Name: Wytwarzanie i zastosowanie różanych filmów bengalsko-chitozanowych w laserowej naprawie tkanek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Naucz się wytwarzać laserowo-aktywowane kleje chitozanowe do naprawy tkanek. Ta metoda minimalizuje uszkodzenia tkanek w porównaniu do tradycyjnych szwów chirurgicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu badawczego UWS.

1. Przygotowanie kleju z chitozanu
<ol>
 <li>Proszek chitozanu jest rozpuszczalny w roztworze kwasu octowego; aby przygotować roztwór zapasowy kwasu octowego (2% v/v), należy dodać 10 ml lodowatego kwasu octowego do 490 ml wody dejonizowanej (DI-H2O).</li>
 <li>Aby przygotować roztwór zapasowy błękitu różowego (Rose Bengal, RB) (0,01% w/v) w kwasie octowym, należy odważyć 5 mg RB do fiolki owiniętej folią aluminiową, aby zapobiec fotoblaknięciu. Dodać 0,5 ml DI-H2O w celu rozpuszczenia proszku, a następnie dodać 49,5 ml roztworu zapasowego kwasu octowego (opisanego w sekcji 1.1).</li>
 <li>Aby przygotować roztwór chitozanu (1,7% w/v), należy odważyć 0,85 g proszku chitozanu (średnia masa cząsteczkowa, 85% stopień acetylacji) i dodać go do 50 ml roztworu RB w kwasie octowym. Grupę kontrolną przygotowano poprzez rozpuszczenie chitozanu w roztworze kwasu octowego bez dodatku RB.</li>
 <li>Do mieszaniny chitozanu dodać mieszadło magnetyczne i mieszać w temperaturze pokojowej. Aby zapewnić całkowite rozpuszczenie składników, chitozan w kwasie octowym z RB należy mieszać przez dwa tygodnie, a chitozan w samym kwasie octowym przez 5 dni (kontrola). Po rozpuszczeniu chitozanu pH roztworu wzrasta z ~2,6 do ~3,9. Należy zauważyć, że RB jest słabo rozpuszczalny przy niskim pH i wymaga zwiększenia pH roztworu oraz wydłużonego czasu mieszania, aby się rozpuścić.</li>
 <li>Roztwory wirować przy 3270 x g przez 1 hr i zebrać nadsącz, używając np. sterylnej strzykawki 10 ml. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu zanieczyszczeń. Na tym etapie roztwór zostaje oczyszczony z zanieczyszczeń makroskopowych i substancji nierozpuszczalnych.</li>
 <li>Za pomocą sterylnej strzykawki nanieść (odwirowany) roztwór chitozanu na płaską płytkę z pleksiglasu. Grubość wysuszonej błony zależy od stosunku ilości naniesionego roztworu do powierzchni, na której został on rozprowadzony. Należy upewnić się, że roztwór jest wolny od pęcherzyków powietrza i równomiernie rozprowadzony na płytce. Aby uzyskać cienkie błony o grubości ~13 μm, należy nanieść ~1 ml roztworu na powierzchnię 12 cm2 (wymiary ~3x4 cm, Rycina 1A).</li>
 <li>Przykryć płytkę z pleksiglasu ekranem, np. z folii aluminiowej, aby zapobiec fotoblaknięciu roztworu. Należy zapewnić odpowiednią wentylację powietrza, aby umożliwić wyschnięcie roztworu pod ekranem.</li>
 <li>Pozostawić roztwór do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (25 °C) i pod ciśnieniem atmosferycznym (1 atm), aż powstała błona stanie się nierozpuszczalna w wodzie i nie będzie makroskopowo pęcznieć. Zazwyczaj osiąga się to w ciągu 2 tygodni.</li>
 <li>Ostrożnie oddzielić błony za pomocą cienkiej, płaskiej szpatułki; błony te można łatwo odkleić od płytki z pleksiglasu bez ich uszkodzenia.</li>
 <li>Zmierzyć grubość błon za pomocą mikrometru.</li>
 <li>Wyciąć klej w prostokątne paski za pomocą czystych, ostrych nożyczek i umieścić je między sterylnymi szkiełkami przedmiotowymi, aby zachować ich płaski kształt. Szkiełka owinąć folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej. Oznaczyć kleje z RB i bez RB odpowiednio jako „klej różowy” (rose adhesive) lub „klej chitozanowy” (chitosan adhesive).</li>
 <li>Błony kleju różowego można sterylizować za pomocą etanolu (90%) lub promieniowaniem gamma (0,1 KGy/h przez 24 hr)4,5.</li>
</ol>
2. Tłumienie optyczne kleju
<ol>
 <li>Zamocuj klej różany wewnątrz kuwety kwarcowej.</li>
 <li>Zarejestruj jego widmo tłumienia w zakresie 400 - 800 nm przy użyciu dwuwiązkowego spektrofotometru4.</li>
 <li>Przyjmując ważność prawa Beera, oblicz długość tłumienia kleju według wzoru: I = I0e-Ax, gdzie I0 to natężenie wiązki padającej, 1/A to długość tłumienia, a x to grubość filmu.</li>
 <li>Powtórz kroki od 2.1 do 2.3 dla kleju z chitosanu, aby służył on jako kontrola.</li>
</ol>
3. Zastosowanie In Vitro: Laserowe łączenie tkanek jelita
<ol>
 <li>Pobierz jelito cielęce natychmiast po uśmierceniu zwierzęcia i przechowuj w temperaturze -80 °C.</li>
 <li>Przed użyciem rozmroź i nawodnij tkankę, zanurzając ją w DI-H2O na 10 min.</li>
 <li>Podziel tkankę na sekcje (2 x 1 cm) za pomocą ostrza nr 10 pod mikroskopem operacyjnym (x10). Utrzymuj sekcje w stanie wilgotnym, używając DI-H2O.</li>
 <li>Zbliż do siebie krawędzie cięcia (stykając końce). Usuń nadmiar wody z powierzchni za pomocą patyczków bawełnianych.</li>
 <li>Za pomocą mikropincety umieść pasek kleju rose (10 x 6 mm) w poprzek nacięcia na warstwie surowiczej, zapewniając pełny kontakt z jelitem (Rysunek 2).</li>
 <li>Adhezja tkankowa kleju rose jest aktywowana przez laser półprzewodnikowy z pompowaniem diodowym, sprzężony z wielomodowym światłowodem (średnica rdzenia 200 μm)4.</li>
 <li>Ustaw moc lasera na 180 mW i naświetlaj klej przez ~6 min przy średnicy plamki wiązki ~5 mm, stosując parametry wymienione w Tabeli 1. Naświetlaj klej punktowo, dbając o to, aby każdy punkt był naświetlany przez ~5 sekund przed przesunięciem wiązki na sąsiedni punkt. Procedura ta gwarantuje, że wiązka lasera wielokrotnie przeskanuje całą powierzchnię kleju.</li>
 <li>Aby ocenić wytrzymałość wiązania tkanki, zamocuj próbkę w skalibrowanym jednokolumnowym tensjometrze (Instron, MA, USA) za pomocą uchwytów mechanicznych. Przesuwaj uchwyty z prędkością 22 mm/min aż do rozdzielenia dwóch końców tkanki4.</li>
