Name: Ułatwianie odkrywania leków: zautomatyzowany test zapalenia o wysokiej zawartości u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Odkryj zautomatyzowany test zapalenia o wysokiej zawartości u Danio rerio do badania związków immunomodulujących. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewanie bioaktywnych substancji z wykorzystaniem mikroskopii automatycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Nadeshdzie Wolf, Nadine Eschen i Susanne Delong za doskonałą opiekę nad zwierzętami. CW otrzymał wsparcie w ramach stypendium doktoranckiego z programu Helmholtz 'BioInterfaces international graduate school' (BIFIGS). Dalsze wsparcie zapewnił grant KIT-RISC oraz grant Marie Curie International Reintegration Grant w ramach 7. Programu Ramowego Wspólnoty Europejskiej (PIRG07-GA-2010-267552) dla CG. AHS otrzymał wsparcie z BOLD (Biology of Liver and Pancreatic Development and Disease) - Marie Curie Initial Training Network (238821). UL otrzymał wsparcie z Dopaminet FP7 (Siódmego Programu Ramowego) (223744).

1. Obsługa zwierząt
W teście ChIn należy wykorzystać 3-dniowe larwy (3 dpf) pochodzące z krzyżówek grupowych homozygotycznych ryb podwójnie transgenicznych cldnB::GFP/lysC::DsRED2 oraz ryb linii AB (typ dziki). Zarodki należy zebrać drogą naturalnego tarła i hodować w temperaturze 29 °C w medium E3 (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 oraz 0.1% błękitu metylenowego, z pH dostrojonym do 7.0) w szalkach Petriego. Niezbędne jest utrzymanie gęstości zarodków nieprzekraczającej 50-70 sztuk na szalkę.
2. Sortowanie larw
Wszystkie larwy należy sprawdzić pod stereomikroskopem fluorescencyjnym pod kątem ekspresji fluorescencyjnego reportera, spontanicznych stanów zapalnych oraz prawidłowego rozwoju związanego z wiekiem.
3. Przygotowanie pożywki przesiewowej (zawsze przygotowywać świeżą)
Przygotować pożywkę E3 bez błękitu metylenowego, uzupełnioną o DMSO (stężenie końcowe 1%) i MS222 (0,05 g/l).
4. Przygotowanie CuSO4 (zawsze przygotowywać świeże)
Najpierw odważ CuSO4 (Mr=159.6 g/mol) i przygotuj 20 mM roztwór stokowy w dH2O. Przygotuj 120 μM roztwór roboczy CuSO4 (z 20 mM roztworu stokowego) w E3/DMSO(1%)/MS-222. Roztwór CuSO4 należy chronić przed światłem.
5. Przygotowanie płytki 384-dołkowej (płytka mikrotitracyjna Greiner 384-dołkowa)
Za pomocą pipety automatycznej z funkcją odsysania (reverse pipette) nanieś 20 μl roztworu E3/DMSO(1%)/MS-222 do każdej studni. Aby ostrożnie manipulować embrionami bez powodowania obrażeń, konieczne jest poszerzenie otworu końcówki pipety, co osiąga się poprzez odcięcie końcówki do średnicy 2 mm. Przenieś pojedynczą larwę w 74 μl medium do każdej studni (84 μl dla kontroli nietraktowanej). W razie potrzeby ustaw larwy w pozycji bocznej w studni, używając elastycznej końcówki do mikroładowania Eppendorf Microloader Pipette Tip (Eppendorf; 5242 956.003).
Wszystkie poniższe etapy dozowania cieczy należy przeprowadzić przy użyciu robotycznej stacji do obsługi cieczy, aby zapewnić jednoczesne traktowanie wszystkich larw.
6. Leczenie farmakologiczne
Zmieszaj związki w płytce ze stokami leków, pipetując w górę i w dół 5 razy. Dodaj 16 μl 7,5X stoku leku z płytki do każdej studni i zmieszaj 5 razy. Dostosuj pozycję końcówki w studniach, aby zapobiec uszkodzeniu larw, i dozuj medium z prędkością 10 μl/s. Zmieszaj medium w studniach 4 razy, aby zapewnić jednorodne rozprzestrzenienie leku w studni.
7. Inkubacja
Inkubować płytkę przesiewową przez 1 h w temperaturze 29 °C, przykrywając ją folią aluminiową w celu ochrony związków oraz CuSO4 przed światłem.
8. Chemiczne wywołanie ran
Do każdego dołka, z wyjątkiem kontroli negatywnych, należy dodać 10 μl roztworu roboczego CuSO4 o stężeniu 120 μM, wymieszać 4 razy i ponownie inkubować przez 1 h w temperaturze 29 °C.
9. Płukanie
Odssać i wymienić 80 μl pożywki z każdej studni dwukrotnie (w krokach po 20 μl), aby usunąć związki oraz CuSO4.
10. Akwizycja obrazów
Rozpocznij akwizycję obrazów za pomocą odwróconego mikroskopu zautomatyzowanego (np.: Olympus scan^R) 90 minut po początkowej ekspozycji na miedź. Ustaw początkowy poziom z tak, aby neuromasty z prawej i lewej tylnej linii bocznej były widoczne. Wykonuj zdjęcia każdej studzienki raz na godzinę w kanałach brightfield, Cy3 i GFP w 4 płaszczyznach ogniskowych (odległość 50 μm), używając obiektywu 4x (N.A. = 0.13).
Dodatkowe informacje na temat przetwarzania obrazów i danych są dostępne na żądanie.
11. Przetwarzanie obrazów
1. Sortowanie danych
Surowe obrazy są przetwarzane za pomocą naszego autorskiego skryptu oprogramowania LabView. Pierwszą operacją w potoku przetwarzania obrazów jest sortowanie surowych obrazów z folderu danych wygenerowanych przez mikroskop według kanału, studzienki oraz punktu czasowego.
2. Rozszerzony zakres ostrości
Następnie oprogramowanie tworzy obrazy o rozszerzonym zakresie ostrości z 4 płaszczyzn ogniskowych dla każdego z kanałów.
3. Nakładka RGB
W ostatnim kroku obrazy z rozszerzonym zakresem ostrości z 3 kanałów są łączone, aby uzyskać końcowy obraz z nałożoną warstwą RGB.
4. Automatyczna detekcja neuromastów
