Name: Wytwarzanie i użytkowanie mikromacierzy MicroEnvironment (MEArrays) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Poznaj metodę mikromacierzy ME do badania wpływu mikrośrodowiska na funkcje komórek. Technika umożliwia analizę adhezji, różnicowania i proliferacji w zdefiniowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

ML jest wspierany przez NIA (R00AG033176 oraz R01AG040081) oraz przez Laboratory Directed Research and Development, kontrakt Departamentu Energii USA nr DE-AC02-05CH11231.

<ol><li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).</li>
<li>LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decsions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Kim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Annals of biomedical engineering. , (2012).</li>
<li>Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+elastic+properties+of+polyacrylamide+gels%3A+implications+for+quantification+of+cellular+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces.</a> Biorheology. 46, 191-205 (2009).</li>
<li>Tse, J. R., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+hydrogel+substrates+with+tunable+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties.</a> Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10(2010).</li>
<li>Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extracellular+matrix+microarray+for+probing+cellular+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation.</a> Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).</li>
<li>Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+regulation+of+human+neural+precursor+cell+differentiation+using+arrays+of+signaling+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiona tutaj metoda MEArray umożliwia analizy funkcjonalne interakcji komórek i kombinatorycznych mikrośrodowisk4. Analiza MEArray łączy wykorzystanie podstawowych technologii mikrowzorowania, biologii komórki, robotów do drukowania macierzy mikroprzewodowych oraz urządzeń analitycznych dostępnych w wielu placówkach wieloużytkowych. Przesiewy MEArray są kompatybilne z większością typów komórek adherentnych, choć w niektórych przypadkach składy mediów bezsurowiczych mogą wymagać dostosowania poprzez doda...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka przedmiotowe 25 mm x 75 mm</td><td>VWR</td><td>48311-600</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki (nr 1) 24 mm x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Kuweta do barwienia (lub naczynie Coplana)</td><td>VWR</td><td>25461-003</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego (15 cm)</td><td>BD Falcon</td><td>351058</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (1,0 N)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2567</td><td></td></tr><tr><td>APES (&amp;gt;98% (3-aminopropyl)trietoksysilan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyd</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7651</td><td>50% w wodzie</td></tr><tr><td>APS (&amp;gt;98% nadsiarczan amonu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Przygotować 10% roztwór roboczy w ddH2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>TEMED (N,N,N',N'-tetrametyloetylenodiamina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid (40%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4058</td><td></td></tr><tr><td>Bis-akrylamid (2% m/v)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1404-250</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;Filtr strzykawkowy nylonowy 4 mm</td><td>Nalgene</td><td>176-0045</td><td></td></tr><tr><td>FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>PDMS (polidimetylosiloksan)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Zestaw elastomeru Sylgard 184 od Ellsworth Adhesives</td></tr><tr><td>szkiełka z 2 komorami</td><td>NUNC</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F108</td><td>BASF</td><td>30089186</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz do akwariów</td><td>Dow Corning</td><td>DAP 00688</td><td></td></tr><tr><td>Fluormount-G</td><td>Southern Biotech&lt;silny&gt;&lt;/strong&gt;</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe kubki plastikowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki do badania gardła</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rękawiczki nitrylowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastikowe pudełka na preparaty mikroskopowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka do nanoszenia warstw</td><td>WS-400B-6NPP/LITE</td><td>Laurell Technologies Corporation</td><td></td></tr><tr><td>Piec / Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa płyta grzejna</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>płytki 384-dołkowe</td><td></td><td></td><td>Marka odpowiednia dla robota do mikroarrayów</td></tr><tr><td>Robot do drukowania macierzy mikroprzepływowych</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop fazowo-kontrastowy i fluorescencyjny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skanery mikroarray Axon</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Istnieje wiele konfiguracji</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (mearrays)

