Name: Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę galwanotaksji do analizy migracji neuronalnych komórek prekursorowych w polu elektrycznym prądu stałego. Technika ta umożliwia badanie zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca jest finansowana przez Kanadyjską Radę Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (grant #249669 i #482986) oraz Heart and Stroke Foundation of Canada (grant #485508). Autorzy dziękują Youssefowi El-Hayekowi i dr Qi Wanowi za ich pomoc w opracowaniu eksperymentalnych protokołów.

Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się ze zwierzętami zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu w Toronto zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (protokół nr 20009387). Poniższe metody powinny być wykonywane przy użyciu sterylnych narzędzi i technik, w razie potrzeby w okapie z przepływem laminarnym.
W poniższym tekście protokołu fraza "EFH-SFM" odnosi się do pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej naskórkowym czynnikiem wzrostu, podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i heparyną. EFH-SFM jest używany podczas badania galwanotaksji niezróżnicowanych NPC, ponieważ te mitogeny utrzymują NPC w ich niezróżnicowanym stanie4. Podczas badania galwanotaksji NPC indukowanych do różnicowania się w dojrzałe typy komórek, "FBS-SFM" odnosi się do pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej 1% płodową surowicą bydlęcą. FBS sprzyja różnicowaniu NPC w dojrzałe fenotypy neuronalne5.
1. Izolacja i hodowla prekursorów neuronalnych (nie pokazane w filmie)
<ol>
 <li>Znieczulić mysz CD1 (w wieku 6-8 tygodni) izofluoranem i poświęcić ją poprzez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
 <li>Oblaj głowę 70% etanolem i odetnij głowę zwierzęciu ostrymi nożyczkami preparacyjnymi.</li>
 <li>Trzymając głowę kleszczami chirurgicznymi, usuń skórę z powierzchni grzbietowej, aby odsłonić czaszkę.</li>
 <li>Za pomocą skalpela i ostrza nr 11 naciąć czaszkę w zatoce czołowej wzdłuż osi przyśrodkowo-bocznej, a także wzdłuż szwu strzałkowego w kierunku ostroogonowym.</li>
 <li>Oderwij kości ciemieniowe od głowy za pomocą zakrzywionych kleszczy nr 7, uważając, aby nie przebić tkanki mózgowej.</li>
 <li>Włóż cienką szpatułkę pod mózg, zaczynając od spodu móżdżku i przesuwając się w kierunku opuszki węchowej. Trzymając czaszkę na miejscu za pomocą kleszczy, delikatnie wyciągnij mózg z czaszki i natychmiast umieść go w lodowatym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (patrz przepisy poniżej).</li>
 <li>Pod mikroskopem preparacyjnym, przy użyciu sterylnych nożyczek preparacyjnych i kleszczy, przecięto mózg na pół wzdłuż linii środkowej. Obróć każdą półkulę tak, aby przyśrodkowa (cięta) powierzchnia była skierowana do góry.</li>
 <li>Wybierz półkulę i z powierzchnią przyśrodkową skierowaną do góry zlokalizuj śledzionę ciała modzelowatego (tylny obszar ciała modzelowatego).</li>
 <li>Wykonaj nacięcie od powierzchni kory do śledziony ciała modzelowatego wzdłuż osi grzbietowo-brzusznej.</li>
 <li>Oderwij naciętą korę w kierunku opuszki węchowej, aby odsłonić przyśrodkowe i boczne ściany komory bocznej.</li>
 <li>Obróć półkulę tak, aby powierzchnia grzbietowa była skierowana do góry, i użyj zakrzywionych mikronożyczek, aby wyciąć i zebrać odsłonięte ściany przyśrodkowe i boczne, które zawierają obszar okołokomorowy, w którym znajdują się NPC6.</li>
 <li>Powtórz kroki 1.8-1.11 dla drugiej półkuli.</li>
 <li>Odpipetować wyizolowaną tkankę do 7 ml roztworu trypsyny (patrz przepis poniżej) w probówce o pojemności 15 ml i umieścić probówkę na kołysce w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 25 minut.</li>