Narzędzie do rozpoznawania wzorców (LabView Rapid IA prototyping tool) identyfikuje neuromasty w obrazach z nałożoną warstwą RGB i tworzy empirycznie zdefiniowany obszar zainteresowania wokół neuromastów.
5. Ilościowe oznaczenie
W ramach empirycznie zdefiniowanego obszaru zainteresowania wokół uszkodzonych neuromastów zliczane są czerwone fluorescencyjne leukocyty (reprezentowane przez czerwone piksele), co daje główny wynik w postaci procentu absolutnego obszaru leukocytów (Paol). Średnio 95,27 ± 2,11% (FDA1) i 95,12 ± 1,56% (FDA2) studzienek (larw) zostało wykrytych prawidłowo i następnie poddanych dalszemu przetwarzaniu danych. Surowe dane wyjściowe (Paol dla każdego wykrytego neuromastu) są przechowywane w pliku txt i stanowią dane wejściowe dla skryptów MATLAB, które przetwarzają surowe dane w dalszej kolejności.
12. Przetwarzanie danych
1. iMaps
Ocena sukcesu poszczególnych eksperymentów poprzez wizualizację graficzną surowych danych wyjściowych Paol w kodzie kolorystycznym może zostać zrealizowana za pomocą tzw. map zapalnych (iMaps) (Rysunek 2). Jasnozielony kolor odzwierciedla wysoki początkowy wskaźnik zapalny; kolor czarny oznacza brak stanu zapalnego. Ten szybki przegląd umożliwia błyskawiczną identyfikację nieudanych eksperymentów, które mogą następnie zostać wykluczone z dalszych analiz danych.
2. Wyznaczanie średniej dla kontroli
Każda płyta eksperymentalna zawiera 320 związków, reprezentujących pojedynczy punkt danych dla każdego związku i punktu czasowego, a także odpowiednio 32 kontrole pozytywne i negatywne. Wyciągnięto średnią z 32 powtórzeń kontrolnych i obliczono odchylenie standardowe. W przypadku kontroli uwzględniono jedynie punkty danych mieszczące się w zakresie 2 odchyleń standardowych.
3. Normalizacja
Normalizację przeprowadza się za pomocą analizy w arkuszu kalkulacyjnym. Średnią wartość dla DMSO, pełniacego rolę kontroli negatywnej, przyjmuje się za 0, natomiast najwyższą średnią wartość Paol dla kontroli miedzi przyjmuje się za 1, tak aby maksymalna różnica między kontrolą pozytywną a negatywną wynosiła 1. Wartość Paol dla każdego związku jest interpolowana lub ekstrapolowana liniowo względem odpowiednich kontroli na płytce eksperymentalnej.
4. Odczyt końcowy: Indeks zapalny
Po przeprowadzeniu odpowiedniej liczby powtórzeń eksperymentów (tzn. 15), uśrednia się znormalizowane surowe dane z powtórzeń, co pozwala uzyskać końcowy odczyt – indeks zapalny. Początkowy indeks zapalny dla kontroli miedzi wynosi 100% dla punktu czasowego zero i odpowiada momentowi rozpoczęcia akwizycji obrazu (90 minut po początkowej obróbce miedzią).
5. Dopasowanie monotonicznej regresji wykładniczej
Ze względu na ustępowanie stanu zapalnego w czasie, przeprowadzamy monotoniczną nieliniową regresję wykładniczą względem początkowego stanu zapalnego, stosując <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Wzór wzrostu wykładniczego \(e^{(a_0 + a_1 x)}\) w wyrażeniu matematycznym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">- a0 jest miarą odpowiedzi początkowej w t=0, a a1 odnosi się do nachylenia amplitudy w czasie.
6. Wykres 2-wymiarowej przestrzeni cech (Rysunek 4)
W celu wygenerowania przestrzeni cech zastosowano regresję nieliniową, a analiza skupień podzieliła przestrzeń cech na regiony charakterystyczne, co pozwoliło na zautomatyzowaną identyfikację interesujących kandydatów z różnych kategorii immunomodulacyjnych (przeciwzapalnych, anty-rezolucyjnych, prozapalnych, pro-rezolucyjnych). Wszystkie związki zostały przedstawione na wykresie 2-D w oparciu o parametry a0 oraz a1.
13. Przetwarzanie i przechowywanie danych
Nasze procedury obsługi danych tworzą strony internetowe służące do wizualizacji i reprezentacji takich przesiewów leków, zapewniając szybki przegląd wyników etapów przetwarzania obrazów i danych, a także szczegółowy widok na żądanie użytkownika10. Zintegrowano również miękkie linki do innych odpowiednich, heterogenicznych baz danych biologicznych i chemicznych, aby zapewnić cenny zasób do badań porównawczych i nowatorskich11. Dzięki tym procedurom ustanowione zostają właściwe standardy danych i metainformacje niezbędne do długoterminowego przechowywania tych danych.
14. Reprezentatywne wyniki
W badaniu pilotażowym przeanalizowano bibliotekę składającą się z 640 zatwierdzonych przez FDA znanych związków bioaktywnych pod kątem ich wpływu na inicjację, progresję lub ustępowanie granulocytowej odpowiedzi zapalnej. Na podstawie zaobserwowanych efektów sklasyfikowano 4 typy fenotypów immunomodulujących, które mogą wskazywać na różne mechanizmy działania: przeciwzapalne (1), przeciwustępowe (2), prozapalne (3) oraz proustępowe (4), które można opisać parametrami a0 i a1 wynikającymi z monotonicznego dopasowania regresji nieliniowej (eao+alx-) do stanu początkowego zapalenia. A0 reprezentuje wielkość odpowiedzi zapalnej, natomiast a1 charakteryzuje nachylenie krzywej, a tym samym opisuje ustępowanie stanu zapalnego. Przedstawienie wszystkich związków na dwuwymiarowym wykresie cech (a1 vs. a0) pozwala na zautomatyzowaną identyfikację potencjalnych kandydatów z różnych kategorii immunomodulacyjnych (Rysunek 3).
