Ułatwianie odkrywania leków: zautomatyzowany test zapalenia o wysokiej zawartości u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest przeprowadzenie fenotypowego badania przesiewowego w celu zidentyfikowania immunomodulacyjnej aktywności związków za pomocą testu zapalenia danio pręgowanego in vivo. Osiąga się to poprzez najpierw rozprowadzenie larw danio pręgowanego do 384. Do larw dodaje się płytki studziennej Kolejne związki, które mają być przesiewane, aby umożliwić penetrację tkanki.

Następnie dodaje się roztwór siarczanu miedzi w celu spowodowania uszkodzeń specyficznych dla tkanki. Na koniec związki i siarczan miedzi są zastępowane świeżą pożywką. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują zakres napływu leukocytów specyficznych dla tkanek w czasie, poprzez analizę danych mikroskopowych in vivo w czasie rzeczywistym.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na jednoczesną indukcję stanu zapalnego u setek osób, a tym samym umożliwia automatyzację eksperymentalną i analityczną. Procedurę zademonstruje Christina Whitman, doktorantka z mojego laboratorium Zajmującego się testem podbródka. Ustaw krycia grupowe między homozygotycznymi, podwójnie transgenicznymi i dzikimi rybami typu AB, zbieraj zarodki przez naturalne tarło i hoduj od 50 do 70 na płytkę w trzech pożywkach E w temperaturze 29 stopni Celsjusza do trzech dni po zapłodnieniu.

Sprawdź wszystkie larwy pod fluorescencyjnym stereoskopem pod kątem fluorescencyjnej ekspresji reporterowej, spontanicznego zapalenia i odpowiedniego rozwoju związanego z wiekiem. Po przygotowaniu pożywki sitowej i dodaniu 20 mikrolitrów do studzienek 384, płytki studzienkowej przenieść pojedynczą znieczuloną larwę w 74 mikrolitrach pożywki do każdej studzienki. Za pomocą końcówki do pipety, która została przycięta do średnicy dwóch milimetrów z elastyczną końcówką do mikropipet.

Ustawić larwę w pozycji bocznej w studzience Przeprowadzić wszystkie następujące etapy postępowania z cieczą za pomocą zrobotyzowanej stacji roboczej do obsługi cieczy, aby zapewnić jednoczesne leczenie wszystkich larw w celu leczenia farmakologicznego. Pipetuj w górę i w dół pięć razy, aby wymieszać związki na talerzu z lekiem. Dodaj 16 mikrolitrów 7,5 x płytki wyjściowej leku do płytki przesiewowej i wymieszaj pięć razy z prędkością 10 mikrolitrów na sekundę.

Przykryj płytkę sitową folią aluminiową i inkubuj przez godzinę w temperaturze 29 stopni Celsjusza. Aby wywołać zranienie chemiczne. Do każdego dodać 10 mikrolitrów 120 mikromolowego roztworu roboczego siarczanu miedzi.

Zaakceptuj kontrole ujemne, wymieszaj cztery razy i ponownie inkubuj przez godzinę w temperaturze 29 stopni Celsjusza. Umyć zarodki, usuwając i wymieniając 80 mikrolitrów pożywki z każdej studzienki dwa razy, zaczynając 90 minut. Po wstępnej obróbce miedzi uzyskaj obrazy na odwróconym mikroskopie automatycznym za pomocą obiektywu Forex.

Ustaw początkowy poziom Z tak, aby masa nerwowa z prawej i lewej tylnej linii bocznej była widoczna i obrazuj każdą studzienkę raz na godzinę. Korzystanie z trzech kanałów po stronie Brightfield i GFP w czterech płaszczyznach ogniskowych. Oprogramowanie do tworzenia niestandardowych widoków laboratoryjnych tworzy obrazy o rozszerzonej ostrości z czterech płaszczyzn ogniskowych dla każdego z kanałów.

Obrazy są następnie łączone w celu utworzenia końcowego obrazu nakładki RGB. Narzędzie do rozpoznawania wzorców identyfikuje nerwiaki na obrazach nakładki RGB i tworzy empirycznie zdefiniowany obszar zainteresowania wokół nerwiaków, w wyniku czego oceniane są czerwone fluorescencyjne leukocyty otaczające uszkodzone nerwiaki, co daje podstawowy odczyt procentowego obszaru zajmowanego przez leukocyty lub bladego. Średnio 95% larw jest wykrywanych prawidłowo, a następnie może być poddanych dalszemu przetwarzaniu danych.

