Ilościowa analiza w czasie rzeczywistym aktywności naprawy przez wycinanie zasad w lizatach komórkowych z wykorzystaniem specyficznych dla uszkodzeń sond molekularnych (molecular beacons)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest pomiar szybkości naprawy DNA w ekstraktach jądrowych komórek w czasie rzeczywistym przy użyciu beacony molekularnych, które fluorescują po dokonaniu naprawy. Beacony molekularne do badania podstawowej naprawy przez wycinanie składają się z deoksyoligonukleotydów w strukturze pętli z łodygą, zawierającej pojedynczą lekcję zasady, z sześcioma grupami fluoresceiny (FAM) sprzężonymi z końcami 5' oraz grupami Dabcyl sprzężonymi z końcami 3' w stanie pofałdowania. Grupa FAM jest wygaszana przez Dabcyl w sposób niefluorescencyjny poprzez transfer energii Förestera.

Aby ocenić aktywność naprawy DNA, sondy (beacons) inkubuje się z ekstraktami jądrowymi komórek zawierającymi enzymy naprawcze. DNA glikozylaza rozpoznaje i usuwa uszkodzenie DNA w sondzie. Powstałe miejsca ABA stanowią substraty dla endonukleazy AP 1 lub ape1. Po rozpoznaniu APE1 przecina szkielet DNA w miejscu ABA, co pozwala na swobodne odłączenie się fragmentu DNA zawierającego 6-fam od spinki do włosów.

Oddzielenie od wygaszacza skutkuje wzrostem fluorescencji, który jest proporcjonalny do poziomu naprawy DNA i może być oceniany w czasie rzeczywistym przy użyciu urządzenia do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Zdolność do naprawy uszkodzeń DNA jest kluczowa dla każdej komórki i każdego organizmu. Wśród wielu komórkowych szlaków naprawy DNA, naprawa przez wycinanie zasad (BER) celuje w uszkodzone zasady, które mogą być wynikiem czynników utleniających lub chemicznych; wyjaśnienie roli poszczególnych elementów komórkowych, które mogą wpływać na naprawę przez wycinanie zasad, jest jednym z głównych celów badań w naszym laboratorium.

W związku z tym, dokładny i czuły pomiar aktywności naprawy DNA stał się przedmiotem zainteresowania w naszym laboratorium. Niniejszy test może dostarczyć takich danych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak znakowanie 32 PN i analiza za pomocą elektroforezy żelowej, jest fakt, że nasza metoda nie wykorzystuje radioaktywnie znakowanych substratów, pozwala na pomiar szybkości naprawy DNA w czasie rzeczywistym i charakteryzuje się bardzo szerokim zakresem dynamicznym.

Ponadto podejście to może wykorzystywać kilka różnych fluoroforów i/lub uszkodzeń zasad w celu określenia specyficzności substratowej. Wykazaliśmy, że test ten jest wysoce ilościowy i bardzo czuły w różnych warunkach. Ten test z użyciem molekularnych beaconów do badania naprawy przez wycinanie zasad nadaje się do analizy kinetycznej.

Wysoka czułość i swoistość testu umożliwiają dokładne ilościowe oznaczenie naprawy przez wycinanie zasad, co czyni go użytecznym w badaniach przesiewowych inhibitorów naprawy lub ich walidacji. Ponadto metoda ta może być dostosowana do pomiaru aktywności naprawy DNA w tkankach oraz lizatach komórek nowotworowych w celu oznaczenia funkcjonalnych biomarkerów. Projektując sondy molekularne (molecular beacons) do tego testu, należy uwzględnić następujące oligonukleotydy DNA o długości 43 zasad, przedstawione tutaj.

Działa sprawnie. Sekwencja DNA nie jest unikalna, ale musi umożliwiać tworzenie struktury spinki do włosów. Gdy jest ona zgięta w sposób pokazany tutaj, specyficzność osiąga się poprzez wprowadzenie specyficznych uszkodzeń zasad, takich jak uracyl lub tetrahydrofuran.