45 z 640 związków wykazało istotny efekt przeciwzapalny, redukując początkowy indeks zapalny do 50% lub mniej. W tej kategorii zidentyfikowano 6 związków należących do farmakologicznej klasy niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ), co potwierdziło poprawność zastosowanego podejścia. Jednakże NLPZ nie znalazły się w grupie najsilniejszych leków przeciwzapalnych. Poza NLPZ zidentyfikowano kilka dodatkowych klas leków farmakologicznych, takich jak na przykład blokery receptora angiotensyny (ARB), antybiotyki oraz inhibitory pompy protonowej.
7 związków spełniło empirycznie określone kryteria progowe dla potencjalnych leków proresolutionowych.
18 leków wywołało efekt prozapalny, co skutkowało zwiększoną rekrutacją leukocytów do uszkodzonych neuromastów w porównaniu z kontrolami pozytywnymi.
Tylko 2 związki zapobiegły terminowemu ustąpieniu odpowiedzi zapalnej.
Przeciwzapalny efekt kilku kandydatów typu „hit” (reprezentatywnych związków z wyżej wymienionych klas leków farmakologicznych) z badania pilotażowego został potwierdzony w sposób zależny od dawki w kolejnych wtórnych testach ChIn (dane nie pokazano). Ponowne przetestowanie 4 potencjalnych leków pro-rozdzielczych nie potwierdziło wskazanego mechanizmu działania zaobserwowanego w badaniu pierwotnym. 2 z leków wykazały niewielki potencjał przeciwzapalny przy wyższych stężeniach (20 μM). Trzeci lek wykazał marginalny, niezależny od dawki efekt przeciwzapalny przy stężeniach leku w zakresie od 5 - 20 μM. Czwarty lek nie wywarł żadnego wpływu na odpowiedź zapalną przy przetestowanych stężeniach.
<img alt="Schemat testu na larwach danio pręgowanego, płytka 384-dołkowa, dozowanie cieczy, odpowiedź zapalna, time-lapse." src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procedury testu ChIn. Transgeniczne larwy cldnB::GFP/lysC::DsRED2 (3 dpf) są ręcznie rozmieszczane w 384-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych z podziałem na poszczególne związki. Leki są dodawane jednocześnie do każdego dołka za pomocą stacji roboczej do dozowania cieczy Zephyr Compact Liquid Handling Workstation. Płytki testowe są następnie inkubowane przez 1 h w temperaturze 29 °C. Traktowanie roztworem CuSO4 (stężenie końcowe 10 μM) przez 1 h powoduje uszkodzenie tkanek i inicjuje ostrą odpowiedź zapalną. Na koniec roztwór miedzi oraz leki są wypłukiwane, a następnie rozpoczyna się zautomatyzowane pozyskiwanie obrazów (90 minut po początkowym traktowaniu miedzią).
<img alt="Mikroskopia konfokalna danio pręgowanego, cztery stosy z; struktury komórkowe; analiza fluorescencji." src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przegląd surowych obrazów. Rysunek przedstawia surowe obrazy z 4 płaszczyzn ogniskowych (Z=0 - 3) w odstępach 50 μm odpowiednio w kanałach Cy3 (lewo) i GFP (prawo). Strzałki (Z=1,2) wskazują przykładowe neuromasty, groty strzałek (Z=1,2) wskazują skupiska leukocytów wokół neuromastów.
<img alt="Mapa ciepła przedstawiająca analizę macierzy danych; zielone kwadraty wskazują różne poziomy intensywności." src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mapy stanu zapalnego (iMaps). Sukces poszczególnych eksperymentów można ocenić na podstawie iMaps odzwierciedlających odpowiedź zapalną (surowe dane) za pomocą kodu kolorystycznego: jasny zielony oznacza silną początkową odpowiedź zapalną; kolor czarny wskazuje brak stanu zapalnego. iMaps w punkcie czasowym 0 (lewo) oraz w punkcie czasowym 5 (prawo) wyraźnie pokazują, czy eksperyment powinien zostać uwzględniony w dalszej analizie danych. Kontrole miedziowe (wiersz 13 i 24) pojawiają się w różnych odcieniach zieleni, podczas gdy studzienki kontrolne DMSO (wiersz 1 i 12) mają kolor ciemnozielony lub czarny. W punkcie czasowym 5 stan zapalny w kontrolach miedziowych jest prawie całkowicie wygaszony, co objawia się ciemnymi odcieniami zieleni lub czernią. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wykres regresji nieliniowej; analiza odpowiedzi na lek, przeciw/prozapalna, pro/przeciwrozdzielcza." src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Rycina 4. Dwuwymiarowy wykres przestrzeni cech dla 320 związków z biblioteki zatwierdzonej przez FDA oraz ich odpowiednich kontroli. Wszystkie studzienki ze związkami można przedstawić na dwuwymiarowym wykresie przestrzeni cech w oparciu o parametry a0 oraz a1, które wynikają z dopasowania regresją nieliniową ( <img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="Wzór wzrostu wykładniczego \(e^{(a_0 + a_1 x)}\) w wyrażeniu matematycznym." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equation 1"> ) względem stanu zapalenia początkowego. Ten wykres przestrzeni cech umożliwia zautomatyzowaną identyfikację interesujących kandydatów należących do jednej z czterech następujących kategorii immunomodulacyjnych, które mogą wskazywać na mechanizm działania leków: przeciwzapalna (1), przeciwrozdzielcza (2), prozapallna (3) i prorozdzielcza (4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinię</a>.