Powodzenie poszczególnych eksperymentów ocenia się za pomocą map stanów zapalnych lub map oczu. Blade dane są oznaczone kolorem jasnozielonym, co oznacza wysoki początkowy wskaźnik stanu zapalnego, a oznacza brak stanu zapalnego. Ten szybki przegląd pozwala na szybką identyfikację nieudanych eksperymentów, które można następnie wykluczyć z dalszej analizy danych.

iMaps w czasie 0.0 i czasie 0.5 wyraźnie pokazują, czy eksperyment powinien zostać uwzględniony w dalszym przetwarzaniu danych. Miedziane kontrolki pojawiają się w różnych odcieniach zieleni, podczas gdy studzienki kontrolne DMSO pojawiają się w kolorze ciemnozielonym lub czarnym w czasie 0,5. Stan zapalny jest prawie rozwiązany w miedzianych kontrolach, które są teraz oznaczone ciemnymi odcieniami zieleni lub czerni w celu przetworzenia kontroli.

32 kontrpróby kontrolne są uśredniane i obliczane jest odchylenie standardowe. Tylko. Uwzględniane są punkty danych w obrębie dwóch odchyleń standardowych. Średnia wartość DMSO kontroli ujemnej jest ustawiona na zero, a najwyższa średnia PAOL dla kontroli miedzi jest ustawiona na jeden, PAOL każdego związku jest liniowo, interpolowany lub ekstrapolowany na odpowiednie kontrole na płytce doświadczalnej.

Znormalizowane surowe dane z powtórzonych eksperymentów są uśredniane, co daje ostateczny odczyt, indeks zapalny spowodowany ustąpieniem stanu zapalnego. Z biegiem czasu wykonuje się monotoniczne wykładnicze dopasowanie regresji nieliniowej w kierunku początkowego stanu zapalnego. Korzystając z tej formuły, w której zero jest miarą początkowej odpowiedzi w czasie równym zero, a jedynka jest związana z nachyleniem wielkości w czasie w celu wygenerowania przestrzeni cech, stosuje się regresję nieliniową, a analiza skupień dzieli przestrzeń cech na charakterystyczne regiony, umożliwiając w ten sposób automatyczną identyfikację interesujących kandydatów z różnych kategorii modulacji immunologicznej.

Wszystkie parametry są wyświetlane na wykresie 2D w oparciu o parametry ACE równe zero i ace równe jeden. Procedury przetwarzania danych tworzą strony internetowe, które zapewniają szybki przegląd wyników, a także szczegółowy widok i są wymagane przez użytkownika. Zintegrowane są również miękkie linki do innych odpowiednich heterogenicznych, biologicznych i chemicznych baz danych, aby zapewnić cenne źródło dla badań porównawczych i nowatorskich za pomocą tych procedur.

Ustalono odpowiednie standardy danych i meta informacje dla długoterminowego przechowywania tych danych na ekranie pilotażowym, przeprowadzono analizę w bibliotece 640 znanych związków bioaktywnych zatwierdzonych przez FDA pod kątem wpływu na progresję inicjacji lub ustąpienie granulocytarnej odpowiedzi zapalnej. Na podstawie zaobserwowanych efektów sklasyfikowano cztery typy fenotypów immunomodulacyjnych, które mogą wskazywać na różne sposoby działania: przeciwzapalne, przeciwrozwiązywalne, prozapalne i pro-rozdzielcze. 45 z 640 związków wywierało znaczące działanie przeciwzapalne poprzez obniżenie początkowego indeksu zapalnego do 50% lub mniej.

W tej kategorii znaleziono sześć związków, które należały do farmakologicznej klasy prawdziwych leków przeciwzapalnych. Potwierdzając słuszność tego podejścia, po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób fenotypowe badania przesiewowe in vivo pod kątem aktywności związków immunomodulujących mogą być w dużej mierze zautomatyzowane, co pozwala zarówno na spójne pozyskiwanie danych, jak i analizę w kontekście całego zwierzęcia.