Inżynieria przylegających bakterii poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest nadanie bakteriom właściwości adhezyjnych w celu ułatwienia ich oddzielenia od płynnych pożywek. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie syntetycznego loka, który omija złożoną regulację genetyczną i umożliwia łatwą i masową produkcję lepkich polimerów. W drugim kroku na polistyrenie wizualizuje się przylegające bakterie i określa je ilościowo, co pozwala na szybkie oszacowanie wydajności urządzenia syntetycznego.

Następnie przylegające bakterie są wizualizowane na szkle za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu bezpośredniej obserwacji biofilmu i uzyskania informacji na temat jego struktury, uzyskuje się wyniki, które wskazują na znaczny wzrost przylegania do szczepu, w którym znajduje się urządzenie syntetyczne, w oparciu zarówno o przyleganie, pomiar procentowy, jak i obserwacje mikroskopowe. Główną przewagą podejścia opartego na biologii syntetycznej w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne klonowanie, jest to, że można bardzo szybko uzyskać konstrukt zawierający tylko absolutnie jasne wymagane geny z odpowiednimi sygnałami.

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytanie w dziedzinie bioremediacji, takie jak rozwiązanie problemu usuwania bakterii zawierających metal z odpadów radioaktywnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie mają trudności, ponieważ wymagana jest podstawowa wiedza na temat genetycznych sygnałów regulacyjnych i obsługi baz danych. Demonstracja wizualna skupi się na kwantyfikacji i wizualizacjach filmu biologicznego, ponieważ te dwa kroki są bardzo trudne do nauczenia się ze względu na kruchość bioram.

Pierwszym krokiem do zaprojektowania syntetycznego karronu jest określenie organizacji genetycznej genów kędzierzawych i zlokalizowanie ich endogennych, transkrypcyjnych i translacyjnych sygnałów. Odbywa się to za pomocą specjalistycznych baz danych, takich jak REON DB lub eco gene. Następnym krokiem jest wybranie pięciu absolutnie wymaganych genów do syntezy kędzierzawej, CSGB i CSGA oraz zakodowanie monomerów włókien oraz C-S-G-E-C-S-G-F i CSGG kodujących kompleks wydzielania zwijania, wyodrębnienie wybranych sekwencji z bazy danych w szybszym formacie zarządzania danymi i wstępna analiza in silico zostanie przeprowadzona za pomocą oprogramowania do zarządzania klonami, ponieważ klaster C-S-G-G-F-E jest antysensowny w genomie E. coli.

Ta sekwencja musi zostać przekształcona w jej odwrotny odpowiednik z dopełnieniem. Użyj narzędzi do zarządzania klonami, operacji procesu, cząsteczki odwróconej cząsteczki, wklej sekwencję C-S-G-E-F-G za C-S-G-B-A za pomocą funkcji ligate. Następnie dodaj odpowiedni promotor PRCN przed sekwencją iCal C-S-G-B-A-E-F-G.

Locus RCN koduje pompę FLX RCNA, odpowiedzialną za detoksykację niklu i kobaltu, oraz pokrewny regulator metalometru RCNR. W przypadku braku kobaltu lub niklu represor RCNR wiąże się z pudełkiem RCNR w DNA i uniemożliwia pełną aktywację transkrypcji dalszych genów. Jeśli wewnątrzkomórkowe stężenie kobaltu lub niklu wzrasta, wiązanie kobaltu lub niklu z białkiem RCNR zapobiega wiązaniu represora z promotorem, a aktywność transkrypcyjna P-R-C-N-A wzrasta poprzez umieszczenie pięciu wybranych kędzierzawych genów pod kontrolą promotora.

Przewiduje się, że PRCN kędzierzawe będą nadprodukowane w obecności kobaltu i niklu. Następnie zoptymalizuj sygnały transkrypcyjne, dodając idealne miejsce wiązania rybosomów lub RBS przed pierwszym TG A sekwencji CS gba, DNA i drugi doskonały RBS przed sekwencją C-S-G-E-F-G. Aby spełnić normy I GMs, urządzenie musi być otoczone standardowym prefiksem bio brick zawierającym miejsca ograniczeń dla ECO R one i X-bar one oraz sufiks zawierający miejsca ograniczeń dla SPE one i PST 1 w celu ułatwienia dalszego montażu.

Sama część bio cegły nie może zawierać żadnych miejsc rozpoznawania ECO R, PST jednego SPE i X-bar R one. W związku z tym miejsca te zostały wyeliminowane przez ciche zmiany mutacji w analizie restrykcji krzemico urządzenia, które ujawniły jedno PST, jedno miejsce w sekwencji CSGA, jedno PST, jedno miejsce w sekwencji RCNR i jedno ECO R jedno w genie CSGE. Miejsca te zostały zmodyfikowane przez ciche mutacje.