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
<li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li>
<li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+advance%3A+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li>
<li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li>
<li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li>
<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42(2007).</li>
<li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo%3A+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li>
<li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151(2010).</li>
<li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li>
<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy przedstawiamy w pełni zautomatyzowaną strategię wysokoprzepustowego przesiewu, umożliwiającą identyfikację związków immunomodulujących w kontekście całego organizmu zwierzęcia. Pozwala to na monitorowanie ostrej odpowiedzi zapalnej in vivo w czasie rzeczywistym.
 Przedstawiamy protokół wykorzystania rybek danio-ostrobramnych jako cennego organizmu modelowego w badaniach nad odkrywaniem nowych leków lub ich repropozycjonowaniem, ponieważ wpływ leków na rekrutację leukocytów do miejsc zranienia można badać z względną łatwością w kontekście w pełni funkcjonalnego wrodzonego układu odpornościowego. Wyjątkową zaletą naszego podejścia jest fakt, że chemiczne wywołanie rany eliminuje konieczność manualnej manipulacji larwami, co umożliwia automatyzację i przesiewanie w formacie wysokoprzepustowym.
 Dodatkowo, za pomocą proponowanej konfiguracji można łatwo ocenić niepożądane lub toksyczne działanie leków, a także silne efekty pozatarcze. Biblioteka zatwierdzona przez FDA nie zawierała jednak żadnych związków toksycznych przy zastosowanych stężeniach przesiewowych. Niemniej jednak, w przypadku wystąpienia ewidentnie toksycznych związków, proponujemy porównanie dostępnego zestawu danych (np. fenotypu immunomodulacyjnego, stężenia leku) pomiędzy przedstawicielami tej samej klasy substancji farmakologicznych obecnymi w testowanej bibliotece. Toksyczne związki z rodziny substancji, która w innym przypadku wykazuje obiecujący fenotyp immunomodulacyjny, mogą zostać ponownie przetestowane przy niższych stężeniach, jeśli będzie to konieczne.
 Wykazaliśmy możliwość automatycznej kategoryzacji leków zgodnie z wywieranym przez nie efektem immunomodulującym. Leki należące do kategorii związków przeciwzapalnych mogły zostać zwalidowane w niezależnych eksperymentach, przy czym większość związków wywierała swój efekt w sposób zależny od dawki. Cztery związki zidentyfikowane jako potencjalne leki pro-rozdzielcze (pro-resolution) nie mogły dotychczas zostać w ten sposób potwierdzone. Wskazuje to również na to, że ta konkretna kategoria immunomodulująca jest trudna do opisania, ponieważ w literaturze nie opisano dotąd żadnych leków wpływających wyłącznie na proces rozdzielania stanu zapalnego. Niemniej jednak 3 z 4 ponownie przetestowanych leków wykazały tendencję przeciwzapalną przy wyższych stężeniach molowych. Optymalizacja empirycznie określonych kryteriów progowych powinna pomóc w zmniejszeniu liczby wyników fałszywie dodatnich.
 Ponadto przedstawiona technika daje możliwość wykorzystania jej do identyfikacji mutacji w genach wpływających na zachowanie migracyjne leukocytów8.
 Podsumowując, proponowana metoda może usprawnić i przyspieszyć procesy odkrywania nowych leków lub repozycjonowania istniejących poprzez dostarczanie potencjalnych nowych struktur wiodących z łatwo dostępnymi informacjami na temat tolerancji leku, toksyczności, dawkowania, a także potencjalnych efektów pozatarczych. Stanowi ona zatem prostą, oszczędną pod względem kosztów i czasu strategię na wczesnych etapach opracowywania leków.

