Name: Inżynieria przylegających bakterii poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Poznaj metodę inżynierii bakterii E. coli poprzez syntetyczny operon curli, który zwiększa przyleganie i ułatwia separację z cieczy. Technika obejmuje mikroskopię konfokalną i kwantyfikację biofilmu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy pozostałym członkom zespołu Lyon INSA-ENS iGEM (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy, Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon oraz Valérie Desjardin), naszym sponsorom za wsparcie finansowe (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon oraz Departament Nauk Biologicznych INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dyé za krytyczną lekturę niniejszego manuskryptu oraz dr C.C. Sze za przekazanie szczepu. B. Drogue otrzymał stypendium doktoranckie z Région Rhône-Alpes.

1. Projekt i synteza Biobrick operonu curli
<ol>
	<li>Określ organizację genetyczną oraz zlokalizuj endogenne sygnały transkrypcyjne i translacyjne genów kurli. Informacje te są gromadzone w specjalistycznych bazach danych, takich jak RegulonDBa lub EcoGeneb i uzupełnione starannym zapoznaniem się z odpowiednimi publikacjami. Zarządzanie danymi i in silico analizy wstępne przeprowadzono za pomocą oprogramowania Clone Managerc.</li>
	<li>Wybierz odpowiednie sekwencje kodujące. Zestaw pięciu genów absolutnie niezbędnych do syntezy curlów (csgB i csgA kodujących monomery włókien) i eksportu (csgE csgF i csgG, kodujących kompleks wydzielniczy curliny) wybrano do konstrukcji operonu syntezyjnego. Wyodrębnij wybrane sekwencje z bazy danych w formacie FASTA. 
	Ponieważ csgGFE klastra jest antysensowny w E. coli genom, przekonwertuj tę sekwencję na jej odwrotną komplementarną za pomocą narzędzi Operations w programie Clone Manager&gt; Proces cząsteczkowy&gt;Odwróć cząsteczkę. Wklej csgEFG sekwencja za csgBA przy użyciu funkcji „Ligate” (Clone&gt; Ligacja).</li>
	<li>Dodaj odpowiedni promotor. Poprzez umieszczenie pięciu wybranych genów czerwieni pod kontrolą promotoru Prcn, przewiduje się nadprodukcję curli w obecności kobaltu i niklu. rcn lokus koduje pompę wydzielniczą odpowiedzialną za detoksykację Ni i Co (rcnA) oraz jego odpowiedni regulator metaloaktywowany (rcnR). RcnR kontroluje ekspresję rcnA i jej własny gen w odpowiedzi na Ni i Co 19. The rcn sekwencja obejmująca rcnR CDS, całość rcn region międzygenowy oraz 41 pierwszych nukleotydów rcnA znajdował się przed csgBAEFG sekwencja chimeryczna (Rysunek 1, sekwencja całego konstruktu została podana jako dane uzupełniające).</li>
	<li>Optymalizacja sygnałów transkrypcyjnych. Idealny miejsce wiązania rybosomu (ang. perfect RBS = AAGGAGGTATATA) został dodany przed pierwszym kodonem ATG csgBA Sekwencja DNA. Drugi idealny RBS został dodany przed csgEFG sekwencja. Endogenne RBS dla csgB i csgF i csgG geny zostały zachowane.</li>
	<li>Aby spełnić standardy iGEM, urządzenie musi być otoczone standardowym prefiksem i sufiksem BioBrick, zawierającymi miejsca restrykcyjne dla EcoRI, PstI (przedrostek) oraz SpeI oraz XbaI (sufiks). Wklej odpowiednie sekwencje na każdym końcu konstruktud.</li>
	<li>Wyeliminuj wszystko EcoRI, PstJa, SpeI oraz Xbamiejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego I w urządzeniu. Aby ułatwić dalszy proces montażu, sam element BioBrick nie powinien zawierać żadnych z tych miejsc restrykcyjnych. Analiza in silico miejsc restrykcyjnych w urządzeniu ujawniła jedno Pstmiejsce I w csgA sekwencja, jeden Pstmiejsce I w rcnR sekwencja i jedna EcoMiejsce rozpoznawania enzymu restrykcyjnego w csgE gena. Miejsca te znajdują się odpowiednio na pozycji 80 (Mut1), 1340 (Mut2) i 1830 (Mut3) sekwencji konstruktu (dane uzupełniające) i zostały zmodyfikowane w sposób następujący za pomocą mutacji cichych. 
	Mut1 PstLokus I CTGCAG zmieniony na CGTCTG 
	Mut2 PstLokus I CTGCAG zmieniony na CAGCAG 
	Mut3 EcoMiejsce restrykcyjne GAATTC zmienione na GAATT</li>
	<li>Przeprowadź symulację klonowania za pomocą oprogramowania Clone Manager (Operation&gt;Przetwarzanie cząsteczek&gt;Użyj programu do analizy sekwencji BLAST, aby zweryfikować pełną homologię między białkiem czerwieni dzikiego typu a białkami kodowanymi przez sztuczny operon.</li>
	<li>Zamów syntetyczny operon. Usługi syntezy genów oferowane są przez wiele firm na całym świecie; naszym partnerem była firma Genecust (Luksemburg). 4 &mu;g sztuczny operon (3165 pz) otrzymano kilka tygodni później i włączono do wektora pUC57 (pIG2)</li>
</ol>
2. Wizualizacja i ilościowe oznaczanie bakterii przylegających do polistyrenu
<ol>
	<li>Wypełnij każdą studzienkę płytki polistyrenowej 24-dołkowej 2 ml minimalnego ośrodka M63 (glukoza 0,2%) i zaszczep każdą studzienkę 106 komórek z nocnej hodowli. Hoduj bakterie przez 18–48 godz. w 30 °C bez mieszania. Każdy wiersz (4 studzienki) reprezentuje jedną modalność. Dodaj odpowiednią ilość kobaltu (25–100 mM) oraz antybiotyku (ampicylina 100 μg·L-1), jeśli to konieczne. Trzy pierwsze wiersze płytki 24-dołkowej są używane do ilościowego oznaczania bakterii przylegających poprzez uśrednienie trzech powtórzeń, ostatni wiersz jest używany do wizualizacji biofilmu.</li>
	<li>Dla trzech pierwszych wierszy płytki 24-dołkowej: z każdej studzienki pobierz supernatant zawierający komórki planktoniczne.</li>
	<li>Delikatnie przepłucz każdą studzienkę 1 ml M63 i połącz 1 ml płukania z początkowym supernatantem uzyskanym w punkcie 2.2). Mieszaninę tę nazywa się komórkami pływającymi (=S).</li>