W pozycji X, sześć zasad od końca 5', zawartość GC powinna wynosić co najmniej 32%, a zasada GB nie powinna znajdować się na końcu 5'. Do końca 5' należy przyłączyć sześć cząsteczek karboksyfluoresceiny lub sześć cząsteczek FAM, natomiast koniec 3' powinien zostać zmodyfikowany za pomocą dab sil. Będzie to stanowiło substrat dla białek naprawy DNA, aby zapewnić wiązanie i aktywność glikozylaz.

Położenie miejsca uszkodzenia wybrano tak, aby zapewnić wystarczającą odległość od struktury spinki do włosów oraz końca DNA. Długość łodygi lub dupleksu spinki do włosów powinna wynosić minimum 15 par zasad. Zalecana długość pętli to 13 zasad.

Kontrolna sonda molekularna (molecular beacon) powinna być identyczna z sondą eksperymentalną, z wyjątkiem tego, że nie zawiera ona uszkodzenia DNA. W związku z tym nie powinna być rozpoznawana przez enzymy naprawy DNA. Po otrzymaniu sond molekularnych należy przeprowadzić ocenę jakości, aby upewnić się, że sondy nie wykazują fluorescencji do momentu podgrzania.

Aby określić optymalną temperaturę topnienia, wszystkie etapy procedury ekstrakcji należy przeprowadzać na lodzie lub w temperaturze 4 °C. W celu zapewnienia stabilności białek, należy przygotować się do eksperymentu poprzez uprzednie schłodzenie następujących elementów: dwóch zlewków o pojemności 1 l na próbkę, buforu do dializy, komór dializacyjnych, probówek do mikrocentryfugi, strzykawek oraz igieł.

Oznakuj stożkowe probówki o pojemności 15 mililitrów i umieść je w lodzie. Odessać pożywkę wzrostową z komórek, a następnie przemyć je dwukrotnie 7,5 mililitrami zimnego PBS. Po drugim przemyciu dodać pięć mililitrów zimnego PBS do każdej szalki i za pomocą skrobaka do komórek zebrać komórki z płytki.

Przenieś komórki do schłodzonej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, a następnie wiruj przy 500 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po wirowaniu usuń nadsącz i oszacuj objętość osadu komórkowego, porównując ją z znanymi objętościami cieczy w podobnych probówkach. Wiruj probówki przez kolejną minutę, a następnie usuń pozostały PBS za pomocą pipety.

Osad komórkowy zawiesić w 150 µL odczynnika do ekstrakcji nuke buster extraction reagent one na każde 50 µL upakowanej objętości komórek. Następnie przenieść resuspendowane komórki do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 1,5 mL i mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund z dużą prędkością. Po wirowaniu w vortexie inkubować probówkę na lodzie przez pięć minut, następnie ponownie mieszać w wstrząsarze typu vortex przez 15 sekund i odwirować przy 13 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu usunąć i odrzucić nadsącz zawierający frakcję cytoplazmatyczną. Osad zawiesić w mieszaninie 1 µL 100x koktajlu inhibitorów proteaz, 1 µL 100 mM DTT oraz 75 µL odczynnika Nuke Buster Extraction Reagent 2 na każde 50 µL objętości upakowanych komórek.

Mieszaj komórki w vortexie przez 15 sekund z wysoką prędkością. Inkubuj na lodzie przez pięć minut, a następnie ponownie mieszaj w vortexie przez 15 sekund z wysoką prędkością i wiruj w wirówce przy 13 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Po wirowaniu użyj strzykawki, aby przenieść nadsącz zawierający białka jądrowe do kasety do dializy z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 7 000.