<table><tbody><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td>Carl Roth GmbH Co KG</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan miedzi(II) bezwodny</td><td>Carl Roth GmbH Co KG</td><td>PO23.1</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteka leków zatwierdzonych przez FDA</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-2841-0100</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 384-dołkowa niewiążąca, &amp;mu;Clear</td><td>Greiner</td><td>781906</td><td>czarna</td></tr><tr><td>Olympus scan^R</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stacja robocza do obsługi cieczy Zephyr Compact</td><td>Caliper</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Larwy danio pręgowanego są szczególnie podatne na przesiewy małocząsteczkowe całych organizmów1,2 ze względu na niewielki rozmiar oraz względną łatwość manipulacji i obserwacji, a także fakt, że związki można po prostu dodać do wody kąpielowej, gdzie są one łatwo wchłaniane, gdy zostaną podane w roztworze &lt;1% DMSO. Dzięki przejrzystości optycznej larw danio pręgowanego oraz dostępności linii transgenicznych wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych w leukocytach, ryby te oferują unikalną zaletę monitorowania ostrej odpowiedzi zapalnej in vivo. W związku z tym zaproponowano wykorzystanie danio pręgowanego do wysokoprzepustowych przesiewów małocząsteczkowych o wysokiej zawartości danych (high-content screens) w celu identyfikacji związków immunomodulujących3-6, sugerując scenariusze indukcji stanu zapalnego, np. miejscowe nacięcia tkanki płetwy, uszkodzenia laserowe skierowane na powierzchnię żółtka embrionów7 lub amputację płetwy ogonowej3,5,6. Główną wadą tych metod była jednak konieczność ręcznej manipulacji larwami w celu wywołania rany, co uniemożliwiało prowadzenie przesiewów wysokoprzepustowych. Wprowadzenie testu chemicznie indukowanego stanu zapalnego (ChIn)8 wyeliminowało te przeszkody. Ponieważ uszkodzenie jest wywoływane chemicznie, liczba embrionów, które można traktować jednocześnie, jest praktycznie nieograniczona. Krótkotrwałe traktowanie larw danio pręgowanego siarczanem miedzi selektywnie indukuje śmierć komórek rzęsatych w systemie linii bocznej i prowadzi do szybkiej rekrutacji granulocytów do uszkodzonych neuromastów. Odpowiedź zapalną można śledzić w czasie rzeczywistym, wykorzystując podwójne transgeniczne larwy danio pręgowanego cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9, które wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego w komórkach neuromastów oraz czerwonego białka fluorescencyjnego znakującego granulocyty.
W celu opracowania strategii przesiewowej, która umożliwiłaby analizy wysokotreściowe oraz wysokoprzepustowe, wprowadziliśmy zrobotyzowany system dozowania cieczy oraz połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskim skryptem oprogramowania. Skrypt ten umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej poprzez obliczanie procentowej powierzchni zajmowanej przez czerwone fluorescencyjne leukocyty w obrębie empirycznie zdefiniowanego obszaru wokół uszkodzonych zielonych fluorescencyjnych neuromastów. Ponadto zautomatyzowaliśmy przetwarzanie, obsługę, wizualizację i przechowywanie danych, opierając te procesy na autorskich skryptach w językach MATLAB i Python.
W skrócie, przedstawiamy zautomatyzowany screening HC/HT, który umożliwia testowanie związków chemicznych pod kątem ich wpływu na inicjację, progresję lub wygaszanie granulocytowej odpowiedzi zapalnej. Niniejszy protokół stanowi dobry punkt wyjścia do bardziej szczegółowych analiz mechanizmów działania leków oraz szlaków zaangażowanych w organizację wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. W przyszłości może on pomóc w identyfikacji niedopuszczalnych efektów toksycznych lub pozacelowych na wcześniejszych etapach odkrywania leków, a tym samym zmniejszyć ryzyko proceduralne i koszty rozwoju leków.

