Name: Bezsoczewkowa mikroskopia tomograficzna na chipie wykorzystująca oświetlenie pod wieloma kątami i superrozdzielczość pikseli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Poznaj bezsoczewkową mikroskopię tomograficzną na chipie z oświetleniem pod wieloma kątami i superrozdzielczością pikseli. Technika umożliwia trójwymiarowe obrazowanie próbek biologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Konfiguracja obrazowania
LOT może być zbudowany w kompaktowej i lekkiej architekturze przenośnej 8 lub alternatywnie jako mikroskop optofluidyczny z możliwością obrazowania przekrojowego. 9 W niniejszym raporcie opiszemy jednak podstawowy układ obrazowania w implementacji laboratoryjnej do tomografii próbek statycznych.
<ol>
 <li>Moduł oświetlenia: W LOT można wykorzystać częściowo koherentne źródła światła, takie jak diody emitujące światło (LED). Dla zapewnienia elastyczności eksperymentalnej zastosowaliśmy monochromator z lampą ksenonową (Cornerstone T260, Newport Corp.). Monochromator został dostrojony tak, aby zapewnić sygnał wyjściowy o szerokości spektralnej ~1-10 nm wokół długości fali centralnej, np. 450-650 nm. Ten częściowo koherentny sygnał jest następnie sprzęgany z wielomodowym światłowodem (Thorlabs AFS105/125Y), aby dostarczyć częściowo koherentne światło do układu. 
Światłowód jest zamontowany na zmotoryzowanym stole obrotowym (Thorlabs PRM-1Z8 sterowanym przez kontroler Thorlabs TDC001) w celu zmiany kąta oświetlenia. Zmotoryzowany stół wraz z przymocowanym źródłem światła jest zamontowany na dwuwymiarowym stole liniowym X-Y (Newport ILS50CC sterowanym przez kontrolery Newport MFA-PPD), który służył do uzyskania przesunięć źródła światła w płaszczyźnie przy danym kącie. </li>
<li>Detekcja: Bezoptyczna tomografia optyczna jest technologią skalowalną, dzięki czemu macierz detektora może być dobrana zgodnie z wymaganiami aplikacji bez znaczącej zmiany etapów akwizycji obrazów lub przetwarzania danych. W niniejszym raporcie zastosowaliśmy macierz czujników CMOS o rozdzielczości 5 Mega Pixels i rozmiarze piksela 2.2 μm (IDS Imaging, UI-1485LE-M). Detektor służy do rejestracji obrazów holograficznych próbek o szerokim polu widzenia (np. 24 mm2), które były umieszczane bezpośrednio na górnej powierzchni obszaru aktywnego detektora. W przypadku implementacji układu tomografii dwuosiowej 7, detektor powinien być również zamontowany na poziomym (względem stołu optycznego) stole obrotowym (np. Thorlabs RP-01), aby obracać próbkę (wraz z detektorem) w płaszczyźnie prostopadłej do osi optycznej. 7</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
Choć bezsoczewkowa tomografia optyczna pozwala na obrazowanie różnych obiektów, takich jak komórki i mikroorganizmy, zilustrujemy jej podstawowe zasady, wykonując mikroskopię trójwymiarową próbki C. elegans.
<ol>
 <li>Za pomocą skalpela lub szpatułki pobierz mały fragment agaru z szalki Petri zawierającej hodowlę C. elegans. Sześcian o boku kilku milimetrów będzie zawierał setki nicieni. </li>
 <li>Umieść mały kawałek agaru w probówce polipropylenowej zawierającej 1 ml wody dejonizowanej (DI). </li>
 <li>Delikatnie mieszaj na wortexie przez 0,5-1 min i odczekaj 10-15 min, aż nicienie wypełzną z fragmentu agaru do wody DI.</li>
 <li>Aby tymczasowo unieruchomić nicienie, dodaj 1 ml 5-10 mM roztworu lewamisolu (Sigma-Aldrich) i odczekaj 10 min.</li>
 <li>Pobierz pipetą 5-10 μl próbki z dna probówki i umieść ją pomiędzy dwoma szkiełkami nakrywkowymi. Próbkę tę, zawierającą dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych nicieni (np. 50-100 osobników), można umieścić na detektorze, aby rozpocząć akwizycję danych.
 </li>
</ol>
3. Pozyskiwanie danych
W niniejszym rozdziale podsumowujemy etapy akwizycji obrazów dla typowego eksperymentu LOT, który został zautomatyzowany przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu LabView.
<ol>
 <li>Ustaw kąt początkowy stolika obrotowego na -50 °, gdzie 0° odpowiada pozycji pionowej źródła światła.</li>
 <li>Ustaw pozycję początkową stolika X-Y na (0,0), co stanowi pozycję domyślną (HOME).</li>
 <li>Dostosuj czas ekspozycji detektora w celu optymalnego wykorzystania jego zakresu dynamicznego, tak aby obraz był jak najjaśniejszy, ale bez nasyconych pikseli. </li>
 <li>Bez zmiany kąta stołu obrotowego należy zarejestrować 9 obrazów. Dla każdego obrazu przesuń stół X-Y do nowej pozycji w siatce kwadratowej 3x3 w taki sposób, aby każdy obraz był przesunięty o około jedną czwartą piksela w stosunku do poprzedniego. Pozyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem, np. w 6μsiatka 6, co może poprawić rozdzielczość w zależności od rodzaju obiektu i stosunku sygnału do szumu (SNR). 10</li>
 <li>Ustaw pozycję początkową stolika X-Y na (0,0), co odpowiada pozycji domyślnej (HOME).</li>
 <li>Zwiększaj kąt stołu obrotowego w odstępach wynoszących 2°, aż do osiągnięcia +50°Po każdym przyroście, t. j. Przy każdym nowym kącie powtórz kroki 3–5. Przyrosty kątowe mogą być mniejsze lub większe, w zależności od optymalizacji czasu akwizycji względem rozdzielczości obrazowania.</li>