 <li>Nałóż klej rose na tkankę zgodnie z opisem w kroku 3.5. Nie naświetlaj próbki i zmierz wytrzymałość wiązania tkanki zgodnie z opisem w kroku 3.8. Próbka ta służy jako kontrola.</li>
</ol>
4. Zastosowanie in vivo: Anastomoza nerwu piszczelowego
<ol>
 <li>Uśpij szczura linii Wistar mieszanką izofluranu/O2 (4% podczas indukcji, 2% w dalszej części)5. Podaj podskórnie Buprenex (0,03 mg/kg), aby zapewnić przeciwbólowcze działanie śródoperacyjne i złagodzić ewentualny ból lub dyskomfort.</li>
 <li>Następującą procedurę chirurgiczną należy przeprowadzić pod mikroskopem operacyjnym (x10). Wykonaj skośne nacięcie skóry o długości około 3 cm w części grzbietowo-bocznej prawego uda i odsłoń nerw piszczelowy, stosując technikę rozsuwania mięśni pośladkowych2.</li>
 <li> Częściowo odpreparuj i przytnij osłonkę nerwu piszczelowego za pomocą prostych mikronozyciór i odsącz nadmiar wody za pomocą sterylnej gazy lub patyczków bawełnianych.</li>
 <li>Przetnij nerw piszczelowy mikronozyciorami.</li>
 <li>Umieść sterylny pasek chitozanowy (wymiary 5 x 4 mm) pod nerwem piszczelowym za pomocą mikro-pincety.</li>
 <li>Zbliż końce przeciętego nerwu koniec do końca za pomocą mikro-pincety nad klejącym paskiem rose.</li>
 <li>Pasek całkowicie przylega do nerwu, tworząc kołnierz, który może ułatwić obrót nerwu podczas naświetlania paska laserem.</li>
 <li>Aktywuj klej rose za pomocą lasera zgodnie z opisem w krokach 3.6) i 3.7).</li>
 <li>Odtnij nadmiar kleju rose z kołnierza operowanego nerwu.</li>
 <li>Zamknij mięśnie i skórę za pomocą pięciu szwów 3-05.</li>
 <li>Należy zastosować standardowe procedury rekonwalescencji pooperacyjnej, w tym codzienną kontrolę pod kątem rozszczepienia rany lub tworzenia się ropy oraz podawanie leków przeciwbólowych w razie potrzeby.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Otrzymane błony mają jasnoróżowy kolor, są cienkie i posiadają gładką powierzchnię (Rycina 1). Są one również elastyczne i mogą być zwijane w rurki o małej średnicy bez powodowania rozdarć ani innych widocznych uszkodzeń (Rycina 1B). Różowe spoiwo wykazuje dwa piki absorpcji przy 530 i 562 nm; w związku z tym zielony laser jest silnie absorbowany przez spoiwo, a odpowiadająca mu długość tłumienia przy 532 nm wynosi ~12 μm (Rycina 3). W przeciwieństwie do tego, błony z chitozanu bez RB słabo tłumią laser (1/A ~162 μm), co prawdopodobnie wynika z rozpraszania. Z wykresu widm wynika, że w błonach nie dochodzi do znaczącej agregacji RB.
Klej różowy wiąże się trwale z jelitem po naświetleniu laserem (Rysunek 2), osiągając typowe maksymalne obciążenie w momencie zerwania wynoszące 0,9 ± 0,4 N (n=30). Wytrzymałość adhezyjną oszacowano jako maksymalne obciążenie podzielone przez powierzchnię klejenia, co wyniosło 15 ± 6 kPa (n=30). Klej różowy nienaświetlony wiązał się z tkanką znacznie słabiej (2 ± 2 kPa, n=30, nieparzysty test t p&lt;106). Anastomoza nerwu piszczelowego in-vivo została pomyślnie wykonana po zastosowaniu i związaniu kleju różowego przy użyciu zielonego lasera. Tydzień po operacji nerw poddany zabiegowi zachował ciągłość, a wytrzymałość naprawy wynosiła 17 ± 9 kPa (n=10).
<img alt="Aplikacja kleju z użyciem roztworu kleju różanego, ustawienie eksperymentalne pokazujące proces adhezji." src="/files/ftp_upload/4158/4158fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A) Roztwór RB-chitosan jest odlewany na płaską płytkę z Perspexu (grubość płytki ~5 mm). Pod płytką umieszczono papier milimetrowy, aby ułatwić etap odlewania na sucho. Nierozpuszczalna w wodzie błona powstaje dwa tygodnie po odlewaniu. B) Klej różany jest elastyczny i może być zwinięty w mały cylinder.
<img alt="Przekrój tkanki z klejem różanym; zaznaczona linia podziału; układ eksperymentalny dla badania adhezji tkankowej." src="/files/ftp_upload/4158/4158fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Klej różany jest związany z jelitem cielęcym po naświetlaniu laserem. Podczas wiązania tkanki stosuje się jednorodne naświetlanie kleju RB; jednak na tym zdjęciu pokazano wybrane punkty, aby zilustrować efekt fotowybielania laserem w kleju.
<img alt="Wykres widma absorpcyjnego klejów; długość fali vs. piki absorpcji przy 562 nm i 530 nm." src="/files/ftp_upload/4158/4158fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Widmo absorpcyjne (w jednostkach umownych) różowego kleju wykazuje dwa piki przy 530 i 562 nm. W związku z tym zielony laser (λ= 532 nm) jest silnie absorbowany przez klej podczas naświetlania laserem. Klej chitozanowy bez RB słabo absorbuje wiązkę lasera.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td> </td>
 <td>n</td>
 <td>Powierzchnia (mm2)</td>
 <td>Moc (W)</td>
 <td>Czas (s)</td>
 <td>Fluencja (J/cm2)</td>
 <td>I (W/cm2)</td>
 <td>Maks. obciążenie/Powierzchnia (kPa)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Klej+Laser</td>
 <td>30</td>
 <td>60 ± 10</td>
 <td>0.18 ± 0.03</td>
 <td>365 ± 5</td>
 <td>~110</td>
 <td>~0.9</td>
 <td>15 ± 1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Klej</td>
 <td>30</td>
 <td>60 ± 10</td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>NA</td>
 <td>2 ± 2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Legenda. n, liczba próbek; Area, powierzchnia kleju z róży (średnia ± błąd maksymalny); Power, moc lasera (średnia ± błąd maksymalny); Time, czas naświetlania (średnia ± błąd maksymalny); Fluence, średnia fluencja lasera; I, szacowane natężenie promieniowania; Max Load/Area, maksymalne obciążenie przy zerwaniu naprawionej tkanki podzielone przez powierzchnię kleju, (średnia ± SE).