W niniejszej pracy opisujemy nowatorski wysokoprzepustowy test chemicznie indukowanego stanu zapalnego, którego celem jest identyfikacja bioaktywnych substancji immunomodulujących. Skutecznie połączyliśmy zautomatyzowaną mikroskopię z autorskimi skryptami oprogramowania, co umożliwia automatyczną kwantyfikację odpowiedzi zapalnej, a także dalsze przetwarzanie, analizę, wydobywanie i przechowywanie danych.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Larwy ryb zebrafish są szczególnie odpowiednie do prowadzenia przesiewów małocząsteczkowych na całym organizmie1,2 ze względu na ich niewielki rozmiar oraz stosunkową łatwość manipulacji i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przeprowadzenie przesiewu fenotypowego w celu zidentyfikowania aktywności immunomodulacyjnej związków przy użyciu testu stanu zapalnego in vivo na rybkach danio-ostrobłotkach. Osiąga się to poprzez rozdzielenie larw danio-ostrobłotków do płytki 384-dołkowej, a następnie dodanie do larw związków przeznaczonych do analizy, aby umożliwić ich penetrację tkanek.Następnie dodaje się roztwór siarczanu miedzi, aby wywołać swoiste uszkodzenie tkanki. Na koniec związki oraz siarczan miedzi zastępuje się świeżym medium. Ostatecznie, poprzez analizę danych z mikroskopii in vivo w czasie rzeczywistym, można uzyskać wyniki obrazujące stopień swoistego napływu leukocytów do tkanki w czasie.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na jednoczesne indukowanie stanu zapalnego u setek osobników, co umożliwia automatyzację procesów eksperymentalnych i analitycznych. Procedurę zaprezentuje Christina Whitman, doktorantka z mojego laboratorium. W celu przeprowadzenia testu chin, przygotuj grupy kojarzenia między homozygotycznymi rybami podwójnie transgenicznymi a rybami AB typu dzikiego. Zbierz embriony poprzez naturalne tarło i hoduj od 50 do 70 sztuk na płytkę w medium E3 w temperaturze 29 °C do trzeciego dnia po zapłodnieniu.Sprawdź wszystkie larwy pod fluorescencyjnym stereoskopem pod kątem ekspresji reportera fluorescencyjnego, samoistnego stanu zapalnego oraz prawidłowego rozwoju związanego z wiekiem. Po przygotowaniu podłoża przesiewowego i dodaniu 20 µL do studzienek płytki 384-dołkowej, przenieś pojedynczą znieczuloną larwę w 74 µL podłoża do każdej studzienki. Użyj końcówki pipety, której otwór został przycięty do średnicy 2 mm, wraz z elastyczną mikrokońcówką do pipety.Ustaw larwę w pozycji bocznej w dołku. Wszystkie kolejne etapy pipetowania przeprowadź za pomocą zrobotyzowanej stacji do obsługi cieczy, aby zapewnić jednoczesne podanie leku wszystkim larwom. Pipetuj w górę i w dół pięć razy, aby wymieszać związki na płytce z zapasem leków. Dodaj 16 µL z płytki z zapasem leków 7.5 x do płytki przesiewowej i wymieszaj pięć razy przy prędkości 10 µL/s.Przykryj płytkę screeningową folią aluminiową i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze 29 °C. Aby wywołać uszkodzenie chemiczne, dodaj 10 µL roztworu roboczego siarczanu miedzi o stężeniu 120 µM do każdej studzienki.Do studzienek z kontrolami negatywnymi dodaj mieszaninę czterokrotnie i inkubuj ponownie przez jedną godzinę w temperaturze 29 °C. Przepłucz embriony, usuwając i wymieniając 80 µL medium z każdej studzienki dwukrotnie, zaczynając od 90 minuty. Po wstępnej obróbce miedzią wykonaj zdjęcia za pomocą zautomatyzowanego mikroskopu odwróconego z obiektywem Forex.Ustaw początkowy poziom Z tak, aby widoczna była masa neuronalna z prawej i lewej linii bocznej tylnej, a następnie wykonuj obrazowanie każdej studzienki raz na godzinę. Do obrazowania wykorzystaj kanał Brightfield side three oraz kanały GFP w czterech płaszczyznach ogniskowania. Specjalistyczne oprogramowanie LabVIEW tworzy obrazy o rozszerzonym zakresie ostrości (extended focus) z czterech płaszczyzn ogniskowania dla każdego z kanałów.Obrazy są następnie łączone w celu stworzenia końcowego obrazu nałożonego w formacie RGB. Narzędzie do rozpoznawania wzorców identyfikuje