Oczyszczanie i agregacja wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu

Celem tej procedury jest oczyszczenie wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu, znanej również jako A ICD, oraz przedstawienie protokołu agregacji termicznej i charakterystyki ICD A za pomocą mikroskopii sił atomowych. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję fuzji A GST ICD w bakteriach. Następnie białko G-S-T-A-I-C-D jest oczyszczane i rozszczepiane trombiną w celu oddzielenia GST od A ICD, a GST jest usuwany.

Następnie indukowana jest agregacja termiczna ICD A. Na koniec agregaty A ICD są obrazowane za pomocą mikroskopii sił atomowych. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które pokazują, że ICD A można oczyścić do jednorodności w ilości wystarczającej do analizy biochemicznej i biofizycznej.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, które wymagają skomplikowanych etapów chromatografii, jest to, że jest wysoce czysta i rozpuszczalna. ICD można wyizolować na stole przy użyciu standardowych odczynników i sprzętu. ICD wytworzony przez ten protokół nadaje się do dalszej charakterystyki biochemicznej i biofizycznej.

Demonstracją procedury będzie Amina ti. Były postdoc w moim laboratorium, dr Andres Oberer, zademonstruje, jak wykonać obrazowanie ICD za pomocą mikroskopii sił atomowych w celu ekspresji rekombinowanej domeny wewnątrzkomórkowej A PP lub ICD. Zacznij od komórek BL 21 przekształconych za pomocą wektora pgx 41, zawierającego ludzki ICD A połączony z końcem C GST z pojedynczą kolonią, zaszczepij 10 mililitrów bulionu LB ampicyliną i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym potrząsaniem następnego ranka.

Inkubować 400 mililitrów ampicyliny LB w litrowej kolbie z pięcioma mililitrami nocnej hodowli. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym potrząsaniem, aż gęstość optyczna przy 600 nanometrach osiągnie 0,4 do 0,6. Zwykle zajmuje to od dwóch do 2,5 godziny, aby wywołać ekspresję G-S-T-A-I-C-D.

Dodajemy 0,4 milimola IPTG i inkubujemy w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym wstrząsaniem przez pięć godzin. Odwirować komórki w temperaturze 6 000 razy G przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i przechowywać osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przygotowaniu lizy, buforu i wyrzuceniu bakterii na lód, dodaj 20 mililitrów buforu do granulki i stosując kombinację wirowania i tacji na lodzie za pomocą pipety.

Reese zawiesił osad bakteryjny, przepuścił zawieszony lizat bakteryjny Reese'a przez wstępnie schłodzony emulgator lub prasę francuską. Przy 30 000 PSI przepuść lizat przez emulgator po raz drugi i zbierz lizat we wstępnie schłodzonej probówce o pojemności 50 mililitrów. Odwirować lizat 15 000 razy G i cztery stopnie Celsjusza przez 30 minut.

Oddzielić i przenieść supinat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 50 mililitrów. Dodaj 500 mikrolitrów powstałej 50% zawiesiny glutationu. Obracać przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, podczas gdy próbka się obraca.

Po inkubacji należy sporządzić świeży bufor elucyjny. Wlej lizat i zawiesinę do jednorazowej pięciocalowej kolumny chromatograficznej z polistyrenu z filtrami kursowymi. Umyj kolumnę pięć razy trzema mililitrami PBS.

Zakryj dno kolumny i dodaj 500 mikrolitrów buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Przykryj górną część kolumny i obracaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zbierz wczesną masę do schłodzonej 1,5-mililitrowej mikrorurki na śmieci.

