w ciągu dwóch godzin na matrycy ME kodowanej PA.

Po osiągnięciu nasycenia adhezji lub upływie wyznaczonego czasu, odessaj niezwiązane komórki i dopełnij objętość w naczyniu do objętości końcowej w przypadku macierzy ME powlekanych PDMS. Usunięcie całego medium spowoduje śmierć komórek. Dlatego podczas wszystkich wymian medium na tych szkiełkach należy sukcesywnie wymieniać połowę objętości medium, a następnie dopełnić naczynie do objętości końcowej.

Kultywacja może być kontynuowana przez wiele dni przy zachowaniu standardowych wymian pożywek. Powszechnie stosowane utrwalacze, takie jak paraformaldehyd, aldehyd oraz aceton z metanolem, są kompatybilne z systemami matryc Emmy. Należy pamiętać, że matryce ME powlekane PDMS muszą pozostać wilgotne, nawet podczas barwienia.

Następnie należy kontynuować technikę wymiany połowy objętości w celu przygotowania preparatów z barwionych macierzy ME. Do usunięcia komór należy użyć żyletki, a szkiełka nakrywkowe przymocować za pomocą flora. Białko G zostało naniesione na wydrukowaną macierz ME kodowaną PDMS przy użyciu silikonowych pinów z kwadratową końcówką zamocowanych na trzpieniu.

Naniesienie różnych białek przez robota do drukowania mikromacierzy zweryfikowano metodą immunofluorescencji z użyciem przeciwciał. Rozcieńczenia roztworów białek na płytce matrycowej odzwierciedlały ilość białka naniesioną na powierzchnię podłoża do drukowania; komórki przytwierdziły się do wydrukowanych punktów w wyraźny, wzorzysty sposób. Podobnie, ten sam wyraźny wzór przytwierdzania komórek występuje, gdy macierz Emmy jest drukowana w skali 40 000 przejść.

Dwa białka mikrośrodowiskowe w żelu PA wywołały zależne od stężenia profile ekspresji keratyn w ludzkiej linii komórek progenitorowych nabłonka piersi o potencjale multipotentnym. Logarytmiczny stosunek sygnałów keratyny 8 do sygnałów keratyny 14 ilustruje zmienność i powtarzalność sygnału. Po 24 godzinach hodowli niezwiązane komórki zostają wypłukane w analizie 12 macierzy me.

Zastosowano standardowe analizy statystyczne, aby określić, czy różne rozcieńczenia kolagenu typu I i rekombinowanej ludzkiej p-kadheryny powodują zmiany w ekspresji keratyny. Początkowo, bezpośrednio po adhezji, nie odnotowano różnic względem średniej wśród komórek na podłożach. Jednak po 24 godzinach wysokie stężenia kolagenu typu I wywołały znacząco wyższą ekspresję keratyny 8.

Podczas gdy wysokie stężenia PCA wywołały silny sygnał keratyny 14. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami na temat bipotencjalnych komórek progenitorowych pamięci. Ze względu na dynamiczny i reciprokalny charakter oddziaływań tych komórek z mikrośrodowiskiem, komórki te mogą same zmieniać skład wydrukowanych mikrośrodowisk.

Zatem, aby zrozumieć ostre skutki działania wydrukowanych mikrośrodowisk, czas ekspozycji po przeprowadzeniu tej procedury nie powinien przekraczać 48 godzin. Każdy proces teoretyczny, który można zmierzyć metodami fluorescencyjnymi lub barwnymi, może zostać oceniony w zależności od mikrośrodowiska, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: w jaki sposób różne mikrośrodowiska zmieniają reakcje na leki w liniach nowotworowych? Można to ocenić poprzez zmiany w poziomie apoptozy i proliferacji.

Lub w jaki sposób mikrośrodowiska zmieniają różnicowanie progenitorów.