<ol><li>O'Neill, A. C., Winograd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+anastomosis+using+a+photochemical+tissue+bonding+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Microvascular anastomosis using a photochemical tissue bonding technique.</a> Lasers Surg. Med. 39, 716-722 (2007).</li>
<li>Yao, M., Yaroslavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+is+not+associated+with+photochemical+tissue+bonding+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity is not associated with photochemical tissue bonding of skin.</a> Lasers Surg. Med. 42, 123-131 (2010).</li>
<li>Lauto, A., Mawad, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+Tissue+Bonding+with+Chitosan+Adhesive+Films%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering+OnLine%22%5BJournal%5D)">Photochemical Tissue Bonding with Chitosan Adhesive Films.</a> Biomedical Engineering OnLine. 9, 47(2010).</li>
<li>Chan, B. P., Kochevar, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+porcine+skin+graft+adherence+using+a+light-activated+process%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Surg.+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancement of porcine skin graft adherence using a light-activated process.</a> J. Surg. Res. 108, 77-84 (2002).</li>
<li>Lauto, A., Faster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sutureless+nerve+repair+with+laser-activated+chitosan+adhesive%3A+a+pilot+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Sutureless nerve repair with laser-activated chitosan adhesive: a pilot in vivo study.</a> Photomed. Laser Surg. 26, 227-234 (2008).</li>
<li>Lauto, A., Hook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chitosan+adhesive+for+laser+tissue+repair%3A+in+vitro+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Chitosan adhesive for laser tissue repair: in vitro characterization.</a> Lasers Surg. Med. 36, 193-201 (2005).</li>
<li>Au, V., Madison, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+singlet+oxygen+on+the+extracellular+matrix+protein+collagen%3A+oxidation+of+the+collagen+crosslink+histidinohydroxylysinonorleucine+and+histidine%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Effects of singlet oxygen on the extracellular matrix protein collagen: oxidation of the collagen crosslink histidinohydroxylysinonorleucine and histidine.</a> Arch. Biochem. Biophys. 384, 133-142 (2000).</li>
<li>Encinas, M. V., Rufs, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthene+dyes%2Famine+as+photoinitiators+of+radical+polymerization%3A+A+comparative+and+photochemical+study+in+aqueous+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Xanthene dyes/amine as photoinitiators of radical polymerization: A comparative and photochemical study in aqueous medium.</a> Polymer. 13, 2762-2767 (2009).</li>
<li>Pini, R., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+technique+for+the+closure+of+the+lens+capsule+by+laser+welding%5BTitle%5D)+AND+%22Ophtalmic+Surgery+Lasers+%26+Imaging%22%5BJournal%5D)">A new technique for the closure of the lens capsule by laser welding.</a> Ophtalmic Surgery Lasers & Imaging. 39, 260-2626 (2008).</li>
<li>Wieken, K., Angioi-Duprez, K., Lim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+anastomosis+with+glue%3A+comparative+histologic+study+of+fibrin+and+cyanoacrylate+glue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reconstr.+Microsurg%22%5BJournal%5D)">Nerve anastomosis with glue: comparative histologic study of fibrin and cyanoacrylate glue.</a> J. Reconstr. Microsurg. 19, 17-20 (2003).</li>
<li>Menovsky, T., Beek, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser%2C+fibrin+glue%2C+or+suture+repair+of+peripheral+nerves%3A+a+comparative+functional%2C+histological%2C+and+morphometric+study+in+the+rat+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Laser, fibrin glue, or suture repair of peripheral nerves: a comparative functional, histological, and morphometric study in the rat sciatic nerve.</a> J. Neurosurg. 95, 694-699 (2001).</li>
<li>García, P., Jorge, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+the+mechanical+behavior+of+a+cyanoacrylate+and+a+bioadhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mater.+Sci.+Mater.+Med%22%5BJournal%5D)">Comparative study of the mechanical behavior of a cyanoacrylate and a bioadhesive.</a> J. Mater. Sci. Mater. Med. 15, 109-115 (2004).</li>
<li>Lauto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+extracellular+matrix+with+chitosan+adhesive+film+for+sutureless+tissue+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+Surg.+Med%22%5BJournal%5D)">Integration of extracellular matrix with chitosan adhesive film for sutureless tissue fixation.</a> Lasers Surg. Med. 41, 366-371 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Wytwarzanie kleju różanego opiera się na prostym procesie odlewania na sucho, choć rozpuszczanie RB w niskim pH wymaga przedłużonego mieszania roztworu chitosanowego. Ważne jest, aby pozwolić roztworowi wyschnąć do momentu, gdy stanie się on nierozpuszczalną w wodzie błoną. Dzieje się to, gdy masowa zawartość wody w wysuszonej błonie wynosi ~10%6. Błony nierozpuszczalne otrzymuje się zazwyczaj 2 tygodnie po odlewaniu na sucho w standardowych warunkach temperatury i ciśnienia (~25 °C i ~1 atm). Mechanizm wiązan...

