Obróbka potransprodukcyjna włókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia do inżynierii tkankowej

Celem niniejszej procedury jest wytworzenie biodegradowalnych rusztowań otrzymywanych metodą elektroprzędzenia, które mogą zostać poddane sterylizacji oraz uzyskać odpowiednią grubość i wytrzymałość mechaniczną niezbędną w klinicznej inżynierii tkankowej. Osiąga się to poprzez elektroprzędzenie polimerów biodegradowalnych w celu stworzenia pierwotnych architektur, które mogą być losowe, uporządkowane i zorientowane lub ułożone sekwencyjnie w warstwy. Drugim krokiem jest wprowadzenie modyfikacji po procesie przędzenia poprzez łączenie wielu warstw rusztowań i ich sterylizację.

Następnie komórki nanosi się na rusztowania, a ich kondycję w trakcie i po hodowli poddaje się ocenie. Ostatnim etapem jest poddanie komórek reżimowi ćwiczeń, aby zasymulować stres fizjologiczny, z którym komórki zetkną się w organizmie, w celu przygotowania ich do transplantacji. Ostatecznie odpowiedź komórek na ćwiczenia możemy ocenić, mierząc ilość wytworzonej przez nie macierzy zewnątrzkomórkowej w odpowiedzi na napięcie dynamiczne.

Technika ta jest wszechstronna i elastyczna, co pozwala na wytwarzanie szerokiej gamy rusztowań o właściwościach specjalnie zmodyfikowanych pod kątem wymaganego zastosowania. Na przykład rusztowania mogą być projektowane do leczenia trudnych stanów wymagających naprawy tkanek, takich jak zastąpienie rozległych ubytków skóry u pacjentów z ciężkimi oparzeniami lub naprawa uszkodzonej błony śluzowej jamy ustnej po nowotworze lub urazie. Chociaż w tym filmie pokazano trwałą produkcję komórek jako marker stresu dynamicznego, można również rozważyć analizę szeregu białek macierzy pozakomórkowej, a także ocenić wiele innych aspektów biologii komórki, wykorzystując komórki poddane ćwiczeniom lub niepoddane ćwiczeniom.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mają trudności z uzyskaniem powtarzalnych rusztowań, ponieważ proces elektroprzędzenia zależy od wielu zmiennych. Istotna jest wizualna demonstracja obróbki elektroprzędzionych rusztowań po zakończeniu przędzenia, co rzadko jest omawiane.

Znajomość tego procesu jest niezbędna do pomyślnego zastosowania tej techniki w praktyce klinicznej. W pierwszej kolejności należy pokryć obrotowy kolektor w formie wrzeciona folią aluminiową, stroną błyszczącą skierowaną na zewnątrz. Następnie należy przygotować cztery strzykawki o pojemności 5 ml, napełniając każdą z nich 5 ml odpowiedniego polimeru.

W tym przypadku kwas polimlekowy jest dozowany za pomocą pompy strzykawkowej. Ustaw prędkość przepływu na 40 µL na minutę dla każdej strzykawki oraz odległość roboczą na 17 cm od końcówki igły do trzpienia. Następnie podaj na igły strzykawek napięcie +17 000 V i przeprowadź elektroprzędzenie z odpowiedniej odległości na pokryty folią aluminiową trzpień w celu uzyskania uporządkowanych włókien.

Obracać urządzenie z prędkością 1000 RPM w celu uzyskania włókien losowych. Obracać urządzenie z prędkością 200 RPM. Rusztowania elektroprzędzone można przechowywać na folii aluminiowej w szczelnym pojemniku w temperaturze czterech stopni Celsius z dodatkiem osuszacza przez co najmniej cztery miesiące po elektroprzędzeniu drugiego polimeru PHBV Lotus.

Ponownie tutaj. PLA wykazało warstwowanie na powierzchni PHBV, przy zastosowaniu parametrów i standardowych warunków przędzenia dla tego polimeru. Ponownie, ten proces addytywny tworzy podwójną warstwę rusztowania, generując strukturę dwuwarstwową w celu wytworzenia rusztowania wielowarstwowego za pomocą grzałki.