 <li>(Krok opcjonalny w przypadku zastosowania schematu tomografii dwuosiowej) Obrócić poziomy stół, na którym zamontowany jest detektor, o 90°Następnie powtórzyć kroki 1–6.</li>
</ol>
4. Analiza danych
Po wykonaniu kroków 1–6 opisanych w sekcji 3, pozyskiwany jest zestaw 459 obrazów, który zawiera 9 obrazów przesuniętych o ułamek piksela dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia. Najpierw każdy zestaw 9 obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów super-rozdzielczości pikselowej 10, aby uzyskać jeden hologram projekcyjny o wysokiej rozdzielczości (HR) na każdy kąt. Należy zauważyć, że super-rozdzielczość pikselowa odnosi się do pokonania ograniczeń wynikających z rozmiaru piksela, a nie z limitu dyfrakcyjnego, w zakresie rozdzielczości przestrzennej obrazów bezsoczewkowych. Hologramy o super-rozdzielczości pikselowej są następnie rekonstruowane cyfrowo 7-10 w celu uzyskania 51 obrazów projekcyjnych. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie poddawany retrospekcji (back-projection) za pomocą TomoJ, wtyczki do programu ImageJ (otwartego oprogramowania do analizy obrazów). 11 Operacja retrospekcji generuje trójwymiarowy obraz (tomogramy) próbki. Chociaż nie zostało to tutaj zaimplementowane, można by również wykorzystać schemat tomografii dwuosiowej, jak opisano w ref. 7. W tym schemacie drugi zestaw tomogramów uzyskuje się poprzez obrót źródła światła wzdłuż osi ortogonalnej względem pierwszej osi obrotu, co dostarcza więcej informacji przestrzennych o próbce i poprawia rozdzielczość osiową. 
5. Reprezentatywne wyniki
Duże pole widzenia (FOV) bezsoczewkowej tomografii optycznej przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ próbka jest umieszczana bezpośrednio na górnej powierzchni matrycy detektora, obrazy holograficzne obiektów mogą być rejestrowane w polu FOV o powierzchni 24 mm2, które może zostać dodatkowo zwiększone dzięki nowym matrycom detektorów o większych obszarach aktywnych.
Choć rozmiar piksela matrycy detektora ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki super-rozdzielczości pikselowej pozwalają zniwelować ten problem. Rycina 2 przedstawia hologramy o zwiększonej rozdzielczości pikselowej wraz z obrazami zrekonstruowanymi (t.j. obrazami projekcyjnymi), które oferują podmikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia.
Obrazy projekcyjne można połączyć, stosując techniki tomograficznej rekonstrukcji obrazu (np. filtrowaną projekcję wsteczną), aby obliczyć tomogramy (t.j. obrazy trójwymiarowe) preparatu. Rysunek 3 przedstawia trzy obrazy przekrojów w płaszczyźnie x-y przez przednią część nicienia, gdzie rurka gardzielowa jest widoczna tylko w przekroju przez z=8 μm, co jest spodziewane w przypadku tej w przybliżeniu cylindrycznej struktury o średnicy zewnętrznej ~5 μm. Ponadto obraz przekroju poprzecznego w płaszczyźnie x-z (wstawka w górnym panelu Rysunku 3) wyraźnie pokazuje granice nicienia oraz znajdującą się wewnątrz rurkę gardzielową (wskazaną strzałkami), co potwierdza pomyślne obrazowanie trójwymiarowe gardzieli.
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig1.jpg" alt="Obraz mikroskopowy bakterii z widocznymi wzorami wzrostu; analiza mikrobiologiczna, wskaźnik skali 1mm." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1 przedstawia pełny obraz holograficzny pola widzenia (24 mm2) zarejestrowany przy użyciu zestawu do bezsoczewkowej tomografii optycznej (LOT) z oświetleniem pionowym. Dzięki dużej powierzchni obrazowania LOT, wiele nicieni można obrazować jednocześnie w jednym kroku akwizycji danych. 
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig2.jpg" alt="Analiza zakrzywionej osłony, kąty θ=-40°, 0°, +40°, obrazowanie eksperymentalne, porównanie mikroskopowe." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2 przedstawia hologramy o super-rozdzielczości pikselowej (lewy panel) oraz cyfrowo zrekonstruowane obrazy projekcyjne (prawy panel) dla nicienia C. elegans (wycinek z szerokiego pola widzenia) przy trzech różnych kątach oświetlenia. Każdy obraz projekcyjny zawiera informacje dotyczące innego kąta widzenia, co umożliwia obliczenie struktury 3D poprzez operację filtrowanej projekcji wstecznej.
<img src="/files/ftp_upload/4161/4161fig3.jpg" alt="Schemat mikroskopowy nicienia na różnych poziomach z; pokazano przednią i tylną część wraz z paskiem skali." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3 przedstawia obliczone tomogramy nicienia C. elegans z Ryciny 2. (Górny rząd) pokazuje obraz przekroju całego nicienia przy z=3 μm. Wstawka przedstawia obraz przekroju poprzecznego przedniej części nicienia. Pasek skali na wstawce wynosi 50 μm. (Dolny rząd) przedstawia trzy obrazy przekrojów przez przednią część nicienia, demonstrując zdolność do sekcjonowania optycznego w bezsoczewkowej tomografii optycznej. Strzałki na całej rycinie wskazują ten sam punkt na rurce gardłowej nicienia. Do porównania wizualnego dołączono również obraz mikroskopowy (x40, 0.65-NA).

