Obróbka poprodukcyjna włókien elektroprzędzonych dla inżynierii tkankowej

Celem tej procedury jest wyprodukowanie elektro wirowanych biodegradowalnych rusztowań, które mogą być sterylizowane i wykonane z wystarczająco grubych i o odpowiedniej wytrzymałości mechanicznej dla klinicznej inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez pierwsze elektroprzędzenie biodegradowalnych polimerów w pierwotne architektury, losowe lub zależne i zorientowane lub sekwencyjnie warstwowe. Drugim krokiem jest zastosowanie modyfikacji po przędzeniu na rusztowaniach poprzez połączenie kilku warstw i ich sterylizację.

Następnie komórki są wprowadzane na rusztowania i oceniane jest ich działanie w trakcie i po hodowli. Ostatnim krokiem jest poddanie komórek reżimowi ćwiczeń, aby naśladować stres fizjologiczny, jaki komórki napotkają w organizmie, aby przygotować je do przeszczepu. Ostatecznie możemy ocenić reakcję komórek na ćwiczenia, mierząc macierz zewnątrzkomórkową, którą wytwarzają w odpowiedzi na dynamiczne napięcie.

Technika ta jest wszechstronna i elastyczna, co pozwala na wykonanie szerokiej gamy rusztowań o właściwościach specjalnie zmodyfikowanych dla wymaganego zastosowania. Na przykład rusztowania mogą być zaprojektowane do leczenia trudnych stanów, w których konieczna jest naprawa tkanek, takich jak zastąpienie rozległej utraty skóry u ciężko poparzonych pacjentów lub naprawa uszkodzonej błony śluzowej jamy ustnej po raku lub urazie. Chociaż ten film pokazuje trwałą produkcję komórek jako marker stresu dynamicznego, możesz również rozważyć szereg białek macierzy zewnątrzkomórkowej, a także ocenić wiele innych aspektów biologii komórki przy użyciu komórek ćwiczonych lub niećwiczących.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z uzyskaniem powtarzalnych rusztowań, ponieważ na proces elektroprzędzenia wpływa wiele zmiennych. Ważna jest wizualna demonstracja obróbki rusztowań wirowanych elektrycznie po przędzeniu. Rzadko się o tym mówi.

Znajomość procesu jest niezbędna, aby technika mogła być z powodzeniem stosowana w klinice. Zacznij od pokrycia obrotowego kolektora trzpieniowego folią aluminiową błyszczącą stroną skierowaną na zewnątrz. Następnie umieść cztery pięciomililitrowe strzykawki załadowane pięciomililitrowymi mililitrami interesującego Cię polimeru.

Tutaj kwas polimlekowy jest używany do pompy strzykawkowej. Ustaw natężenie przepływu na 40 mikrolitrów na minutę na strzykawkę, a odległość roboczą na 17 centymetrów od końcówki igły do trzpienia. Następnie naładuj igły strzykawki do plus 17 000 woltów i wiruj elektro z odpowiedniej odległości na trzpieniu pokrytym folią aluminiową, aby wyrównać włókna.

Obróć manl z prędkością 1000 obr./min dla losowych włókien. Obróć manl z prędkością 200 obr./min. Rusztowania do bułek elektrycznych mogą być przechowywane na folii aluminiowej w szczelnym pojemniku w temperaturze czterech stopni Celsjusza w obecności środka osuszającego przez co najmniej cztery miesiące po elektroprzędzeniu drugiego polimeru PHBV Lotus.

Znowu tutaj. PLA pokazał nakładanie warstw na PHBV, a następnie przy użyciu parametrów i normalnych warunków dla tego spinu polimeru. Ponownie, ten proces addytywny tworzy podwójną warstwę rusztowania, tworząc dwuwarstwę w celu wytworzenia wielowarstwowego rusztowania za pomocą grzejnika.

Klęcząc, umieść cztery arkusze PLGA jeden na drugim, a następnie podgrzej i klęknij arkusze w temperaturze 60 stopni Celsjusza przez trzy godziny, aby wytworzyć wielowarstwowe rusztowanie przez klęczenie parowe. Wlej 10 mililitrów metanu DILU lub DCM do pojemnika o odpowiedniej wielkości. Następnie umieść cztery arkusze PLGA jeden na drugim i zawieś je dwa centymetry nad DCM.

Na koniec zamknij pojemnik na godzinę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać aseptyczną produkcję rusztowania przez wirowanie elektryczne, rozpuść polimery klasy medycznej wysterylizowane przez inkubację w DCM, a następnie elektro. Odwiruj roztwór polimeru na sterylnej folii owiniętej wokół wysterylizowanego trzpienia. Następnie w sterylnym okapie z przepływem lanar inkubować rusztowanie w pożywce wzrostowej wolnej od antybiotyków przez odpowiedni okres, aby zweryfikować sterylność próbek podczas eksperymentalnej dezynfekcji etanolem.

Umieść rusztowania w roztworze etanolu i wody destylowanej na 15 minut. Do sterylizacji kwasem nadoctowym. Zanurz rusztowania w roztworze kwasu paracetowego i PBS na trzy godziny.

W temperaturze pokojowej do sterylizacji gamma należy napromienić rusztowania dawką trzech kilogramów graya za pomocą źródła cezu, a następnie pociąć rusztowania na prostokąty o wymiarach pięć milimetrów na 20 milimetrów. Następnie za pomocą mikrometru zmierz grubość rusztowania. Następnie umieść prostokąty w instrumencie Bose electro force 3, 100.

Oblicz moduł i sprężystość młodego na podstawie obciążenia w funkcji przemieszczenia jako krzywą naprężenie-odkształcenie wykreśloną przez przyrząd. Zacznij od oznaczenia komórek barwnikiem fluorescencyjnym przed zasianiem komórek. Następnie inkubuj zbieg, ludzkie fibroblasty skóry w trypsynie i EDTA przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie odwiruj odłączone komórki przez 10 minut w temperaturze 150 razy G w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach DMEM. Po zliczeniu dostosuj stężenie komórek do wysiewu i wysiewaj komórki na rusztowaniach. Teraz zobrazuj powierzchnię oznaczonych rusztowań za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać penetrację komórek Głębiej w rusztowaniach można użyć wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.

W ten sposób można osiągnąć penetrację około 200 mikronów do większości rusztowań z komórkami lub bez. Następnie, po wyhodowaniu rusztowań z nasionami, utrwal próbki w jednym mililitrze formaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po utrwaleniu umyj próbki trzykrotnie jednym mililitrem PBS, teraz inkubuj każdą z próbek w 200 mikrolitrach przeciwciał pierwszorzędowych elastyny przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przemyć próbki jeszcze trzy razy w jednym mililitrze PBS, a następnie inkubować próbki w roztworze przeciwciała drugorzędowego w PBS zawierającym DPI przez 30 minut. Na koniec, po ostatnim umyciu próbek na obrazie PBS, próbki na mikroskopie fluorescencyjnym przy użyciu wzbudzenia 365 nanometrów i remisji 460 nanometrów dla DPI oraz 480 nanometrowych wzbudzeń i 533 nanometrów reemisji dla przeciwciała wtórnego. Najpierw autoklaw aparat do regulacji przepływu i balon, a następnie w czystym pomieszczeniu, rozpakuj aparat w okapie z przepływem laminarnym w pozycji do wirowania elektrycznego.

Następnie podłącz 50-mililitrową strzykawkę wypełnioną PBS do odgałęzienia kranu trójdrożnego i napompuj balon PBS, aż będzie jędrny. Teraz elektro obróć żądany polimer na balonie. Stosując normalne warunki wirowania i odległość roboczą 10 centymetrów, mokre włókna są wystarczająco lepkie, aby przylegać do powierzchni balonu bez późniejszego odklejania.

Po wyschnięciu rusztowania umieść balon w sterylnym naczyniu, a następnie przetransportuj naczynie do okapu z przepływem blaszki Nadaje się do hodowli komórek. Hodowla komórek na rusztowaniu na rozdętym balonie w celu poddania komórek warunkowaniu biomechanicznemu jest najtrudniejszą częścią tej procedury. Konieczne jest wielokrotne oparcie balonu roztworem komórkowym, aby przymocować jak najwięcej komórek do rusztowania.

Okazuje się, że zajmuje to około 20 minut. W kapturze wyjmij balon z naczynia i umieść go na sterylnej powierzchni, takiej jak użyta tutaj szalka Petriego i pipetuj zawiesinę komórek na powlekanym balonie co 20 sekund przez 20 minut, aby spróbować równomiernie rozprowadzić komórki na powierzchni balonu. Następnie umieść balon z powrotem w naczyniu hodowlanym i dodaj wstępnie ogrzaną pożywkę odpowiednią do typu komórki.

Na koniec podłącz urządzenie do pompowania do pompy strzykawkowej i napompuj i opróżnij balon zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać rozciągnięcie dwuosiowe. Sterowana komputerowo pompa strzykawkowa może być użyta do osiągnięcia bardziej złożonego reżimu rozdęcia. Przędzenie elektryczne można wykorzystać do tworzenia rusztowań o losowych i uporządkowanych architekturach.

Jest to powtarzalne, a włókna są jednolite. Na przykład prostopadłe włókna można utworzyć poprzez elektroprzędzenie zestawu wyrównanych włókien na folii aluminiowej, obracając folię o 90 stopni, a następnie natychmiastowe elektroprzędzenie drugiego zestawu wyrównanych włókien na nich. Wiele rodzajów polimerów może być przędzonych elektro o właściwościach, które mogą się znacznie różnić, jak pokazano tutaj dla P-L-A-P-H-B-V-P-C-L i PLGA: należy pamiętać, że P-L-A-P-C-L i PLGA są jednolitymi rusztowaniami mikrowłóknistymi.

PHBV jest przędzony jako naszyjnik z pereł z nanowłóknami łączącymi koraliki o wielkości od pięciu do 20 mikronów. W tym przypadku rusztowania były początkowo przędzone przy użyciu PHBV, a następnie strzykawki były wypełniane PLA i obracane na rusztowaniach PHBV. Zdjęcia te pokazują reprezentatywne pojedyncze warstwy PHBV i PLA.

Ten obraz ilustruje, jak może wyglądać przekrój poprzeczny dwuwarstwy A-P-H-B-V-P-L-A z gęstym naszyjnikiem z nano włókien, warstwą PHBV i bardziej otwartą warstwą mikrowłóknistego PLA, jak mogą wyglądać wszystkie trzy typy rusztowań, które ułatwiają przyczepianie i proliferację komórek. Jeśli wymagane są grubsze rusztowania, do łączenia warstw rusztowań można zastosować klękanie pary i grzejnika, jak pokazano na kilku następnych zdjęciach. Warstwy rusztowania klęczącego nie rozwarstwiają się i znalezienie połączenia między warstwami może być bardzo trudne.

To zdjęcie pokazuje przekrój przez rusztowanie z parą i klęczącym PLA, w którym umieszczono początkowe włókniste rusztowania o wielkości około 150 mikronów. A następnie para DCM została użyta do wykonania znacznie grubszych rusztowań o grubości do 500 mikronów. Ten obraz pokazuje ten sam przekrój dwuwarstwy parowej zero około dwa razy Poprzednie powiększenie na tym obrazie obserwuj, jak rusztowanie składa się z warstw znacznie grubszych włókien w rozproszonych warstwach cieńszych włókien utworzonych przez grzejnik, klęczące warstwy cienkich i grubych włókien razem, aby wytworzyć rusztowania o złożonych właściwościach mechanicznych.

Po raz kolejny ten obraz pokazuje ten sam grzejnik klęczący na rusztowaniu cztery razy. Poprzednie powiększenie za pomocą błon warstwowych można wykonać z różnymi typami komórek, z których każda jest hodowana na oddzielnej membranie bez mieszania, jak pokazano na tych obrazach ludzkich fibroblastów skóry zabarwionych dwoma różnymi fluorescencyjnymi barwnikami śledzącymi komórki. Pierwszy obraz to fibroblasty na elektros bun PLA.

Komórki zostały utrwalone i wybarwione tutaj, poplamione fibroblasty zostały wysiane na electros bun PHBV. W tym eksperymencie fibroblasty zostały wstępnie wybarwione żywym zielonym znacznikiem komórek barwnikowych. Zauważ, że komórki znajdują się po stronie PLA dwuwarstwy.

Obraz ten przedstawia reprezentatywny przekrój przez dwuwarstwę z zabarwionymi na czerwono fibroblastami na dolnej powierzchni PHBV i zielonymi fibroblastami na górnej powierzchni PLA. Na tym zdjęciu fibroblasty wstępnie zabarwione na czerwono znacznikiem komórek podczas wzrostu na powierzchni A-P-H-B-V. W związku z tym zastosowanie ważnych barwników fluorescencyjnych zapewnia wygodną metodologię badania rozmieszczenia komórek na rusztowaniu, gdy komórki wciąż rosną.

Metoda sterylizacji wpływa na rusztowanie i późniejszą hodowlę komórkową. Ten wykres liniowy ilustruje wpływ kwasu paracetynowego, promieniowania gamma i etanolu na ostateczną wytrzymałość na rozciąganie i moduł Younga A PLG. Rusztowanie.

Każda z metod sterylizacji zmienia ostateczną wytrzymałość na rozciąganie i elastyczność rusztowań. Hodowla komórek na tych rusztowaniach dodatkowo zmniejsza ich końcowe naprężenie rozciągające, ale zwiększa elastyczność. Ten wykres słupkowy ilustruje wpływ metody sterylizacji na średnicę włókien pojedynczego rusztowania.

Promieniowanie gamma nie ma znaczącego wpływu na średnicę włókien, podczas gdy kwas paracetowy i etanol zmniejszają średnicę włókien o około 50%Dlatego najlepszym sposobem na uzyskanie sterylnych rusztowań jest wytwarzanie ich w warunkach aseptycznych. Ta ostatnia seria obrazów pokazuje, że komórki zachowują żywotność podczas dynamicznego rozdęcia, a także wytwarzają zwiększone ilości elastyny. Zwróć uwagę na rozwój ciemnoniebieskiego koloru wytwarzanego przez rosnące komórki, wykryty za pomocą wskaźnika metabolicznego. MTT.

W tym przypadku komórki w kolorze niebieskim wyhodowane na balonie i poddane dwuosiowemu rozdęciu rozwinęły włókna elastyny, na co wskazuje zielone zabarwienie. Kontrastuje to wyraźnie z brakiem elastyny, gdy te same komórki są utrzymywane w warunkach statycznych na identycznym rusztowaniu balonowym. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak hodowla statyczna i przepływ płynu przez komórki w rusztowaniach, aby zbadać, jak komórki reagują na różne warunki hodowli.

Opracowanie hodowli komórek na rusztowaniu na balonie, które można rozdęć, okazało się bardzo przydatne, ponieważ utorowało drogę naukowcom w dziedzinie inżynierii tkankowej do badania wpływu dynamicznego kondycjonowania komórek w konstruktach inżynierii tkankowej Nie zapominaj, że praca z zasilaczami wysokiego napięcia, rozpuszczalnikami, Lasery i komórki ludzkie mogą być niebezpieczne, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować odpowiednie szkolenie i środki ostrożności.