Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie szybkości naprawy DNA i ekstraktów jądrowych komórek w czasie rzeczywistym za pomocą latarni molekularnych, które fluoryzują po naprawie. Podstawowe latarnie molekularne do naprawy wycinania składają się z deoksyoligonukleotydów w strukturze pętli macierzystej zawierającej pojedynczą zmianę zasadową z sześcioma zakrzywionymi ugrupowaniami oksyfluoresceiny sprzężonymi z pięcioma pierwszymi końcami i dil moti sprzężonymi z trzema pierwszymi końcami po złożeniu. Sześć rodzin jest gaszone przez dab sil w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii rezonansu leśnego.

Aby ocenić aktywność naprawczą DNA, latarnie są inkubowane z ekstraktami jądrowymi komórek, które zawierają enzymy naprawcze. Glikozylan DNA jest rozpoznawany i usuwa zmianę DNA w sygnalizatorze. Powstałe miejsca ABA są substratami dla endonukleazy AP jeden lub małpy po rozpoznaniu APE rozszczepia szkielet DNA w miejscu ABA, umożliwiając DNA zawierającemu sześć rodzin swobodną dysocjację od spinki do włosów.

Odłączenie od wygaszacza powoduje wzrost fluorescencji, który jest proporcjonalny do poziomu naprawy DNA i może być oceniany w czasie rzeczywistym za pomocą ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym. Zdolność do naprawy uszkodzeń DNA jest kluczowa dla każdej komórki i każdego organizmu. Wśród mnogości szlaków naprawy DNA komórkowego, cele naprawy przez wycinanie zasad, uszkodzone zasady, które mogą powstać w wyniku uszkodzeń oksydacyjnych lub chemicznych, jednym z głównych celów naszych badań laboratoryjnych jest wyjaśnienie roli poszczególnych elementów komórkowych, które mogą wpływać na naprawę przez wycinanie zasad.

W związku z tym dokładny i czuły pomiar aktywności naprawy DNA stał się przedmiotem zainteresowania naszego laboratorium. Ten test może dostarczyć takich danych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie 32 PN i analiza za pomocą elektroforezy żelowej, jest to, że nasza technika nie wykorzystuje substratów znakowanych radioaktywnie, może mierzyć szybkość naprawy dary w czasie rzeczywistym i ma bardzo duży zakres dynamiki.

Co więcej, podejście to może wykorzystywać kilka różnych zmian fluoro-czwórkowych i/lub zasadowych w celu określenia specyficzności substratu. Wykazaliśmy, że ten test jest wysoce ilościowy i bardzo czuły w różnych warunkach. Ten test molekularnej latarni morskiej z wycięciem podstawy jest podatny na analizę kinetyczną.

Wysoka czułość i swoistość testu pozwala na dokładną kwantyfikację naprawy przez wycięcie zasady, a zatem jest przydatna do badań przesiewowych inhibitorów naprawy lub walidacji. Ponadto można go dostosować do pomiaru aktywności naprawczej oraz lizatów tkanek i komórek nowotworowych do funkcjonalnych pomiarów biomarkerów. Projektując latarnie molekularne, które będą używane do tego testu, należy wziąć pod uwagę następujące oligonukleotydy DNA o długości 43 zasad, jak pokazano tutaj.

Działa dobrze. Sekwencja DNA nie jest unikalna, ale musi umożliwiać utworzenie struktury spinki do włosów. Gdy klęczy, jak pokazano tutaj, swoistość uzyskuje się poprzez wprowadzenie określonych zmian zasadowych, takich jak uracyl lub tetra hydrofuryna.

W pozycji X sześć zasad od pięciu głównych końców zawartość GC powinna wynosić co najmniej 32%, a zasada GB nie powinna być umieszczana na pięciu głównych końcach. Sześć karboksylofluoresceiny lub sześć fam należy sprzęgnąć z piątym pierwszym końcem, a trzy główne końce należy zmodyfikować za pomocą zimnicy sil. Będzie to substrat dla białek naprawczych DNA, aby zapewnić wiązanie i aktywność uwalniania glikozylu.

Pozycja zmiany została dobrana tak, aby zapewnić wystarczającą ilość miejsca od struktury spinki do włosów i końca DNA. Długość trzpienia lub spinki do włosów powinna wynosić co najmniej 15 par zasad. Zalecana długość pętli to 13 podstaw.

Kontrolna radiolatarnia molekularna powinna być identyczna z eksperymentalną radiolatarnią molekularną, z wyjątkiem tego, że nie zawiera zmiany DNA. Dlatego nie powinien być rozpoznawany przez enzymy naprawy DNA. Po umieszczeniu nadajników molekularnych w ręku należy przeprowadzić ocenę jakości, aby upewnić się, że sygnalizatory nie fluoryzują, dopóki nie zostaną podgrzane.

Aby określić optymalną temperaturę topnienia, wszystkie etapy procedury ekstrakcji należy wykonywać na lodzie lub w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby zapewnić stabilność białka, przygotuj się do eksperymentu poprzez wstępne schłodzenie. Dwie jednolitrowe zlewki na próbkę Bufor do dializy, komory dializacyjne, mikrowirówka, probówki, strzykawki i igły.

Oznacz 15-mililitrowe stożkowe rurki i umieść je na lodzie. Odessać pożywkę wzrostową z komórek, a następnie umyć je dwukrotnie 7,5 mililitra zimnego PBS Po drugim praniu. Dodaj pięć mililitrów zimnego PBS do każdego naczynia i użyj podnośnika komórkowego, aby zeskrobać komórki z płytki.

Przenieś komórki do schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów, a następnie odwiruj w temperaturze 500 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po wirowaniu usuń supernatant i oszacuj objętość upakowanych komórek, porównując ją ze znanymi objętościami cieczy w podobnych probówkach. Odwirować probówki przez kolejną minutę, a następnie usunąć pozostały PBS za pomocą pipety.

Zawieś osad komórkowy w 150 mikrolitrach odczynnika do ekstrakcji nuke buster, jeden na każde 50 mikrolitrów upakowanej objętości komórki. Następnie przenieś zawieszone komórki do wstępnie schłodzonej rurki o pojemności 1,5 mililitra i wiruj przez 15 sekund z dużą prędkością. Po wirowaniu inkubować probówkę na lodzie przez pięć minut, następnie wirować przez kolejne 15 sekund i wirować przy 13 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu należy usunąć i wyrzucić supernatant, który zawiera frakcję cytoplazmatyczną. Resus zawiesić granulat w mieszaninie jednego mikrolitra resusa zawieszonego 100 x koktajl inhibitorów proteazy, jeden mikrolitr 100 milimolowych DTT i 75 mikrolitrów ekstrakcji nuke buster. Odczynnik drugi na 50 mikrolitrów objętości upakowanych komórek.

Komórki wiru przez 15 sekund z dużą prędkością. Inkubować na lodzie przez pięć minut i ponownie wirować przez 15 sekund na wysokich obrotach, wirować pod ciśnieniem 13 000 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu wykorzystuje strzykawkę do przeniesienia supernatantu, który zawiera białka jądrowe, do kasety dializacyjnej z odcięciem 7 000 mas cząsteczkowych.

Następnie dodaj 500 mikrolitrów jednego molowego DTT do 500 mililitrów wstępnie schłodzonego buforu do dializy i dializuj lizat przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Po 90 minutach przenieść kasetę dializacyjną do drugiej zlewki zawierającej 0,5 litra wstępnie schłodzonego buforu do dializy z naziemną telewizją i dializą. Lizat przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem po dializie ekstrakt mógł skrystalizować z powodu wysokich stężeń białka.

Następnie włożyć nową strzykawkę do innego portu niż ten, który jest używany do wstrzykiwania kasety i pobrać dializowany roztwór białka jądrowego z kasety dializy. Staraj się dołączyć mętnie wyglądające kryształy podczas usuwania dializowanego roztworu białka jądrowego. Porcję próbki do mikro probówek wirówkowych po 20 mikrolitrów szybko zamrozić na suchym lodzie, a następnie przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aż będzie potrzebna.

Określić stężenie białka i przeprowadzić kontrolę jakości zgodnie z opisem w dokumencie towarzyszącym. Aby przeprowadzić test z radiolatarnią molekularną, rozmrozić i rozcieńczyć lizaty komórkowe do dwóch mikrogramów na mikrolitr białka z podstawowym buforem reakcyjnym naprawy nacyzyjnym zawierającym jeden milimol DTT, rozcieńczyć znaczniki molekularne do 200 mikromolów z podstawowym buforem reakcyjnym naprawy przez wycinanie. Ponieważ ilościowa maszyna do PCR w czasie rzeczywistym zwykle nie jest używana jako fluorymetr, zmień metodę uruchamiania w ilościowej maszynie do PCR w czasie rzeczywistym, aby zbierać dane co 20 sekund w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej 180 cykli.

Następnie co 20 sekund przez 15 cykli przy maksymalnej fluorescencji latarni molekularnej, aby uzyskać dane do normalizacji. Ustaw objętość reakcji na 25 mikrolitrów. Następnie ustaw projekt płytki na instrumencie za pomocą zastosowanego oprogramowania biosystemu z krzywą standardową wybraną jako typ eksperymentu, uzupełnij układ płytki.

Przykład przedstawiono w poniższej tabeli, która znajduje się również w dokumencie towarzyszącym. Nie dodawaj niczego do dobrze wybranej jako krzywa standardowa. Umieścić na lodzie podstawowy bufor reakcyjny do naprawy przez wycinanie lizatu komórkowego DTT o stężeniu dwóch mikrogramów na mikrolitr i wszystkie latarnie molekularne używane w eksperymencie.