<ol><li>Schmitt, J. M. Optical coherence tomography (OCT): a review, J. Sel. Top. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchmitt%2C+JM+%22Quant.+Elect%22">Quant. Elect</a>. 5, 1205-1215 (1999).</li>
<li>Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+zebrafish+early+embryonic+development+by+scanned+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy.</a> Science. 322, 1065-1069 (2008).</li>
<li>Sharpe, J., Ahlgren, U., Perry, P., Hill, B., Ross, A., Hecksher-Sørensen, J., Baldock, R., Davidson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Projection+Tomography+as+a+Tool+for+3D+Microscopy+and+Gene+Expression+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical Projection Tomography as a Tool for 3D Microscopy and Gene Expression Studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li>
<li>Sung, Y., Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+diffraction+tomography+for+high+resolution+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical diffraction tomography for high resolution live cell imaging.</a> Opt. Exp. 17, 266-277 (2009).</li>
<li>Debailleul, M., Simon, B., Georges, V., Haeberle, O., Lauer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holographic+microscopy+and+diffractive+microtomography+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Meas.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Holographic microscopy and diffractive microtomography of transparent samples.</a> Meas. Sci. Technol. 19, 074009(2008).</li>
<li>Charrière, F., Pavillon, N., Colomb, T., Depeursinge, C., Heger, T. J., Mitchell, E. A. D., Marquet, P., Rappaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Living+specimen+tomography+by+digital+holographic+microscopy%3A+Morphometry+of+testate+amoeba%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Living specimen tomography by digital holographic microscopy: Morphometry of testate amoeba.</a> Opt. Exp. 14, 7005-7013 (2006).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Mavandadi, S., Yu, S. W., Feng, S., Lau, R., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens-free+optical+tomographic+microscope+with+a+large+imaging+volume+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Lens-free optical tomographic microscope with a large imaging volume on a chip.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 108, 7296-7301 (2011).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Sikora, U., Yaglidere, O., Yeah, J., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-portable+Lensfree+Tomographic+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Field-portable Lensfree Tomographic Microscope.</a> Lab Chip. 11, 2222-2230 (2011).</li>
<li>Isikman, S. O., Bishara, W., Zhu, H., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+tomography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22App.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optofluidic tomography on a chip.</a> App. Phys. Lett. 98, 161109(2011).</li>
<li>Bishara, W., Su, T. W., Coskun, A., Ozcan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lensfree+on-chip+microscopy+over+a+wide+field-of-view+using+pixel+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Lensfree on-chip microscopy over a wide field-of-view using pixel super-resolution.</a> Opt. Exp. 18, 11181-11191 (2010).</li>
<li>Messaoudi, C., Boudier, T., Sorzano, C. O. S., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).</li>
<li>Heng, X., Erickson, D., Baugh, L. R., Yaqoob, Z., Sternberg, P. W., Psaltis, D., Yang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optofluidic+Microscopy%3A+A+Method+for+Implementing+High+Resolution+Optical+Microscope+On+A+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Optofluidic Microscopy: A Method for Implementing High Resolution Optical Microscope On A Chip.</a> Lab on a Chip. 6, 1274-1276 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Ważne jest podkreślenie, że unikalna geometria bezsoczewkowej holograficznej mikroskopii na chipie jest kluczowym czynnikiem umożliwiającym uzyskanie superrozdzielczości pikselowej oraz obrazowania tomograficznego. Ponieważ rejestrowane obrazy nie są traktowane jako obrazy projekcyjne, jak w podejściach do niespójnego obrazowania kontaktowego 12, lecz jako hologramy projekcyjne, dyfrakcja światła przechodzącego aż do momentu uderzenia w detektor może zostać cyfrowo skorygowana poprzez rekonstrukcję ho...