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

Interakcje między komórkami a ich otaczającym mikrośrodowiskiem mają funkcjonalne konsekwencje dla zachowania komórkowego. Na poziomie pojedynczej komórki odmienne mikrośrodowiska mogą wymuszać fenotypy różnicowania, migracji i proliferacji, a na poziomie tkanki mikrośrodowisko wpływa na procesy tak złożone jak morfogeneza i tumorigenesis1. Na komórki wewnątrz mikrośrodowiska wpływają nie tylko zawartości komórkowe i molekularne, ale także elastyczność2 i geometria3 tkanki. Mikrośrodowisko, definiowane jako suma interakcji między komórkami, między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową (ECM) oraz między komórkami a czynnikami rozpuszczalnymi, dodatkowo uwzględniając cechy fizyczne, jest układem złożonym. Fenotypy komórek w obrębie tkanki wynikają częściowo z ich zawartości genomicznej, a częściowo z kombinatorycznych interakcji z mikrośrodowiskiem. Głównym wyzwaniem jest powiązanie konkretnych kombinacji komponentów mikrośrodowiska z charakterystycznymi zachowaniami.
W niniejszej pracy przedstawiamy platformę mikrotablicową mikrośrodowiska (MEArray) do funkcjonalnego przesiewania interakcji z kombinatorycznymi mikrośrodowiskami opartych na komórkach4. Metoda ta umożliwia jednoczesną kontrolę składu molekularnego oraz modułu sprężystości, łącząc wykorzystanie powszechnie dostępnych technologii mikrotablic i mikrowzorowania. Przesiewy MEArray wymagają zaledwie 10 000 komórek na tablicę, co ułatwia badania funkcjonalne rzadkich typów komórek, takich jak dorosłe komórki progenitorowe. Ograniczeniem tej technologii jest fakt, że całe mikrośrodowiska tkankowe nie mogą zostać w pełni odwzorowane na MEArray. Niemniej jednak porównanie odpowiedzi tego samego typu komórek na liczne powiązane mikrośrodowiska, na przykład na pary kombinacji białek ECM charakterystycznych dla danej tkanki, pozwoli zrozumieć, w jaki sposób składniki mikrośrodowiska wywołują tkankowo specyficzne fenotypy funkcjonalne.
MEArrays można drukować, wykorzystując szeroką gamę rekombinowanych czynników wzrostu, cytokin i oczyszczonych białek ECM oraz ich kombinacje. Platforma ta jest ograniczona jedynie dostępnością konkretnych odczynników. MEArrays nadają się do analizy poklatkowej, jednak najczęściej stosuje się je do analiz końcowych funkcji komórkowych, które można zmierzyć za pomocą sond fluorescencyjnych. Przykładowo, powszechnie mierzy się syntezę DNA, apoptozę, nabywanie stanów zróżnicowanych lub produkcję specyficznych produktów genów. W skrócie, podstawowy przebieg eksperymentu z użyciem MEArray polega na przygotowaniu szkiełek pokrytych podłożami do druku oraz przygotowaniu płyty głównej z białkami przeznaczonymi do wydruku. Następnie macierze są drukowane za pomocą robota do mikromacierzy, po czym pozwala się komórkom przytwierdzić i rosnąć w kulturze, a po osiągnięciu punktu końcowego eksperymentu są one utrwalane chemicznie. Do ujawnienia odpowiednich fenotypów molekularnych i komórkowych wykorzystuje się testy fluorescencyjne lub kolorymetryczne, obrazowane za pomocą tradycyjnych mikroskopów lub skanerów do mikromacierzy (Rysunek 1).

Opisano kombinatoryczną metodę przesiewania funkcjonalnego służącą do pogłębienia wiedzy na temat wpływu składu molekularnego mikrośrodowisk na funkcje komórkowe. Metoda ta wykorzystuje istniejące technologie oparte na mikromacierzych do generowania macierzy zdefiniowanych kombinatorycznych mikrośrodowisk, które umożliwiają adhezję komórek oraz analizę funkcjonalną.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Interakcje między komórkami a otaczającym je mikrośrodowiskiem mają funkcjonalne konsekwencje dla zachowania komórkowego. Na poziomie pojedynczej komórki...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar wpływu różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe adherentnych typów komórek poprzez ich równoległą ekspozycję na zróżnicowany zbiór mikrośrodowisk Combinator. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie podłoży do druku wspierających absorpcję mieszanin białek mikrośrodowiskowych. Następnie przygotowywane są płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi, które służą do drukowania macierzy ME przy użyciu robota do drukowania mikromacierzy z końcówkami typu quill lub kapilarnymi.Następnie przygotowuje się płytki matrycowe z białkami mikrośrodowiskowymi. Potem komórki adherentne hoduje się na matrycy ME, z możliwością ograniczenia liczby komórek. Uzyskane wyniki, oparte na analizie immunofluorescence, wykazują wpływ różnych mikrośrodowisk na funkcje komórkowe, takie jak różnicowanie lub proliferacja.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy chcieliśmy ilościowo określić wpływ mikrośrodowisk tkankowych na decyzje dotyczące losów ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych, jednak zdaliśmy sobie sprawę, że praca in vivo jest niemożliwa. Po opracowaniu metoda ta znalazła wiele zastosowań w biologii komórki, badaniach oraz procesach odkry

fabrication-and-use-of-microenvironment-microarrays-mearrays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja i użycie mikrośrodowiskowych mikroArray (MEArrays)

Opisano prostą procedurę przeprowadzania niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA. Kroki obejmują izolację RNA, znakowanie RNA i DNA referencyjnego, hybrydyzację próbek z mikromacierzami, skanowanie mikromacierzy oraz kwantyfikację i analizę sygnałów hybrydyzacji.