neuromy na obrazach nałożonych RGB i tworzy empirycznie zdefiniowany obszar zainteresowania wokół neuromów; ocenie podlegają czerwone fluorescencyjne leukocyty otaczające uszkodzone neuromy, co pozwala uzyskać główny odczyt w postaci procentu powierzchni zajętej przez leukocyty lub obszary blade. Średnio 95% larw jest wykrywanych prawidłowo i może zostać następnie poddanych dalszemu przetwarzaniu danych.Sukces poszczególnych eksperymentów ocenia się za pomocą map stanu zapalnego lub map oka. Dane są zakodowane kolorami: jasna zieleń reprezentuje wysoki początkowy wskaźnik stanu zapalnego, a kolor czarny oznacza brak stanu zapalnego. Ten szybki przegląd pozwala na błyskawiczną identyfikację nieudanych eksperymentów, które mogą zostać następnie wykluczone z dalszej analizy danych.Mapy iMaps w czasie 0,0 i 0,5 wyraźnie pokazują, czy dany eksperyment powinien zostać uwzględniony w dalszym przetwarzaniu danych. Kontrole miedzi wykazują różne odcienie zieleni, podczas gdy studzienki kontrolne z DMSO w czasie 0,5 są ciemnozielone lub czarne. Stan zapalny jest prawie całkowicie ustąpiony w kontrolach miedzi, które są obecnie oznaczone ciemnymi odcieniami zieleni lub czernią w celu przetworzenia kontroli.Wyznaczane są średnie oraz odchylenia standardowe dla 32 powtórzeń kontrolnych. Uwzględniane są jedynie punkty danych mieszczące się w granicach dwóch odchyleń standardowych. Średnią wartość negatywnej kontroli DMSO przyjmuje się za zero, a najwyższą średnią wartość PAOL dla kontroli miedzi za jeden; następnie wartość PAOL dla każdego związku jest interpolowana liniowo lub ekstrapolowana względem odpowiednich kontroli na płytce eksperymentalnej.Znormalizowane surowe dane z eksperymentów powtórzonych są uśredniane w celu uzyskania ostatecznego odczytu, czyli indeksu zapalnego wynikającego z rozdzielczości stanu zapalnego. W czasie przeprowadza się monotoniczne dopasowanie nieliniowej regresji wykładniczej względem początkowego stanu zapalnego. Wykorzystując ten wzór, w którym zero jest miarą odpowiedzi początkowej w czasie równym zero, a jeden odnosi się do nachylenia wielkości w czasie w celu wygenerowania przestrzeni cech, stosuje się regresję nieliniową, a analiza skupień dzieli przestrzeń cech na regiony charakterystyczne, co umożliwia zautomatyzowaną identyfikację interesujących kandydatów z różnych kategorii immunomodulacyjnych.Wszystkie parametry są wyświetlane na wykresie 2D w oparciu o parametry ACE zero oraz ace jeden. Procedury przetwarzania danych generują strony internetowe, które zapewniają szybki przegląd wyników, a na żądanie użytkownika również widok szczegółowy. W ramach tych procedur zintegrowano również miękkie linki do innych istotnych heterogenicznych baz danych biologicznych i chemicznych, co stanowi cenny zasób do przeprowadzania badań porównawczych i nowatorskich.Wprowadzono odpowiednie standardy danych i metadane w celu długoterminowego przechowywania danych z badania pilotażowego. Przeprowadzono analizę biblioteki 640 znanych związków bioaktywnych zatwierdzonych przez FDA pod kątem ich wpływu na inicjację, progresję lub wygaszanie odpowiedzi zapalnej granulocytowej. Na podstawie zaobserwowanych efektów sklasyfikowano cztery typy fenotypów immunomodulujących, które mogą wskazywać na różne mechanizmy działania: przeciwzapalny, przeciwko wygaszaniu, prozapalny oraz sprzyjający wygaszaniu. 45 spośród 640 związków wykazało istotne działanie przeciwzapalne, redukując początkowy indeks zapalny do 50% lub mniej.W tej kategorii zidentyfikowano sześć związków należących do klasy farmakologicznej rzeczywistych leków przeciwzapalnych. Potwierdzając zasadność tego podejścia, po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo uzyskać pełne zrozumienie tego, jak fenotypowy screening in vivo w poszukiwaniu związków o działaniu immunomodulującym może zostać w dużej mierze zautomatyzowany, co pozwala na spójne pozyskiwanie danych i ich analizę w kontekście całego organizmu zwierzęcia.