Ułóż cztery arkusze PLGA jeden na drugim, a następnie poddaj je wyżarzaniu w temperaturze 60°C przez trzy godziny, aby wytworzyć rusztowanie wielowarstwowe metodą wyżarzania w oparach. Wlej 10 ml dichlorometanu (DCM) do odpowiednio dobranego pojemnika. Następnie ułóż cztery arkusze PLGA jeden na drugim i zawieś je dwa centymetry nad DCM.

Na koniec szczelnie zamknij pojemnik na jedną godzinę w temperaturze pokojowej, aby uzyskać aseptyczną produkcję rusztowania metodą elektroprzędzenia; rozpuść polimery klasy medycznej, wysterylizowane poprzez inkubację, w DCM, a następnie przeprowadź elektroprzędzenie roztworu polimeru na sterylną folię owiniętą wokół wysterylizowanego trzpienia. Następnie, w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza, inkubuj rusztowanie w pożywce wzrostowej bez antybiotyków przez odpowiedni czas, aby zweryfikować sterylność próbek po przeprowadzonej dezynfekcji etanolem.

Umieścić rusztowania w roztworze etanolu i wody destylowanej na 15 minut. W celu sterylizacji kwasem nadoctowym zanurzyć rusztowania w roztworze kwasu nadoctowego i PBS na trzy godziny.

W temperaturze pokojowej, w celu sterylizacji gamma, naświetl rusztowania dawką 3 kGy przy użyciu źródła cezu, a następnie potnij je na prostokąty o wymiarach 5 mm na 20 mm. Następnie za pomocą mikrometru zmierz grubość rusztowania. Potem umieść prostokąty w urządzeniu Bose electro force 3, 100.

Oblicz moduł Younga oraz sprężystość na podstawie zależności obciążenia od przemieszczenia w postaci krzywej naprężenie-odkształcenie wykreślonej przez instrument. Rozpocznij od oznakowania komórek barwnikiem fluorescencyjnym przed ich wysianiem. Następnie inkubuj konfluencyjne ludzkie fibroblasty skóry w trypsynie i EDTA przez pięć minut w temperaturze 37°C.

Następnie odwiruj odseparowane komórki przez 10 minut przy 150 ×g w temperaturze pokojowej i resuspender osad w pięciu mililitrach DMEM. Po policzeniu dostosuj stężenie komórek do wysiewu i wysiej komórki na rusztowania. Teraz obrazuj powierzchnię znakowanych rusztowań za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, aby zbadać penetrację komórek; do badania głębszej penetracji w głąb rusztowań można użyć wielofotonowego mikroskopu konfokalnego.

Pozwala to na penetrację do około 200 micronów w większości rusztowań, z komórkami lub bez nich. Następnie, po inkubacji zasianych rusztowań, utrwalone próbki należy poddać fiksacji w jednym mililitrze formaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Po utrwaleniu próbki należy przemyć trzykrotnie jednym mililitrem PBS, a następnie inkubować każdą z próbek w 200 µL przeciwciał pierwotnych przeciwko elastinie przez 30 minut w temperaturze 37 °C.

Przejmij próbki trzykrotnie w 1 ml PBS, a następnie inkubuj je przez 30 minut w roztworze przeciwciała wtórnego w PBS zawierającym DPI. Na koniec, po ostatnim przemyciu próbek w PBS, wykonaj obrazowanie próbek przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, stosując wzbudzanie 365 nm i emisję 460 nm dla DPI oraz wzbudzanie 480 nm i emisję 533 nm dla przeciwciała wtórnego. Najpierw poddaj autoklawowaniu aparat do regulacji przepływu oraz balon, a następnie w pomieszczeniu czystym rozpakuj aparat w komorze z laminarnym przepływem powietrza w pozycji do elektroprzędzenia.

Następnie podłącz strzykawkę o pojemności 50 mililitrów wypełnioną PBS do odgałęzienia kranu trójdrożnego i pompuj PBS do wnętrza balonu, aż stanie się on napięty. Teraz przeprowadź elektroprzędzenie pożądanego polimeru na balon. Przy zastosowaniu standardowych warunków przędzenia i odległości roboczej wynoszącej 10 centymetrów, mokre włókna są na tyle lepkie, że przylegają do powierzchni balonu, nie odrywając się od niej w dalszej kolejności.