 <li>Odwirować probówkę z prędkością 1500 obr./min przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić tkankę w 2 ml roztworu inhibitora trypsyny (patrz przepis poniżej).</li>
 <li>Delikatnie rozcieraj tkankę pipetą Pasteura 30-50 razy z małym otworem, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Odwirować probówkę z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1-2 ml SFM (patrz przepis poniżej), rozcierając osad 3-5 razy.</li>
 <li>Odwirować probówkę z prędkością 1 500 obr./min przez 3 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 1 ml SFM + EFH.</li>
 <li>Policz gęstość żywych komórek za pomocą hemocytometru i umieść komórki w kolbie hodowlanej T25 o gęstości 10 komórek na μl w SFM + EFH.</li>
 <li>Pozwól kulturze rosnąć bez przeszkód przez 7 dni, aby uzyskać swobodnie unoszące się pierwotne neurosfery składające się z NPC.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komory galwanotaksji
<ol>
 <li>Umieść 3 kwadratowe szkiełka nakrywkowe nr 1 (22 x 22 x 0,17 mm) w butelce z kwasem solnym 6N na noc.</li>
 <li>Następnego dnia za pomocą noża do szkła z diamentową końcówką wytnij 6 prostokątnych pasków (22 x 5 x 0,17 mm) szkła z kwadratu nr 1 szkiełka nakrywkowego.</li>
 <li>Przenieś kwadratowe i prostokątne szkiełka przemyte kwasem do okapu z przepływem laminarnym. Umyj prostokątne i kwadratowe paski najpierw 70% etanolem, a następnie autoklawowaną wodą z kultur tkankowych i pozostaw do wyschnięcia na chusteczce Kim (dla zwiększenia sterylności szkło można pozostawić do wyschnięcia na powietrzu).</li>
 <li>Nałóż smar próżniowy na obwód jednej powierzchni kwadratowych szkiełek podstawowych i przymocuj je do podstawy plastikowych szalek Petriego o średnicy 60 mm.</li>
 <li>Nałóż smar próżniowy wzdłuż długiej osi jednej powierzchni prostokątnych pasków szklanych i uszczelnij je do przeciwległych krawędzi kwadratowych szkiełek szklanych (tak, aby były równoległe do siebie) w celu utworzenia centralnego koryta.</li>
 <li>Sterylizuj komory promieniami UV przez co najmniej 15 minut w okapie z przepływem laminarnym.</li>
 <li>Pobrać pipetę 250-300 μl poli-L-lizyny na centralne koryto komór i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.</li>
 <li>Na około 15 minut przed zakończeniem okresu inkubacji przygotować roztwór Matrigel (patrz przepis poniżej).</li>
 <li>Odessać poli-L-lizynę, przemyć rynny centralne 1 ml wody z autoklawizu i odpipetować 250-300 μl roztworu Matrigel na rynny centralne.</li>
 <li>Inkubować komory w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
 <li>Odessać roztwór Matrigelu i delikatnie przemyć środkowe koryta 1-2 ml SFM.</li>
 <li>Pobrać pipetę 100 μl EFH-SFM lub FBS-SFM na rynny centralne i przenieść komory galwanotaksji na stolik mikroskopu liczącego.</li>
 <li>Odpipetować 3-4 ml kultury zawierającej neurosferę na szalkę Petriego o średnicy 60 mm i przenieść szalkę Petriego na etap mikroskopu liczącego.</li>
 <li>Przy ognisku widzenia 5x użyj pipety P10, aby przenieść 5-8 całych neurosfer (do czterech na raz) na centralne koryto każdej komory galwanotaksji bez ich dysocjacji i ostrożnie rozprowadź neurosfery wokół centralnej rynny, nie naruszając substratu Matrigel.</li>
 <li>Dodaj dodatkowe 150-200 μl EFH-SFM lub FBS-SFM na środkowe rynny.</li>
 <li>Przenieś komory galwanotaksji do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2, w 100% nawilżonego na 17-20 godzin (w przypadku analizy niezróżnicowanych NPC), aby umożliwić neurosferom przyleganie do substratu Matrigel i dysocjację na pojedyncze komórki, jak pokazano na rysunku 1. W przypadku analizy zróżnicowanych NPC okres inkubacji należy wydłużyć do 69-72 godzin, aby umożliwić różnicowanie komórek.</li>
