Name: Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy aktywności naprawczej DNA w lizatach jądrowych z wykorzystaniem sygnalizatorów molekularnych. Technika umożliwia pomiar kinetyczny glikozylaz i endonukleaz AP w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana grantami z Pittsburgh Foundation oraz National Institutes of Health (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] przyznanymi dla RWS. Wsparcie dla UPCI Lentiviral Facility zostało zapewnione RWS przez Cancer Center Support Grant z National Institutes of Health [P30 CA047904]. Wsparcie zostało również zapewnione przez University of Pittsburgh Department of Pharmacology &amp; Chemical Biology dla DS. Wsparcie zostało ponadto zapewnione przez ESTRO dla CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS jest konsultantem naukowym w firmie Trevigen, Inc. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktów interesów.

Istnieje ponad 600 cytowań wykorzystujących termin „molecular beacon” (świetlna sonda molekularna) do wykrywania i ilościowego oznaczania licznych cząsteczek oraz aktywności enzymatycznych, w tym aktywności helikazy6, aktywności polimerazy DNA7,8, aktywności ligazy DNA9, aktywności telomerazy10, aktywności fotoliazy DNA11 oraz hybryd DNA/RNA12, spośród wielu innych. Oprócz zastosowania sond molecular beacon do pomiaru wymienionych wyżej aktywności naprawy ...

<table><tbody><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher</td><td>P217-500</td><td>Stopień czystości molecular grade</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td>Stopień czystości molecular grade</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór HEPES</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Sól HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034-500G</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Sigma</td><td>17-8</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0.22&amp;mu;M</td><td>Nalgene</td><td>167-0020</td><td></td></tr><tr><td>Produkty do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>Pierce</td><td>66373</td><td>MW 7000</td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Fisher</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Igła</td><td>Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi 1.5 mL</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>Czarne</td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 mL</td><td>Fisher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji białek NucBuster</td><td>Calbiochem</td><td>71183</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Sondy Molecular Beacons</td><td>IDT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koncentrat odczynnika barwiącego do analizy białek BioRad</td><td>BioRad</td><td>Cat# 500-0006</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych z wykorzystaniem molekularnych beaconi do badania naprawy przez wycięcie zasady (BER). Substrat (beacon) składa się z deoksyoligonukleotydu zawierającego pojedynczą uszkodzoną zasadę, z cząsteczką 6-karboksyfluoresceiny (6-FAM) przyłączoną do końca 5' oraz cząsteczką Dabcyl przyłączoną do końca 3' oligonukleotydu. Molekularny beacon BER ma długość 43 zasad, a jego sekwencja została zaprojektowana tak, aby sprzyjać tworzeniu struktury pętli z łodyżką, z 13 nukleotydami w pętli i 15 parami zasad w łodyżce1,2. Po sfałdowaniu w tej konfiguracji cząsteczka 6-FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii fluorescencji Förstera (FRET)3,4. Uszkodzenie jest umiejscowione w taki sposób, że po usunięciu uszkodzonej zasady i przecięciu nici, pozostały 5-zasadowy oligonukleotyd zawierający cząsteczkę 6-FAM zostaje uwolniony z łodyżki. Uwolnienie i oddzielenie od wygaszacza (Dabcyl) prowadzi do wzrostu fluorescencji proporcjonalnego do poziomu naprawy DNA. Dzięki wielokrotnym pomiarom wartości fluorescencji możliwa jest ocena aktywności BER w czasie rzeczywistym. Wykorzystanie standardowych instrumentów do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym pozwala na jednoczesną analizę licznych próbek. Konstrukcja tych molekularnych beaconi BER z pojedynczym uszkodzeniem zasady nadaje się do analiz kinetycznych, kwantyfikacji BER oraz walidacji inhibitorów, a także może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i komórek nowotworowych lub przy użyciu oczyszczonych białek. Analiza aktywności BER w lizatach nowotworowych lub aspiratach tkankowych z użyciem tych molekularnych beaconi może znaleźć zastosowanie w pomiarach funkcjonalnych biomarkerów. Ponadto analiza aktywności BER z oczyszczonymi białkami przy użyciu tego testu ilościowego zapewnia szybką, wysokoprzepustową metodę odkrywania i walidacji inhibitorów BER.