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Automatyzacja badań nad lekami: Automatyczna metoda badania stanów zapalnych o wysokiej zawartości w rybach ze gatunku Danio rerio

Opisujemy opracowanie systemu do zautomatyzowanego obrazowania i analizy transgenicznych embrionów zebrafish w płytkach wielodołkowych. System ten wykazuje możliwość pomiaru efektów zależnych od dawki małej cząsteczki, BCI, na ekspresję genu reporterowego Fibroblast Growth Factor i dostarcza technologii do tworzenia wysokoprzepustowych skriningów chemicznych na zebrafish.

Opracowanie zautomatyzowanego obrazowania i analizy dla chemicznych badań przesiewowych na daniowiczkach Zebrafish.

Nasze laboratorium opracowało nowatorski system automatycznego obrazowania o wysokiej przepustowości, który jest przydatny do wykrywania kilku różnych zachowań u 7-dniowych larw danio pręgowanego. System może być używany do wykrywania subtelnych zmian w zachowaniu po wystawieniu larw na działanie toksyn środowiskowych lub farmaceutyków.

Zautomatyzowane, wysokoprzepustowe analizy behawioralne larw danio pręgowanego

Ten artykuł wideo opisuje potok o wysokiej przepustowości, który został pomyślnie ustanowiony do infekowania i analizowania dużej liczby zarodków danio pręgowanego, dostarczając nowego potężnego narzędzia do testowania związków i odkrywania leków przy użyciu całego organizmu kręgowców zwierzęcych.

Opracowanie i optymalizacja wysokoprzepustowej konfiguracji do badania zakażeń Staphylococcus epidermidis i Mycobacterium marinum jako modelu do odkrywania leków

Danio pręgowany jest doskonałym organizmem doświadczalnym do badania procesów rozwojowych kręgowców i modelowania chorób ludzkich. W tym miejscu opisujemy protokół, w jaki sposób przeprowadzić ręczne, wysokoprzepustowe badanie chemiczne na zarodkach danio pręgowanego z odczytem hybrydyzacji in situ (WISH) w całości.

Ręczne badanie przesiewowe małych cząsteczek zbliżające się do wysokiej przepustowości przy użyciu zarodków danio pręgowanego

Protokół opisuje intubację dorosłego danio pręgowanego za pomocą leku biologicznego; następnie preparację i przygotowanie jelita do cytometrii, mikroskopii konfokalnej i qPCR. Metoda ta pozwala na podawanie związków bioaktywnych w celu monitorowania wychwytu jelitowego i wywołanego miejscowego bodźca immunologicznego. Ma to znaczenie dla badania dynamiki jelit w profilaktyce doustnej.

Doustna intubacja dorosłego danio pręgowanego: model oceny wychwytu związków bioaktywnych w jelitach

Celem tego protokołu jest zmierzenie czasu przejścia fluorescencyjnie znakowanego pokarmu przez jelita larw danio pręgowanego w sposób wysokoprzepustowy.

Wysokoprzepustowy pomiar czasu pasażu jelitowego przy użyciu larw danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Modele ksenoprzeszczepów danio pręgowanego pozwalają na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków i obrazowanie fluorescencyjne ludzkich komórek nowotworowych w mikrośrodowisku in vivo. Opracowaliśmy przepływ pracy do zautomatyzowanych badań przesiewowych leków na dużą skalę na próbkach białaczki pobranych od pacjentów u danio pręgowanego przy użyciu zautomatyzowanego urządzenia do obrazowania wyposażonego w mikroskop fluorescencyjny.

Badania przesiewowe leków w ksenoprzeszczepach nowotworowych pochodzących od pacjenta pręgowanego

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół automatycznego wszczepiania ksenoprzeszczepu nowotworowego larwam danio pręgowanego za pomocą nowoczesnego robotycznego systemu iniekcji. Ponadto prezentujemy filmy z iniekcjami oraz dane walidacyjne pokazujące skuteczną wydajność systemu.

Automatyzacja implantacji guzów w larwach danio dano młodego dla badań i medycyny nowotworowej

Analityka wizualna (VA) to nowe podejście do interaktywnej analizy danych. W tym filmie omawiamy problem nadmiaru danych wynikający z wysokoprzepustowych eksperymentów biologicznych i proponujemy VA jako rozwiązanie tego problemu. Film demonstruje analizę w obrębie oraz pomiędzy zestawami danych immunologicznych przy użyciu narzędzia VA o nazwie Tableau.

Ułatwianie analizy danych immunologicznych za pomocą technik analizy wizualnej

Odkryj zautomatyzowany test zapalenia o wysokiej zawartości u Danio rerio do badania związków immunomodulujących. Ta metoda umożliwia szybkie przesiewanie bioaktywnych substancji z wykorzystaniem mikroskopii automatycznej.

Usprawnianie odkrywania leków: zautomatyzowany wysokotreściowy test stanu zapalnego u rybek danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów