Name: Bezelektryczna, sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Poznaj metodę bezelektryczną izolacji kwasów nukleinowych i białek z próbek biologicznych. Technika wykorzystuje sorpcję w pipetce ekstrakcyjnej z tioczynianem guanidyny, umożliwiając pracę w warunkach polowych bez infrastruktury laboratoryjnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie opracowania pipety ekstrakcyjnej zostało częściowo zapewnione z wewnętrznego grantu na badania i rozwój (Internal Research and Development) przyznanego DRP.

1. Lizy próbek
<ol>
 <li>Próbki powinny być w formie ciekłej. Jeśli próbka jest stała, na przykład żywność lub stolec, należy zawiesić ją w medium ciekłym, takim jak woda lub bufor fosforanowy (PBS).</li>
 <li>W probówce o pojemności 1,5 mL wymieszać 500 μL próbki z 500 μL 6M tiocyjanianu guanidyny (pH 6,5).</li>
 <li>Ucisnąć gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby wypchnąć powietrze.</li>
 <li>Powoli zwolnić ucisk gruszki, aby zassać całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez materiał sorbentny.</li>
 <li>Odwrócić urządzenie ekstrakcyjne tak, aby kuleczki sorbentu wraz z próbką spłynęły do gruszki.</li>
 <li>Rozetrzeć kuleczki sorbentu wraz z próbką wewnątrz gruszki, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.</li>
</ol>
2. Izolacja kwasów nukleinowych (Rysunek 1, Panel A)
<ol>
 <li>Odwrócić pipetę ekstrakcyjną (otworem w dół) i wypchnąć próbkę do oryginalnej probówki 1,5 mL.</li>
 <li>Wciągnąć całą 1 mL próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.</li>
 <li>Wypchnąć całą próbkę do probówki 1,5 mL poprzez naciśnięcie gruszki.</li>
 <li>Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, aby łącznie uzyskać 5 przejść.</li>
 <li>Po piątym przejściu przez sorbent wypchnąć całą 1 mL próbki do 4 mL buforu do ekstrakcji białek (do stożkowej probówki 15 mL), zamknąć probówkę i odstawić do późniejszego użycia.</li>
 <li>Przemyć wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez sorbent trzy razy, zwracając etanol do oryginalnej probówki po ostatnim przejściu.</li>
 <li>Powtórzyć krok 2.6, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.</li>
 <li>Przez 5 minut naciskać i puszczać gruszkę, przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu wysuszenia kwasów nukleinowych/złoża sorbentu. Przetrzeć końcówkę pipety ekstrakcyjnej z pozostałości etanolu za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
 <li>Odzyskać kwasy nukleinowe, przepuszczając 250 μL 10 mM Tris (pH 6,8) przez sorbent pięć razy. Bufor Tris można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, np. PBS. Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja białek (Rysunek 1, Panel B)
<ol>
 <li>Wymieszaj próbkę z buforem do ekstrakcji białek z kroku 2.5 poprzez odwracanie probówki, a następnie przepuść około dwa do trzech mililitrów tej 5 mL próbki przez sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej.</li>
 <li>Wytłocz całą próbkę do tej samej stożkowatej probówki 15 mL, dbając o to, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.</li>
 <li>Powtórz kroki 3.1 i 3.2, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy.</li>
 <li>Przemyj sorbent i związane białko, przepuszczając 1 mL 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, wyrzucając etanol do oryginalnej probówki.</li>
 <li>Powtórz krok 3.4, używając drugiej porcji 1 mL 95% etanolu do płukania.</li>
 <li>Naciskaj i puszczaj gruszkę przez 5 minut, przepuszczając powietrze otoczenia przez pipetę ekstrakcyjną, aby osuszyć złoże białko/sorbent. Wytrzyj pozostałości etanolu z końcówki pipety ekstrakcyjnej za pomocą chusteczki Kimwipe.</li>
 <li>Odzyskaj białko, przepuszczając 250 μL PBS przez sorbent pięć razy. Bufor PBS można zastąpić jakimkolwiek innym odpowiednim roztworem wodnym, np. 10 mM Tris (pH 6.8). Otrzymany roztwór zawiera zawartość białek z próbki.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Schemat ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek; etapy lizy, płukania i elucji; proces protokołu laboratoryjnego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1A"> 
Rycina 1. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Wynik elektroforezy DNA z prążkami do porównania wielkości; analiza ścieżek dla badania genetycznego." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Widmo UV wyizolowanego DNA; absorbancja w funkcji długości fali; wykres; porównanie izolacji." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Szybkie paski testowe E. coli, analiza jakościowa, schemat porównania wyników w wykrywaniu bakterii." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. 
<img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Wyniki elektroforezy SDS-PAGE, prążki białkowe w ścieżkach A-D, rozdział według masy cząsteczkowej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