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylazy DNA oraz endonukleazy AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych. Analiza ta pozwala na wyznaczenie szybkości aktywności naprawy DNA umożliwiającej analizę kinetyczną i może być dostosowana do ilościowego oznaczania aktywności naprawy DNA w lizatach tkanek i nowotworów lub z użyciem oczyszczonych białek.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Opisujemy metodę ilościowego pomiaru aktywności glikozylaz DNA oraz endonukleaz AP w czasie rzeczywistym w lizatach jąder komórkowych przy użyciu zasad...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar szybkości naprawy DNA w ekstraktach jądrowych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu beacony molekularnych, które fluorescują po dokonaniu naprawy. Beacony molekularne do badania podstawowej naprawy przez wycinanie składają się z deoksyoligonukleotydów w strukturze pętli z łodygą, zawierającej pojedynczą lekcję zasady, z sześcioma grupami fluoresceiny (FAM) sprzężonymi z końcami 5' oraz grupami Dabcyl sprzężonymi z końcami 3' w stanie pofałdowania. Grupa FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii Förestera.Aby ocenić aktywność naprawy DNA, sondy (beacons) inkubuje się z ekstraktami jądrowymi komórek zawierającymi enzymy naprawcze. DNA glikozylaza rozpoznaje i usuwa uszkodzenie DNA w sondzie. Powstałe miejsca ABA stanowią substraty dla endonukleazy AP 1 lub ape1. Po rozpoznaniu APE1 przecina szkielet DNA w miejscu ABA, co pozwala na swobodne odłączenie się fragmentu DNA zawierającego 6-fam od spinki do włosów.Oddzielenie od wygaszacza skutkuje wzrostem fluorescencji, który jest proporcjonalny do poziomu naprawy DNA i może być oceniany w czasie rzeczywistym przy użyciu urządzenia do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Zdolność do naprawy uszkodzeń DNA jest kluczowa dla każdej komórki i każdego organizmu. Wśród wielu komórkowych szlaków naprawy DNA, naprawa przez wycinanie zasad (BER) celuje w uszkodzone zasady, które mogą być wynikiem czynników utleniających lub chemicznych; wyjaśnienie roli poszczególnych elementów komórkowych, które mogą wpływać na naprawę przez wycinanie zasad, jest jednym z głównych celów badań w naszym laboratorium.W związku z tym, dokładny i czuły pomiar aktywności naprawy DNA stał się przedmiotem zainteresowania w naszym laboratorium. Niniejszy test może dostarczyć takich danych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie 32 PN i analiza za pomocą elektroforezy żelowej, jest fakt, że nasza metoda nie wykorzystuje radioaktywnie znakowanych substratów, pozwala na pomiar szybkości naprawy DNA w czasie rzeczywistym i charakteryzuje się bardzo szerokim zakresem dynamicznym.Ponadto podejście to może wykorzystywać kilka różnych fluoroforów i/lub uszkodzeń zasad w celu określenia specyficzności substratowej. Wykazaliśmy, że test ten jest wysoce ilościowy i bardzo czuły w różnych warunkach. Ten test z użyciem molekularnych beaconów do badania naprawy przez wycinanie zasad nadaje się do analizy kinetycznej.Wysoka czułość i swoistość testu umożliwiają dokładne ilościowe oznaczenie naprawy przez wycinanie zasad, co czyni go użytecznym w badaniach przesiewowych inhibitorów naprawy lub ich walidacji. Ponadto metoda ta może być dostosowana do pomiaru aktywności naprawy DNA w tkankach oraz lizatach komórek nowotworowych w celu oznaczenia funkcjonalnych biomarkerów. Projektując sondy molekularne (molecular beacons) do tego testu, należy uwzględnić następujące oligonukleotydy DNA o długości 43 zasad, przedstawione tutaj.Działa sprawnie. Sekwencja DNA nie jest unikalna, ale musi umożliwiać tworzenie struktury spinki do włosów. Gdy jest ona zgięta w sposób pokazany tutaj, specyficzność osiąga się poprzez wprowadzenie specyficznych uszkodzeń zasad, takich jak uracyl lub tetrahydrofuran.W pozycji X, sześć zasad od końca 5', zawartość GC powinna wynosić co najmniej 32%, a zasada GB nie powinna znajdować się na końcu 5'. Do końca 5' należy przyłączyć sześć cząsteczek karboksyfluoresceiny lub sześć cząsteczek FAM, natomiast koniec 3' powinien zostać zmodyfikowany za pomocą dab sil. Będzie to stanowiło substrat dla białek naprawy DNA, aby zapewnić wiązanie i aktywność glikozylaz.Położenie miejsca uszkodzenia wybrano tak, aby zapewnić wystarczającą odległość od struktury spinki do włosów oraz końca DNA. Długość łodygi lub dupleksu spinki do włosów powinna wynosić minimum 15 par zasad. Zalecana długość pętli to 13 zasad.Kontrolna sonda molekularna (molecular beacon) powinna być identyczna z sondą eksperymentalną, z wyjątkiem tego, że nie zawiera ona uszkodzenia DNA. W związku z tym nie powinna być rozpoznawana przez enzymy naprawy DNA. Po otrzymaniu sond molekularnych należy przeprowadzić ocenę jakości, aby upewnić się, że sondy nie wykazują fluorescencji do momentu podgrzania.Aby określić optymalną temperaturę topnienia, wszystkie etapy procedury ekstrakcji należy przeprowadzać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. W celu zapewnienia stabilności białek, należy przygotować się do eksperymentu poprzez uprzednie schłodzenie następujących elementów: dwóch zlewków o pojemności 1 l na próbkę, buforu do dializy, komór dializacyjnych, probówek do mikrocentryfugi, strzykawek oraz igieł.Oznakuj stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów i umieść je w lodzie. Odessać pożywkę wzrostową z komórek, a następnie przemyć je dwukrotnie 7,5 mililitrami zimnego PBS. Po drugim przemyciu dodać pięć mililitrów zimnego PBS do każdej szalki i za pomocą skrobaka do komórek zebrać komórki z płytki.Przenieś komórki do schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie wiruj przy 500 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po wirowaniu usuń nadsącz i oszacuj objętość osadu komórkowego, porównując ją z znanymi objętościami cieczy w podobnych probówkach. Wiruj probówki przez kolejną minutę, a następnie usuń pozostały PBS za pomocą pipety.Osad komórkowy zawiesić w 150 µL odczynnika do ekstrakcji nuke buster extraction reagent one na każde 50 µL upakowanej objętości komórek. Następnie przenieść resuspendowane komórki do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 1,5 mL i mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund z dużą prędkością. Po wirowaniu w vortexie inkubować probówkę na lodzie przez pięć minut, następnie ponownie mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund i odwirować przy 13 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Po wirowaniu usunąć i odrzucić nadsącz zawierający frakcję cytoplazmatyczną. Osad zawiesić w mieszaninie 1 µL 100x koktajlu inhibitorów proteaz, 1 µL 100 mM DTT oraz 75 µL odczynnika Nuke Buster Extraction Reagent 2 na każde 50 µL objętości upakowanych komórek.Mieszaj komórki w vortexie przez 15 sekund z wysoką prędkością. Inkubuj na lodzie przez pięć minut, a następnie ponownie mieszaj w vortexie przez 15 sekund z wysoką prędkością i wiruj w wirówce przy 13 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu użyj strzykawki, aby przenieść nadsącz zawierający białka jądrowe do kasety do dializy z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 7 000.Następnie należy dodać 500 µL 1 M DTT do 500 mL schłodzonego buforu do dializy i dializować lizat przez 90 minut w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Po 90 minutach kasetę do dializy należy przenieść do drugiego zlewki zawierającej 0,5 l schłodzonego buforu do dializy z DTT i kontynuować dializę lizatu przez kolejne 90 minut w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Po dializie ekstrakt może ulec krystalizacji ze względu na wysokie stężenie białek.Następnie włóż nową strzykawkę do innego portu niż ten, którego użyto do wstrzyknięcia kasety, i pobierz zdializowany roztwór białek jądrowych z kasety dializacyjnej. Podczas pobierania zdializowanego roztworu białek jądrowych staraj się uwzględnić widoczne, mętne kryształy. Przenieś próbkę do probówek do mikrocentryfugi w alikwotach po 20 µL, zamroź szybko na suchym lodzie, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.Wyznaczyć stężenie białka i przeprowadzić kontrolę jakości zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Aby przeprowadzić test z wykorzystaniem molekularnych sond typu beacon, rozmrozić i rozcieńczyć lizaty komórkowe do stężenia 2 µg/µL białka w podstawowym buforze do reakcji naprawy przez wycinanie zasad zawierającym 1 mM DTT; rozcieńczyć molekularne sondy typu beacon do stężenia 200 µM w podstawowym buforze do reakcji naprawy przez wycinanie zasad. Ponieważ urządzenie do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym zazwyczaj nie jest używane jako fluorymetr, należy zmienić metodę pomiaru w urządzeniu do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym tak, aby zbierać dane co 20 s w temperaturze 37 °C przez co najmniej 180 cykli.Następnie co 20 sekund przez 15 cykli przy maksymalnej fluorescencji sondy molekularnej (molecular beacon), aby uzyskać dane do normalizacji. Ustaw objętość reakcji na 25 µL. Następnie skonfiguruj projekt płytki w urządzeniu za pomocą oprogramowania Applied Biosystems, wybierając krzywą standardową jako typ eksperymentu, i uzupełnij układ płytki.Przykład przedstawiono w poniższej tabeli, która znajduje się również w załączonym dokumencie. Do studzienki wybranej jako krzywa wzorcowa nie należy dodawać żadnych składników. Bufor do reakcji naprawy przez wycinanie zasad (basic excision repair), DTT, lizat