Po zakończeniu projektowania syntetycznego opora przeprowadź symulację translacji za pomocą oprogramowania do zarządzania klonami. Użyj programu do wyrównywania sekwencji, aby zweryfikować idealną homologię między białkami kędzierzawymi typu dzikiego a białkami kodowanymi przez syntetyk, aby rozpocząć tę procedurę dla każdej studzienki 24-dołkowej płytki polistyrenowej z dwoma mililitrami M 63, minimalną pożywką z 0,2% glukozy, zaszczepić każdą studzienkę 10 do sześciu komórek nocnej kultury bakteryjnej. Hoduj bakterie w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 18 do 48 godzin bez potrząsania każdą kolumną 24-dołkowej płytki, co stanowi modalność.

W razie potrzeby dodaje się odpowiednią ilość kobaltu i antybiotyku. Trzy pierwsze rzędy służą do ilościowego określenia bakterii przylegających do A poprzez uśrednienie trzech powtórzeń. Ostatni rząd po lewej służy do wizualizacji biofilmu poprzez barwienie fioletem krystalicznym po 18 do 48 godzinach, odzyskanie supinianu zawierającego komórki planktonowe z każdej studzienki z pierwszych trzech rzędów płytki 24-dołkowej i przeniesienie supinianu do probówki hemolitycznej.

Ostrożnie przepłucz każdą studzienkę jednym mililitrem pożywki M 63 i wciągnij płuczkę do rurki hemolizy z początkowym supinatem. Basen ten jest określany jako komórki pływackie o nazwie S. Dno studzienek w mikropłytce pokryte jest komórkami przylegającymi. Aby odzyskać biofilm, dodaj jeden mililitr M 63 do każdego.

Dobrze zeskrob końcówką pipety, a następnie pipetuj w górę iw dół i przenieś frakcję biofilmu do nowej probówki do hemolizy. Wiruj rurkę przez 15 sekund. Zbierz frakcję biofilmu w probówkach do hemolizy.

Ta pula reprezentuje komórki przyczepione do powierzchni o nazwie B, które przenoszą 200 mikrolitrów supinianu i frakcji biofilmu z probówek hemolitycznych na płytkę 96-dołkową. Oszacuj liczbę bakterii przyczepionych do powierzchni i pływających na podstawie gęstości optycznej na 600 nanometrów. Procent przylegania dla każdej modalności oblicza się przy użyciu wzoru B razy 100 podzielonego przez trzy razy S plus B.To wizualizacji biofilmu tylko dla ostatniego rzędu z 24 dołków, płytki dołkowej wyrzuć komórki planktonu z tych studzienek.

Dodaj jeden mililitr M 63 do każdego dołka, aby wypłukać biofilm, który utworzył się na dnie płytki. Suszyć odkrytą płytkę przez godzinę w temperaturze 80 stopni Celsjusza po godzinie, dodać 100 mikrolitrów 20% fioletu krystalicznego na dwie krople do każdego dołka, a następnie obficie przemyć wodą. Do tego protokołu wymagana jest obudowa fluorescencyjna.

Odpowiednim gospodarzem dla plazmidu noszącego syntetyczny kędzierzawy jest szczep E coli SCC one, który konstytutywnie ulega ekspresji białka zielonej fluorescencji bez zauważalnej różnicy w stosunku do szczepu macierzystego MG 1 16 55. Przekształć szczep gospodarza za pomocą plazmidu krążka 57 zawierającego syntetyczne loki, aby uzyskać szczep S 23. Przekształć szczep gospodarza za pomocą kontrolnego krążka plazmidowego 18, aby uzyskać szczep kontrolny.

S 24 rośnie przez noc w kulturach wstępnych szczepów S 23 i S 24 w temperaturze 30 stopni Celsjusza. W pożywce M 63 uzupełnionej glukozą i ampicyliną następnego dnia dodać 20 mililitrów pożywki M 63 do szalki Petriego, a następnie zaszczepić 15 mililitrów pożywki M 63 na szalkach Petriego 100 mikrolitrami kultur wstępnych. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu i nie zapomnij o kontroli ujemnej bez kobaltu.

Wprowadź trzy prostokątne szklane szkiełka do każdej szalki Petriego. Inkubuj naczynia przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza bez wstrząsania. Bakterie można uwidocznić bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym w kolejnych dniach.

