Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja migracji dorosłych nerwowych komórek prekursorowych w obecności pola elektrycznego prądu stałego. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie i wyhodowanie podwyściółkowych nerwowych komórek prekursorowych od dorosłej myszy. Następnym krokiem jest przygotowanie komór Galvan Axxis i przeniesienie nerwowych komórek prekursorowych do komór.

Ostatnim krokiem jest przyłożenie pola elektrycznego prądu stałego do komory Galvan Axxis i wykonanie obrazowania poklatkowego w celu obserwacji migracji neuroprekursorów. Ostatecznie mikroskopia obrazowania poklatkowego pozwala uchwycić właściwości taktyczne Galvana neuroprekursorów w ich zróżnicowanym i niezróżnicowanym stanie. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat oazy galwanowej komórek neuroprekursorowych, można ją również zastosować do innych systemów, takich jak mysi model udaru do rekrutacji neuroprekursorów do miejsc zmian chorobowych w celu poprawy naprawy neuronów.

Procedurę zademonstruje Rob Pilley Post, doktorant z mojego laboratorium. Rozpoczynając tę procedurę, NPC muszą być w kulturze przez siedem dni, tak aby swobodnie unoszące się pierwotne neurosfery były gotowe do zbioru. W razie potrzeby rozpocznij przygotowanie trzech komór Galvan Axxis od umieszczenia trzech kwadratowych szklanek.

Po pierwsze, szkiełka nakrywkowe umieszcza się na noc w butelce z sześcioma normalnymi kwasami solnymi. Wcześnie następnego dnia ustaw żel matra, aby powoli rozmrażał się na lodzie. Po czterech godzinach będzie gotowy do użycia do budowy komory.

Najpierw użyj noża do szkła z diamentową końcówką, aby wyciąć sześć prostokątnych pasków szkła z nowego kwadratu. Po pierwsze, szkiełka nakrywkowe. Przenieś myte kwasem kwadratowe zrazy i prostokątne szkiełka do okapu z przepływem laminarnym.

Umyj szklane paski 70% etanolem, a następnie wodą z autoklawu do hodowli tkankowych. Pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu lub wysusz na niestrzępiącym się papierze. Następnie nałóż smar próżniowy na obwód jednej powierzchni każdego kwadratowego szkiełka i uszczelnij je do podstawy z 60-milimetrowego tworzywa sztucznego.

szalki Petriego. Nałóż tłuszcz próżniowy po jednej stronie prostokątnych pasków szklanych i uszczelnij je do przeciwległych krawędzi kwadratu. Szklane szkiełka do tworzenia kwadratów z centralnym korytem pośrodku każdego naczynia.

Sterylizuj UV te zmodyfikowane szklane kwadraty lub komory przez co najmniej 15 minut w okapie. Następnie odpipetować od 250 do 300 mikrolitrów poliolilizyny na centralne koryto komór. Następnie inkubować komory w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, około 15 minut przed zakończeniem inkubacji.

Przygotuj roztwór żelu matri po dwóch godzinach, odessaj poliolową lizynę i umyj środkowe koryta jednym mililitrem wody z autoklawu. Następnie odpipetować od 250 do 300 mikrolitrów roztworu żelu Matri na centralne koryta i inkubować komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę. Po inkubacji odessać roztwór matrigelu.

Następnie delikatnie umyj środkowe koryta jednym do dwóch mililitrów SFM. Teraz odpipetuj 100 mikrolitrów E-F-H-S-F-M lub F-B-S-S-F-M na centralne koryta w celu przygotowania hodowlanych komórek. Następnie odpipetuj od czterech do pięciu mililitrów kuli neurosowej zawierającej kulturę na nową, 60-milimetrową szalkę Petriego.

Następnie umieść szalkę Petriego na stoliku mikroskopu liczącego pod pięciokrotnym obiektywem view. Użyj pipety P 10, aby delikatnie przenieść od pięciu do ośmiu całych neurosfer na centralne koryto każdej komory. Do czterech.

Neurosfery mogą być przenoszone jednocześnie, ale nie należy ich rozdzielać z neurosferami w centralnych korytach. Ostrożnie rozprowadź je, nie naruszając podłoża matrycowego. Następnie dodaj dodatkowe 150 mikrolitrów E-F-H-S-F-M lub F-B-S-S-F-M na środkowe koryta.

Teraz hodowla, komórki w nawilżonym inkubatorze. Po 17 do 20 godzinach w kulturze, niezróżnicowani NPC będą dostępni po 69 do 72 godzinach. W kulturze dostępni będą zróżnicowani NPC.