<table><tbody><tr><td>Bengała różowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>632-69-9</td><td> </td></tr><tr><td>Chitozan (średnia MW)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10318AJ</td><td> </td></tr><tr><td>Kwas octowy lodowaty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>08050051</td><td>2% v/v w wodzie DI</td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>Heidolph</td><td>MR Hei-Mix S</td><td> </td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allegra X-12R</td><td> </td></tr><tr><td>Spektrofotometr</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>Cary 4000 UV-Visible</td><td> </td></tr><tr><td>Laser</td><td>CNI Laser</td><td>MGL-532</td><td> </td></tr><tr><td>Mikrometr</td><td>Mitutoyo</td><td>Series 227</td><td> </td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>OPMI</td><td> </td></tr></tbody></table>

wytwarzanie i zastosowanie błon z błękitu bengalskiego i chitosanu w laserowej naprawie tkanek

Fabrication and Application of Rose Bengal-chitosan Films in Laser Tissue Repair

Fotochemiczne łączenie tkanek (PTB) to bezszwowa technika naprawy tkanek, którą osiąga się poprzez naniesienie roztworu błękitu różowego (RB) pomiędzy dwa brzegi tkanek1,2. Następnie są one naświetlane laserem, którego promieniowanie jest selektywnie absorbowane przez RB. Wynikające z tego reakcje fotochemiczne prowadzą prawdopodobnie do sieciowania włókien kolagenowych w tkance przy minimalnej emisji ciepła3. W niniejszym raporcie RB został włączony do cienkich błon chitozanowych w celu opracowania nowego, aktywowanego laserowo kleju tkankowego. Błony adhezyjne na bazie chitozanu zawierające ~0,1% masowych RB zostały wykonane i przyklejone do jelita cielęcego oraz nerwów piszczelowych szczura za pomocą lasera w stanie stałym (λ=532 nm, Fluence~110 J/cm2, rozmiar plamki~0,5 cm). Do badania wytrzymałości wiązania użyto tensjometru jednokolumnowego połączonego z komputerem osobistym. Klej RB-chitozan silnie wiąże się z jelitem z wytrzymałością 15 ± 6 kPa (n=30). Wytrzymałość adhezji spada do 2 ± 2 kPa (n=30), gdy laser nie jest stosowany do aktywacji kleju. Anastomozę nerwów piszczelowych można również przeprowadzić bez użycia szwów. Opracowano nowy klej chitozanowy, który wiąże się z tkanką fotochemicznie i nie wymaga stosowania szwów.

Do naprawy tkanek podczas procedur chirurgicznych zazwyczaj niezbędne są szwy. Jednak ich stosowanie może być problematyczne, ponieważ są one inwazyjne i mogą uszkodzić tkankę. W niniejszym opracowaniu przedstawiono metody wytwarzania i aplikacji nowatorskiego kleju tkankowego. Ta folia adhezyjna jest aktywowana laserowo i nie wymaga stosowania szwów.

Wytwarzanie i zastosowanie błon z błękitu bengalskiego i chitosanu w laserowej naprawie tkanek