<table><tbody><tr><td>Liniowe stoliki X-Y</td><td>Newport Corp.</td><td>MFA-PP</td><td>Miniaturowy stolik liniowy</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik obrotowy</td><td>Thorlabs</td><td>PRM1Z8</td><td>Zmotoryzowany precyzyjny uchwyt obrotowy</td></tr><tr><td>Wielomodowe światłowody optyczne</td><td>Thorlabs</td><td>AFS105/125Y</td><td>Światłowód wielomodowy</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Newport Corp.</td><td>6255</td><td>Bezozonowa lampa ksenonowa</td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Newport Corp.</td><td>74100</td><td>Monochromator Cornerstone 260 1/4 m</td></tr><tr><td>Matryca sensorów CMOS</td><td>Aptina Inc.</td><td>MT9P031STC</td><td>Sensor CMOS 5 megapikseli</td></tr><tr><td>Próbka &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td><td>Carolina Biosupply</td><td>173500</td><td>Dziki typ &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Lewamizol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9756-5G</td><td>Wodorochlorek tetramizolu</td></tr></tbody></table>

bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Obrazowanie tomograficzne jest szeroko stosowanym narzędziem w medycynie, ponieważ pozwala na uzyskanie trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych o obiektach o różnych skalach wielkości. W skalach mikrometrycznej i milimetrowej coraz częściej wykorzystuje się metody mikroskopii optycznej ze względu na niejonizujący charakter światła widzialnego oraz dostępność bogatego zestawu źródeł oświetlenia (takich jak lasery i diody elektroluminescencyjne) oraz elementów detekcyjnych (takich jak matryce detektorów CCD i CMOS o dużym formacie). Do niedawno opracowanych metod optycznej mikroskopii tomograficznej można zaliczyć optyczną tomografię koherencyjną, optyczną tomografię dyfrakcyjną, optyczną tomografię projekcyjną oraz mikroskopię arkusza światła. 1-6 Platformy te umożliwiają obrazowanie przekrojowe komórek, mikroorganizmów i zwierząt modelowych, takich jak C. elegans, danio pręgowany oraz embriony mysie.
Istniejące trójwymiarowe obrazowniki optyczne zazwyczaj posiadają stosunkowo masywną i złożoną architekturę, co ogranicza dostępność tego sprzętu do zaawansowanych laboratoriów i utrudnia jego integrację z platformami typu lab-on-a-chip oraz chipami mikroprzepływowymi. Aby zapewnić alternatywny mikroskop tomograficzny, opracowaliśmy niedawno bezsoczewkową tomografię optyczną (LOT) jako wysokoprzepustową, kompaktową i opłacalną kosztowo metodę tomografii optycznej. 7 LOT rezygnuje z użycia soczewek i masywnych komponentów optycznych, polegając zamiast tego na wielokątowym oświetleniu i obliczeniach cyfrowych w celu uzyskania obrazowania mikroobiektów z rozdzielczością głębokości w dużej objętości obrazowania. LOT pozwala na obrazowanie preparatów biologicznych z rozdzielczością przestrzenną &lt;1 μm x &lt;1 μm x &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, w dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie przydatne dla platform lab-on-a-chip.