Pod mikroskopem księgowym wybierz komorę z najlepszymi komórkami do analizy migracji obrazowania żywych komórek. Komórki powinny być okrągłe, prawie całkowicie oddzielone od swoich neurosfer i jeszcze nie zaczęły lub dopiero zaczęły tworzyć procesy w kapturze. Przygotuj pokrywę komory.

Umyj kwadratowe szklane szkiełko nakrywkowe 70% etanolem, a następnie wodą w autoklawie i nałóż pasek smaru próżniowego na dwie równoległe krawędzie. Teraz przykryj komorę. Najpierw zassaj pożywkę hodowlaną z centralnego koryta, a następnie szybko uszczelnij pokrywę, wsuń na prostokątne ściany jak dach.

Następnie, stosując działanie kapilarne, załaduj 100 mikrolitrów świeżej pożywki do centralnego koryta. Teraz użyj tłuszczu próżniowego, aby stworzyć obramowania dla basenów pożywek hodowlanych. Na każdym końcu centralnego koryta w systemie obrazowania żywych komórek przygotuj probówki z żelem agros, elektrody z srebrem, chlorkiem srebra i dwie 60-milimetrowe szalki Petriego do użycia.

Jako zbiorniki pożywek hodowlanych, pozwól komorom spoczywać w środowisku 37 stopni Celsjusza 5% dwutlenku węgla przez 20 do 30 minut. W tym czasie przygotuj pokrywki dwóch pustych szalek Petriego i pokrywę szalki Petriego w komorze Galvan Axxis, wiercąc w nich otwory za pomocą pipety Dremel lub narzędzia, 1,5 do dwóch mililitrów pożywki po obu stronach centralnego koryta i dodaj od siedmiu do ośmiu mililitrów SFM do każdej pustej szalki Petriego. Umieść po jednej szalce Petriego po każdej stronie centralnego koryta komory i umieść jedną elektrodę w każdym naczyniu.

Wypełnij lukę między komorą a szalkami Petriego, aby ustanowić ciągłość elektryczną. Za pomocą mostków żelowych Agros podłącz elektrody do zewnętrznego źródła zasilania z miernikiem M szeregowo, aby zmierzyć prąd elektryczny i włączyć zasilanie. Użyj miernika objętości, aby zmierzyć natężenie pola elektrycznego bezpośrednio w poprzek centralnej rynny.

W razie potrzeby wyreguluj moc wyjściową zasilacza. Teraz zainicjuj moduł poklatkowy w systemie obrazowania. W oprogramowaniu Axio vision wybierz akwizycję wielowymiarową i kliknij zobacz.

W przypadku kanałów wybierz kanał szósty, kliknij T, aby przejść przez upływ czasu. Ustaw ustawienia interwału poklatkowego na jedną minutę, ustaw czas trwania na osiem godzin w ustawieniach pola przed, po punkcie czasu, wybierz czas przed i po punkcie czasu. Teraz kliknij start i pozwól eksperymentowi działać przez żądany czas po zakończeniu testu, kontynuuj analizę IHC.

Analiza kinematyczna ujawniła, że w obecności DCEF o napięciu 250 miliwoltów na milimetr niezróżnicowane NPC wykazują, wysoce ukierunkowane i szybkie galwanowe axxis w kierunku katody przy tym natężeniu pola, więcej niż 98% niezróżnicowanych NPC migrowało przez całe sześć do ośmiu godzin, dla których były obrazowane. W przypadku braku A-D-C-E-F. Zaobserwowano losowy ruch komórek.

Ponieważ martwe komórki nie migrują, sugeruje to, że pozostają żywotne w tym okresie. W przypadku braku lub obecności A-D-C-E-F, zróżnicowane fenotypy uległy znikomej migracji, zarówno w obecności, jak i przy braku podzbiorów A-D-C-E-F zróżnicowanych komórek. Rozszerzone procesy, które miały tendencję do ustawiania się prostopadle do kierunku DCEF, ale nie zaobserwowano zauważalnej translokacji ciała komórki.

Barwienie immunologiczne potwierdziło, że NPC utrzymywały dodatnią ekspresję gniazda markera prekursorowego neuronów po sześciu godzinach ekspozycji na DC EF. W testach z udziałem NPC indukowanych do różnicowania się w dojrzałe fenotypy, większość komórek wykazuje ekspresję dojrzałego markera astrocytów glialnego fibrylarnego białka kwaśnego lub GFAP po sześciu godzinach ekspozycji na DCEF. Postępując zgodnie z tą procedurą, można uzyskać wgląd w mechanizmy komórkowe, które są zaangażowane w przekształcanie pola elektrycznego prądu stałego w ruchliwość komórki, wykorzystując modele nokautów genetycznych.

Albo proszę pana, na przykład.