</ol>
3. Obrazowanie poklatkowe na żywo komórek
<ol>
 <li>Pozwól, aby system obrazowania żywych komórek osiągnął równowagę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem zapisu poklatkowego.</li>
 <li>Wytnij dwa 12 cm kawałki srebrnego drutu o średnicy 1 mm, zwiń je z jednego końca i umieść w wybielaczu Clorox na 20 minut, aby utworzyć elektrody Ag/AgCl.</li>
 <li>Przenieś komory galwanotaksji na stolik mikroskopu liczącego i wybierz, która komora będzie używana do analizy migracji obrazowania żywych komórek w oparciu o następujące kryteria: i) neurosfery powinny być prawie całkowicie zdysocjowane na pojedyncze komórki oraz ii) komórki powinny mieć okrągłe morfologie z niewielkimi lub żadnymi procesami wystającymi z ciał komórkowych.</li>
 <li>Przenieś wybraną komorę galwanotaksji do okapu z przepływem laminarnym wraz z oddzielnym szkiełkiem nakrywkowym nr 1 i smarem próżniowym.</li>
 <li>Najpierw umyj szkiełko nakrywkowe 70% etanolem, a następnie wodą w autoklawie i nałóż pasek smaru próżniowego na dwie równoległe krawędzie szkiełka nakrywkowego.</li>
 <li>Zassać pożywkę hodowlaną z centralnej rynny komory, a następnie szybko umieścić szkiełko nakrywkowe (stroną ze smarem skierowaną w dół) na komorze tak, aby paski tłuszczu spoczywały na dwóch równoległych prostokątnych paskach szkła, skutecznie tworząc dach komory.</li>
 <li>Odpipetować 100 μl świeżego EFH-SFM lub FBS-SFM do koryta centralnego za pomocą działania kapilarycznego.</li>
 <li>Użyj smaru próżniowego, aby utworzyć obramowania dla kałuż pożywek hodowlanych na każdym końcu środkowego koryta, jak pokazano na rysunku 2.</li>
 <li>Wytnij dwa 15-centymetrowe kawałki rurki PVC i użyj strzykawki o pojemności 10 ml z igłą o rozmiarze 18, aby ostrożnie wstrzyknąć roztwór agarozy do rurki, upewniając się, że w probówkach nie tworzą się pęcherzyki, i pozwól żelowi zestalić się przez 5 minut.</li>
 <li>Przenieś komorę galwanotaksji do systemu obrazowania żywych komórek wraz z probówkami z żelem agarozowym, elektrodami Ag/AgCl i parą pustych 60-milimetrowych szalek Petriego, które będą używane jako zbiorniki pożywek hodowlanych i będą zawierać elektrody Ag/AgCl. Pozostaw komorę galwanotaksji na odpoczynek w środowisku o temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 20-30 minut.</li>
 <li>W tym czasie przygotuj pokrywki 2 pustych szalek Petriego oraz pokrywę szalki Petriego w komorze galwanotaksji, wiercąc w nich otwory za pomocą narzędzia Dremel lub podobnego narzędzia, jak pokazano na rysunku 3.</li>
 <li>Odpipetować 1-1,5 ml EFH-SFM lub FBS-SFM po obu stronach rynny środkowej i 7-8 ml SFM do każdej pustej szalki Petriego. Umieścić po jednej szalce Petriego z każdej strony centralnego koryta komory galwanotaksji i umieścić jedną elektrodę Ag/AgCl w każdej szalce. Wypełnij lukę między komorą galwanotaksji a szalkami Petriego, aby ustanowić ciągłość elektryczną z mostkami żelu agarozowego, jak pokazano na rysunku 4.</li>
 <li>Podłącz elektrody Ag/AgCl do zewnętrznego źródła zasilania, z amperomierzem połączonym szeregowo do pomiaru prądu elektrycznego i włącz zasilanie. Użyj woltomierza, aby zmierzyć natężenie pola elektrycznego bezpośrednio w poprzek centralnej rynny i wyreguluj moc wyjściową zasilacza, aż do osiągnięcia pożądanego natężenia pola elektrycznego (testy przeprowadzone w tym laboratorium wykorzystują siłę dcEF 250 mV/mm przy prądzie elektrycznym od 1 do 1,5 mA).</li>
 <li>Zainicjuj moduł poklatkowy w systemie obrazowania żywych komórek i pozwól eksperymentowi działać przez żądany czas. Po zakończeniu testu utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie do standardowej analizy barwienia immunologicznego.</li>
</ol>