Po wyschnięciu rusztowania umieść balon w sterylnym naczyniu, a następnie przenieś naczynie do dygestorium z laminarnym przepływem powietrza odpowiedniego do hodowli komórek. Hodowanie komórek na rusztowaniu znajdującym się na rozciągniętym balonie w celu poddania ich warunkowaniu biomechanicznemu jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Niezbędne jest wielokrotne polewanie balonu zawiesiną komórkową, aby do rusztowania przyłączyło się jak najwięcej komórek.

Ustaliliśmy, że czynność ta zajmuje około 20 minut. W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy wyjąć balon z naczynia i położyć go na sterylnej powierzchni, takiej jak użyta tutaj szalka Petriego, a następnie co 20 sekund przez 20 minut pipetować zawiesinę komórek na powleczony balon, aby spróbować równomiernie rozprowadzić komórki po jego powierzchni. Następnie należy ponownie umieścić balon w naczyniu hodowlanym i dodać podgrzaną pożywkę odpowiednią dla danego typu komórek.

Na koniec podłącz aparat do nadmuchiwania do pompy strzykawkowej, a następnie nadmuchuj i wypuszczaj powietrze z balonu zgodnie z wymaganiami, aby uzyskać rozciąganie dwuosiowe. Do realizacji bardziej złożonego schematu rozciągania można zastosować sterowaną komputerowo pompę strzykawkową. Do tworzenia rusztowań o strukturach losowych i uporządkowanych można wykorzystać elektroprzędzenie.

Metoda ta jest powtarzalna, a otrzymane włókna są jednorodnie rozmieszczone. Przykładowo, włókna prostopadłe można uzyskać poprzez elektroprzędzenie zestawu wyrównanych włókien na folię aluminiową, a następnie obrócenie folii o 90 stopni i natychmiastowe elektroprzędzenie drugiego zestawu wyrównanych włókien na nich. Można elektroprząść wiele rodzajów polimerów, których charakterystyka może się znacznie różnić, co pokazano tutaj dla P-L-A-P-H-B-V-P-C-L oraz PLGA; należy zauważyć, że P-L-A-P-C-L i PLGA tworzą jednorodne rusztowania mikrowłókniste.

PHBV jest przędziony w formie sznura pereł z nanowłóknami łączącymi kuleczki o rozmiarach od 5 do 20 µm. W tym przypadku rusztowania zostały początkowo przędzione z PHBV, a następnie strzykawki napełniono PLA, które przędziono na wierzchu rusztowań PHBV. Przedstawione obrazy ukazują reprezentatywne pojedyncze warstwy PHBV i PLA.

Ten obraz przedstawia przekrój poprzeczny dwuwarstwy A-P-H-B-V-P-L-A z gęstym nanowłóknistym naszyjnikiem, warstwą PHBV i bardziej otwartą mikrowłóknistą warstwą PLA; wszystkie trzy typy rusztowań sprzyjają adhezji i proliferacji komórek. Jeśli wymagane są grubsze rusztowania, można zastosować wygrzewanie w oparach i podgrzewanie w celu połączenia warstw rusztowań, co zaprezentowano na kolejnych kilku obrazach. Wygrzane warstwy rusztowania nie ulegają delaminacji, a odnalezienie miejsca styku między warstwami może być bardzo trudne.

Na tym obrazie przedstawiono przekrój przez rusztowanie z PLA poddane działaniu par i wyżarzaniu, w którym początkowo połączono włókniste rusztowania o grubości około 150 µm. Następnie zastosowano opary DCM, aby stworzyć znacznie grubsze rusztowania o wielkości do 500 µm. Ten obraz ukazuje ten sam przekrój dwuwarstwy z PLA przy powiększeniu około dwukrotnie większym niż poprzednio; można zauważyć, że rusztowanie składa się z warstw znacznie grubszych włókien przeplatających się z warstwami włókien cieńszych, stworzonych w procesie wyżarzania. Łączenie warstw włókien cienkich i grubych pozwala na otrzymanie rusztowań o złożonych właściwościach mechanicznych.

Ponownie, obraz ten przedstawia ten sam rusztowanie w kształcie kolana grzejnego w czterech powiększeniach. Poprzednie powiększenie membran warstwowych można wykonać z różnymi typami komórek, z których każda jest hodowana na oddzielnej membranie bez mieszania się, co pokazują te obrazy ludzkich fibroblastów skórnych zabarwionych dwoma różnymi fluorescencyjnymi barwnikami do śledzenia komórek. Pierwszy obraz przedstawia fibroblasty na elektroprzędzonym PLA.

Komórki utrwalono i barwiono; tutaj zabarwione fibroblasty wysiano na PHBV z elektroprzędu. W tym doświadczeniu fibroblasty wstępnie zabarwiono żywym barwnikiem Cell Tracker Green. Należy zauważyć, że komórki znajdują się po stronie PLA dwuwarstwy.

Ten obraz przedstawia reprezentatywny przekrój przez dwuwarstwę z fibroblastami zabarwionymi na czerwono na dolnej powierzchni PHBV oraz fibroblastami zabarwionymi na zielono na górnej powierzchni PLA. Na tym obrazie fibroblasty zostały uprzednio zabarwione markerem cell tracker red podczas wzrostu na powierzchni A-P-H-B-V. Zatem zastosowanie żywych barwników fluorescencyjnych zapewnia wygodną metodologię obserwacji rozkładu komórek na rusztowaniu w trakcie ich wzrostu.

Metoda sterylizacji wpływa na rusztowanie oraz późniejszą hodowlę komórkową. Ten wykres liniowy przedstawia wpływ kwasu nadoctowego, promieniowania gamma i etanolu na wytrzymałość na rozciąganie oraz moduł Younga rusztowania z PLG.

Każda z metod sterylizacji zmienia wytrzymałość na rozciąganie oraz elastyczność rusztowań. Hodowla komórek na tych rusztowaniach dodatkowo zmniejsza ich maksymalne naprężenie rozciągające, ale zwiększa elastyczność. Ten wykres słupkowy ilustruje wpływ metody sterylizacji na średnicę włókien w pojedynczym rusztowaniu.

Naświetlanie gamma nie ma istotnego wpływu na średnicę włókien, natomiast kwas nadoctowy i etanol redukują ją o około 50%. Zatem najlepszym sposobem na uzyskanie sterylnych rusztowań jest ich wytwarzanie w warunkach aseptycznych. Ta ostatnia seria obrazów wykazuje, że komórki pozostają żywotne podczas dynamicznego rozciągania i produkują również zwiększone ilości elastyny. Należy zwrócić uwagę na rozwój ciemnoniebieskiego koloru wytwarzanego przez rosnące komórki, wykrytego za pomocą wskaźnika metabolicznego MTT.

W tym przypadku komórki zaznaczone na niebiesko, hodowane na balonie i poddane rozciąganiu dwuosiowemu, wytworzyły włókna elastyny, co wskazuje zielone barwienie. Stanowi to wyraźny kontrast z brakiem elastyny w sytuacji, gdy te same komórki są utrzymywane w warunkach statycznych na identycznym rusztowaniu balonowym. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak hodowla statyczna i przepływ płynu w obrębie komórek w rusztowaniach, aby zbadać, w jaki sposób komórki reagują na różne warunki hodowli.

Opracowanie metody hodowli komórek na rusztowaniu umieszczonym na balonie, który może być rozciągany, okazało się bardzo użyteczne, ponieważ utorowało drogę badaczom z dziedziny inżynierii tkankowej do zgłębiania wpływu dynamicznego warunkowania komórek w konstrukcjach inżynierii tkankowej. Należy pamiętać, że praca z zasilaczami wysokiego napięcia, rozpuszczalnikami, laserami oraz ludzkimi komórkami może być niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przejść odpowiednie szkolenie i przestrzegać wszelkich środków ostrożności.