Model koinfekcji in vitro do badania interakcji Plasmodium falciparum-HIV-1 w ludzkich pierwotnych komórkach odpornościowych pochodzących z monocytów

Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie modelu in vitro do badania wpływu erytrocytów zakażonych Plasmodium fpar na replikację wirusa HIV w pierwotnych makrofagach pochodzących z monocytów ludzkich. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie plasmodium, fałszywych czerwonych krwinek zakażonych para, za pomocą układu veac, a następnie wystawienie ludzkich makrofagów pochodzących z monocytów na zakażone komórki. Następnie makrofagi pochodzące z monocytów narażone na czerwone krwinki są zakażone w pełni replikacyjnym wirusem HIV lub kodowaniem lucyferazy pojedynczej replikacji, HIV.

Wreszcie, supernatanty hodowlane są zbierane w dniach 3, 6, 9 i 12 po zakażeniu w celu uzyskania w pełni replikacyjnego wirusa dla wirusa kodującego lucyferazy. Zainfekowane komórki są kłamstwami po 72 godzinach od infekcji. Ostatecznie replikację wirusa można monitorować, określając ilościowo ilość białka kapsydu HIV jednego P 24 w supernatantach za pomocą leku Eliza, a transkrypcję wirusa można monitorować za pomocą oznaczania ilościowego lizatów komórkowych lucyferazy.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie malarii, koinfekcji wirusem HIV. Na przykład, w jaki sposób zakażenie pasożytem plasmodium wpływa na replikację wirusa HIV? Chociaż metoda ta została opracowana do badania interakcji między zarodźcem a wirusem HIV w makrofagach, można ją również zastosować do innych typów komórek.

Na przykład komórki dendrytyczne, monocyty lub limfocyty T CD 4 demonstrujące procedurę to Guadalupe Andreani. Doktor habilitowany w laboratorium Zacznij od zebrania czerwonych krwinek z płytki hodowlanej, umyj odzyskane komórki w 10 mililitrach pożywki makrofagowej pochodzącej z monocytów, a następnie ponownie zawieś osad w 12 mililitrach pożywki do hodowli makrofagów pochodzących z monocytów. Teraz powoli dodaj zawiesinę komórkową do kolumny Milton ECS i pozwól zawiesinie przepłynąć po jednokrotnym umyciu kolumny świeżym podłożem, wyjmij ją z magnesu i przepłucz 12 mililitrów kultury makrofagów pochodzących z monocytów.

Pożywka przez kolumnę, wymykająca się zakażonym krwinkom czerwonym do sterylnej probówki w celu wystawienia makrofagów pochodzących z monocytów na zakażone lub niezakażone krwinki czerwone. Dodać odpowiednią objętość zawiesiny krwinek czerwonych do każdego dołka uprzednio przygotowanej 24-dołkowej płytki zawierającej makrofagi pochodzące z monocytów. Inkubować kultury ko, w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla po czterech godzinach, usunąć pożywkę zawierającą czerwone krwinki, a następnie delikatnie dodać do każdej z nich 600 mikrolitrów PBS wolnego od endotoksyn, dobrze trzykrotnie odsysając PBS natychmiast po każdym myciu.

Teraz w 200 mikrolitrach lodu, zimnej, sterylnej wody do każdej studzienki, aby ułożyć czerwone krwinki zasysające wodę po 20 sekundach. Następnie w 600 mikrolitrach pożywki hodowlanej makrofagów pochodzących z monocytów do każdej studzienki i inkubować kultury przez 24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Aby ocenić wpływ fałszywego paremu zarodźca na replikację wirusa HIV w makrofagach pochodzących z monocytów w 300 mikrolitrach pożywki makrofagowej pochodzącej z monocytów zawierającej P 24 z NL czterech trzech wirusów BO IV jeden do odpowiednich studzienek, podobnie jak protokół przedstawiony na tym rysunku.

Po inkubacji kultur co przez dwie godziny umyj komórki trzykrotnie 600 mikrolitrami PBS wolnego od endotoksyn. Następnie w 600 mikrolitrach świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej z monocytów do każdej studzienki i kontynuuj inkubację kultur co w dniach 3, 6, 9 i 12 Po początkowej infekcji wirusowej zbierz 200 mikrolitrów każdego nakłucia, zastępując odzyskaną zawiesinę komórek 200 mikrolitrami świeżych makrofagów pochodzących z monocytów. Średni. Następnie należy przechowywać zebrane supernatanty w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do późniejszej analizy przez Elizę.

W celu określenia wpływu pasożytów na HIV ekspresja jednego genu w makrofagach pochodzących z monocytów w 300 mikrolitrach pożywki makrofagowej pochodzącej z monocytów zawierającej P 24 wirusa pokrytego lucyferazy, ENC będącego przedmiotem zainteresowania odpowiednich studzienek, podobnie jak w przedstawionych tutaj protokołach. Po inkubacji i umyciu kultur kodowych, jak właśnie pokazano dla wirusa pokrytego ENC bez lucyferazy, usuń pożywkę 72 godziny po zakażeniu i dodaj 200 mikrolitrów testu lucyferazy. Bufor do lizy Hit układa teraz komórki w temperaturze pokojowej z delikatnym potrząsaniem, a następnie przechowuje kultury koco w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu płytki przenieś 40 mikrolitrów lizatu z każdej studzienki do odpowiedniej studzienki na 96-dołkowej płytce luminometru. Następnie dodaj 100 mikrolitrów substratu lucyferazy zestawu do oznaczania lucyferazy do każdego. Cóż, w końcu zmierz aktywność lucyferazy świetlików w luminometrze.

Zgodnie z instrukcjami producenta w tym eksperymencie, makrofagi pochodzące z monocytów zostały wystawione na działanie zakażonych lub niezakażonych czerwonych krwinek, a następnie zakażonych NL four three blen. Jak właśnie wykazano, produkcja białka wirusowego P 24 była następnie monitorowana przez ELIZA pod kątem HIV jednego P 24 w bezkomórkowych supernatantach w różnych punktach czasowych po początkowej infekcji wirusowej. Należy zwrócić uwagę na znaczny spadek uwalniania cząstek wirusa w dniu 12, mierzony za pomocą białka kapsydu HIV jednego P 24 w supernacie makrofagów pochodzących z monocytów wstępnie leczonych pasożytami.

W tym eksperymencie makrofagi pochodzące z monocytów wystawiono na zakażone i niezakażone czerwone krwinki, a następnie zakażono wirusem kodowanym lucyferazy, jak właśnie wykazano, ekspresja lucyferazy została następnie oceniona w lizacie komórkowym 72 godziny po początkowym wirusie w infekcji. Zakażenie makrofagami pochodzącymi z monocytów takimi wirusami zawierającymi egzogenne VS. Glikoproteiny VG lub HIV one prowadziły do znacznie mniejszej produkcji lucyferazy w komórkach narażonych na fałszywy spar. Warto zauważyć, że pseudowirusy typu VSVG wykazywały znacznie większą aktywność lucyferazy niż ich odpowiedniki JRFL ze względu na większą skuteczność infekcji pseudotypowanych cząstek VSPG.

Technika ta pozwoli naukowcom zajmującym się malarią, koinfekcjami HIV na zbadanie interakcji między tymi dwoma patogenami w modelu in vitro, który można dostosować do badania kilku typów komórek odpornościowych.