Produkcja oraz bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Agencję ds. Redukcji Zagrożeń Obronnych Stanów Zjednoczonych (Defense Threat Reduction Agency).

Narzędzie, odczynniki oraz protokół opisane w niniejszym raporcie stanowią pierwszy znany przykład systemu ekstrakcji wielu makrocząsteczek niewymagającego dostępu do energii elektrycznej, który może być wykorzystywany w aplikacjach terenowych typu point-of-care. Oba rodzaje makrocząsteczek mogą być stosowane w wielu diagnostycznych lub analitycznych urządzeniach do dalszej analizy. Na przykład wyizolowane kwasy nukleinowe posiadają jakość umożliwiającą przeprowadzenie PCR (Rycina 2 i 3), natomiast komponent białkowy próbki wykazuje reaktywność immunologiczną (Rycina 4). Wykorzystanie tego systemu ekstrakcji w trudnych warunkach lub w regionach świata o ograniczonych zasobach mogłoby drastycznie zmniejszyć obciążenie chorobami populacji tam zamieszkujących. System ten mógłby również wspomóc programy nadzoru nad chorobami na całym świecie, zapewniając niezawodną, a jednocześnie szybką i kosztowo efektywną metodę przetwarzania próbek w trudnych warunkach lub w lokalizacjach oddalonych.
Ważnym aspektem opisanej powyżej metody ekstrakcji jest możliwość jej modyfikacji przez użytkownika. Na przykład w przypadkach, gdy objętość próbki jest większa lub mniejsza niż początkowe 500 μLs (krok 1.2), użytkownik może odpowiednio dostosować objętości odczynników. Oznacza to, że stosunek objętości odczynników do objętości próbki powinien pozostać stały, podczas gdy objętości bezwzględne mogą ulec zmianie. Ponadto, liczba przejść przez sorbent może zostać dostosowana według uznania użytkownika. Na przykład w przypadku zastosowania większej objętości próbki, wielokrotne przepuszczanie próbki przez sorbent (częściej niż wskazano w krokach 2.4 i 3.3) zwiększy prawdopodobieństwo kontaktu danego typu makrocząsteczek (kwasów nukleinowych lub białek) z sorbentem. Zwiększenie liczby przejść powinno podnieść wydajność wychwytu, aż do momentu osiągnięcia nasycenia sorbentu.
Stwierdziliśmy, że narzędzie do ekstrakcji oraz powiązane z nim odczynniki chemiczne posiadają pewne ograniczenia, z których najistotniejszym jest niska wydajność chemii ekstrakcji białek w odzyskiwaniu białek silnie glikozylowanych. W przypadku, gdy diagnostyka w dalszych etapach jest skierowana na białko glikozylowane, system ten może nie być optymalny do identyfikacji. Ponadto wciąż określane są górne i dolne granice wydajności ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz białek, a obecnie trwają prace optymalizacyjne w celu maksymalizacji wydajności odzyskiwania. Dalszy rozwój narzędzia pozwoli na wyeliminowanie tych luk w wiedzy.