	<li>Pobierz biofilm do 1 ml M63, przez sczepianie i pipetowanie w górę i w dół (=B). Wytrząsaj przez 15 sekund. Oszacuj liczbę bakterii przylegających do powierzchni i pływających na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm (OD600), aby uzyskać procent przylegania odpowiadający każdej modalności.</li>
	<li>Procent przylegania oblicza się według wzoru: B×100/(3×S+B).</li>
	<li>Wyłącznie dla ostatniego wiersza płytki 24-dołkowej: usuń komórki planktoniczne.</li>
	<li>Przepłucz biofilm, który wytworzył się na dnie płytki, 1 ml M63.</li>
	<li>Wysusz otwartą płytkę przez 1 godz. w 80 °C.</li>
	<li>Dodaj do każdej studzienki 100 μl 20% fioleci krystalicznej na 2 min, a następnie dokładnie przepłucz wodą, aby zwizualizować bakterie przylegające do powierzchni. 
	Należy przeprowadzić trzy niezależne oznaczenia (płytki), aby zapewnić powtarzalność wyników.</li>
</ol>
3. Wizualizacja przylegających bakterii na szkle metodą mikroskopową
<ol>
	<li>Uzyskaj szkielet fluorescencyjny. E. coli SCC1e szczep, który konstytutywnie ekspresuje zielony białko fluorescencyjne (GFP) bez obserwowalnej różnicy w porównaniu z szczepem macierzystym MG1655 20 jest odpowiednim gospodarzem dla plazmidu zawierającego syntetyczny operon czerwieni</li>
	<li>Transformuj szczep SCC1 plazmidem pIG2 (=syntetyczny operon cURLi wbudowany w) EcoRI/PstI miejsce plazmidu pUC57), aby uzyskać szczep S23. Przekształć SCC1 plazmidem kontrolnym (pUC18), aby uzyskać szczep kontrolny S24 21.</li>
	<li>Upraszczając regulację czerwi przez przełączenie endogennego złożonego promotoru (zidentyfikowano ponad 10 regulatorów transkrypcyjnych) na prosty promotor regulowany metalem, znacznie ułatwia się kontrolę przylegania. Drugi krok obejmuje ocenę jakościową i ilościową zdolności przylegania za pomocą prostych metod. Metody te można zastosować do szerokiego zakresu bakterii przylegających, niezależnie od struktur biologicznych zaangażowanych w tworzenie biofilmu. Test przylegania w 24-dołkowych płytach polistyrenowych pozwala na szybką wstępną wizualizację biofilmu bakteryjnego po barwieniu fioletem krystalicznym. Tę ocenę jakościową można doprecyzować poprzez ilościowe oznaczenie procentu przylegania. Taka metoda jest bardzo prosta, ale bardziej dokładna niż sama metoda barwienia fioletem krystalicznym, opisana wcześniej1, cechując się dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością. Wizualizacja bakterii znakowanych GFP na szkiełkach mikroskopowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej pozwala wzmocnić wyniki uzyskane w teście na 24-dołkowej płycie poprzez bezpośrednią obserwację zjawiska. 30 &deg;C w pożywce M63 uzupełnionej glukozą (0,2%) i ampicylina (100 &mu;g.-1).</li>
	<li>Zaszczep 15 ml tego samego podłoża w szalkach Petriego 100 &mu;l kultur wstępnych. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu (czyli 25 &mu;M) i nie zapomnij o ujemnej kontroli bez kobaltu. Umieść 3 prostokątne szkiełka pokrywkowe w każdej szalce Petriego. Inkubuj nocą w temperaturze 30 &deg;C bez mieszania</li>
	<li>Usuń szkiełko z płytki Petriego i ostrożnie je osusz. Delikatnie wyczyść dolną powierzchnię małą watą nasączoną 70 &deg; etanol, usuwając wszelkie pozostałości bakteryjne. W celu obserwacji konfokalnej oczyść oba górne końce na kilka milimetrów, aby umożliwić późniejsze zamocowanie pokrywki.</li>
	<li>Przyległe bakterie można wizualizować bezpośrednio, ale szybko, pod mikroskopem fluorescencyjnym, należy jednak uważnie unikać wysychania próbki.</li>
	<li>W celu obserwacji konfokalnej należy umieścić szkiełko pokrywowe na szkiełku podstawowym tak, aby strona górna pokryta biofilmem była skierowana do góry. Następnie biofilm przykrywa się większym szkiełkiem pokrywовым, które przykleja się do szkiełka podstawowego lakierem. Następnie cały zestaw odwraca się, tak aby biofilm znalazł się na dolnej stronie.</li>
	<li>Umieść zestaw pod mikroskopem konfokalnym z laserem. Użyto mikroskopu konfokalnego z laserem Axioplan2 LSM510 (Zeiss) na platformie Platimf.</li>
	<li>Ustawienie. Wzbudź GFP przy długości fali 488 nm i zbieraj fluorescencję bakterii w zakresie od 500 do 600 nm. Do pozyskiwania obrazów w trybie konfokalnego skanowania laserowego użyj obiektywu 40x z zanurzeniem olejowym. Skanuj całe trójwymiarowe struktury biofilmów od powierzchni stałej aż do granicy fazowej ze środowiskiem wzrostu, stosując krok 1 &mu;m.</li>
	<li>Wykonaj trójwymiarowe projekcje za pomocą oprogramowania IMARIS (Bitplane, Zürich, Szwajcaria). Oceń grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości z wzdłuż statystycznych przekrojów podłużnych. Ilościowe określenie objętości biofilmu można uzyskać z zestawów obrazów konfokalnych w kierunku osi z, zgodnie z opisem w innych publikacjach. 22.</li>
</ol>
aRegulonDB zawiera informacje o mechanizmach organizacji operonów oraz ich rozkładzie na jednostki transkrypcyjne, promotory i ich typ sigma, geny oraz miejsca wiązania rybosomów, terminatory, miejsca wiązania specyficznych regulatorów transkrypcyjnych, a także ich organizacji w ramach regulacyjnych fraz. <a href="http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp" target="_blank">http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp</a>
bBaza danych EcoGene zawiera aktualne informacje o sekwencjach genomu i proteomu szczepu E. coli K-12, w tym obszerne bibliografie genów. Głównym celem projektu EcoGene była ponowna ocena miejsc inicjacji translacji. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a>
c<a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a>
d<a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Pomoc:Prefiks_i_sufiks_BioBrick</a>
ePrezent od Chun Chau Sze, Nan Yang Technical University, Singapur.
fPlatforma mikroskopowa UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