Następnie dodać DTT do podstawowego buforu reakcyjnego do naprawy przez wycinanie do końcowego stężenia jednej pipety milimolowej. 15 mikrolitrów podstawowego buforu reakcyjnego do naprawy przez wycinanie z DTT do każdej studzienki kompatybilnej płytki optycznej Q-R-T-P-C-R na lodzie. Następnie, zgodnie z układem płytek, odpipetuj lampy ostrzegawcze do odpowiednich studzienek.

Każda kombinacja lizatu i radiolatarni molekularnej lub kontroli powinna być oznaczona w trzech egzemplarzach. Na koniec odpipetować pięć mikrolitrów rozcieńczonego lizatu jądrowego na studzienkę do odpowiednich studzienek. Ważne jest, aby pamiętać, aby wszystkie odczynniki do latarni molekularnych były zimne, a na koniec pipetować lizaty do płytki.

Pamiętaj, że lizaty zawierają aktywne białka i zaczną naprawiać latarnie molekularne, gdy tylko zostaną dopipetowane do mieszaniny reakcyjnej. Dlatego bardzo ważne jest, aby wszystkie odczynniki były zimne, aby zminimalizować ilość naprawy sygnalizatora, która ma miejsce przed rozpoczęciem wykonywania pomiarów. Po dodaniu wszystkiego uszczelnij płytkę optyczną folią samoprzylepną i wymieszaj, delikatnie stukając w płytkę.

Następnie wykonaj szybkie dziesięciosekundowe wirowanie za pomocą wirówki, aby zebrać roztwory na dnie probówek lub płytki po wirowaniu, włóż płytkę do ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym i rozpocznij test po zakończeniu, wyeksportuj surowe dane, najlepiej w formacie Excel i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, aby przeanalizować dane po wykonaniu niezbędnych obliczeń. Wykreślić znormalizowane dane fluorescencji jako procent wolnego fam w czasie w sekundach na wykresie rozrzutu z odpowiednimi błędami, aby ocenić aktywność naprawczą DNA i jakość ekstraktów jądrowych z komórek LN 4 28 i linii komórkowej nadekspresji MPG oznaczonej jako LN 4 28 MPG. Test opisany w tym filmie przeprowadzono przy użyciu latarni molekularnej zawierającej APE jeden substrat tetrafuryny jako kontrolę pozytywną.

Jak pokazano na tym rysunku, obie linie komórkowe mają silną aktywność APE one, na co wskazuje strome nachylenie, aktywność glikozatu DNA specyficzna dla usuwania substratu MPG. Hipoksantyna oznaczona jako HX była mierzona w lizatach jądrowych z obu linii komórkowych. Każdy lizat analizowano przy użyciu podstawowej latarni molekularnej do kontroli naprawy wycinania lub latarni molekularnej do naprawy wycinania zasady HX dla latarni kontrolnej, LN 4 28 jest pokazana na zielono, a LN 4 28 MPG na fioletowo dla latarni hipo.

LN 4 28 jest pokazany na niebiesko, a LN 4 28 MPG na pomarańczowo. Wyniki są podawane jako A jako średnie jednostki fluorescencji i B, znormalizowana fluorescencja. W każdej komórce wystąpił zależny od czasu wzrost fluorescencji wskazujący na naprawę HX.

Lizat inkubowany z latarnią molekularną HX zgodnie z oczekiwaniami. Linia komórkowa LN 4 28 MPG oznaczona pomarańczowym śladem miała znacznie wyższą szybkość naprawy, na co wskazuje szybsza akumulacja fluorescencji niż rodzicielska linia komórkowa LN 4 28, która ma minimalną zawartość białka MPG. W ten sposób szybkość naprawy określonych zmian DNA przez określone białka naprawcze może być mierzona z ekstraktów komórkowych w czasie rzeczywistym przy minimalnych poziomach tła niespecyficznego rozszczepienia DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować swoje molekularne latarnie i mierzyć tempo naprawy DNA w czasie rzeczywistym przy użyciu oczyszczonych białek lub lizatów komórkowych. W odniesieniu do analizy zasadnicze znaczenie ma ocena zakresu dynamicznego i wartości tła poprzez uwzględnienie reakcji kontrolnych, takich jak z sygnalizatorami kontroli dodatniej i ujemnej lub bez nich. Biorąc pod uwagę zmienność między odwiertami, przydatne jest znormalizowanie danych w poszczególnych studzienkach do wartości wejściowych.

Są one określane przez drobniejszy krok w temperaturze topnienia. To, a także włączenie innych barwników, takich jak matryca skalna, będzie odpowiadało za zmienność nieodłącznie związaną z błędami pipetowania lub różnicami w detektorach. Technika ta pozwoliła nam wyjaśnić wpływ poszczególnych składników naprawczych na ogólną aktywność i zdolność naprawczą.

Jest wystarczająco czuły, aby zdemaskować drobne zmiany, które nie byłyby wykrywalne konwencjonalnymi metodami.