<table><tbody><tr><td>Tiocyjanian guanydyny</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>G4000</td><td></td></tr><tr><td>etanol</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>11ACS200</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109827-1L</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4503</td><td></td></tr></tbody></table>

sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Patogeny tradycyjne i wyłaniające się, takie jak enterohemoragiczna Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis czy choroby prionowe, stanowią istotny problem dla rządów, przemysłu i personelu medycznego na całym świecie. Na przykład EHEC, wraz z Shigella, odpowiadają za śmierć około 325 000 dzieci każdego roku i są szczególnie rozpowszechnione w krajach rozwijających się, gdzie identyfikacja laboratoryjna, powszechna w Stanach Zjednoczonych, jest niedostępna 1. Opracowanie i rozpowszechnienie niskokosztowych, terenowych narzędzi do diagnostyki w punkcie opieki (point-of-care), wspomagających szybką identyfikację i/lub diagnozę patogenów lub markerów chorób, mogłoby drastycznie zmienić przebieg choroby i rokowania pacjentów. Opracowaliśmy narzędzie do izolacji kwasów nukleinowych i białek z próbki metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE) bez użycia energii elektrycznej i towarzyszącego wyposażenia laboratoryjnego 2. Izolowane makrocząsteczki mogą być wykorzystane do diagnostyki zarówno w laboratorium, jak i przy użyciu terenowych platform diagnostycznych w punkcie opieki. Co ważne, metoda ta umożliwia bezpośrednie porównanie danych dotyczących kwasów nukleinowych i białek z niepodzielonej próbki, zapewniając wiarygodność dzięki potwierdzeniu analizy genomowej i proteomicznej.
Nasze narzędzie do izolacji wykorzystuje standard przemysłowy w zakresie izolacji kwasów nukleinowych w fazie stałej, technologię BOOM, która izoluje kwasy nukleinowe z roztworu soli chaotropowych, zazwyczaj izotiocyjanianu guanidyny, poprzez wiązanie z cząstkami lub filtrami na bazie krzemionki 3. Autorska chemia ekstrakcji w fazie stałej opracowana przez CUBRC jest stosowana do oczyszczania białek z roztworów soli chaotropowych, w tym przypadku z odpadów lub frakcji przepływowej powstałej po izolacji kwasów nukleinowych4.
Poprzez zamknięcie dobrze scharakteryzowanych procesów chemicznych w małej, niedrogiej i prostej platformie, stworzyliśmy przenośny system do ekstrakcji kwasów nukleinowych i białek, który może być wykorzystywany w różnych warunkach. Wyizolowane kwasy nukleinowe są stabilne i mogą być transportowane do miejsca z dostępem do zasilania w celu przeprowadzenia amplifikacji PCR, natomiast zawartość białek może zostać natychmiast poddana analizie za pomocą przenośnych lub innych testów immunologicznych. Szybka identyfikacja markerów choroby w terenie mogłaby znacząco wpłynąć na rokowania pacjenta poprzez wdrożenie właściwego leczenia na wcześniejszym etapie postępu choroby. Opisane narzędzie i metoda nadają się do zastosowania w przypadku niemal każdego czynnika zakaźnego i oferują użytkownikowi możliwość redundantnej analizy wielu typów makrocząsteczek, przy jednoczesnym zmniejszeniu obciążeń logistycznych.