Fotochemiczne wiązanie tkanek (PTB) to bezszwowa technika naprawy tkanek, realizowana poprzez aplikację roztworu błękitu różowego (RB) pomiędzy dwie...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie aktywowanego laserem kleju na bazie chitozanu oraz przedstawienie sposobu jego zastosowania podczas naprawy nerwów obwodowych. Osiąga się to poprzez uprzednie rozpuszczenie chitozanu i proszku bengoły różowej w roztworze kwasu octowego. Drugim krokiem procedury jest odparowanie rozpuszczalnika z wylanego roztworu w celu otrzymania cienkiej błony.Trzecim krokiem jest odsłonięcie nerwu szczura i jego wypreparowanie. W ostatnim etapie folię umieszcza się wokół wypreparowanego nerwu, a następnie naświetla zielonym laserem, aby związać folię z tkanką. Ostatecznie siłę wiązania folii różanej z tkanką mierzy się przy użyciu skalibrowanego tensiometru.Klej laserowy jest biokompatybilny i charakteryzuje się zaletą bezpośredniego wiązania z tkanką. Dzięki temu jest on bardzo użyteczny przy naprawie tkanek położonych głęboko i trudno dostępnych, gdzie zastosowanie szwów byłoby utrudnione. Wykazuje on również zaletę w naprawie tkanek, w których kluczowe jest zapewnienie wodoszczelnego zamknięcia, takich jak opona twarda lub jelita.Ważne jest, aby zaprezentować wizualnie technikę alto i adhezyjną, ponieważ przygotowanie adhezywu obejmuje kilka etapów, a sama procedura chirurgiczna wymaga szczególnej ostrożności podczas nakładania adhezywu na tkankę. Większość demonstracji przeprowadzi Matt Barton, student studiów podyplomowych w moim laboratorium, a operację chirurgiczną wykona profesor Marcus Studley z Quare University. Należy rozpocząć od przygotowania roztworu piasku Kita w kwasie octowym z dodatkiem błękitu bengalskiego.Roztwór kontrolny może po prostu nie zawierać różanego bengalu; należy przygotować roztwór, mieszając go magnetycznie w temperaturze pokojowej. Będzie on gotowy w ciągu około dwóch tygodni lub pięciu dni w przypadku kontroli bez różanego bengalu. W tym czasie pH wzrasta z około 2,6 do 3,9 w miarę rozpuszczania się chitosanu.Po przygotowaniu odwiruj roztwór w wirówce przez godzinę i oddziel go od osadu zanieczyszczeń. Podczas delikatnego odsysania należy uważać, aby nie naruszyć osadu. Za pomocą sterylnej strzykawki nanieś roztwór na płaską płytkę z pleksiglasu.Równomiernie rozprowadź roztwór, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Aby uzyskać warstwę o grubości około 13 mikronów, rozprowadź 1 ml roztworu na powierzchni 12 cm². Przykryj płytkę z Perspexu ekranem z folii aluminiowej, aby zapobiec fotoblaknięciu roztworu, pozostawiając jednak wystarczającą przestrzeń wentylacyjną do wyschnięcia filmu. Pozostaw roztwór do wyschnięcia w temperaturze i pod ciśnieniem pokojowym.Po wyschnięciu filmu należy użyć ciennej szpatułki, aby ostrożnie oddzielić go od płytki w celu przeprowadzenia testu. Jeśli klej jest suchy, należy wyciąć małą próbkę i umieścić ją w fiolce zawierającej wodę.Gdy błona jest nierozpuszczalna i nie pęcznieje makroskopowo, uznaje się ją za suchą. Zazwyczaj trwa to dwa tygodnie. Następnie należy zmierzyć grubość błony za pomocą mikrometru, używając czystych, ostrych nożyczek.Potnij folię na prostokątne paski o rozmiarze wymaganym do Twojej aplikacji. Przechowuj kawałki kleju różanego lub kleju kontrolnego pomiędzy sterylnymi szkiełkami przedmiotowymi owiniętymi w folię aluminiową, w temperaturze pokojowej. Przed zastosowaniem folii w aplikacji określ jej tłumienie optyczne.Osiąga się to poprzez zamocowanie niewielkiego fragmentu folii w kuwecie kwarcowej. Następnie, za pomocą spektrofotometru dwuwiązkowego, rejestruje się widmo osłabienia folii w zakresie od 400 do 800 nanometrów. Pomiary można zinterpretować zgodnie z prawem Lamberta-Beera, aby wyznaczyć drogę osłabienia, która będzie porównywalna z grubością folii.Do niniejszego protokołu jelito cielęce musi zostać pobrane natychmiast po eutanazji zwierzęcia i przechowywane w temperaturze -80°C. Rozmroź i nawodnij