Następnie należy dodać 500 µL 1 M DTT do 500 mL schłodzonego buforu do dializy i dializować lizat przez 90 minut w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Po 90 minutach kasetę do dializy należy przenieść do drugiego zlewki zawierającej 0,5 l schłodzonego buforu do dializy z DTT i kontynuować dializę lizatu przez kolejne 90 minut w temperaturze 4 °C przy łagodnym mieszaniu. Po dializie ekstrakt może ulec krystalizacji ze względu na wysokie stężenie białek.

Następnie włóż nową strzykawkę do innego portu niż ten, którego użyto do wstrzyknięcia kasety, i pobierz zdializowany roztwór białek jądrowych z kasety dializacyjnej. Podczas pobierania zdializowanego roztworu białek jądrowych staraj się uwzględnić widoczne, mętne kryształy. Przenieś próbkę do probówek do mikrocentryfugi w alikwotach po 20 µL, zamroź szybko na suchym lodzie, a następnie przechowuj w temperaturze -80 °C do czasu użycia.

Wyznaczyć stężenie białka i przeprowadzić kontrolę jakości zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie. Aby przeprowadzić test z wykorzystaniem molekularnych sond typu beacon, rozmrozić i rozcieńczyć lizaty komórkowe do stężenia 2 µg/µL białka w podstawowym buforze do reakcji naprawy przez wycinanie zasad zawierającym 1 mM DTT; rozcieńczyć molekularne sondy typu beacon do stężenia 200 µM w podstawowym buforze do reakcji naprawy przez wycinanie zasad. Ponieważ urządzenie do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym zazwyczaj nie jest używane jako fluorymetr, należy zmienić metodę pomiaru w urządzeniu do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym tak, aby zbierać dane co 20 s w temperaturze 37 °C przez co najmniej 180 cykli.

Następnie co 20 sekund przez 15 cykli przy maksymalnej fluorescencji sondy molekularnej (molecular beacon), aby uzyskać dane do normalizacji. Ustaw objętość reakcji na 25 µL. Następnie skonfiguruj projekt płytki w urządzeniu za pomocą oprogramowania Applied Biosystems, wybierając krzywą standardową jako typ eksperymentu, i uzupełnij układ płytki.

Przykład przedstawiono w poniższej tabeli, która znajduje się również w załączonym dokumencie. Do studzienki wybranej jako krzywa wzorcowa nie należy dodawać żadnych składników. Bufor do reakcji naprawy przez wycinanie zasad (basic excision repair), DTT, lizat komórkowy o stężeniu 2 µg/µL oraz wszystkie latarnie molekularne (molecular beacons) wykorzystywane w doświadczeniu należy umieścić w lodzie.

Następnie dodaj DTT do buforu reakcyjnego do podstawowej naprawy przez wycinanie (BER) do stężenia końcowego 1 mM. Pipetuj 15 µL buforu reakcyjnego do podstawowej naprawy przez wycinanie z DTT do każdej studzienki kompatybilnej optycznej płytki qPCR w lodzie. Następnie, zgodnie z układem płytki, pipetuj sondy typu beacon do odpowiednich studzienek.

Każdą kombinację lizatu z beaconem molekularnym lub kontrolą należy przebadać w trzech powtórzeniach. Na koniec do odpowiednich dołków pipetować 5 µL rozcieńczonego lizatu jądrowego na dołek. Należy pamiętać o przechowywaniu wszystkich odczynników do beaconów molekularnych w niskiej temperaturze oraz o pipetowaniu lizatów do płytki jako ostatnim etapie.

Należy pamiętać, że lizaty zawierają aktywne białka, które zaczną naprawiać sondy molekularne (molecular beacons) natychmiast po ich pipetowaniu do mieszaniny reakcyjnej. Dlatego bardzo ważne jest utrzymywanie wszystkich odczynników w niskiej temperaturze, aby zminimalizować zakres naprawy sond przed rozpoczęciem pomiarów. Po dodaniu wszystkich składników należy uszczelnić płytkę za pomocą optycznej folii klejącej i wymieszać zawartość, delikatnie opukując płytkę.