Izolacja kwasów nukleinowych: Izolowane kwasy nukleinowe nadają się do amplifikacji metodą PCR i są wolne od zanieczyszczeń białkowych.
Przykład 1: Odzyskane kwasy nukleinowe nadają się do zastosowań opartych na metodzie PCR. Na przykład Rysunek 2 przedstawia amplifikację genów toksyny Shiga związanych z enterohemoragicznym szczepem E. coli O157:H7 EDL-933 (ATCC # 35150) z procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych/białek z wykorzystaniem pipety ekstrakcyjnej. Geny toksyny Shiga stx1 i stx2 znajdują się w umiarkowanych bakteriofagach podobnych do lambda oraz w uszkodzonych bakteriofagach w tym oraz innych enterohemoragicznych szczepach E. coli pod kontrolą promotora PR 5 6 7 8. Aktywacja odpowiedzi SOS w E. coli prowadzi do indukcji profaga i/lub produkcji toksyny 9. Wykorzystaliśmy zmodyfikowaną wersję testu multiplex PCR opracowanego przez Feng et al.11 w celu zidentyfikowania genów stx1 i stx2 zarówno w kulturach, jak i w posiewach próbek ścieków. Ścieżki A i B na Rysunku 2 przedstawiają wyniki amplifikacji PCR nieprzetworzonej próbki hodowli (ścieżka A) oraz przetworzonej próbki hodowli (ścieżka B). Wyniki te są praktycznie identyczne, co oznacza brak utraty wierności w przetworzonych lub wyizolowanych kwasach nukleinowych. Następnie przeprowadziliśmy amplifikację surowych ścieków z dodatkiem wzorca (ścieżka D) lub wyizolowanych kwasów nukleinowych ze ścieków z dodatkiem wzorca (ścieżki E i F). Dane te wskazują, że wyizolowane kwasy nukleinowe zapewniły większą amplifikację w porównaniu z nieizolowanymi kwasami nukleinowymi z próbek ścieków z dodatkiem wzorca. Wyciągamy zatem wniosek, że albo inhibitory PCR naturalnie występujące w ściekach zostały usunięte podczas izolacji, albo kwasy nukleinowe uległy zagęszczeniu podczas izolacji. Możliwa jest również kombinacja obu tych hipotez.
Następnie wykorzystano spektroskopię ultrafioletową, aby wykazać, że wyizolowane kwasy nukleinowe były względnie wolne od zanieczyszczeń białkowych. Rysunek 3 przedstawia widma UV dwóch ekstrakcji kwasów nukleinowych z E. coli O157:H7, oznaczonych jako izolacja a i izolacja b, w porównaniu z znormalizowanym widmem kultury bakteryjnej, oznaczonego jako przed izolacją. Widma UV wyizolowanych kwasów nukleinowych przypominają widma czystych kwasów nukleinowych, z obliczonym stosunkiem absorbancji między 260 nm a 280 nm zbliżającym się do 1,810. Dane te wskazują, że w frakcji kwasów nukleinowych odzyskanej za pomocą opisanego sposobu znajduje się bardzo mało zanieczyszczeń białkowych.
Izolacja białka: Białko odzyskane w eksperymencie izolacji kwasów nukleinowych/białek wykazuje immunoreaktywność i jest elektroforetycznie identyczne z czystym białkiem.
Przykład 2: Wyizolowaną frakcję białkową naniesiono na paski do testu przepływu bocznego RapidChek E. coli O157 (SDIX, Inc.). Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających E. coli O157, z indukcją STX lub bez niej (Rysunek 4, odpowiednio ścieżki B i C). Dane na Rysunku 4 wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających E. coli O157, które zostały poddane izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek przy użyciu pipety do ekstrakcji. Dane te pokazują, że wyizolowane białko z każdej próbki jest immunoreaktywne, co wywołuje pozytywną odpowiedź.
Przeprowadzono amplifikację PCR (zgodnie z opisem w Przykładzie 1) próbek białek, aby wykazać, że wyizolowana frakcja białkowa była wolna od zanieczyszczeń kwasami nukleinowymi. Wyniki tych eksperymentów w elektroforezie żelowej były we wszystkich przypadkach negatywne. W związku z tym stwierdzamy, że zawartość białek w próbce została oddzielona od zanieczyszczających kwasów nukleinowych. Wyniki te, razem z opisanymi dla etapu izolacji kwasów nukleinowych, pokazują, że kwasy nukleinowe oraz białka są izolowane w osobnych etapach frakcjonowania.
Przykład 3: Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy 10. Rysunek 5 przedstawia żel akrylamidowy 8% barwiony Coomassie, na który naniesiono BSA (Rysunek 5, ścieżki A i C) oraz BSA wyizolowane z 6M izotiocyjanianu guanydyny przy użyciu pipety ekstrakcyjnej i powiązanego protokołu. Mobilność elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w przypadku próbek kontrolnych. Wyciągamy zatem wniosek, że proces ekstrakcji nie zmienia struktury kowalencyjnej wyizolowanego białka.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji kwasów nukleinowych z użyciem pipet, pokazujący etapy od przygotowania próbki do elucji." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1a"> 
Rycina 1, panel A: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji kwasów nukleinowych. Próbkę miesza się z 6M tiocyjanianem guanidyny w probówce z próbką i przepuszcza przez sorbent pięć razy. Po ostatnim przejściu próbkę dodaje się do buforu do ekstrakcji białek. Sorbent i związane kwasy nukleinowe przemywa się dwukrotnie etanolem. Następnie próbkę suszy się na powietrzu i eluuje z sorbentu.
<img alt="Schemat procesu ekstrakcji białek z probówkami z próbkami, pipetami oraz etapami płukania i eluowania." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1b"> 
Rycina 1, panel B: Przedstawienie typowej procedury ekstrakcji białek. Próbkę zmieszaną z buforem do izolacji białek z etapu 1, Rycina 1, panel A, przepuszcza się przez sorbent drugiej pipety ekstrakcyjnej 15 razy. Pozostała część procedury jest identyczna z protokołem ekstrakcji kwasów nukleinowych.
<img alt="Wynik elektroforezy DNA z prążkami do porównania wielkości; analiza ścieżek w badaniu genetycznym." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Negatyw żelu agarozowego barwionego bromkiem etydyny. Przeprowadzono eksperyment z multipleksową amplifikacją genów toksyny shiga 1 i 2 z wykorzystaniem próbek hodowlanych (ścieżki A i B) lub próbek ścieków surowych wzbogaconych o E. coli O157:H7 (ścieżki D, E i F). Próbki dodano bezpośrednio do probówki z reakcją PCR (ścieżki A i D) lub przetworzono w procesie izolacji, a wyekstrahowane kwasy nukleinowe dodano do probówki z reakcją PCR (próbki B, E i F). Protokół PCR jest modyfikacją metody opisanej przez Feng et al11. Nasza modyfikacja objęła jedynie fragmenty amplifikowane przez pary starterów stx1 (dolny prążek) i stx2 (górny prążek), z pominięciem wszystkich pozostałych par starterów. Ścieżka C to marker 1Kb od BioRad.
<img alt="Widmo UV wyizolowanego DNA; absorpcja w funkcji długości fali; wykres; porównanie izolacji." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Wyniki spektroskopii UV kwasów nukleinowych E. coli O157:H7 wyizolowanych przy użyciu opisanej pipety do ekstrakcji. Wyizolowane kwasy nukleinowe są oznaczone jako izolacja a i izolacja b. Przebadano również widmo UV próbki przed ekstrakcją kwasów nukleinowych, oznaczone jako przed izolacją. Widma uzyskano za pomocą spektrofotometru Hitachi U3010 oraz powiązanego pakietu oprogramowania.
<img alt="Szybkie paski testowe do wykrywania E. coli, analiza jakościowa, schemat porównania wyników detekcji bakterii." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Zdjęcie kolorowe pasków testowych RapidChek. Zawartość białek w próbkach użytych w Rycina 2 została wyizolowana za pomocą pipety ekstrakcyjnej i przetestowana pod kątem immunoreaktywności za pomocą analizy przepływu bocznego. Ścieżki A-C to kontrole nieprzetworzone, czyli hodowla komórkowa została dodana do paska testowego bez ekstrakcji kwasów nukleinowych lub białek. Ścieżka A to E. coli BL21 DE3 pLysS jako kontrola negatywna; ścieżki B i C przedstawiają E. coli O157:H7 nieleczoną (B) lub traktowaną mitomycyną C przez 4 godziny (C). Ścieżki od D do H przedstawiają wyniki dodania ekstraktu białkowego do pasków testowych przepływu bocznego. Ścieżki D i E zostały przebadane przy użyciu ekstraktu białkowego z E. coli BL21 DE3 pLysS odpowiednio bez (D) lub z traktowaniem mitomycyną C (E) jako kontrole negatywne. Ścieżki F-H przedstawiają wyniki przy użyciu ekstraktu białkowego z E. coli O157:H7. Białko ekstrahowano z hodowli nieleczonych (F), lub traktowanych mitomycyną C przez 2 godziny (G) lub 4 godziny (H). Wyniki dodatnie dają podwójną czerwoną linię.
<img alt="Wyniki elektroforezy SDS-PAGE, prążki białkowe w ścieżkach A-D, rozdzielenie według masy cząsteczkowej." src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Zdjęcie żelu SDS-PAGE barwionego Coomassie. BSA wyizolowano z roztworu przy użyciu pipety ekstrakcyjnej zgodnie z opisanymi protokołami. Ścieżki A i C to ścieżki kontrolne o stężeniach odpowiednio 250 μg/mL i 500 μg/mL. Ścieżki B i D przedstawiają odzyskaną BSA z roztworów zawierających takie same stężenia jak ich odpowiednie kontrole.