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Obrazowanie tomograficzne jest powszechnie stosowanym narzędziem w medycynie, ponieważ pozwala na uzyskanie trójwymiarowych (3D) informacji strukturalnych dotyczących obiektów o różnych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie bezsoczewkowego obrazowania trójwymiarowego preparatów biologicznych bezpośrednio na chipie w dużej objętości obrazowania. Osiąga się to poprzez umieszczenie próbki bezpośrednio na chipie sensora i zapewnienie częściowo koherentnego oświetlenia. Drugim krokiem jest przesuwanie źródła światła w różnych pozycjach poprzecznych w celu rejestracji obrazu.Holograficzne obrazy próbki przesunięte o subpiksele. Kolejne przesunięcia subpikselowe. Obrazy holograficzne są rejestrowane przy różnych kątach oświetlenia w celu obrazowania tomograficznego.Ostatnim etapem jest przetwarzanie danych, podczas którego pozyskany zestaw danych jest rekonstruowany cyfrowo w celu uzyskania trójwymiarowych obrazów tomograficznych próbki. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalna mikroskopia świetlna, jest zapewnienie wysokowydajnego obrazowania w kompaktowej architekturze. Sprawia to, że nasza platforma jest szczególnie użyteczna w integracji z platformami Lebanon chip.W niniejszym raporcie opisano podstawową konfigurację obrazowania dla implementacji laboratoryjnej służącej do tomografii próbek statycznych. Monochromator z lampą ksenonową został dostrojony tak, aby zapewnić sygnał wyjściowy o szerokości spektralnej od około 1 do 10 nanometrów wokół długości fali centralnej od 450 do 650 nanometrów. To częściowo spójne światło jest następnie wprowadzane do wielomodowego światłowodu w celu dostarczenia częściowo spójnego promieniowania do układu.Światłowód został zamocowany na zmotoryzowanym stole obrotowym w celu zmiany kąta oświetlenia. Zmotoryzowany stół z przymocowanym źródłem światła umieszczono na dwuwymiarowym stole liniowym XY, który służy do przesuwania źródła światła w płaszczyźnie przy danym kącie detekcji. Wykorzystano matrycę czujnika A-C-M-O-S o rozdzielczości pięciu megapikseli i rozmiarze piksela 2,2 mikrona.Detektor służy do rejestracji holograficznych obrazów próbek o szerokim polu widzenia. Kluczowe jest, aby matryca czujnika znajdowała się w tej samej płaszczyźnie osiowej co oś obrotu źródła światła, aby upewnić się, że czujnik otrzymuje wystarczającą ilość światła przy dużych kątach oświetlenia. Chociaż bezsoczewkowa tomografia optyczna pozwala na obrazowanie różnych obiektów, takich jak komórki i mikroorganizmy, podstawowe zasady zostaną tutaj zademonstrowane poprzez wykonanie mikroskopii trójwymiarowej próbki ząbkowca morskiego z wykorzystaniem skalpela lub szpatułki.Pobierz mały fragment AGA z szalki Petriego zawierającej hodowlę organów uszczelniających. Kawałek o kształcie sześcianu o boku kilku milimetrów będzie zawierać setki nicieni. Umieść ten mały fragment agaru w probówce polipropylenowej zawierającej jeden mililitr wody dejonizowanej.Delikatnie mieszaj w wirówce (vortex) przez 30 sekund do jednej minuty. Po 10 do 15 minutach nicie powinny wypełznąć z agaru do wody dejonizowanej. Należy zauważyć, że nicie są tutaj zbyt małe, aby były widoczne, w celu tymczasowego unieruchomienia nicieni oraz jeden mililitr od 5 do 10 milimolarnych Lima.Wymieszać roztwór i odczekać 10 minut. Pipetą pobrać od 5 do 10 µL próbki z dna fiolki i umieścić ją pomiędzy dwiema lamelkami. Tę próbkę, zawierającą dużą liczbę tymczasowo unieruchomionych nicieni, można umieścić na detektorze, aby rozpocząć akwizycję danych.W celach demonstracyjnych w tej sekcji podsumowano kroki akwizycji obrazu dla typowego eksperymentu bezsoczewkowej tomografii optycznej (LOT); cały proces został jednak zautomatyzowany przy użyciu specjalnie opracowanego interfejsu LabVIEW. Aby rozpocząć kroki manualne, należy ustawić początkowy kąt obracałki na minus 50 stopni, przyjmując, że