tkankę, zanurzając ją w wodzie dejonizowanej na 10 minut. Następnie podziel tkankę na sekcje o wymiarach 2 cm na 1 cm, używając skalpela z ostrzem nr 10 pod mikroskopem operacyjnym przy niskim powiększeniu.Utrzymuj sekcje w stanie wilgotnym, dodając krople wody, aby połączyć dwie sekcje. Umieść je jedna za drugą i wytrzyj nadmiar wody z powierzchni. Używaj patyczków bawełnianych oraz mikropincet.Naklej pasek różowej folii adhezyjnej w poprzek nacięcia na warstwie ciero. Upewnij się, że folia w pełni przylega do jelita. Przygotuj laser w stanie stałym z pompowaniem DDE, sprzężony z wielomodowym światłowodem.Upewnij się, że parametry lasera są ustawione prawidłowo. Następnie naświetl adhezyw. Wielkość plamki wiązki powinna wynosić około pięciu milimetrów w miejscu styku z plamką adhezywną w rzędzie; naświetlaj każdą część adhezywu przez około pięć sekund.Ostatecznie powierzchnię skanuje się kilkakrotnie przez około sześć minut. Wyjmij napromieniowaną próbkę. W celu oceny wytrzymałości wiązania tkanki.Zaciśnij próbkę w skalibrowanym jednoosiowym tensjometrze, używając uchwytów mechanicznych. Przesuwaj uchwyty z prędkością 22 mm/min aż do rozdzielenia obu kikutów tkanki w celu uzyskania kontroli.Nanieś klej różany na tkankę. Nie naświetlaj próbki i zmierz wytrzymałość wiązania tkanki. W tej procedurze błony kleju różanego muszą zostać wysterylizowane.Można to przeprowadzić, stosując 90% ethanol lub promieniowanie gamma. Uśpij szczura linii Wistar, podając 4% gazowy isofluorine, a następnie zmniejsz stężenie do 2%, gdy zwierzę przestanie reagować na bodziec bólowy. Przeprowadź test, np. uciśnięcie palca, a następnie ogól i zdezynfekuj udo szczura.Ustaw pacjenta do operacji pod mikroskopem operacyjnym, wykonaj skośne nacięcie skóry o długości około trzech centymetrów w części grzbietowo-bocznej prawego uda. Odsłoń nerw piszczelowy, stosując technikę rozdzielania mięśni pośladkowych za pomocą prostych mikronozyczek. Częściowo odpreparuj i przytnij powiekę nerwu piszczelowego.Nadmiar płynów należy wchłonąć za pomocą sterylnej gazy lub patyczków bawełnianych. Następnie należy przeciąć nerw piszczelowy za pomocą mikropincety. Pod nerwem piszczelowym należy umieścić sterylny plastery przylepny Rose.Następnie należy przybliżyć końce kikutów nerwowych do siebie, kładąc je na pasku kleju Rose. Ważne jest, aby nerwy nie były poddawane napięciu. Pasek w pełni przylgnie do nerwu, tworząc obręcz, która może pomóc w rotacji nerwu.Podczas naświetlania laserem należy aktywować klej rose za pomocą lasera, zgodnie z wcześniejszym opisem. Na koniec zamknąć mięśnie i skórę za pomocą szwów 3-0 i zastosować standardowe protokoły pooperacyjne w celu rekonwalescencji szczura. Postępując zgodnie z opisanym protokołem.Otrzymane filmy mają jasnoróżowy kolor, są cienkie i posiadają gładką powierzchnię. Filmy są również elastyczne i mogą być zwijane w rurki o małej średnicy bez powodowania pęknięć ani innych widocznych uszkodzeń. Klej różowy wykazuje dwa piki absorpcji przy 530 i 562 nanometrach.Zielony laser jest zatem silnie pochłaniany przez adhezyw, a odpowiadająca mu długość tłumienia przy 532 nanometrach wynosi około 12 mikronów. W przeciwieństwie do nich, błony Esan bez RB tłumią laser słabo. Różowy adhezyw trwale wiąże się z jelitem pod wpływem naświetlania laserowego, osiągając typowe maksymalne obciążenie przy zerwaniu na poziomie około jednego Newtona.Wytrzymałość adhezyjną oszacowano jako maksymalne obciążenie podzielone przez powierzchnię adhezji. Klej z róży niepoddany naświetlaniu wiązał się z tkanką w stopniu znacznie niższym. Ważne jest, aby suszyć keto i klej do momentu, aż staną się całkowicie nierozpuszczalne w wodzie.Proces ten trwa około dwóch tygodni. Ponadto, podczas przygotowywania spoiwa niezbędne są kwasy, którymi należy operować w dygestorium. Należy również pamiętać, że w procedurze tej wykorzystuje się lasery, które mogą być bardzo niebezpieczne, dlatego przez cały czas należy nosić okulary ochronne do laserów.

fabrication-application-rose-bengal-chitosan-films-laser-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Produkcja i zastosowanie filmów z Bengalskiego Różańca i chitozanu w naprawie tkanek laserowych

Opisano proces wytwarzania nowego, elastycznego chirurgicznego kleju w formie cienkiej warstwy z zatwierdzonych przez FDA składników: chitosanu oraz zieleni indocyjaninowej. Zademonstrowano wiązanie tego kleju z tkanką kolagenową poprzez prosty proces aktywacji z użyciem niskomocnego lasera podczerwonego.

SurgiLux: przygotowanie i demonstracja aktywowanej laserowo cienkiej powłoki chirurgicznego kleju na bazie chitosanu

Główną przeszkodą w obecnych terapiach komórkami macierzystymi jest określenie najskuteczniejszej metody dostarczania tych komórek do tkanek gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy metodę dostarczania opartą na chitosanie, która jest wydajna i prosta w zastosowaniu, a jednocześnie pozwala komórkom macierzystym pochodzącym z tkanki tłuszczowej zachować ich wielopotencjalność.

Konstrukcja hydrożelu kolagenowego do dostarczania mikrosfer chitozanowych obciążonych komórkami macierzystymi

Niniejszy artykuł opisuje podejście w zakresie biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności spolaryzowanych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych filmów, które mogą zostać funkcjonalizowane komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię wytwarzania tych filmów, a także ich podstawowe zastosowania w tworzeniu interaktywnych, biofunkcjonalizowanych powierzchni dla aplikacji typu lab-on-a-chip.