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Patogeny tradycyjne i wyłaniające się, takie jak enterohemoragiczna Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis lub choroby prionowe, stanowią istotny problem...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białka immunoreaktywnego z próbki, bez konieczności korzystania z energii elektrycznej lub infrastruktury laboratoryjnej. Izolacja kwasów nukleinowych i białek rozpoczyna się od zmieszania próbki z guanidyną i tiocyjanianem w celu lizy próbki, a następnie przeprowadzenia mieszaniny przez sorbent znajdujący się w pipecie ekstrakcyjnej. Po piątym i ostatnim przejściu przez sorbent, mieszaninę przenosi się do buforu do ekstrakcji białek i odstawia w celu wyizolowania białka immunoreaktywnego.Następnie sorbent oraz związane kwasy nukleinowe są płukane poprzez przepuszczanie 95% etanolu przez sorbent. Wielokrotnie osuszane są następnie sorbent i związane kwasy nukleinowe poprzez przepuszczanie powietrza otoczenia przez sorbent przez pięć minut. Ostatnim etapem izolacji kwasów nukleinowych gotowych do PCR jest elucja kwasów nukleinowych z sorbentu przy użyciu 250 µl buforu Tris lub innego podobnego roztworu wodnego w celu izolacji białka immunoreaktywnego.Po zmieszaniu próbki z buforem do ekstrakcji białek, należy użyć drugiej pipety do ekstrakcji i przepuścić mieszaninę przez sorbent 15 razy. Kolejnym krokiem jest przemycie sorbentu z związanym białkiem poprzez wielokrotne przepuszczenie 95% ethanol przez sorbent. Następnie sorbent i związane białko są suszone poprzez przepuszczanie powietrza otoczenia przez sorbent przez pięć minut.Ostatnim krokiem protokołu jest elucja białka z sorbentu. W rezultacie pipeta ekstrakcyjna wykorzystana w tej procedurze umożliwia izolację kwasów nukleinowych gotowych do PCR oraz białek immunoreaktywnych bez użycia energii elektrycznej. Cześć, nazywam się Dave Pawlowski.Jestem starszym naukowcem badawczym w firmie Kubrick Incorporated w Buffalo w stanie Nowy Jork. Dzisiaj zapoznamy się z techniką, która pozwala na jednoczesną izolację białek i kwasów nukleinowych bez konieczności użycia wirówki, wibratora typu vortex ani żadnego innego dodatkowego sprzętu laboratoryjnego przed lizą próbek. Należy upewnić się, że próbki są w formie ciekłej. Jeśli próbka jest stała, na przykład żywność lub kał, powinna zostać zawieszona w medium ciekłym, takim jak woda lub roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.Wymieszaj 500 µL próbki z 500 µL sześciomolarnego tiycyjanianu guanydyny w probówce o pojemności 1,5 mL. Następnie naciśnij gruszkę pipety ekstrakcyjnej, aby usunąć z niej powietrze. Powoli puść gruszkę, pozwalając jej się rozszerzyć, i wciągnij całą próbkę o objętości 1 mL do pipety ekstrakcyjnej przez materiał absorbujący.Odwróć narzędzie do ekstrakcji w taki sposób, aby kulek sorbentu i próbka spłynęły do kolby. Rozetrzyj kulki sorbentu wraz z próbką w kolbie, uważając, aby nie wypchnąć próbki z pipety ekstrakcyjnej.Odwróć pipetę ekstrakcyjną i wydmuchaj próbkę do oryginalnej probówki o pojemności 1,5 ml. Pobierz całą 1 ml próbki do pipety ekstrakcyjnej, przepuszczając ją przez sorbent z umiarkowaną prędkością. Uważając, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej, wydmuchaj całą próbkę do probówki 1,5 ml, naciskając gruszkę.Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent jeszcze cztery razy, tak aby łącznie wykonać pięć przejść. Po piątym przejściu przez sorbent, przetłocz całą próbkę o objętości 1 ml do 4 ml buforu do ekstrakcji białek w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. Wymieszaj zawartość probówki przez odwracanie, a następnie zamknij ją i odstaw do późniejszego użycia.Przemyj wyizolowane kwasy nukleinowe, przepuszczając jeden mililitr 95% ethanolu przez sorbent trzy razy, przelewając etanol z powrotem do pierwotnej probówki. Po ostatnim przelewie powtórz płukanie trzykrotnie, używając drugiego mililitra 95% ethanolu. Kolejnym krokiem procedury jest osuszenie sorbentu; odzysk kwasów nukleinowych z sorbentu jest najskuteczniejszy, gdy sorbent jest suchy.Wiem, że ten etap jest żmudny. Jednakże, jeśli wykonają Państwo ten krok w zalecanym czasie, uzyskane wyniki będą lepsze. Naciskaj i puszczaj gruszkę przez pięć minut.Przesuwając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną w celu osuszenia kwasów nukleinowych i złoża sorbentu, przetrzyj końcówkę pipety ekstrakcyjnej, aby usunąć pozostałości etanolu. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskaj kwasy nukleinowe, przepuszczając 250 µL 10 mM Tris przez sorbent pięć razy. Bufor Tris można zastąpić innym odpowiednim roztworem wodnym, np. PBS.Otrzymany roztwór zawiera wyekstrahowane kwasy nukleinowe. Aby najpierw przeprowadzić ekstrakcję białek, wymieszaj próbkę w buforze do ekstrakcji białek, który został wcześniej odstawiony, odwracając probówkę. Przenieś około dwa do trzech mililitrów tej pięciomililitrowej próbki na sorbent nowej pipety ekstrakcyjnej. Wypchnij całą próbkę do tej samej probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów, uważając, aby sorbent pozostał w szyjce pipety ekstrakcyjnej.Powtórz ten proces, przepuszczając próbkę przez sorbent 15 razy. Przemyj sorbent i związane białko, przepuszczając jeden mililitr 95% etanolu przez złoże sorbentu trzy razy, odprowadzając etanol do pierwotnej probówki; przemyj go trzykrotnie, używając kolejnego jednego mililitra 95% etanolu do płukania.Kolejnym krokiem procedury jest ponowne wysuszenie sorbentu. Podobnie jak w przypadku kwasów nukleinowych, odzysk białek przebiega najlepiej, gdy sorbent jest wysuszony. Przez dłuższy czas.Naciskaj i zwalniaj gruszkę przez pięć minut, przepuszczając powietrze przez pipetę ekstrakcyjną. Aby osuszyć złoże sorbentu białkowego, wytrzyj pozostały etanol z końcówki pipety ekstrakcyjnej. Używając chusteczki Kim wipe, odzyskaj białko, przepuszczając przez sorbent 250 µL PBS pięciokrotnie.Bufor PBS można zastąpić dowolnym innym odpowiednim roztworem wodnym, takim jak 10 milimolowy Tris o pH 6,8. Powstały roztwór zawiera zawartość białek z próbki. Geny toksyny Shiga powiązane ze szczepem E DL 9 33 enterohemolitycznej E. coli O157:H7 zostały namnożone w procedurze ekstrakcji białek z kwasów nukleinowych przy użyciu pipety do ekstrakcji.Geny toksyny Shiga, toksyny Shiga 1 i toksyny Shiga 2, znajdują się na umiarkowanych fagach bakteryjnych podobnych do lambda oraz na wadliwych fagach bakteryjnych pod kontrolą promotora PR. Aktywacja odpowiedzi SOS w e coli prowadzi do indukcji profagów i/lub produkcji toksyny. W tym przypadku obserwuje się znaczny wzrost amplifikacji genu toksyny Shiga 2, gdy odpowiedź SOS zostanie wywołana przez mitomycynę C, w porównaniu z kontrolą nieleczoną.Sugeruje to indukcję profagów i replikację genomu fagowego. Białko odzyskane w ramach eksperymentów izolacji białek z kwasów nukleinowych opisanych w filmie wykazuje reaktywność immunologiczną. Izolowana frakcja białkowa została naniesiona na paski testowe do szybkiego wykrywania E. coli O 157 w teście przepływu bocznego.Kontrole wykazują pozytywną identyfikację we wszystkich próbkach zawierających e coli oh 1 5 7 z indukcją lub bez indukcji shiga toin, co jest widoczne w postaci dwóch czerwonych prążków. Dane wykazują również wyniki pozytywne dla tych próbek zawierających e coli oh 1 5 7, w których kwasy nukleinowe i białka opracowano przy użyciu pipety ekstrakcyjnej. Dane te pokazują, że wyizolowane białko z każdej próbki jest immunoaktywne, wywołując tym samym reakcję pozytywną.Wyizolowane białko nadaje się do elektroforezy, co przedstawiono tutaj na żelu 8% akrylamidu barwionym kumasym, na który naniesiono BSA wyizolowane z sześciomolarnego izotiocyjanianu gudiny. Przy zastosowaniu opisanej metody ekstrakcji, pipetowania i powiązanego protokołu, mobilność elektroforetyczna wyizolowanego białka jest identyczna jak w przypadku próbek kontrolnych. Po opanowaniu techniki można ją przeprowadzić w czasie krótszym niż 20 minut.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć jasne wyobrażenie o tym, jak izolować białka i kwasy nukleinowe z tego prostego urządzenia. Dziękujemy za poświęcenie czasu na obejrzenie naszego filmu.