Następnie wykonaj krótkie, dziesięciosekundowe wirowanie w wirówce, aby zebrać roztwory na dnie probówek lub płytki; po wirowaniu umieść płytkę w urządzeniu do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym i rozpocznij analizę. Po zakończeniu wyeksportuj surowe dane, najlepiej w formacie Excel, a następnie postępuj zgodnie z instrukcjami w załączonym dokumencie, aby przeanalizować dane po wykonaniu niezbędnych obliczeń. Przedstaw znormalizowane dane fluorescencji jako procent wolnego FAM w funkcji czasu w sekundach na wykresie punktowym wraz z odpowiednimi błędami, aby ocenić aktywność naprawy DNA oraz jakość ekstraktów jądrowych z komórek LN 4 28 oraz linii komórkowej z nadekspresją MPG oznaczonej jako LN 4 28 MPG. Analiza opisana w tym filmie została przeprowadzona z użyciem molekularnej sondy (molecular beacon) zawierającej substrat APE one tetra furin jako kontrolę pozytywną.

Jak pokazano na tej rycinie, obie linie komórkowe wykazują silną aktywność APE1, na co wskazuje strome nachylenie krzywej, oraz aktywnośćy glikozylazy DNA specyficzną dla usuwania substratu MPG. Poziom hypoksantyny, oznaczonej jako HX, zmierzono w lizatach jąder komórkowych obu linii komórkowych. Każdy lizat analizowano przy użyciu kontrolnej sondy molekularnej do naprawy przez wycinanie zasad (BER) lub sondy molekularnej BER HX; dla sondy kontrolnej LN 4 28 kolor zielony został przypisany do kontroli, a kolor fioletowy do LN 4 28 MPG w przypadku sondy dla hypoksantyny.

LN 4 28 przedstawiono w kolorze niebieskim, a LN 4 28 MPG w kolorze pomarańczowym. Wyniki przedstawiono jako A średnie jednostki fluorescencji oraz B znormalizowaną fluorescencję. W każdej komórce wystąpił zależny od czasu wzrost fluorescencji, co wskazuje na naprawę HX.

Lizat inkubowany z molekularną latarnią HX zgodnie z oczekiwaniami. Linia komórkowa LN 4 28 MPG, zaznaczona pomarańczową linią, wykazała znacznie wyższą szybkość naprawy, o czym świadczy szybsza akumulacja fluorescencji niż w przypadku rodzimej linii komórkowej LN 4 28, która posiada minimalną ilość białka MPG. Zatem szybkość naprawy specyficznych uszkodzeń DNA przez konkretne białka naprawcze może być mierzona w ekstraktach komórkowych w czasie rzeczywistym przy minimalnym poziomie tła niespecyficznego cięcia DNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat projektowania sond molekularnych (molecular beacons) oraz pomiaru szybkości naprawy DNA w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem oczyszczonych białek lub lizatów komórkowych. W odniesieniu do analizy, niezbędna jest ocena zakresu dynamicznego i wartości tła, co należy osiągnąć poprzez włączenie reakcji kontrolnych, na przykład z wykorzystaniem pozytywnych i negatywnych sond kontrolnych lub bez nich. Biorąc pod uwagę zmienność między poszczególnymi dołkami, przydatna jest normalizacja danych w pojedynczych dołkach do wartości wejściowych.

Są one określane przez dokładniejszy krok temperatury topnienia. To, wraz z zastosowaniem innych barwników, takich jak barwnik referencyjny, pozwoli zniwelować zmienność wynikającą z błędów pipetowania lub różnic w detektorach. Technika ta pozwoliła nam wyjaśnić wpływ poszczególnych komponentów naprawy przez wycinanie zasad na ogólną aktywność i wydolność procesu naprawy.

Jest ono wystarczająco czułe, aby wykryć niewielkie zmiany, które nie byłyby zauważalne przy użyciu konwencjonalnych metod.