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Ten protokół ma na celu złagodzenie ograniczeń związanych z nieprawidłowym przeszczepem komórek macierzystych w leczeniu zawałów mięśnia sercowego za pomocą systemu hydrożelowego i kleju na bazie fibryny. Dzięki takiemu podejściu można utrzymać kontakt komórka-tkanka po zawale choroby, zwiększając potencjał terapeutyczny korzystnych środków w miejscu urazu.

Konstrukt hydrożelowy i podejście oparte na kleju na bazie fibryny w celu dostarczania leków w mysim modelu zawału mięśnia sercowego.

Przygotowano rusztowanie do wstrzykiwań inżynierii tkankowej składające się z mikrocząsteczek poli(N-izopropylacrylamidu)-siarczanu chondroityny (PNIPAAm-g-CS)-zawierającego poli(N-izopropylacrylamid). W tym badaniu analizowana jest siła adhezji, właściwości pęcznienia i biokompatybilność in vitro. Opracowane tutaj techniki charakterystyki mogą mieć zastosowanie do innych systemów termożelowania.

Synteza termożelujących kompozytów siarczanowych poli(N-izopropylacyloamidu)-grafto-chondroityny z mikrocząstkami alginianowymi dla inżynierii tkankowej

Elektroforeza kapilarna bez roztworu jest szybką, tanią i solidną metodą analityczną, która umożliwia ilościowe monitorowanie reakcji chemicznych w czasie rzeczywistym. Jego przydatność do szybkiej, wygodnej i precyzyjnej analizy została tutaj zademonstrowana poprzez analizę szczepienia peptydów kowalencyjnych na foliach chitozanu w celu poprawy adhezji komórek.

Elektroforeza kapilarna do monitorowania szczepienia peptydów na warstwach chitozanu w czasie rzeczywistym

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli sferoidów komórek ludzkiego więzadła przyzębia (PDL) za pomocą filmów chitozanowych. Hodowla trójwymiarowych (3D) sferoid komórkowych stanowi alternatywę dla konwencjonalnego systemu hodowli polistyrenowych do hodowli tkankowych (TCPS).

Tworzenie sferoid ludzkich komórek więzadeł przyzębia na błonach chitozanu

Obecny protokół opisuje nieopartą na emulsji metodę wytwarzania mikrożeli chitozanowo-genipinowych. Wielkość tych mikrożeli może być precyzyjnie kontrolowana i mogą one wykazywać pęcznienie zależne od pH, ulegać degradacji in vivo i być naładowane cząsteczkami terapeutycznymi, które uwalniają się z czasem w sposób ciągły, co czyni je bardzo istotnymi dla zastosowań inżynierii tkankowej.

Wytwarzanie mikrożeli chitozanowo-genipinowych o kontrolowanej wielkości i wolnych od emulsji do zastosowań w inżynierii tkankowej

Mechanicznie izolowana frakcja naczyniowa zrębu (SVF) w połączeniu z hydrożelem fibrynowym oferuje łatwy i skuteczny nośnik dla żywotnych komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej dla różnych wskazań, w tym inżynierii tkankowej i/lub gojenia się ran. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie mechanicznego konstruktu hydrożelowego SVF (mSVF)-fibryna do badań translacyjnych i zastosowań klinicznych.

Połączenie mechanicznie izolowanej frakcji zrębu naczyniowego i hydrożelu fibrynowego: protokół przetwarzania

To badanie przedstawia model laboratoryjny przeznaczony do oceny kompatybilności materiałów do opatrunków z podciśnieniowymi systemami leczenia ran poprzez ocenę ciśnienia i zbierania płynów przez 72 godziny przy ciągłych i przerywanych ustawieniach ciśnienia.

Opracowanie modelu laboratoryjnego do oceny kompatybilności materiałów opatrunkowych z podciśnieniowymi systemami leczenia ran

Przedstawiono protokół powtarzalny do przygotowania, wzbogacania i zastosowania in situ żelu żelatynowo-ryboflawinowego krzyżowalnego światłem niebieskim do naprawy ran stromalnych rogówki u królików, w tym kroki proceduralne dotyczące postępowania chirurgicznego, częściowej tarzoraphii i opieki pooperacyjnej.

Produkcja i chirurgiczne zastosowanie wzbogaconych żeli żelatynowych przekształconych światłem i riboflawiny do naprawy ran rogówki u królików

Naucz się wytwarzać laserowo-aktywowane kleje chitozanowe do naprawy tkanek. Ta metoda minimalizuje uszkodzenia tkanek w porównaniu do tradycyjnych szwów chirurgicznych.

Wytwarzanie i zastosowanie błon z błękitu bengalskiego i chitosanu w laserowej naprawie tkanek

Przeglądaj więcej filmów