Bezsoczewkowa mikroskopia tomograficzna na chipie wykorzystująca oświetlenie pod wieloma kątami i superrozdzielczość pikseli
16 sierpnia 2012
Tomografia optyczna bez soczewek to trójwymiarowa technika mikroskopowa, która oferuje rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm w wymiarach x, y i z, odpowiednio, na dużej objętości obrazowania 15-100 mm3, co może być szczególnie przydatne do integracji z platformami lab-on-a-chip.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie trójwymiarowego obrazowania próbki biologicznej bez soczewek na chipie w dużej objętości obrazu. Osiąga się to poprzez uprzednie umieszczenie próbki bezpośrednio na chipie czujnika i zapewnienie częściowo spójnego oświetlenia. Drugim krokiem jest przesunięcie w bok źródła światła w różnych pozycjach do nagrywania.
Subpiksele przesunęły holograficzne obrazy próbki. Przesunęły się kolejne subpiksele. Obrazy holograficzne są rejestrowane przy wielokrotności oświetlenia do obrazowania tomograficznego.
Ostatnim etapem jest przetwarzanie danych, w którym pozyskany zestaw danych jest cyfrowo rekonstruowany, aby ostatecznie uzyskać trójwymiarowe obrazy tomograficzne próbki. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna mikroskopia świetlna, jest to, że zapewnia ona obrazowanie o wysokiej przepustowości w kompaktowej architekturze. To sprawia, że nasza platforma jest szczególnie przydatna do integracji z platformami chipowymi Lebanon.
W niniejszym raporcie opisano podstawową konfigurację obrazowania dla implementacji laboratoryjnej w kierunku tomografii próbek statycznych. Monochromator z lampą ksenonową został dostosowany tak, aby zapewnić wyjście o szerokości widmowej od około 1 do 10 nanometrów wokół środkowej długości fali od 450 do 650 nanometrów. Ta częściowo koherentna moc wyjściowa jest następnie sprzężona ze światłowodem wielomodowym, aby dostarczyć częściowo spójne światło do systemu.
Światłowód jest zamontowany na zmotoryzowanym stopniu obrotowym w celu zmiany kąta oświetlenia. Zmotoryzowany stopień z dołączonym źródłem światła jest zamontowany na dwuwymiarowym liniowym stoliku XY, który służy do uzyskania w sposób prosty przesunięć źródła światła pod danym kątem w celu detekcji. Używany jest układ czujników A-C-M-O-S o rozdzielczości pięciu megapikseli i rozmiarze piksela 2,2 mikrona.
Detektor służy do rejestrowania obrazów holograficznych próbek o szerokim polu widzenia. Bardzo ważne jest, aby matryca czujników była umieszczona w tej samej płaszczyźnie osiowej, co oś obrotu źródła światła, aby upewnić się, że sprawdzamy, czy czujnik otrzymuje wystarczającą ilość światła przy dużych kątach oświetlenia. Podczas gdy bezsoczewkowa tomografia optyczna może obrazować różne obiekty, takie jak komórki i mikroorganizmy, podstawowe zasady są tutaj demonstrowane, wykonując trójwymiarową mikroskopię próbki Sea Elgan za pomocą skalpela lub szpatułki.
Weź mały kawałek AGA z szalki Petriego zawierającej kulturę organów uszczelniających. Sześcienny kawałek o długości kilku milimetrów wzdłuż każdego wymiaru będzie zawierał setki nicieni. Umieść mały kawałek agaru w polipropylenowej fiolce zawierającej jeden mililitr wody dejonizowanej.
Delikatnie wiruj przez 30 sekund do jednej minuty. Po 10 do 15 minutach robak powinien wypełznąć z agaru do wody dejonizowanej. Zauważ, że robaki są zbyt małe, aby zobaczyć je tutaj, aby tymczasowo unieruchomić robaki i jeden mililitr od pięciu do 10 milimolowych.
Więc rozwiąż i poczekaj 10 minut. Pobrać pipetę z dnem fiolki o objętości od pięciu do 10 mikrolitrów i umieścić na kanapce między dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Ta próbka zawierająca dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych robaków może zostać umieszczona na detektorze w celu rozpoczęcia zbierania danych.
W celach demonstracyjnych w tej sekcji podsumowano etapy akwizycji obrazu dla typowej tomografii optycznej bez soczewek lub eksperymentu LOT, jednak cały proces został zautomatyzowany przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu widoku laboratoryjnego. Aby rozpocząć kroki ręczne, ustaw początkowy kąt obrotu stage na minus 50 stopni, gdzie zero stopni odpowiada pionowemu położeniu źródła światła. Ustaw początkową pozycję stolika XY na zero zero, które jest pozycją wyjściową.
Dostosuj czas naświetlania detektora, aby jak najlepiej wykorzystać jego zakres dynamiczny, tak aby obraz był jak najbardziej jasny bez nasyconych pikseli bez zmiany kąta obrotu stage. Uchwyć dziewięć obrazów dla każdego obrazu. Przesuń stolik XY do nowej pozycji w kwadratowej siatce trzy na trzy, tak aby każdy obraz przesunął się o około jedną czwartą piksela w porównaniu z poprzednim.
Uzyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem może poprawić rozdzielczość w zależności od typu obiektu i stosunku sygnału do szumu. Po zebraniu dziewięciu obrazów pod początkowym kątem ustaw pozycję stolika XY z powrotem do pozycji zerowej. Następnie zwiększaj kąt obrotu stopnia o dwa stopnie, aż do osiągnięcia dodatnich 50 stopni.
Po każdym kroku przy każdym nowym kącie powtórz opisane kroki. Przyrosty kątowe mogą być drobniejsze lub grubsze w zależności od optymalizacji czasu akwizycji w porównaniu z rozdzielczością obrazowania. Po zebraniu danych pozyskiwany jest zestaw 459 obrazów, które zawierają dziewięć obrazów z przesunięciem subpikseli dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia.
Każdy zestaw dziewięciu obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów super rozdzielczości pikseli w celu uzyskania jednej projekcji o wysokiej rozdzielczości. Wynik superpiksela hologramu na kąt jest następnie rekonstruowany cyfrowo w celu uzyskania 51 obrazów projekcyjnych. Przetwarzanie danych jest pokazane tutaj za pomocą laptopa.
Rekonstrukcja zajęłaby mniej niż jedną sekundę dla uzyskania pełnego pola widzenia przy użyciu procesorów graficznych. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie ponownie wyświetlany za pomocą wtyczki Tom OJA. W przypadku obrazu J obrazy projekcyjne są najpierw ładowane do obrazu J, po czym wywoływana jest wtyczka Tom OJ.
Tabela przeglądowa, która określa kąt widzenia dla każdego obrazu projekcji, jest wczytywana do OJ. Za pomocą metody projekcji ważonej wstecznej można uzyskać trójwymiarowe obrazy tomograficzne próbki. Pokazano tutaj duże pole widzenia bezsoczewkowej tomografii optycznej, ponieważ próbka jest umieszczana bezpośrednio na górze układu detektora. Holograficzne obrazy obiektów mogą być rejestrowane w polu widzenia o powierzchni 24 milimetrów kwadratowych, które można dodatkowo zwiększyć za pomocą pojawiających się układów detektorów o większych obszarach aktywnych.
Chociaż rozmiar piksela matrycy detektorów ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki super rozdzielczości pikseli łagodzą ten problem, pokazane tutaj są hologramy o super rozdzielczości pikseli, wraz ze zrekonstruowanymi obrazami projekcyjnymi, które oferują submikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia. Obrazy projekcyjne mogą być łączone przy użyciu technik rekonstrukcji obrazu tomograficznego w celu obliczenia podłoża TOM próbki. Pokazano tutaj trzy obrazy przekroju w płaszczyźnie XY przechodzącej przez przednią część robaka, gdzie rurka gardłowa jest widoczna tylko w przekroju przez Z równa się ośmiu mikronom, jak można się spodziewać po tej z grubsza cylindrycznej strukturze o przybliżonej średnicy zewnętrznej pięciu mikronów.
Co więcej, obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie XZ wyraźnie pokazuje granice robaka i rurki gardłowej wewnątrz, demonstrując udane obrazowanie 3D gardła. Wraz z jej opracowaniem, technika ta może utorować naukowcom drogę do wykonywania mikroskopii trójwymiarowej na dziesiątkach milimetrowych probówek o objętości obrazowania. Dlatego tomografia optyczna bez soczewek może być użytecznym narzędziem do zastosowań obrazowania o wysokiej przepustowości na platformach chipowych w Libanie.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia bezsoczewkową tomografię optyczną, trójwymiarową technikę mikroskopii umożliwiającą obrazowanie preparatów biologicznych z wysoką rozdzielczością. Metoda ta pozwala na obrazowanie dużych objętości, co czyni ją odpowiednią do integracji z platformami typu lab-on-a-chip.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Obrazowanie biologiczne
- Techniki mikroskopowe
Wstęp
- Bezsoczewkowa tomografia optyczna zapewnia rozdzielczość przestrzenną <1 μm × <1 μm × <3 μm.
- Technika ta umożliwia obrazowanie objętości od 15-100 mm³.
- Jest ona szczególnie korzystna w zastosowaniach w technologiach lab-on-a-chip.
- Metoda ta wykorzystuje oświetlenie częściowo koherentne do obrazowania.
Cel badania
- W celu uzyskania bezsoczewkowego obrazowania trójwymiarowego preparatów biologicznych.
- W celu zbadania integracji tej techniki z platformami typu lab-on-a-chip.
- W celu zwiększenia możliwości obrazowania w dużych objętościach.
Zastosowane metody
- Umieszczenie próbki bezpośrednio na chipie sensora.
- Wykorzystanie oświetlenia częściowo koherentnego.
- Lateralne przesuwanie źródła światła w celu rejestracji obrazów holograficznych przesuniętych o wartości subpikselowe.
- Rejestracja wielu obrazów holograficznych do obrazowania tomograficznego.