<ol><li>O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2437(2011).</li>
<li>Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+sensor+cell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Microbial sensor cell arrays.</a> Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).</li>
<li>Melamed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+printed+nanolitre-scale+bacterial+sensor+array%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A printed nanolitre-scale bacterial sensor array.</a> Lab Chip. 11, 139-146 (2011).</li>
<li>Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+trace+cobalt+from+simulated+spent+decontamination+solutions+of+nuclear+power+reactors+using+E.+coli+expressing+NiCoT+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).</li>
<li>Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin+binding+mediated+by+a+novel+class+of+surface+organelles+on+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli.</a> Nature. 338, 652-655 (1989).</li>
<li>Prigent-Combaret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+pathway+for+biofilm+formation+in+curli-producing+Escherichia+coli+strains%3A+role+of+flagella%2C+curli+and+colanic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid.</a> Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).</li>
<li>Chapman, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Escherichia+coli+curli+operons+in+directing+amyloid+fiber+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation.</a> Science. 295, 851-855 (2002).</li>
<li>Vidal, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+an+Escherichia+coli+K-12+mutant+strain+able+to+form+biofilms+on+inert+surfaces%3A+involvement+of+a+new+ompR+allele+that+increases+curli+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression.</a> J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).</li>
<li>Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curli+produced+by+Escherichia+coli+PHL628+provide+protection+from+Hg%28II%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II).</a> Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).</li>
<li>Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+Zn%28II%29%2C+Cu%28II%29%2C+and+Fe%28II%29+ions+to+Alzheimer%27s+A+beta+peptide+studied+by+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem.+Lett%22%5BJournal%5D)">Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence.</a> Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).</li>
<li>Taylor, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+resolution+insights+into+curli+fiber+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis.</a> Structure. 19, 1307-1316 (2011).</li>
<li>Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+curli+biosynthesis+regulator+CsgD+co-ordinates+the+expression+of+both+positive+and+negative+determinants+for+biofilm+formation+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli.</a> Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).</li>
<li>Pesavento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+regulatory+coordination+of+motility+and+curli-mediated+adhesion+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli.</a> Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).</li>
<li>Dueholm, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillation+of+the+major+curli+subunit+CsgA+under+a+wide+range+of+conditions+implies+a+robust+design+of+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation.</a> Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).</li>
<li>Jubelin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpxR%2FOmpR+interplay+regulates+curli+gene+expression+in+response+to+osmolarity+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).</li>
<li>Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+biofilm+master+regulator+CsgD+in+cross-regulation+between+biofilm+formation+and+flagellar+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis.</a> J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).</li>
<li>Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+mechanical+characterisation+of+amyloid+fibrils+discovered+in+a+natural+adhesive%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive.</a> J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).</li>
<li>Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+two+csg+operons+is+required+for+production+of+fibronectin-+and+congo+red-binding+curli+polymers+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12.</a> Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).</li>
<li>Blaha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Escherichia+coli+metallo-regulator+RcnR+represses+rcnA+and+rcnR+transcription+through+binding+on+a+shared+operator+site%3A+Insights+into+regulatory+specificity+towards+nickel+and+cobalt%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt.</a> Biochimie. 93, 434-439 (2011).</li>
<li>Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+fluorescence+system+for+flow+cytometric+analysis+of+Escherichia+coli+transcriptional+response+in+multi-species+context%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context.</a> J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).</li>
<li>Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+preparation+of+competent+Escherichia+coli%3A+transformation+and+storage+of+bacterial+cells+in+the+same+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).</li>
<li>Perrin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nickel+promotes+biofilm+formation+by+Escherichia+coli+K-12+strains+that+produce+curli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).</li>
<li>Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+imaging+of+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+populations+expressing+three+different+autofluorescent+proteins+in+the+rhizosphere%3A+new+perspectives+for+studying+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).</li>
<li>Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLandini%2C+P+%22Biological+Adhesives%22">Biological Adhesives</a>. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).</li>
<li>Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+architecture+of+sixty+opportunistic+pathogens+deciphered+using+a+high+throughput+CLSM+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method.</a> J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+Biofilm+Device%3A+new+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).</li>
<li>Harrison, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+microscopy+and+three-dimensional+visualization+to+evaluate+the+structure+of+microbial+biofilms+cultivated+in+the+Calgary+Biofilm+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Proced.+Online%22%5BJournal%5D)">The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device.</a> Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).</li>
<li>Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+device+for+rapid+evaluation+of+biofilm+formation+potential+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria.</a> J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).</li>
<li>Miller, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiller%2C+JE+%22Experiments+in+molecular+genetics%22">Experiments in molecular genetics</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Kluczowe etapy
Kluczowym etapem w tym podejściu z zakresu biologii syntetycznej jest projektowanie genów. Projektowanie genów syntetycznych musi być skrupulatne, aby zapewnić wydajną produkcję systemu. Dwa geny kodujące monomery włókien oraz trzy geny kodujące białka zaangażowane w ich system sekrecji zostały połączone z silnym, indukowalnym metalem promotorem w celu stworzenia nowej jednostki funkcjonalnej do nowatorskiego zastosowania: biodekontaminacji ścieków nuklearnych. Zgodnie z planem i p...