zero stopni odpowiada pionowej pozycji źródła światła. Następnie należy ustawić początkową pozycję stołu XY na 0 0, co stanowi pozycję domyślną.Dostosuj czas ekspozycji detektora w celu optymalnego wykorzystania jego zakresu dynamicznego, tak aby obraz był jak najjaśniejszy, lecz bez nasyconych pikseli, nie zmieniając kąta nachylenia stołu obrotowego. Wykonaj dziewięć obrazów dla każdej pozycji. Przesuń stół XY do nowej pozycji w siatce kwadratowej trzy na trzy, tak aby każdy obraz był przesunięty o około jedną czwartą piksela w stosunku do poprzedniego.Pozyskanie większej liczby obrazów pod każdym kątem może poprawić rozdzielczość, w zależności od rodzaju obiektu oraz stosunku sygnału do szumu. Po zebraniu dziewięciu obrazów pod kątem początkowym, przywróć pozycję stolika XY do punktu zero-zero. Następnie zwiększaj kąt obrotu stolika w krokach co dwa stopnie, aż do osiągnięcia wartości dodatnich 50 stopni.Po każdym przyroście pod każdym nowym kątem powtórz opisane kroki. Przyrosty kątowe mogą być mniejsze lub większe, w zależności od optymalizacji czasu akwizycji względem rozdzielczości obrazowania. Po zakończeniu akwizycji danych uzyskuje się zestaw 459 obrazów, który zawiera dziewięć obrazów przesuniętych o subpiksele dla każdego z 51 różnych kątów oświetlenia.Każdy zestaw dziewięciu obrazów jest przetwarzany cyfrowo przy użyciu algorytmów superrozdzielczości pikselowej w celu uzyskania jednej projekcji o wysokiej rozdzielczości. Następnie wyniki superrozdzielczości pikselowej hologramów dla każdego kąta są rekonstruowane cyfrowo, aby uzyskać 51 obrazów projekcyjnych. Przetwarzanie danych pokazano tutaj przy użyciu laptopa.Rekonstrukcja dla pełnego pola widzenia przy użyciu jednostek przetwarzania graficznego trwałaby mniej niż jedną sekundę. Ten zestaw 51 obrazów projekcyjnych jest następnie poddawany wstecznej projekcji przy użyciu wtyczki Tom OJA. W przypadku programu Image J obrazy projekcyjne są najpierw ładowane do Image J, po czym wywoływana jest wtyczka Tom OJ.Do OJ ładowana jest tabela wyszukiwania zawierająca kąt widzenia dla każdego obrazu projekcyjnego. Wykorzystując metodę ważonej retrospekcji (weighted back projection), można uzyskać trójwymiarowe obrazy tomograficzne próbki. Duże pole widzenia bezsoczewkowej tomografii optycznej zostało tutaj zademonstrowane poprzez umieszczenie próbki bezpośrednio na górnej powierzchni matrycy detektora. Obrazy holograficzne obiektów mogą być rejestrowane w polu widzenia o wymiarach 24 mm x 24 mm, co można dodatkowo zwiększyć, stosując nowoczesne matryce detektorów o większych obszarach aktywnych.Chociaż rozmiar piksela macierzy detektora ogranicza rozdzielczość rejestrowanych obrazów holograficznych, techniki super-rozdzielczości pikselowej pozwalają złagodzić ten problem; przedstawione tutaj hologramy o super-rozdzielczości pikselowej wraz z zrekonstruowanymi obrazami projekcyjnymi oferują podmikrometrową rozdzielczość przestrzenną dla trzech różnych kątów oświetlenia. Obrazy projekcyjne mogą być łączone przy użyciu technik tomograficznej rekonstrukcji obrazu w celu obliczenia tomogramów preparatu. Przedstawiono tutaj trzy obrazy przekrojowe w płaszczyźnie XY przez przednią część nicienia, gdzie rurka gardłowa jest widoczna tylko w przekroju przez Z równym 8 µm, co jest zgodne z oczekiwaniami dla tej w przybliżeniu cylindrycznej struktury o zewnętrznej średnicy około 5 µm.Ponadto obraz w przekroju w płaszczyźnie XZ wyraźnie pokazuje granice nicienia oraz znajdującą się wewnątrz rurkę przełykową, co potwierdza sukces obrazowania gardła w 3D. Wraz z dalszym rozwojem technika ta może umożliwić badaczom przeprowadzanie mikroskopii trójwymiarowej w objętościach obrazowania obejmujących rurki o długości wielu milimetrów. W związku z tym bezsoczewkowa tomografia optyczna może być użytecznym narzędziem w zastosowaniach do wysokoprzepustowego obrazowania na platformach typu lab-on-a-chip.