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wolny od prądu, sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Źródło: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).W niniejszym materiale wideo zaprezentowano izolację kompleksów białko–wirusowe DNA z jąder komórkowych z wykorzystaniem chemii klik i oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych. Protokół obejmuje znakowanie genomów wirusowych nukleotydami zmodyfikowanymi alkinią, biotynylację poprzez reakcję klik oraz wiązanie do kulek magnetycznych powlekanych...

Izolacja białek z kompleksów DNA wirusowego z białkami

TruTip to prosta technologia ekstrakcji kwasów nukleinowych, w której porowata, monolityczna matryca wiążąca jest umieszczana w końcówce pipety.  W związku z tym format przygotowania próbki jest kompatybilny z większością przyrządów do obsługi cieczy i może być używany do wielu zastosowań klinicznych o średniej i wysokiej przepustowości oraz typów próbek.

Wysokowydajna, zautomatyzowana ekstrakcja DNA i RNA z próbek klinicznych przy użyciu technologii TruTip w popularnych robotach do obsługi cieczy

Opisujemy wydajną, solidną i opłacalną metodę ekstrakcji kwasu nukleinowego z wymazów w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych za pomocą sekwencjonowania amplikonów genu 16S rRNA. Metoda ta pozwala na zastosowanie wspólnego podejścia do przetwarzania wielu typów próbek i uwzględnia szereg dalszych procesów analitycznych.

Wydajna ekstrakcja kwasów nukleinowych i sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu scharakteryzowania społeczności bakteryjnych

Opisujemy tutaj prostą i szybką metodę ekstrakcji DNA prowirusa HIV z pełnej krwi, wykrywaną metodą ilościowego PCR. Protokół ten może zostać rozszerzony do wykorzystania w wykrywaniu innych markerów genetycznych lub przy użyciu alternatywnych metod amplifikacji.

Filtracja izolacji kwasów nukleinowych: prosta i szybka metoda ekstrakcji DNA

Celem tego protokołu jest specyficzne oznaczanie i selektywne izolowanie wirusowego DNA z zakażonych komórek w celu scharakteryzowania białek związanych z genomem wirusa.

Oczyszczanie DNA wirusa w celu identyfikacji powiązanych białek wirusowych i komórkowych

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Poznaj metodę bezelektryczną izolacji kwasów nukleinowych i białek z próbek biologicznych. Technika wykorzystuje sorpcję w pipetce ekstrakcyjnej z tioczynianem guanidyny, umożliwiając pracę w warunkach polowych bez infrastruktury laboratoryjnej.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

Przeglądaj więcej filmów