komórkowy o stężeniu 2 µg/µL oraz wszystkie latarnie molekularne (molecular beacons) wykorzystywane w doświadczeniu należy umieścić w lodzie.Następnie dodaj DTT do buforu reakcyjnego do podstawowej naprawy przez wycinanie (BER) do stężenia końcowego 1 mM. Pipetuj 15 µL buforu reakcyjnego do podstawowej naprawy przez wycinanie z DTT do każdej studzienki kompatybilnej optycznej płytki qPCR w lodzie. Następnie, zgodnie z układem płytki, pipetuj sondy typu beacon do odpowiednich studzienek.Każdą kombinację lizatu z beaconem molekularnym lub kontrolą należy przebadać w trzech powtórzeniach. Na koniec do odpowiednich dołków pipetować 5 µL rozcieńczonego lizatu jądrowego na dołek. Należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich odczynników do beaconów molekularnych w niskiej temperaturze oraz o pipetowaniu lizatów do płytki jako ostatnim etapie.Należy pamiętać, że lizaty zawierają aktywne białka, które zaczną naprawiać sondy molekularne (molecular beacons) natychmiast po ich pipetowaniu do mieszaniny reakcyjnej. Dlatego bardzo ważne jest utrzymywanie wszystkich odczynników w niskiej temperaturze, aby zminimalizować zakres naprawy sond przed rozpoczęciem pomiarów. Po dodaniu wszystkich składników należy uszczelnić płytkę za pomocą optycznej folii klejącej i wymieszać zawartość, delikatnie opukując płytkę.Następnie wykonaj krótkie, dziesięciosekundowe wirowanie w wirówce, aby zebrać roztwory na dnie probówek lub płytki; po wirowaniu umieść płytkę w urządzeniu do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym i rozpocznij analizę. Po zakończeniu wyeksportuj surowe dane, najlepiej w formacie Excel, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami w załączonym dokumencie, aby przeanalizować dane po wykonaniu niezbędnych obliczeń. Przedstaw znormalizowane dane fluorescencji jako procent wolnego FAM w funkcji czasu w sekundach na wykresie punktowym wraz z odpowiednimi błędami, aby ocenić aktywność naprawy DNA oraz jakość ekstraktów jądrowych z komórek LN 4 28 oraz linii komórkowej z nadekspresją MPG oznaczonej jako LN 4 28 MPG. Analiza opisana w tym filmie została przeprowadzona z użyciem molekularnej sondy (molecular beacon) zawierającej substrat APE one tetra furin jako kontrolę pozytywną.Jak pokazano na tej rycinie, obie linie komórkowe wykazują silną aktywność APE1, na co wskazuje strome nachylenie krzywej, oraz aktywnośćy glikozylazy DNA specyficzną dla usuwania substratu MPG. Poziom hypoksantyny, oznaczonej jako HX, zmierzono w lizatach jąder komórkowych obu linii komórkowych. Każdy lizat analizowano przy użyciu kontrolnej sondy molekularnej do naprawy przez wycinanie zasad (BER) lub sondy molekularnej BER HX; dla sondy kontrolnej LN 4 28 kolor zielony został przypisany do kontroli, a kolor fioletowy do LN 4 28 MPG w przypadku sondy dla hypoksantyny.LN 4 28 przedstawiono w kolorze niebieskim, a LN 4 28 MPG w kolorze pomarańczowym. Wyniki przedstawiono jako A średnie jednostki fluorescencji oraz B znormalizowaną fluorescencję. W każdej komórce wystąpił zależny od czasu wzrost fluorescencji, co wskazuje na naprawę HX.Lizat inkubowany z molekularną latarnią HX zgodnie z oczekiwaniami. Linia komórkowa LN 4 28 MPG, zaznaczona pomarańczową linią, wykazała znacznie wyższą szybkość naprawy, o czym świadczy szybsza akumulacja fluorescencji niż w przypadku rodzimej linii komórkowej LN 4 28, która posiada minimalną ilość białka MPG. Zatem szybkość naprawy specyficznych uszkodzeń DNA przez konkretne białka naprawcze może być mierzona w ekstraktach komórkowych w czasie rzeczywistym przy minimalnym poziomie tła niespecyficznego cięcia DNA.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat projektowania sond molekularnych (molecular beacons) oraz pomiaru szybkości naprawy DNA w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem oczyszczonych białek lub lizatów komórkowych. W odniesieniu do analizy, niezbędna jest ocena zakresu dynamicznego i wartości tła, co należy osiągnąć poprzez włączenie reakcji kontrolnych, na przykład z wykorzystaniem pozytywnych i negatywnych sond kontrolnych lub bez nich. Biorąc pod uwagę zmienność między poszczególnymi dołkami, przydatna jest normalizacja danych w pojedynczych dołkach do wartości wejściowych.Są one określane przez dokładniejszy krok temperatury topnienia. To, wraz z zastosowaniem innych barwników, takich jak barwnik referencyjny, pozwoli zniwelować zmienność wynikającą z błędów pipetowania lub różnic w detektorach. Technika ta pozwoliła nam wyjaśnić wpływ poszczególnych komponentów naprawy przez wycinanie zasad na ogólną aktywność i wydolność procesu naprawy.Jest ono wystarczająco czułe, aby wykryć niewielkie zmiany, które nie byłyby zauważalne przy użyciu konwencjonalnych metod.

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ilościowa, czasu rzeczywistego analiza aktywności naprawy wycinania zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem sond molekularnych specyficznych dla uszkodzeń

Wzbogacanie gDNA do sekwencjonowania NGS jest łatwym i potężnym narzędziem do badania mutacji konstytucyjnych. W tym artykule przedstawiamy procedurę analizy w prosty sposób pełnej sekwencji 11 genów biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA.

Wzbogacanie gDNA za pomocą technologii opartej na transpozazie do analizy NGS całej sekwencji genów BRCA1, BRCA2 i 9 biorących udział w naprawie uszkodzeń DNA

Tutaj pokazano badanie różnych podejść do rozpoznawania zmian DNA za pomocą obrazowania AFM pojedynczej cząsteczki na przykładzie systemu naprawy wycinania nukleotydów. Opisano procedury przygotowania próbek DNA i białek oraz szczegóły doświadczalne i analityczne dla doświadczeń AFM.

Badania mikroskopii sił atomowych rozpoznawania zmian DNA w naprawie przez wycinanie nukleotydów

Tutaj pokazano, jak test ligacji zbliżeniowej in situ (PLA) może być wykorzystany do wykrywania i wizualizacji bezpośrednich interakcji białko-białko między ATM i p53 w hodowlach komórek zawiesinowych narażonych na stres genotoksyczny.

Wykrywanie i wizualizacja kompleksów białkowych indukowanych uszkodzeniem DNA w hodowlach komórek zawiesinowych za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Badanie kinetyki naprawy uszkodzeń DNA wymaga systemu do wywoływania uszkodzeń w określonych regionach subjądrowych. Opisujemy metodę tworzenia zlokalizowanych dwuniciowych pęknięć za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser 405 nm i zapewniamy zautomatyzowane procedury ilościowego określania dynamiki czynników naprawczych w tych zmianach.

Badanie rekrutacji białek do zmian DNA za pomocą mikropromieniowania laserowego 405 nm

Celem tego protokołu jest ilościowe określenie naprawy zdefiniowanych wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidowym DNA. Uszkodzone plazmidy są transfekowane do linii komórkowych ssaków biorcy i zbierane o niskiej masie cząsteczkowej w wielu punktach czasowych po transfekcji. Kinetykę naprawy DNA określa się ilościowo za pomocą specyficznego dla nici wydłużania startera, a następnie qPCR.

Prosty, szybki i ilościowy test do pomiaru naprawy wiązań krzyżowych DNA-białko na plazmidach transfekowanych do komórek ssaków

Nieoznakowana, nieradio-izotopowa metoda korekty polimerazy DNA i testu naprawy DNA została opracowana przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF o wysokiej rozdzielczości i strategii przedłużania pojedynczego nukleotydu. Test okazał się bardzo specyficzny, prosty, szybki i łatwy do wykonania w przypadku korekty i naprawy łatek krótszych niż 9-nukleotydy.

Korekta i test naprawy DNA przy użyciu przedłużenia pojedynczego nukleotydu i analizy spektrometrii mas MALDI-TOF

Przedstawiono tutaj endonukleazę sgRNA/CAS9 oraz protokół sekwencjonowania nowej generacji, który może być wykorzystany do identyfikacji mutacji związanych z naprawą pęknięć podwójnej nici w pobliżu promotora CD4.

Wykorzystanie sekwencjonowania nowej generacji do identyfikacji mutacji związanych z naprawą wywołanego przez CAS9 pęknięcia podwójnej nici w pobliżu promotora CD4

Testy wychwytywania pętli D (DLC) i przedłużania pętli D (DLE) wykorzystują zasadę ligacji zbliżeniowej wraz z ilościowym PCR do ilościowego określenia powstawania pętli D, wydłużania pętli D i tworzenia produktu w miejscu indukowalnego dwuniciowego pęknięcia u Saccharomyces cerevisiae.

Wykrywanie produktów pośrednich rekombinacji homologicznej poprzez ligację zbliżeniową i ilościową reakcję PCR u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj przedstawiono protokół oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe, na przykładzie enzymów ligazy, nukleazy i polimerazy. Test wykorzystuje znakowane fluorescencyjnie i nieznakowane oligonukleotydy, które można łączyć w dupleksy naśladujące uszkodzenia RNA i / lub DNA lub pośrednie szlaki, co pozwala na scharakteryzowanie zachowania enzymu.

Wykorzystanie zmodyfikowanych syntetycznych oligonukleotydów do oznaczania enzymów metabolizujących kwasy nukleinowe

Prezentujemy protokoły oceny biegłości w naprawie szlaku pęknięć dwuniciowych w komórkach przy użyciu zestawu pozachromosomalnych substratów reporterowych opartych na luminescencji.

Ocena aktywności naprawczej pęknięć podwójnej nici DNA przy użyciu wysokoprzepustowych i ilościowych testów reporterowych opartych na luminescencji

Poznaj metodę ilościowej analizy aktywności naprawczej DNA w lizatach jądrowych z wykorzystaniem sygnalizatorów molekularnych. Technika umożliwia pomiar kinetyczny glikozylaz i endonukleaz AP w czasie rzeczywistym.

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawczej przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla zmian molekularnych sygnalizatorów (Wideo) | JoVE Journal

Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Przeglądaj więcej filmów