lensfree-on-chip-tomographic-microscopy-employing-multi-angle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia tomograficzna bezoliwkowa na chipie wykorzystująca wielokątne oświetlenie i nadrozdzielczość pikseli

Przedstawiono bezsoczewkową obrazowanie i charakterystykę komórek na chipie. To podejście do obrazowania komórek na chipie zapewnia kompaktowe i kosztowo efektywne narzędzie do diagnostyki medycznej oraz wysokoprzepustowych zastosowań w biologii komórki, co czyni je szczególnie odpowiednim dla obszarów o ograniczonych zasobach.

Obrazowanie komórek na chipie bez użycia soczewek stanowi nowe narzędzie dla wysokoprzepustowej biologii komórki i diagnostyki medycznej

Zaprezentowano bezsoczewkową platformę do fluorescencyjnej mikroskopii na chipie, która umożliwia obrazowanie obiektów fluorescencyjnych w bardzo szerokim polu widzenia, np. &gt;0,6-8 cm2, z rozdzielczością &lt;4μm, przy użyciu algorytmu dekodującego opartego na próbkowaniu kompresyjnym. Taka kompaktowa modalność obrazowania fluorescencyjnego na chipie z szerokim polem widzenia może być cenna w cytometrii wysokoprzepustowej, badaniach rzadkich komórek oraz analizach mikromacierzy.

