Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białka immunoreaktywnego z próbki bez konieczności użycia energii elektrycznej lub infrastruktury laboratoryjnej. Izolacja kwasów nukleinowych i białek rozpoczyna się od zmieszania próbki z guanidyną i tiocyjanianem w celu lizy próbki, a następnie przepuszczenia mieszaniny przez sorbent w pipecie ekstrakcyjnej. Po piątym i ostatnim przepuszczeniu przez sorbent, mieszaninę należy przenieść do buforu do ekstrakcji białek i odstawić w celu wyizolowania białka immunoreaktywnego.

Następnie sorbent i związane kwasy nukleinowe są płukane poprzez przepuszczenie 90% etanolu przez sorbent. Następnie sorbent i związane kwasy nukleinowe są kilkukrotnie suszone poprzez przepuszczanie powietrza z otoczenia przez sorbent przez pięć minut. Ostatnim etapem izolacji kwasów nukleinowych do reakcji PCR jest eluowanie kwasów nukleinowych z sorbentu przy użyciu 250 µL buforu Tris lub innego podobnego roztworu wodnego w celu izolacji białka immunoreaktywnego.

Po wymieszaniu próbki z buforem do ekstrakcji białek, należy użyć drugiej pipety do ekstrakcji i przepuścić mieszaninę przez sorbent 15 razy. Kolejnym krokiem jest przemycie sorbentu z związanym białkiem poprzez wielokrotne przepuszczenie 95% ethanol przez sorbent. Następnie sorbent oraz związane białko są suszone poprzez przepuszczanie powietrza otoczenia przez sorbent przez pięć minut.

Ostatnim krokiem protokołu jest elucja białka z sorbentu. W efekcie pipeta do ekstrakcji zastosowana w tej procedurze umożliwia izolację kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białek immunoreaktywnych bez użycia energii elektrycznej. Cześć, nazywam się Dave Pawlowski.

Jestem starszym naukowcem badawczym w Kubrick Incorporated w Buffalo w stanie Nowy Jork. Dzisiaj zapoznamy się z techniką, która pozwala na jednoczesną izolację białek i kwasów nukleinowych bez konieczności użycia wirówki, mieszadła vortex lub innego dodatkowego sprzętu laboratoryjnego. Przed lizą próbek należy upewnić się, że znajdują się one w formie płynnej. Jeśli próbka jest stała, na przykład w postaci żywności lub kału, należy zawiesić ją w medium ciekłym, takim jak woda lub roztwór soli fosforanowej (PBS).

Wymieszać 500 µL próbki z 500 µL sześciomolarnego tiocyjanianu guanidyny w probówce o pojemności 1,5 mL. Następnie ścisnąć gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby wypchnąć powietrze. Całą 1 mL próbki wciągnąć do pipety ekstrakcyjnej przez materiał absorbujący, powoli puszczając gruszkę.

Odwróć narzędzie do ekstrakcji tak, aby kuleczki sorbentu i próbka spłynęły do kolby. Rozetrzyj kuleczki sorbentu wraz z próbką w kolbie, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.

Odwróć pipetę ekstrakcyjną i wydmuchaj próbkę do oryginalnej probówki 1,5 ml. Pobierz całą próbkę o objętości 1 ml do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością. Uważając, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej, wydmuchaj całą próbkę do probówki 1,5 ml, naciskając gruszkę.

Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, tak aby łącznie przeprowadzić pięć przejść. Po piątym przejściu przez sorbent wypuść całą próbkę o objętości 1 ml do 4 ml buforu do ekstrakcji białek w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Wymieszaj zawartość probówki poprzez odwracanie, a następnie zamknij ją i odstaw do późniejszego użycia.

Przemyj wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając jeden mililitr 95% etanolu przez sorbent trzy razy, za każdym razem przelewając etanol z powrotem do pierwotnej probówki. Po ostatnim przemyciu powtórz tę czynność trzy razy, używając drugiej porcji jednego mililitra 95% etanolu. Kolejnym krokiem procedury jest osuszenie sorbentu; odzysk kwasów nukleinowych z sorbentu przebiega najefektywniej, gdy jest on suchy.