Adhezja bakterii do nośników abiotycznych odgrywa kluczową rolę w bioremediacji, biokatalizie lub w mikrobiologicznych ogniwach paliwowych. Procesy bioremediacji wykorzystują zdolność mikroorganizmów do degradacji substancji organicznych lub do modyfikacji rozkładu (immobilizacja, ulatnianie) bądź specjacji metali. Te korzystne działania obserwuje się w ekosystemach wodnych i lądowych, a także w systemach sztucznych opracowanych w celu oczyszczania zanieczyszczonej wody z odpadów przemysłowych i bytowych. Intensywność i jakość aktywności mikrobiologicznej zależą od czynników fizykochemicznych, ale także od trybu życia mikroorganizmów (wolno żyjących lub wbudowanych w biofilm). Tworzenie biofilmu wiąże się z metabolizmem promującym odporność na biocydy poprzez różnorodne mechanizmy. Zjawisko to jest zatem pożądane w większości procesów bioremediacji. Ponadto inżynieria komórek Escherichia coli w celu kontrolowania tworzenia biofilmu została z sukcesem zastosowana do immobilizacji biosensorów całokomórkowych na biochipach2-3.
Adaptacja mikroorganizmów do wysokich stężeń metali odbywa się poprzez różnorodne mechanizmy, takie jak adsorpcja do składników macierzy zewnątrzkomórkowej, aktywacja pomp efleksowych lub swoistych transporterów zdolnych do koncentrowania metalu wewnątrz komórki. Zwiększenie tych aktywności bakteryjnych poprzez inżynierię genetyczną umożliwia efektywne i tanie usuwanie zanieczyszczeń metalami w skali laboratoryjnej, szczególnie w przypadku metali o wysokiej toksyczności występujących w niewielkich ilościach, jak opisali Raghu et al. 2008 4. Bioremediacja bakteryjna stanowi w tym przypadku konkurencyjną i oszczędną metodę w porównaniu z klasycznymi procesami chemicznymi z wykorzystaniem żywic jonowymiennych. Autorzy opisali chassis E. coli zmodyfikowanych genetycznie w celu zwiększenia poboru i retencji kobaltu, najpierw poprzez knockout genu rcnA kodującego pompę efleksową, a następnie poprzez transformację plazmidem wielokopiowym umożliwiającym nadekspresję transportera z preferencyjnym powinowactwem do kobaltu. Taki szczep wydaje się być wydajną alternatywą dla żywic jonowymiennych w oczyszczaniu ścieków radioaktywnych, jednak kluczowym nierozwiązanym problemem pozostaje odzyskanie zanieczyszczonych bakterii na koniec procesu 4. Celem naszej pracy było zatem stworzenie specjalnie zaprojektowanego szczepu zdolnego do przylegania do nośników abiotycznych, takich jak szkło lub plastik.
Spośród całego zestawu adhezyn i fimbrii adhezyjnych zidentyfikowanych u bakterii Gram-ujemnych, zdecydowaliśmy się zaprojektować system umożliwiający produkcję curli. Curli to cienkie (średnica 2-5 nm) i silnie agregujące włókna amyloidowe, które wystają z powierzchni E. coli oraz Salmonella w postaci niekrystalicznej i nierozpuszczalnej macierzy 5-7. Curli biorą również udział w kolonizacji powierzchni abiotycznych i rozwoju biofilmów 8. Niedawno wykazano, że curli wiążą jony rtęci 9. Wiadomo, że amyloidy posiadają wysokie powinowactwo do jonów metali, takich jak Cu2+, Zn2+ i Fe3+ 10. Właściwość ta może dodatkowo usprawnić dekontaminację ścieków zanieczyszczonych metalami. Klastry csg odpowiadają za produkcję włókien curli i składają się z dwóch operonów transkrybowanych w przeciwnych kierunkach (Rysunek 1). Geny csgB, csgA i csgC tworzą operon sens, kodujący dwie podjednostki curli: CsgA i CsgB. CsgC wydaje się być zaangażowane w aktywność redoks w obrębie systemu biogenezy curli oraz wpływać na zachowanie porów CsgG 11. Jednak brak csgC u większości bakterii produkujących curli wskazuje, że odpowiadające mu białko zapewnia jedynie wtórny poziom kontroli nad biogenezą curli. Aby uprościć system, zdecydowaliśmy się pracować z minimalną liczbą genów.
Operon csgDEFG koduje białka niezbędne w regulacji i transporcie CsgA i CsgB na powierzchnię komórki. CsgD jest aktywatorem transkrypcyjnym operonu csgBAC i odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu tworzenia biofilmu poprzez regulację produkcji fimbrii curli oraz innych komponentów biofilmu, takich jak celuloza 12, a także poprzez hamowanie produkcji wici 13. CsgE, CsgF i CsgG tworzą specyficzny dla curli aparat wydzielniczy w błonie zewnętrznej, przez który główna białkowa podjednostka curli CsgA jest wydzielana jako białko rozpuszczalne. Polimeryzacja CsgA zależy in vivo od związanego z błoną białka nukleatora CsgB (przegląd w 14). Wykazano, że ekspresja genów curli jest kontrolowana przez złożone szlaki regulacyjne obejmujące kilka dwuskładnikowych systemów sygnałowych 15-16. Te złożone regulacje pozwalają bakteriom tworzyć grube biofilmy poprzez produkcję curli w odpowiedzi na sygnały środowiskowe, lecz są trudne do kontrolowania w zastosowaniach przemysłowych. Aby ułatwić odzyskiwanie bakterii wypełnionych metalami podczas procesu przemysłowego, unieruchomienie bakterii na stałym nośniku musi być kontrolowane przez dobrze zdefiniowany parametr lub parametry. Adhezyjne właściwości curli są związane z ich naturą amyloidową 17 i mogłyby zostać wykorzystane do usprawnienia procesów bioremediacji, jednak konieczne jest stworzenie prostszego i łatwiej kontrolowanego mechanizmu.
Spośród tych 7 genów 18 do konstrukcji syntetycznego operonu wybrano zestaw 5 genów absolutnie niezbędnych do syntezy curli (csgB oraz csgA kodujących monomery włókien) i ich eksportu (csgE csgF oraz csgG kodujących kompleks sekrecji curli). Aby uniknąć „naturalnej” regulacji curli, zaprojektowano i zsyntetyzowano syntetyczny operon obejmujący te 5 genów csg pod kontrolą silnego i indukowalnego kobaltem promotora (Rycina 2). Opisano szczegółową analizę regionu kodującego curli oraz procedurę projektowania funkcjonalnego syntetycznego operonu. Wyjaśniono dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji adhezji bakterii do polistyrenu i szkła.

<table><tbody><tr><td>pIG2</td><td></td><td></td><td>pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) z fragmentem EcoRI/PstI o długości 3165 bp zawierającym syntetyczny operon P&lt;em&gt;rcn&lt;/em&gt;-&lt;em&gt;csgBAEFG &lt;/em&gt; ; Amp&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>pUC18</td><td></td><td></td><td>Plazmid wielokopiowy (pMB1 ori, 2686 bp), Amp&lt;sup&gt;r&lt;/sup&gt; </td></tr><tr><td>S23</td><td></td><td></td><td>SSC1 (= MG1655 z tagiem GFP, dar od C.C. Sze)/pIG2</td></tr><tr><td>S24</td><td></td><td></td><td>SSC1/pUC18</td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Roztwór stokowy 0,1M przechowywany w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>M63</td><td></td><td></td><td>29 </td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa </td><td>Nunc</td><td>55429</td><td>Polistyrenowe płytki 24-dołkowe</td></tr></tbody></table>

inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

Opisana tutaj metoda polega na modyfikacji właściwości adhezyjnych E. coli poprzez zgromadzenie minimalnej liczby genów curli pod kontrolą silnego i nadindukowalnego metalami promotora, a następnie wizualizację i kwantyfikację wynikającego z tego wzrostu adhezji bakteryjnej. Metoda ta wykorzystuje odpowiednie zasady inżynieryjne dotyczące abstrakcji i standaryzacji biologii syntetycznej, co doprowadziło do stworzenia Biobricku BBa_K540000 (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
Pierwszy etap polega na zaprojektowaniu syntetycznego operonu odpowiedzialnego za nadekspresję curli w odpowiedzi na obecność metalu, a tym samym na zwiększeniu zdolności adhezyjnych szczepu typu dzikiego. Oryginalny operon curli został zmodyfikowany in silico w celu optymalizacji sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych oraz uniknięcia „naturalnej” regulacji curli. Podejście to pozwoliło na pomyślne przetestowanie naszej aktualnej wiedzy na temat produkcji curli. Ponadto uproszczenie regulacji curli poprzez zastąpienie endogennego złożonego promotora (zidentyfikowano ponad 10 regulatorów transkrypcyjnych) prostym promotorem regulowanym przez metal sprawia, że adhezja jest znacznie łatwiejsza do kontrolowania.
Drugi krok obejmuje jakościową i ilościową ocenę zdolności do adhezji poprzez zastosowanie prostych metod. Metody te można stosować w odniesieniu do szerokiego zakresu bakterii adhezyjnych, niezależnie od struktur biologicznych biorących udział w tworzeniu biofilmu. Test adhezji na polistyrenowych płytkach 24-dołkowych zapewnia szybką, wstępną wizualizację biofilmu bakteryjnego po barwieniu fioletem krystalicznym. Ten test jakościowy można uzupełnić o ilościowe określenie procentu adhezji. Metoda ta jest bardzo prosta, a jednocześnie dokładniejsza niż samo barwienie fioletem krystalicznym, opisane wcześniej 1, charakteryzując się dobrą powtarzalnością i odtwarzalnością. Wizualizacja bakterii znakowanych GFP na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej lub konfokalnej pozwala na wzmocnienie wyników otrzymanych w teście na płytkach 24-dołkowych poprzez bezpośrednią obserwację zjawiska.

In silico adnotacja sekwencji csg typu dzikiego E. coli K12 powiązana z optymalizacją sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych pozwoliła na zaprojektowanie pojedynczego syntetycznego operonu curli Prcn-csg przedstawionego na Rysunku 3 (pełna sekwencja w danych uzupełniających). Do wizualizacji i kwantyfikacji adhezji związanej z produkcją curli wykorzystano protokół 2 i protokół 3. Dzięki barwieniu fioletem krystalicznym na polistyrenowych płytkach 24-dołkowych (prot...

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Opisana tutaj metoda polega na zmianie właściwości adhezyjnych E. coli poprzez zgromadzenie minimalnej liczby genów curli pod kontrolą...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest nadanie bakteriom właściwości adhezyjnych w celu ułatwienia ich oddzielenia od mediów ciekłych. Osiąga się to poprzez zaprojektowanie syntetycznego curli, aby ominąć złożoną regulację genetyczną i umożliwić łatwą oraz masową produkcję lepkich polimerów. W drugim kroku bakterie adhezyjne są wizualizowane i ilościowo oznaczane na polistyrenie, co pozwala na szybką ocenę wydajności urządzenia syntetycznego.Następnie bakterie przylegające do szkła są wizualizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. W celu bezpośredniej obserwacji biofilmu i uzyskania informacji o jego strukturze, uzyskano wyniki wykazujące znaczący wzrost adhezji u szczepu zawierającego urządzenie syntetyczne, co potwierdzono zarówno za pomocą pomiaru procentowego adhezji, jak i obserwacji mikroskopowych. Główną zaletą podejścia biologii syntetycznej w stosunku do istniejących metod, takich jak konwencjonalne klonowanie, jest możliwość bardzo szybkiego uzyskania konstruktu zawierającego wyłącznie absolutnie niezbędne geny z odpowiednimi sygnałami.Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie bioremediacji, takie jak rozwiązanie problemu usuwania bakterii obciążonych metalami z odpadów radioaktywnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wymagana jest podstawowa wiedza na temat genetycznych sygnałów regulacyjnych oraz obsługi baz danych. Demonstracja wizualna skupi się na kwantyfikacji i wizualizacji biofilmu, ponieważ oba te etapy są bardzo trudne do opanowania ze względu na kruchość struktur biofilmu.Pierwszym krokiem w projektowaniu syntetycznego carronu jest określenie organizacji genetycznej genów curly oraz lokalizacja ich endogennych sygnałów transkrypcyjnych i translacyjnych. Jest to realizowane przy użyciu wyspecjalizowanych baz danych, takich jak REON DB lub eco gene. Kolejnym krokiem jest wybór pięciu genów absolutnie niezbędnych do syntezy curly: CSGB i CSGA kodują monomery włókien, natomiast C-S-G-E-C-S-G-F i CSGG kodują kompleks sekrecji curly. Wybrane sekwencje należy wyeksportować z bazy danych w formacie FASTA; zarządzanie danymi oraz wstępna analiza in silico zostaną przeprowadzone za pomocą oprogramowania Clone Manager, ponieważ klaster C-S-G-G-F-E w genomie e coli jest w orientacji antysensownej.Sekwencję tę należy przekształcić w jej odwrotny komplement. Korzystając z narzędzi menedżera klonów, wykonaj operację procesu cząsteczki: odwróć cząsteczkę, a następnie wklej sekwencję C-S-G-E-F-G za C-S-G-B-A, używając funkcji ligacji. Następnie dodaj odpowiedni promotor PRCN przed sekwencją iCal C-S-G-B-A-E-F-G.Lokus RCN koduje pompę FLX RCNA, odpowiedzialną za detoksykację niklu i kobaltu, oraz powiązany z nią regulator metaliczny RCNR. W przypadku braku kobaltu lub niklu, represor RCNR wiąże się z sekwencją RCNR box w DNA i zapobiega pełnej aktywacji transkrypcji genów znajdujących się w dół strumienia. Jeśli wewnątrzkomórkowe stężenie kobaltu lub niklu wzrośnie, wiązanie kobaltu lub niklu z białkiem RCNR uniemożliwia przytwierdzenie represora do promotora, a aktywność transkrypcyjna P-R-C-N-A wzrasta, stawiając pięć wybranych genów curly pod kontrolą promotora.Przewiduje się, że PRCN curly będą nadprodukowane w obecności kobaltu i niklu. Następnie należy zoptymalizować sygnały transkrypcyjne poprzez dodanie idealnej sekwencji wiążącej rybosom (RBS) przed pierwszym kodonem ATG w sekwencji DNA CS gba oraz drugiego idealnego RBS przed sekwencją C-S-G-E-F-G. Aby spełnić standardy iGM, urządzenie musi być flankowane przez standardowy prefiks BioBrick zawierający miejsca restrykcyjne dla EcoRI i XbaI oraz sufiks zawierający miejsca restrykcyjne dla SpeI i PstI w celu ułatwienia dalszego montażu.Sama część bio-brick nie może zawierać żadnych miejsc rozpoznawania przez EcoRI, PstI, SpeI oraz XbaI. W związku z tym miejsca te zostały usunięte poprzez ciche mutacje. Analiza restrykcyjna in silico urządzenia wykazała obecność jednego miejsca PstI w sekwencji CSGA, jednego miejsca PstI w sekwencji RCNR oraz jednego miejsca EcoRI w genie CSGE. Miejsca te zostały zmodyfikowane za pomocą cichych mutacji.Po zakończeniu projektowania syntetycznego operonu, przeprowadź symulację translacji przy użyciu oprogramowania do zarządzania klonami (clone manager). Użyj programu do dopasowania sekwencji blast, aby zweryfikować pełną homologię między białkami curly typu dzikiego a białkami kodowanymi przez syntetyczny operon. Aby rozpocząć tę procedurę, w każdej studience 24-studzienkowej płytki polistyrenowej umieść 2 mL minimalnego medium M 63 z 0,2% glukozy, a następnie zaszczep każdą studzienkę 10⁶ komórek nocnej hodowli bakteryjnej. Hoduj bakterie w temperaturze 30 °C przez 18 do 48 godzin bez wytrząsania. Każda kolumna płytki 24-studzienkowej reprezentuje jedną modalność.W razie potrzeby dodaje się odpowiednią ilość kobaltu i antybiotyku. Trzy pierwsze rzędy służą do ilościowego oznaczenia bakterii przylegających A poprzez wyciągnięcie średniej z trzech powtórzeń. Ostatni rząd po lewej służy do wizualizacji biofilmu za pomocą barwienia fioletem krystalicznym po 18 do 48 godzinach; następnie odzyskuje się nadsącz zawierający komórki planktoniczne z każdej studni z trzech pierwszych rzędów płytki 24-dołkowej i przenosi nadsącz do probówki do hemolizy.Każdą studienkę należy ostrożnie wypłukać za pomocą 1 mL pożywki M 63, a następnie przenieść płuczuk do probówki do hemolizy wraz z początkowym nadsączem. Tę pulę określa się mianem komórek pływających (S). Dno studienek w mikropłytce jest pokryte komórkami przylegającymi. Aby odzyskać biofilm, należy dodać do każdej z nich 1 mL pożywki M 63.Następnie należy zeskrobać materiał końcówką pipety, wykonać kilka razy pipetowanie w górę i w dół, a następnie przenieść frakcję biofilmu do nowej probówki do hemolizy. Probówkę należy