<ol><li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li>
<li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential%2C+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li>
<li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li>
<li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem%2FProgenitor+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li>
<li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li>
<li>Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Protokół ten został zaadaptowany z dobrze ugruntowanych metod z poprzednich badań7-9. Komory galwanotaktyczne mogą być konstruowane przy użyciu wielu różnych technik, w tym budowy oddzielnej szklanej studzienki do zatrzymywania wysiewu komórek lub przy użyciu ablacji laserowej CO2 do mikrowytwarzania centralnego koryta10,11. Niektóre techniki mogą być bardziej pracochłonne lub kosztowne niż inne. Opisaliśmy prosty i opłacalny test do budowy komory galwanotaksji NPC przy użyciu materiałów ...

<table><tbody><tr><td colspan="4"><silna> izolacja komórek prekursorowych neuronów</td></tr><tr><td>2M NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>11.688 g rozpuszczona w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>1M KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>7.456 g rozpuszczona w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>20.33 g rozpuszczona w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>155 mM NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>1,302 g rozpuszczony w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>0,5 M Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td>9,01 g rozpuszczony w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>108 mM CaCl2 </td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>1,59 g rozpuszczony w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna trzustki bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>T1005</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza jąder owiec</td><td>Sigma</td><td>H6254</td><td></td></tr><tr><td>Kwas kynureninowy</td><td>Sigma</td><td>K3375</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor trypsyny ovomukoid</td><td>Worthington</td><td>LS003086</td><td></td></tr><tr><td>DMEM </td><td>Invitrogen</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Invitrogen</td><td>21700075</td><td></td></tr><tr><td>30% Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>7,5% NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>23,83 g rozpuszczony w 100 ml dH2O</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8041</td><td>Rozpuścić w 1 ml mieszanki hormonów i poddzielić na 20 &mu; l jednostek.</td></tr><tr><td>FGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0226</td><td>Rozpuścić w 0,5 ml mieszaniny hormonów i podwielokrotności do 20 μm; l jednostek.</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferyna</td><td>R& D Systems</td><td>3188-AT</td><td>0,1 g rozpuszczony w 4 ml dH20</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P7505</td><td>Rozpuścić 9,61 mg w roztworze Apo-transferyny</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I5500</td><td>Rozpuścić 25 mg w 0,5 ml 0,1N HCl i dodać do 3,5 ml dH20</td></tr><tr><td>Selen</td><td>Sigma</td><td>S9133</td><td></td></tr><tr><td>Progesteron</td><td>Sigma</td><td>P6149</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe narzędzia do preparacji</td><td>Narzędzia do nauki precyzyjnej Mikroskop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Przygotowanie komory galwanotaksji</mocna></td></tr> <tr><td>Kwadratowe szkiełka osłonowe</td><td>VWR</td><td>16004</td><td></td></tr><tr><td>6N Kwas solny</td><td>VWR</td><td>BDH3204-1</td><td></td></tr><tr><td>Smar wysokopróżniowy</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mm szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizyna</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td>Rozmrożenie i podwielokrotnienie na 150 &mu; l jednostki</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10082139</td><td>Używaj tylko w przypadku indukowania różnicowania NPC, w przeciwnym razie użyj pożywki hodowlanej SFM + EFH, jak wskazano powyżej</td></tr><tr><td>Mikroskop zliczający</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Live Cell Time-Lapse Imaging</td></tr><tr><td>Silver wire</td><td>Alfa Aesar</td><td>11434</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Inaktywowane termicznie rurki PVC FBS</td><td>Sigma</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific 80000006</td><td></td><td>3/32 "ID x 5/32" OD</td></tr><tr><td>Wybielacz</td> Strzykawka <td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 cc</td><td>Igła BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>18 mm</td><td></td><td></td> Wiertarka 305195 <td></td></tr><tr><td>Dremel</td><td>Dremel</td><td>Model 750</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony wyposażony w nawilżaną, inkubowaną komorę</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert-200M</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Recipes <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Volume</td> </tr> <tr> <td>2M NaCl</td> < td>6,2 ml</td> </tr> <tr> <td>1M KCl</td> <td>0,5 ml</td> </tr> <tr> <td>1M MgCl2</td> <td>0,32 ml</td> </tr> <tr> <td>155mM NaHCO3</td> <td>16,9 ml</td> </tr> <tr> <td>1M Glukoza</td> <td>1 ml</td> </tr> <tr> <td>108 mM CaCl2</td> <td>0,09256 ml</td> </tr> <tr> <td>Penicylina-streptomycyna</ td> <td>1 ml</td> </tr> <tr> <td>Woda autoklawowana</td> <td>74 ml</td> </tr> </tbody> </table> Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy <table border="1"> <tbody> <tr> < td><silny>Pozycja</silny></td> <td><silny>Objętość lub masa</silny></td> </tr> <tr> <td>Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy</td> <td>30 ml</td> </tr> <tr> <td>Trzustka bydlęca trypsyna</td> <td>40 mg</td> </tr> <tr> <td>Jądra owiec hialuronidaza</td> <td>22,8 mg</td> </tr> <tr> <td>Kwas kynureninowy</td> <td>5 mg</td> </tr> </tbody> </table> <silny>Roztwór trypsyny <granica stołu=" 1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Objętość lub masa</td> </tr> <tr> <td>SFM</td> <td>15 ml</td> </tr> <tr> <td>Inhibitor trypsyny jajomukoid</td> <td>10 mg</td> </tr> </tbody> </table> Roztwór inhibitora trypsyny <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Volume</td> </ tr> <tr> <td>Woda autoklawowana</td> <td>37 ml</td> </tr> <tr> <td>10X DMEM/F12</td> <td>10 ml</td> </tr> <tr> <td>30% Glukoza</td> <td>2 ml</td> </tr> <tr> <td> 7,5% NaHCO3</td> <td>1,5 ml</td> </tr> <tr> <td>1M HEPES</td> <td>0,5 ml</td> </tr> <tr> <td>Transferyna, roztwór putrescyny</td> <td>4 ml</td> </tr> <tr> <td>25 mg roztworu insuliny</td> <td>4 ml</td> </tr> <tr> <td>Selen</td> <td>100 &mu; l</td> </tr> <tr> <td>Progesteron</td> <td>100 &mu; l</td> </tr> </tbody> </table> Hormone Mix (łącznie 100 ml, przechowywać w temperaturze -20 stopni; C) <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Objętość</td> </tr> <tr> <td>Woda autoklawowana</td> <td>37.5 ml</td> </tr> <tr> <td>10X DMEM/F12 (3:1)</td> <td>5 ml</td> </tr> <tr> <td>30% Glukoza</td> <td>1 ml</td> </tr> <tr> <td>7,5% NaHCO3</td> <td>0,75 ml</td> </tr> <tr> <td>1M HEPES</td> <td>0,25 ml</td> </tr> <tr> <td>Mieszanka hormonalna</td> <td>5 ml</td> </tr> <tr> <td>L-glutamina</td> <td>0,5 ml</td> </tr> <tr> <td>penicylina-streptomycyna</td> <td>0,5 ml</td> </tr> </tbody> </table> Serum Free Media EFH-SFM: dodaj 10 &mu; l z EFG, 10 i mu; l FGF oraz 3,66 &mu; l heparyny FBS-SFM: dodać 0,5 ml FBS <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Volume</td> </tr> <tr> <td>Matrigel</td> <td>150 &mu; l</td> </tr> <tr> <td>SFM</td> <td>3,6 ml</td> </tr> </tbody> </table> Matrigel Solution Podwielokrotność Matrigelu należy umieścić w pudełku z lodem i pozostawić do powolnego rozmrożenia przez 4-5 godzin, aby utworzyć lepką ciecz przed zmieszaniem z SFM. Zapewni to utworzenie gładkiej warstwy podłoża Matrigel. Jeśli nie zostanie rozmrożony powoli, powstały substrat będzie zawierał grudki Matrigel, co może utrudniać migrację komórek. <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Item</td> <td>Objętość lub masa</td> </tr> <tr> <td>UltraPure Agarose</td> < td>300 mg w 10 ml ddH20</td> </tr> <tr> <td>SFM Inaktywowany termicznie FBS</td> <td>8 ml 2 ml</td> </tr> </tbody> </table> <silny>Roztwór Matrigel</silny> Wymieszaj 8 ml SFM z 2 ml inaktywowanego termicznie FBS w probówce falcon o pojemności 15 cm3. Wymieszaj agarozę z 10 ml ddH20 w kolbie Erlenmeyera i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 30 sekund w odstępach 10-sekundowych, upewniając się, że po każdej 10-sekundowej przerwie wyjmujesz roztwór z kuchenki mikrofalowej i dokładnie wymieszaj. Po ostatnim 10-sekundowym okresie mikrofalowym wymieszaj roztwór agarozy z roztworem SFM/FBS i przechowuj w temperaturze 57 ° C kąpiel wodna. </td></tr></tbody></table>

test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

Odkrycie nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (zbiorczo nazywanych neuronalnymi komórkami prekursorowymi) (NPC) w mózgu dorosłych ssaków doprowadziło do szeregu badań mających na celu wykorzystanie multipotencjalnych i proliferacyjnych właściwości tych komórek do rozwoju strategii neuroregeneracyjnych. Kluczowym krokiem dla powodzenia takich strategii jest mobilizacja NPC w kierunku miejsca zmiany chorobowej po przeszczepie egzogennym lub w celu wzmocnienia odpowiedzi endogennych prekursorów, które znajdują się w regionie okołokomorowym OUN. W związku z tym konieczne jest zrozumienie mechanizmów, które promują, kierują i wzmacniają migrację NPC. Nasza praca koncentruje się na wykorzystaniu pól elektrycznych prądu stałego (dcEF) do promowania i kierowania migracją NPC - zjawiskiem znanym jako galwanotaksja. Endogenne fizjologiczne pola elektryczne działają jako krytyczne wskazówki dla migracji komórek podczas normalnego rozwoju i gojenia się ran. Farmakologiczne zaburzenie potencjału cewy transneuronalnej w zarodkach aksolotla powoduje poważne wady rozwojowe1. W kontekście gojenia się ran szybkość naprawy uszkodzonej rogówki jest bezpośrednio skorelowana z wielkością potencjału nabłonkowego rany, który powstaje po urazie, jak wykazano przez farmakologiczne wzmocnienie lub zakłócenie tego dcEF2-3. Wykazaliśmy, że dorosłe podwyściółkowe NPC ulegają szybkiej i ukierunkowanej migracji katodowej in vitro po wystawieniu na działanie zewnętrznego dcEF. W tym protokole opisujemy techniki naszego laboratorium do tworzenia prostego i skutecznego testu galwanotaksji do długoterminowej, wysokiej rozdzielczości obserwacji ukierunkowanej translokacji (migracji) ciała komórki na poziomie pojedynczej komórki. Test ten byłby odpowiedni do badania mechanizmów regulujących transdukcję dcEF w ruchliwość komórkową za pomocą myszy transgenicznych lub nokautujących, krótkiego interferującego RNA lub specyficznych agonistów/antagonistów receptorów.