Powtórz elucję jeszcze dwa razy. Następnego dnia należy dializować eluat w membranie dializacyjnej o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej w czterech litrach PBS przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Dializuj z dodatkowymi czterema litrami PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Usunąć białko z kasety dializacyjnej i przeprowadzić test ilościowy białka w celu określenia wydajności G-S-T-A-I-C-D. Typowe oczyszczanie z 400 mililitrów kultury spowoduje uzyskanie plonów większych niż 20 miligramów oczyszczonego białka przy stężeniach od 10 do 20 miligramów na mililitr. Podniec białko na 200 mikrolitrów, porcje i zamrozić w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Aby uwolnić ICD A z rozmrażania GST, 200 mikrolitrów oczyszczonego G-S-T-A-I-C-D i dodać 20 mikrouwolnień jednej jednostki na mikrolitr trombiny inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza następnego dnia, usunąć cały zagregowany materiał przez odwirowanie w temperaturze 20 000 razy G przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś SUPINATE do wstępnie schłodzonej mikroprobówki, aby usunąć GST i trombinę. Dodaj odpowiednio 50 mikrolitrów gnojowicy 50% glutationu aro i 50 mikrolitrów, 50% p i gnojowicy wino zaine aro.

Inkubować z rotacją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Odwirować na krótko, aby osadzać kulki agro i usunąć supinat do świeżej probówki. Wyciągnij GST jeszcze cztery razy za pomocą glutationu.

Aros przeprowadza test ilościowy białka na pięciu mikrolitrach oczyszczonego ICD A. Typowe plony z hodowli o pojemności 400 mililitrów wynoszą od 50 do 100 mikrogramów przy stężeniu od 0,2 do 0,5 miligrama na mililitr. Po rozcieńczeniu świeżo przygotowanego ICD w PBS do stężenia 0,1 miligrama na mililitr indukowała agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 stopni Celsjusza przy 800 obr./min w podgrzewanej wytrząsarce przez 48 godzin.

Rozcieńczyć próbkę 20-krotnie wodą dejonizowaną i nanieść dwa mikrolitry na świeżo rozszczepione. Mika wysuszyć próbkę w wysuszonym roztworze przez noc, aby uwidocznić zagregowany ICD A użyj mikroskopii sił atomowych w trybie stukania ze złotą kozą. Wsporniki z azotku mikro ostrego o nominalnym promieniu końcówki wynoszącym dwa nanometry.

Typowe amplitudy stukania podczas obrazowania, od 10 do 20 nanometrów przy częstotliwości rezonansowej wsporników. Wyrażenie i względne wzbogacenie G-S-T-A-I-C-D jest pokazane tutaj. Po lizie większość białka fuzyjnego jest obecna we frakcji rozpuszczalnej, dlatego ekstrakcja z ciał inkluzyjnych nie jest wymagana.

Materiał, o którym mowa w kolumnie z powozem glutationu, jest czysty w ponad 95%. W przedstawionym tutaj preparacie stężenie białka naliczonego z kolumny wynosiło 14,5 miligrama na mililitr, a wydajność wynosiła 22 miligramy. Rozszczepienie 200 mikrolitrów tego preparatu w ciągu nocy z 20 jednostkami trombiny spowodowało prawie 100% rozszczepienie białka fuzyjnego.

Ilość użytej trombiny jest na tyle mała, że nie jest wykrywalna przez kumasi. Niebieskie zabarwienie, usunięcie trombiny i GST spowodowało pewne straty materiału. Jednak był on większy niż 90% czysty z wydajnością w tym preparacie 70 mikrogramów ICD w stężeniu 0,35 miligrama na mililitr.

Agregacje ICD, obrazowane przez FM, są zazwyczaj steroidowe amorficzne i mają rozmiar od 50 do 100 nanometrów. Zagregowany materiał nie jest wykrywalny, gdy do reakcji agregacji dodaje się równomolową ilość białka opiekuńczego UBI Quillin one. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oczyścić EICD, indukować jego agregację i wnękę agregacji obrazu A-F-M-E-I-C-D.

Oczyszczone za pomocą tej techniki można zastosować do innych metod, takich jak rozpraszanie światła i testy pułapek filtrujących, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu molekularnych białek opiekuńczych na agregację EACD.