Name: Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy aktywności naprawczej DNA w lizatach jądrowych z wykorzystaniem sygnalizatorów molekularnych. Technika umożliwia pomiar kinetyczny glikozylaz i endonukleaz AP w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana grantami z Pittsburgh Foundation oraz National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] przyznanymi dla RWS. Wsparcie dla UPCI Lentiviral Facility zostało zapewnione RWS przez Cancer Center Support Grant z National Institutes of Health [P30 CA047904]. Wsparcie zostało również zapewnione przez University of Pittsburgh Department of Pharmacology &amp; Chemical Biology dla DS. Wsparcie zostało ponadto zapewnione przez ESTRO dla CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS jest konsultantem naukowym w firmie Trevigen, Inc. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Istnieje ponad 600 cytowań wykorzystujących termin „molecular beacon” (świetlna sonda molekularna) do wykrywania i ilościowego oznaczania licznych cząsteczek oraz aktywności enzymatycznych, w tym aktywności helikazy6, aktywności polimerazy DNA7,8, aktywności ligazy DNA9, aktywności telomerazy10, aktywności fotoliazy DNA11 oraz hybryd DNA/RNA12, spośród wielu innych. Oprócz zastosowania sond molecular beacon do pomiaru wymienionych wyżej aktywności naprawy ...

<table><tbody><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Stopień czystości molecular grade</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Stopień czystości molecular grade</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Sól HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>17-8</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0.22&amp;mu;M</td><td>Nalgene</td><td>167-0020</td><td></td></tr><tr><td>Produkty do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>Pierce</td><td>66373</td><td>MW 7000</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi 1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Czarne</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 mL</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji białek NucBuster</td><td>Calbiochem</td><td>71183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sondy Molecular Beacons</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat odczynnika barwiącego do analizy białek BioRad</td><td>BioRad</td><td>Cat# 500-0006</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych z wykorzystaniem molekularnych beaconi do badania naprawy przez wycięcie zasady (BER). Substrat (beacon) składa się z deoksyoligonukleotydu zawierającego pojedynczą uszkodzoną zasadę, z cząsteczką 6-karboksyfluoresceiny (6-FAM) przyłączoną do końca 5' oraz cząsteczką Dabcyl przyłączoną do końca 3' oligonukleotydu. Molekularny beacon BER ma długość 43 zasad, a jego sekwencja została zaprojektowana tak, aby sprzyjać tworzeniu struktury pętli z łodyżką, z 13 nukleotydami w pętli i 15 parami zasad w łodyżce1,2. Po sfałdowaniu w tej konfiguracji cząsteczka 6-FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii fluorescencji Förstera (FRET)3,4. Uszkodzenie jest umiejscowione w taki sposób, że po usunięciu uszkodzonej zasady i przecięciu nici, pozostały 5-zasadowy oligonukleotyd zawierający cząsteczkę 6-FAM zostaje uwolniony z łodyżki. Uwolnienie i oddzielenie od wygaszacza (Dabcyl) prowadzi do wzrostu fluorescencji proporcjonalnego do poziomu naprawy DNA. Dzięki wielokrotnym pomiarom wartości fluorescencji możliwa jest ocena aktywności BER w czasie rzeczywistym. Wykorzystanie standardowych instrumentów do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym pozwala na jednoczesną analizę licznych próbek. Konstrukcja tych molekularnych beaconi BER z pojedynczym uszkodzeniem zasady nadaje się do analiz kinetycznych, kwantyfikacji BER oraz walidacji inhibitorów, a także może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i komórek nowotworowych lub przy użyciu oczyszczonych białek. Analiza aktywności BER w lizatach nowotworowych lub aspiratach tkankowych z użyciem tych molekularnych beaconi może znaleźć zastosowanie w pomiarach funkcjonalnych biomarkerów. Ponadto analiza aktywności BER z oczyszczonymi białkami przy użyciu tego testu ilościowego zapewnia szybką, wysokoprzepustową metodę odkrywania i walidacji inhibitorów BER.

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylaz DNA oraz endonukleaz AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych przy użyciu zasad...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar szybkości naprawy DNA w ekstraktach jądrowych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu beacony molekularnych, które fluorescują po dokonaniu naprawy. Beacony molekularne do badania podstawowej naprawy przez wycinanie składają się z deoksyoligonukleotydów w strukturze pętli z łodygą, zawierającej pojedynczą lekcję zasady, z sześcioma grupami fluoresceiny (FAM) sprzężonymi z końcami 5' oraz grupami Dabcyl sprzężonymi z końcami 3' w stanie pofałdowania. Grupa FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii Förestera.Aby ocenić aktywność naprawy DNA, sondy (beacons) inkubuje się z ekstraktami jądrowymi komórek zawierającymi enzymy naprawcze. DNA glikozylaza rozpoznaje i usuwa uszkodzenie DNA w sondzie. Powstałe miejsca ABA stanowią substraty dla endonukleazy AP 1 lub ape1. Po rozpoznaniu APE1 przecina szkielet DNA w miejscu ABA, co pozwala na swobodne odłączenie się fragmentu DNA zawierającego 6-fam od spinki do włosów.Oddzielenie od wygaszacza skutkuje wzrostem fluorescencji, który jest proporcjonalny do poziomu naprawy DNA i może być oceniany w czasie rzeczywistym przy użyciu urządzenia do iloś

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa, czasu rzeczywistego analiza aktywności naprawy wycinania zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem sond molekularnych specyficznych dla uszkodzeń

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Ten artykuł przedstawia podstawowe etapy immunobarwienia i immunoprecypitacji chromatyny. Protokoły te są powszechnie stosowane do badania procesów komórkowych związanych z uszkodzeniem DNA oraz do wizualizacji i ilościowego określenia rekrutacji białek zaangażowanych w naprawę DNA.

Wizualizacja i ilościowe określanie uszkodzeń DNA specyficznych dla miejsca na podstawie endonukleazy

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj metodę ilościowej analizy aktywności naprawczej DNA w lizatach jądrowych z wykorzystaniem sygnalizatorów molekularnych. Technika umożliwia pomiar kinetyczny glikozylaz i endonukleaz AP w czasie rzeczywistym.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Przeglądaj więcej filmów