mieszać na wortexie przez 15 sekund. Frakcję biofilmu należy gromadzić w probówkach do hemolizy.Ta pula reprezentuje komórki przylegające do powierzchni nazwane B; przenieś 200 µL nadsączu i frakcji biofilmu z probówek do płytki 96-dołkowej. Oszacuj liczbę bakterii przylegających do powierzchni oraz bakterii pływających na podstawie gęstości optycznej przy 600 nm. Procent przylegania dla każdego wariantu oblicza się według wzoru B razy 100 podzielone przez 3 razy S plus B. Aby zwizualizować biofilm, w przypadku tylko ostatniego rzędu płytki 24-dołkowej, usuń komórki planktoniczne z tych dołków.Do każdego dołka dodaj 1 ml pożywki M 63, aby wypłukać biofilm, który rozwinął się na dnie płytki. Pozostaw odsłoniętą płytkę do wyschnięcia na jedną godzinę w temperaturze 80 °C; po tym czasie dodaj do każdego dołka 100 µL 20% fioletu krystalicznego, a następnie przeprowadź dokładne przemycia wodą. Do wykonania tego protokołu wymagane jest chassis fluorescencyjne.Odpowiednim gospodarzem dla plazmidu niosącego syntetyczne curli jest szczep e coli SCC one, który konstytutywnie ekspresuje zielone białko fluorescencyjne i nie wykazuje widocznych różnic w stosunku do szczepu rodzicielskiego MG 1 16 55. Przekształć szczep gospodarza za pomocą plazmidu puck 57 niosącego syntetyczne curli, aby uzyskać szczep S 23. Przekształć szczep gospodarza za pomocą plazmidu kontrolnego puck 18, aby uzyskać szczep kontrolny.Przez noc hoduj prekultury szczepów S 23 i S 24 w temperaturze 30 °C w pożywce M 63 uzupełnionej o glukozę i ampicylinę. Następnego dnia wlej 20 ml pożywki M 63 do szalki Petriego, a następnie zaszczep 15 ml pożywki M 63 w szalkach Petriego, dodając 100 µl prekultur. Dodaj odpowiednie stężenie kobaltu i pamiętaj o przygotowaniu kontroli negatywnej bez kobaltu.Do każdej szalki Petriego włóż trzy prostokątne szkiełka nakrywkowe. Inkubuj szalki przez noc w temperaturze 30 °C bez wytrząsania. Bakterie można wizualizować bezpośrednio pod mikroskopem fluorescencyjnym w kolejnych dniach.Należy unikać wysychania próbki, dlatego kolejne kroki muszą zostać wykonane starannie, lecz szybko. Należy zdjąć każde szkiełko nakrywkowe z szalek Petriego i ostrożnie je odlać. Dolną powierzchnię należy starannie oczyścić małym patyczkiem bawełnianym nasączonym 70% etanolem, aby usunąć wszystkie pozostałości bakterii przed obserwacją konfokalną.Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku przedmiotowym stroną z biofilmem skierowaną do góry. Biofilm należy następnie przykryć większym szkiełkiem nakrywkowym, które następnie przytwierdza się do szkiełka przedmiotowego za pomocą lakieru.Odwróć układ tak, aby biofilm znalazł się na dolnej powierzchni. W tym doświadczeniu umieść układ pod konfokalnym mikroskopem laserowym. W ramach platformy CT micro wykorzystano konfokalny mikroskop laserowy Zeiss LSM 510 Meta.Wybierz obiektyw imersyjny 40×. Zastosuj następujące ustawienia: wzbudź GFP przy 488 nanometrach i zbierz fluorescencję bakteryjną w zakresie od 500 do 600 nanometrów. Do pozyskiwania obrazów użyj obiektywu imersyjnego 40×.W trybie konfokalnej mikroskopii skaningowej. Skanowanie ogólnych struktur trójwymiarowych biofilmów od powierzchni stałej do interfejsu z pożywką wzrostową. Należy zastosować krok wynoszący 1 µm.Należy wykonać projekcje trójwymiarowe przy użyciu oprogramowania maus, a następnie określić grubość biofilmu poprzez analizę średniej wartości C wzdłuż statystycznych przekrojów podłużnych. Ilościowe oznaczenie biofilmu oraz objętości biologiczne mogą zostać wyodrębnione ze stosów Z z mikroskopii konfokalnej. Zdolności adhezyjne szczepów e coli zmodyfikowanych genetycznie w celu nadprodukcji curly w odpowiedzi na obecność metalu można ocenić za pomocą prostych metod.Na przykład barwienie fioletem krystalicznym na polerowanych płytkach 24-dołkowych Irene umożliwia szybką wizualizację tworzenia się biofilmu na dnie każdego dołka, co obrazuje różnica w intensywności fioletowego koloru. Wydaje się, że szczep typu dzikiego wykazuje mniejszą adhezję niż szczep zmodyfikowany. Metodą ilościową jest pomiar procentowego stopnia adhezji do polistyrenu szczepów typu dzikiego i zmodyfikowanych przy różnych stężeniach kobaltu.Wyniki przedstawione na tym wykresie wykazują, że procentowa adhezja szczepu zmodyfikowanego jest 1,5 raza wyższa niż w przypadku szczepu typu dzikiego w warunkach braku kobaltu. Ponadto zaobserwowano znaczące wzmocnienie adhezji wraz ze wzrostem stężeń kobaltu; w pożywkach o stężeniu kobaltu 25 µM lub 50 µM procentowa adhezja komórek zmodyfikowanych osiąga odpowiednio 30% i 40%. Zdolności adhezyjne można porównać również za pomocą mikroskopii z wykorzystaniem bakterii znakowanych GFP hodowanych na szkiełkach przedmiotowych; obserwacje w mikroskopie epifluorescencyjnym wykazują zielone bakterie na czarnym tle, gdzie szczep zmodyfikowany tworzy biofilm, podczas gdy szczep typu dzikiego tworzy jedynie mikrokolonie wskazane strzałkami.Analiza za pomocą mikroskopii konfokalnej zapewnia ogólny wgląd w trójwymiarową strukturę biofilmu. Rekonstrukcje widoku z góry przedstawiono w panelach A, a rekonstrukcje widoku z boku w panelach B. Wyniki potwierdzają, że szczep zmodyfikowany wykazuje większą adhezję oraz tworzy gęstszy i grubszy biofilm niż typ dziki. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest ponowne sprawdzenie projektu badania, na przykład w celu zbadania potencjału bioremediacyjnego zmodyfikowanych e coli lub occus ants w kontekście radioaktywnych ścieków.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat projektowania syntetycznego otworu przy użyciu oprogramowania do zarządzania klonami oraz sposobu szybkiej kwantyfikacji ekspresji szczepów bakteryjnych. Proszę pamiętać, że praca z genami syntetycznymi i organizmami modyfikowanymi genetycznie może być niezwykle niebezpieczna. Muszą one być obsługiwane zgodnie z obowiązującymi przepisami, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze przestrzegać środków ostrożności, takich jak autoklawowanie bakterii transformowanych.

engineering-adherent-bacteria-creating-single-synthetic-curli

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Inżynieryjne przywierające bakterie poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu Curli

Systematyczne, wielkoskalowe przesiewy syntetycznych interakcji genetycznych (gen-gen lub epistaza) mogą być wykorzystywane do badania redundancji genetycznej i wzajemnych powiązań między szlakami sygnałowymi. W niniejszej pracy opisujemy opracowaną przez nas technologię wysokoprzepustowych ilościowych przesiewów macierzy syntetycznych interakcji genetycznych, nazwaną eSGA, służącą do wyjaśniania relacji epistatycznych i badania sieci interakcji genetycznych w Escherichia coli.

Mapowanie bakteryjnych sieci funkcjonalnych i szlaków w Escherichia Coli z wykorzystaniem syntetycznych macierzy genetycznych

Bakterie wytwarzają wydzielane związki, które mogą wpływać na fizjologię swoich mikrobiologicznych sąsiadów. W tym miejscu opisujemy badanie przesiewowe kokultury, które umożliwia wykrywanie takich chemicznie zapośredniczonych interakcji międzygatunkowych poprzez mieszanie mikroorganizmów glebowych z fluorescencyjnymi transkrypcyjnymi szczepami reporterowymi Bacillus subtilis na podłożach stałych.

Wykorzystanie kokultury do wykrywania interakcji międzygatunkowych o podłożu chemicznym

To badanie opisuje metody koekspresji wielu genów z pojedynczego plazmidu w Escherichia coli za pośrednictwem T7 przy użyciu systemu plazmidowego pMGX.

Indukowalny wielogenowy system ekspresji za pośrednictwem polimerazy RNA T7, pMGX

Ten artykuł przedstawia serię protokołów do rozwoju inżynieryjnych komórek i funkcjonalizowanych powierzchni, które umożliwiają syntetycznie modyfikowanym E. coli kontrolowanie i manipulowanie programowalnymi powierzchniami materiałów.

Wykorzystanie biologii syntetycznej do inżynierii żywych komórek, które łączą się z programowalnymi materiałami

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Opisana tutaj jest metoda analizy ekspresji genów bakteryjnych w tkankach zwierzęcych na poziomie komórkowym. Metoda ta stanowi źródło do badania różnorodności fenotypowej występującej w populacji bakterii w odpowiedzi na środowisko tkankowe podczas infekcji.

Oparta na fluorescencji metoda badania regulacji genów bakteryjnych w zakażonych tkankach

Ten artykuł opisuje metodę przekształcenia taniej komercyjnej drukarki 3D w bakteryjną drukarkę 3D, która może ułatwić drukowanie wzorzystych biofilmów. Opisano wszystkie niezbędne aspekty przygotowania biodrukarki i biotuszu, a także metody weryfikacji w celu oceny powstawania biofilmów.

Trójwymiarowe wzory biofilmów inżynieryjnych za pomocą biodrukarki zrób to sam

Opisujemy łatwą procedurę jednokopijnego uzupełniania chromosomalnego genu pompy wypływu za pomocą systemu ekspresji opartego na mini-Tn7 do zmodyfikowanego szczepu Acinetobacter baumannii, z niedoborem wypływu. To precyzyjne narzędzie genetyczne pozwala na kontrolowaną ekspresję genów, co ma kluczowe znaczenie dla scharakteryzowania pomp wypływowych w patogenach opornych na wiele leków.

Charakterystyka wielolekowych systemów wypływu u Acinetobacter baumannii przy użyciu szczepu bakteryjnego z niedoborem wypływu i systemu ekspresji genów z pojedynczą kopią

Tutaj przedstawiono protokół projektowania, konstruowania i dostarczania sterowanego tetracykliną indukowalnego obwodu syntetycznego. Wpływ obwodów syntetycznych na eliminację pasożytów i ekspresję cytokin można badać poprzez kanalizację prezentowanego rurociągu. Protokół ten jest istotny dla naukowców badających syntetyczne terapie oparte na obwodach w chorobach zakaźnych.

Obwody immunometaboliczne w zakażeniach w celu rozwoju terapii ukierunkowanych na gospodarza

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Poznaj metodę inżynierii bakterii E. coli poprzez syntetyczny operon curli, który zwiększa przyleganie i ułatwia separację z cieczy. Technika obejmuje mikroskopię konfokalną i kwantyfikację biofilmu.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Przeglądaj więcej filmów