Przeprowadzanie niestandardowych eksperymentów z wykorzystaniem mikromacierzy mikroRNA

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Ten film demonstruje technikę, która wykorzystuje technologię mikromacierzy peptydowych do profilowania specyficzności przeciwciał rozpoznających modyfikacje potranslacyjne (PTM) na peptydach histonowych. Szkiełko mikromacierzy zawierające unieruchomione peptydy histonowe sprzężone z fluoroforem ze znanymi kombinacjami PTM poddaje się działaniu docelowych przeciwciał specyficznych dla PTM. Proces ten pomaga zidentyfikować swoistość przeciwciała dla celu i jego potencjalną reaktywność krzyżową z...

Technologia mikromacierzy peptydowych do profilowania swoistości przeciwciał

Mikromacierz amplifikacyjna łączy asymetryczną amplifikację PCR i hybrydyzację mikromacierzy w jednej komorze, co znacznie usprawnia pracę z mikromacierzą dla użytkownika końcowego. Uproszczenie przepływu pracy z mikromacierzami jest niezbędnym pierwszym krokiem do stworzenia diagnostyki opartej na mikromacierzach, która może być rutynowo używana w środowiskach o niższych zasobach.

Demonstracja wielolekoopornej mikromacierzy amplifikacyjnej Mycobacterium tuberculosis

Opisane są protokoły ilościowego określania interakcji mechanicznych między przylegającymi komórkami a mikrostrukturalnymi substratami. Interakcje te są ściśle związane z podstawowymi zachowaniami komórek, w tym migracją, proliferacją, różnicowaniem i apoptozą. Protokoły prezentują oprogramowanie do analizy obrazu o otwartym kodzie źródłowym o nazwie MechProfiler, które umożliwia określenie zaangażowanych sił dla każdego mikrosłupka.

Łatwe i dokładne profilowanie mechaniczne na matrycach Micropost

Różnicowanie komórek jest regulowane przez wiele czynników mikrośrodowiskowych, w tym zarówno skład matrycy, jak i właściwości materiału substratu. Opisujemy tutaj technikę wykorzystującą mikromacierze komórkowe w połączeniu z mikroskopią sił trakcyjnych do oceny zarówno różnicowania komórek, jak i biomechanicznych interakcji komórka-substrat w funkcji kontekstu mikrośrodowiskowego.

Wysokowydajna platforma mikromacierzy komórkowych do korelacyjnej analizy różnicowania komórek i sił trakcyjnych

Rozwój społeczności mikroorganizmów zależy od kombinacji czynników, w tym architektury środowiska, liczebności członków, cech i interakcji. Protokół ten opisuje syntetyczne, mikrofabrykowane środowisko do jednoczesnego śledzenia tysięcy społeczności zawartych w studniach femtolitrowych, w którym można przybliżyć kluczowe czynniki, takie jak wielkość niszy i zamknięcie.

Montaż i śledzenie rozwoju społeczności mikrobiologicznej w ramach platformy Microwell Array

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię przygotowania matrycy Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) do wysokoprzepustowej manipulacji fizycznych i chemicznych sygnałów naśladujących mikrośrodowiska komórkowe in vivo oraz do identyfikacji optymalnego środowiska komórkowego dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) z profilowaniem pojedynczych komórek.

Wytwarzanie multipleksowanej sztucznej macierzy mikrośrodowiska komórkowego

Celem przedstawionej tutaj metody jest pokazanie, jak mikromacierze mikrośrodowiskowe (MEMA) mogą być wytwarzane i wykorzystywane do badania wpływu tysięcy prostych mikrośrodowisk kombinatorycznych na fenotyp hodowanych komórek.

Wykorzystanie mikromacierzy do badania wpływu mikrośrodowiska na fenotypy komórkowe w raku

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Poznaj metodę mikromacierzy ME do badania wpływu mikrośrodowiska na funkcje komórek. Technika umożliwia analizę adhezji, różnicowania i proliferacji w zdefiniowanych warunkach.

Wytwarzanie i zastosowanie mikroarrayów mikrośrodowiskowych (MEArrays)

Przeglądaj więcej filmów