Analiza kinetyczna wykazuje, że w obecności dcEF o natężeniu 250 mV/mm niezróżnicowane NPC wykazują silnie ukierunkowaną i szybką galwanotaksję w kierunku katody (Rycina 5A, Film 1). W przypadku braku dcEF obserwuje się ruchy losowe komórek (Rycina 5B, Film 2). Przy tej wartości natężenia pola &gt; 98% niezróżnicowanych NPC migruje przez cały okres obrazowania trwający 6-8 h, a ponieważ martwe komórki nie migrują, sugeruje to, że pozostają one żywe w tym czasie, niezależnie od obecności ...

W tym protokole pokazujemy, jak konstruować niestandardowe komory, które pozwalają na zastosowanie pola elektrycznego prądu stałego, aby umożliwić obrazowanie poklatkowe translokacji komórek prekursorowych pochodzenia nerwowego w dorosłym mózgu podczas galwanotaksji.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja migracji dojrzałych komórek prekursorowych neuronów w obecności elektrycznego pola prądu stałego. Osiąga się to poprzez wstępną izolację i hodowlę subependymalnych komórek prekursorowych neuronów od dorosłej myszy. Kolejnym krokiem jest przygotowanie komór Galvan Axxis i przeniesienie komórek prekursorowych neuronów do tych komór.Ostatnim krokiem jest przyłożenie pola elektrycznego prądu stałego do komory Galvan Axxis i przeprowadzenie obrazowania poksylowanego (time-lapse), aby zaobserwować migrację prekursorów neuronów. Ostatecznie mikroskopia z obrazowaniem poksylowanym pozwala uchwycić właściwości galwanotaktyczne prekursorów neuronów w ich stanach zróżnicowanych i niezróżnicowanych. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat galwanotaksji komórek prekursorowych neuronów, można ją również zastosować w innych systemach, takich jak mysi model udaru, w celu zbadania rekrutacji prekursorów neuronów do miejsc uszkodzeń w celu usprawnienia neuroregeneracji.Procedurę zademonstruje Rob Pilley Post, doktorant z mojego laboratorium. Przed rozpoczęciem procedury NPC muszą pozostawać w hodowli przez siedem dni, tak aby wolno pływające pierw

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Test galwanotaksy do analizy kinetyki migracji komórek prekursorowych neuronów w zewnętrznie stosowanym stałym polu elektrycznym

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Niniejszy protokół demonstruje metody wykorzystywane do tworzenia środowisk 2D i 3D w specjalnie zaprojektowanych komorach elektrotaktycznych, które umożliwiają śledzenie komórek in vivo/ex vivo przy użyciu rejestracji time-lapse na poziomie pojedynczych komórek, w celu zbadania galwanotaksji/elektrotaksji oraz innych odpowiedzi komórkowych na elektryczne pola (EFs) prądu stałego (DC).