Ważne jest, aby unikać wysuszenia próbki, dlatego następujące kroki należy wykonać ostrożnie, ale szybko. Usuń każdą szkiełko nakrywkowe z szalek Petriego i ostrożnie ją osusz. Ostrożnie oczyść dolną część twarzy małym bawełnianym wacikiem nasączonym 70% etanolem, aby zetrzeć wszelkie pozostałości bakteryjne do obserwacji konfokalnej.

Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym z górną powierzchnią pokrytą biofilmem umieszczonym stroną zadrukowaną do góry. Biofilm jest następnie przykrywany większym szkiełkiem nakrywkowym, które jest mocowane do szkła. Zjeżdżalnia z lakierem.

Odwróć konfigurację tak, aby biofilm znalazł się teraz na dolnej powierzchni. W tym eksperymencie umieść zestaw pod konfokalnym mikroskopem laserowym. W mikroplatformie CT zastosowano mikroskop laserowy Zeiss LSM five 10 meta confokalny.

Wybierz obiektyw 40-krotne zanurzenie w olejku. Użyj następujących ustawień, wzbudz GFP przy 4 88 nanometrach i zbierz fluorescencję bakteryjną w zakresie od 500 do 600 nanometrów. Użyj obiektywu 40-krotnego zanurzenia w oleju do robienia zdjęć.

W trybie konfokalnym skanowania laserowego. Zeskanuj ogólne trójwymiarowe struktury biofilmów od powierzchni ciała stałego do granicy faz z pożywką wzrostową. Za pomocą kroku jednego mikrona.

Wykonaj rzuty trójwymiarowe za pomocą oprogramowania maus, określ grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości C wzdłuż statystycznych odcinków podłużnych. Kwantyfikacja biofilmu, objętości biologiczne można wyekstrahować z konfokalnych stosów Z. Zdolności adhezyjne bakterii E. coli zmodyfikowanej do nadprodukcji kędzierzawych w odpowiedzi na metal można ocenić za pomocą prostych metod.

Na przykład barwienie fioletem krystalicznym na 24 dobrze wypolerowanych płytkach Irene umożliwia szybką wizualizację tworzenia się biofilmu na dnie każdej studzienki, o czym świadczy różnica w intensywności koloru fioletowego. Wygląda na to, że szczep typu dzikiego jest mniej zwolennikiem niż szczep zmodyfikowany. Metoda ilościowa polega na pomiarze procentowej przyczepności do polistyrenu typu dzikiego i zmodyfikowanych szczepów o różnych stężeniach kobaltu.

Wyniki przedstawione na tym wykresie pokazują, że procentowa przyczepność zmodyfikowanego szczepu jest 1,5 raza wyższa niż w przypadku szczepu dzikiego przy braku kobaltu. Ponadto zaobserwowano znaczne wzmocnienie adhezji w obecności rosnących stężeń kobaltu w pożywkach o stężeniu kobaltu 25 mikromolowym lub 50 mikromolowym procentowym przylegania komórek zmodyfikowanych do przestrzegania zaleceń lekarskich osiąga odpowiednio 30% i 40%. Zdolności adhezyjne można również porównać za pomocą mikroskopii z bakteriami oznaczonymi GFP hodowanymi na szkiełkach podstawowych, obserwacje mikroskopii fluorescencyjnej epi zielonych bakterii na czarnym tle ujawniają, że zmodyfikowany szczep tworzy biofilm, podczas gdy dziki szczep trippe tworzy tylko mikrokolonie wskazane strzałkami.

Analiza mikroskopii konfokalnej zapewnia ogólny obraz trójwymiarowej struktury biofilmu. Rekonstrukcje w widoku z góry są pokazane w panelach A, a rekonstrukcje w widoku z boku są pokazane w panelach B. Wyniki potwierdzają, że zmodyfikowany szczep jest bardziej przylegający i tworzy gęstszy i grubszy biofilm niż typ dziki. Podejmując próbę wykonania tej procedury, ważne jest, aby dokładnie sprawdzić projekt działania, na przykład w celu zbadania potencjału mediacji biologicznej zmodyfikowanych bakterii E. coli lub mrówek okus w kontekście ścieków promieniotwórczych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak zaprojektować syntetyczny otwarty za pomocą oprogramowania do zarządzania klonami i jak szybko określić ilościowo wypowiedź szczepów bakteryjnych. Nie zapominaj, że praca z syntetycznymi genami i organizmami modyfikowanymi genetycznie może być niezwykle niebezpieczna. Muszą być one zgodne z obowiązującymi przepisami, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak autoklawowanie przekształconych bakterii.