Bezosobnikowa mikroskopia fluorescencyjna na chipie

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Obrazowanie przyżyciowe o wysokiej rozdzielczości ze zwiększonym kontrastem do głębokości 120 μm w węzłach chłonnych dorosłych myszy osiąga się poprzez przestrzenną modulację wzorca wzbudzenia wieloogniskowego mikroskopu dwufotonowego. Na głębokości 100 μm zmierzyliśmy rozdzielczości 487 nm (boczna) i 551 nm (osiowa), omijając w ten sposób granice rozpraszania i dyfrakcji.

Wysokorozdzielcza przyżyciowa mikroskopia pasiasta ośrodków rozrodczych

Opisano moduł do mikroskopii z oświetleniem jednopłaszczyznowym (SPIM), który można łatwo dostosować do odwróconego mikroskopu szerokokątnego i zoptymalizować pod kątem trójwymiarowych hodowli komórkowych. Próbka znajduje się w prostokątnej kapilarze, a za pomocą układu mikroprzepływowego można w niewielkich ilościach aplikować barwniki fluorescencyjne, środki farmaceutyczne lub leki.

Moduł oświetlenia jednopłaszczyznowego i podejście mikrokapilarne dla mikroskopu szerokokątnego

Przygotowanie funkcjonalizowanych białkiem płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym, określenie ruchliwości białek w ich obrębie i pomiar gęstości białek jest pokazane tutaj. Nakreślono mapę drogową budowy mikroskopu całkowitego wewnętrznego odbicia z redukcją szumów, który umożliwia wizualizację pojedynczych dwuwarstwowych fluorochromów o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej.

Mikroskopia fluorescencyjna pojedynczych cząsteczek na dwuwarstwach podpartych planarnie

Użycie hipersoczewki zostało uznane za nowatorską technikę obrazowania w superrozdzielczości ze względu na jej zalety w obrazowaniu w czasie rzeczywistym i jej prostą implementację za pomocą konwencjonalnej optyki. W tym miejscu przedstawiamy protokół opisujący wytwarzanie i obrazowanie zastosowań hipersoczewki sferycznej.

Demonstracja mikroskopu zintegrowanego z hipersoczewkami i obrazowania superrozdzielczego

Tutaj prezentujemy protokół pozwalający uzyskać trójwymiarową (3D) fluorescencję (3D) i obraz siatkówki OCT o dużym polu widzenia (FOV) za pomocą nowatorskiej platformy multimodalnej do obrazowania. Przedstawimy konfigurację systemu, metodę wyrównania i protokoły operacyjne. Przeprowadzone zostaną badania obrazowe in vivo, a ich wyniki zostaną przedstawione.

Multimodalne obrazowanie wolumetryczne siatkówki za pomocą skośnej skaningowej oftalmoskopii laserowej (oSLO) i optycznej koherentnej tomografii (OCT)

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Ilościowe, wysokoprzepustowe, w czasie rzeczywistym i bez znakowania wykrywanie biomolekuł (DNA, białek itp.) na powierzchniach SiO2 można osiągnąć za pomocą prostej techniki interferometrycznej, która opiera się na oświetleniu LED, minimalnej liczbie komponentów optycznych i kamerze. Sensor obrazowania odbiciowego interferometrycznego (IRIS) jest niedrogi, prosty w obsłudze i dostosowany do formatów mikromacierzy.

Detekcja biomolekularna z wykorzystaniem interferometrycznego czujnika obrazowania odbiciowego (IRIS)

Poznaj bezsoczewkową mikroskopię tomograficzną na chipie z oświetleniem pod wieloma kątami i superrozdzielczością pikseli. Technika umożliwia trójwymiarowe obrazowanie próbek biologicznych z wysoką rozdzielczością przestrzenną.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Przeglądaj więcej filmów