Sterowana polem elektrycznym migracja kierunkowa komórek progenitorowych neuronów w środowiskach 2D i 3D

Badacze mogą uruchomić ruch na żądanie u C. elegans, stosując pole elektryczne, które robaki wyczuwają i na które reagują. Ten film przedstawia zachowanie elektrotaktyczne i pokazuje przykładowy protokół, który jest wykonywany w urządzeniu mikroprzepływowym.

Test elektrotaksji: metoda obserwacji lokomocji u C. elegans

Opisano półautomatyczną metodę mikro-elektro-fluidyczną do wywoływania lokomocji na żądanie u Caenorhabditis elegans. Metoda ta opiera się na neurofizjologicznym zjawisku robaków reagujących na łagodne pola elektryczne ("elektrotaksję") wewnątrz kanałów mikroprzepływowych. Elektrotaksja mikroprzepływowa służy jako szybka, czuła, tania i skalowalna technika badań przesiewowych pod kątem czynników wpływających na zdrowie neuronów.

Elektrotaksja oparta na mikroprzepływach do analizy ilościowej na żądanie lokomocji Caenorhabditis elegans

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Prezentujemy metodę zastosowania fizjologicznego pola elektrycznego do migrujących, unieśmiertelnionych komórek prostaty w specjalnie wykonanej komorze galwanotaksji. Za pomocą tej metody wykazujemy, że 2 linie nienowotworowych komórek prostaty wykazują różne stopnie kierunkowości migracji w terenie.

Wykorzystanie specjalnie zaprojektowanych komór galwanotaksji do badania kierunkowej migracji komórek prostaty

Wiele urządzeń mikroprzepływowych zostało opracowanych do użytku w badaniach nad elektrotaksją. Jednak żaden z tych chipów nie pozwala na efektywne badanie jednoczesnego wpływu substancji chemicznych i pola elektrycznego (EF) na komórki. Opracowaliśmy urządzenie na bazie polimetakrylanu metylu, które zapewnia lepiej kontrolowany współistniejący ślad węglowy i stymulację chemiczną do wykorzystania w badaniach nad elektrotaksją.

Badania elektrotaktyczne komórek raka płuc przy użyciu wielokanałowego układu mikroprzepływowego o podwójnym polu elektrycznym

Siły mechaniczne są ważne dla kontrolowania migracji komórek. Protokół ten demonstruje użycie elastycznych hydrożeli, które można odkształcić za pomocą szklanej mikropipety i mikromanipulatora w celu stymulacji komórek za pomocą lokalnego gradientu sztywności w celu wywołania zmian w strukturze komórki i migracji.

Test durotaksji pojedynczej komórki do oceny mechanicznej kontroli ruchu komórkowego i powiązanych zdarzeń sygnalizacyjnych

Prezentujemy trzy proste testy in vitro - test migracji na duże odległości, test migracji kokulturowej i test przyciągania chemo-chemicznego - które wspólnie oceniają funkcje komórek śródbłonka okołokomorowego pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i ich interakcję z interneuronami GABA-ergicznymi.

Testy migracji, chemoprzyciągania i kohodowli komórek śródbłonka pochodzących z ludzkich komórek macierzystych i neuronów GABA-ergicznych

W tym badaniu prezentujemy protokół różnicowania nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych (NPC) indukowanych wyłącznie przez stymulację impulsami prądu stałego (DC) w systemie mikroprzepływowym.

Różnicowanie neuronalnych komórek prekursorowych pod wpływem pola elektrycznego w urządzeniach mikroprzepływowych

Poznaj metodę galwanotaksji do analizy migracji neuronalnych komórek prekursorowych w polu elektrycznym prądu stałego. Technika ta umożliwia badanie zachowań komórkowych w czasie rzeczywistym.

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego (Wideo) | JoVE Journal

Test galwanotaksji do analizy kinetyki migracji neuronalnych komórek prekursorowych w zewnętrznie przyłożonym polu elektrycznym prądu stałego

Przeglądaj więcej filmów