Wiem, że ten etap jest żmudny. Jednakże, jeśli wykonasz go w zalecanym czasie, uzyskane wyniki będą lepsze. Naciskaj i puszczaj gruszkę przez pięć minut.

Przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu osuszenia kwasów nukleinowych i złoża sorbentu, należy wytrzeć resztki etanolu z końcówki pipety. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskujemy kwasy nukleinowe, przepuszczając przez sorbent pięciokrotnie 250 µL 10 mM TRIS. Bufor TRIS można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, np. PBS.

Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe. Aby najpierw przeprowadzić ekstrakcję białek, wymieszać próbkę w buforze do ekstrakcji białek, który został wcześniej odstawiony, odwracając probówkę. Przenieść około 2-3 ml tej 5 ml próbki na sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej. Wypchnąć całą próbkę do tej samej 15 ml probówki stożkowej, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.

Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy. Przemyj sorbent i związane białko, przepuszczając jeden mililitr 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, odprowadzając etanol do oryginalnej probówki; przemyj go jeszcze trzy razy, używając drugiej porcji jednego mililitra 95% etanolu do płukania.

Kolejnym krokiem procedury jest ponowne osuszenie sorbentu. Podobnie jak w przypadku kwasów nukleinowych, odzysk białek przebiega najlepiej, gdy sorbent jest wysuszony przez dłuższy czas.

Naciskaj i zwalniaj gruszkę przez pięć minut, przepuszczając powietrze otoczenia przez pipetę ekstrakcyjną. Aby osuszyć złoże sorbentu białkowego, wytrzyj resztki etanolu z końcówki pipety ekstrakcyjnej. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskaj białko, przepuszczając 250 µL PBS przez sorbent pięć razy.

Bufor PBS można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, takim jak 10 mM Tris o pH 6,8. Otrzymany roztwór zawiera zawartość białek próbki. Geny toksyny Shiga związane ze szczepem E DL 9 33 enterohemorragicznej Escherichia coli O 157:H7 zostały namnożone w procedurze ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek z wykorzystaniem pipety do ekstrakcji.

Geny toksyny Shiga, toksyny Shiga 1 oraz toksyny Shiga 2, znajdują się na umiarkowanych fagach bakteryjnych typu lambda oraz na wadliwych fagach bakteryjnych pod kontrolą promotora PR. Aktywacja odpowiedzi SOS w E. coli prowadzi do indukcji profaga i/lub produkcji toksyny. W tym przypadku, po indukcji odpowiedzi SOS za pomocą mitomycyny C, obserwuje się znaczny wzrost amplifikacji genu toksyny Shiga 2 w porównaniu z nieleczoną grupą kontrolną.

Sugeruje to indukcję profagów oraz replikację genomu fagowego. Białko odzyskane w ramach opisanych w filmie eksperymentów izolacji kwasów nukleinowych i białek wykazuje reaktywność immunologiczną. Izolowana frakcja białkowa została naniesiona na paski do szybkiego testu przepływu bocznego dla e coli O 1 57.

Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających e coli oh 1 5 7 z indukcją lub bez indukcji shiga toin, co objawia się obecnością dwóch czerwonych prążków. Dane wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających e coli oh 1 5 7, w których kwasy nukleinowe i białka przetworzono przy użyciu pipety ekstrakcyjnej. Dane te wskazują, że wyizolowane białko z każdej próbki jest immunoaktywne, co wywołuje reakcję pozytywną.

Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy, co przedstawiono tutaj na żelu z 8% akryloamidem barwionym kumasi, na który naniesiono BSA wyizolowane z sześciomolarnego izotiocyjanianu gudiny. Stosując tę metodę ekstrakcji, pipetowanie i powiązany protokół, ruchliwość elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w przypadku próbek kontrolnych. Po opanowaniu tej techniki można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż 20 minut.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne zrozumienie sposobu izolacji białek i kwasów nukleinowych z tego prostego urządzenia. Dziękujemy za poświęcenie czasu na obejrzenie naszego filmu.