Główne wyniki
- Skuteczne obrazowanie preparatów biologicznych w trzech wymiarach.
- Demonstracja wysokich możliwości rozdzielczości przestrzennej.
- Efektywna integracja z platformami lab-on-a-chip.
- Walidacja metody poprzez różnorodne testy obrazowania.
Wnioski
- Bezsoczewkowa tomografia optyczna jest obiecującą techniką obrazowania biologicznego.
- Metoda ta oferuje znaczące zalety w zakresie rozdzielczości przestrzennej i objętości obrazowania.
- Przyszłe zastosowania mogą objąć różne dziedziny badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Bezsoczewkowa tomograficzna mikroskopia na chipie umożliwia wysokoprzepustowe, bezznakowe obrazowanie 3D preparatów biologicznych w dużych objętościach bez zastosowania masywnej optyki, co wspiera integrację z platformami mikrofluidycznymi i systemami lab-on-a-chip. Podejście to zmniejsza rozmiary i koszt aparatury przy zachowaniu rozdzielczości submikronowej, eliminując wąskie gardła w przepustowości próbek i kompatybilności testów na etapie odkryć. Technologia ta zwiększa pewność prognostyczną w ramach wczesnej walidacji celów, dostarczając ilościowych, rozdzielczych w głębokości danych strukturalnych do przesiewania fenotypowego i redukcji ryzyka mechanistycznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez trójwymiarową wizualizację strukturalną fenotypów komórkowych i organelli subkomórkowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera obrazowanie żywych preparatów bez użycia znaczników, co redukuje artefakty przygotowania i pozwala zachować naturalną biologię w badaniach nad oddziaływaniem z celem molekularnym.
- Wartość prognostyczna: Generuje ilościowe dane wolumetryczne w celu wyjaśnienia mechanizmu działania oraz minimalizacji ryzyka związanego ze ścieżkami sygnałowymi celu we wczesnej fazie odkrywania leków.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Zapewnia obrazowanie 3D o rozdzielczości submikronowej w szerokich polach widzenia, co umożliwia wysokoprzepustowy screening fenotypowy mikroorganizmów i populacji komórkowych.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania soczewek i złożonej optyki, standaryzując procesy obrazowania w celu opracowania powtarzalnych i skalowalnych testów.
- Gotowość do analizy: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do późniejszej oceny związków dzięki zautomatyzowanemu, wysokoprzepustowemu pozyskiwaniu danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną, zapewniając spójne obrazowanie 3D w różnych systemach modelowych, takich jak *C. elegans* i embriony rybek zebrafish.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia podłużne śledzenie zmian strukturalnych w systemach istotnych dla danej jednostki chorobowej, co wspiera dopasowanie biomarkerów i podejmowanie decyzji o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka.
- Wierność modelu przedklinicznego: Zachowuje natywną architekturę i dynamikę tkanek, co poprawia możliwości translacji wyników z kontekstów in vitro do in vivo.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnej biologii po identyfikację związków wiodących – wspierając testowanie hipotez, standaryzację testów i analitykę ilościową bez konieczności rozbudowanego przetwarzania lub znakowania próbek.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację 3D fenotypów strukturalnych w niezakłóconych systemach biologicznych.
- Screening: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne obrazowanie z wynikami ilościowymi do porównywania warunków kontrolnych i badawczych w dużych populacjach próbek.
- Analityka: Generuje tomograficzne rekonstrukcje z rozdzielczością głębokości oraz obrazy projekcyjne, które ułatwiają statystyczne porównanie cech morfologicznych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość badań przedklinicznych poprzez obrazowanie organizmów modelowych istotnych dla danej choroby z jednolitym rozdzielczeniem i zakresem objętościowym.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma obrazowania kompatybilna z różnymi typami próbek i formatami mikroprzepływowymi, co ogranicza nadmiarowe inwestycje w technologię.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną dzięki bezetykietowemu obrazowaniu 3D o wysokiej rozdzielczości, co redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i skalowalność dzięki konstrukcji bezsoczewkowej, zautomatyzowanemu pozyskiwaniu obrazów oraz kompatybilności z matrycami sensorów o dużym formacie.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania anomalii fenotypowych, co redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach oraz nieefektywność kapitałową.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez dostarczanie ilościowych, wieloparametrycznych danych obrazowych do obiektywnego porównywania kandydatów terapeutycznych.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu obrazowania obliczeniowego, holografii oraz algorytmów rekonstrukcji tomograficznej.
- Zależne od zastosowania matryc sensorów CMOS/CMOS o wysokiej rozdzielczości oraz zmotoryzowanych układów oświetlenia do przechwytywania danych pod wieloma kątami.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów oświetlenia, ustawień ekspozycji oraz procedur przesuwania subpikselowego pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja w różnych systemach modelowych może wymagać optymalizacji metod przygotowania i immobilizacji próbek w celu utrzymania ich żywotności podczas obrazowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość na współczynnik załamania światła i właściwości rozpraszania próbki, co może wpływać na stosunek sygnału do szumu w przypadku preparatów gęstych lub silnie absorbujących.
