Name: Oczyszczanie i agregacja wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Poznaj metodę oczyszczania domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu (AICD) oraz jej agregację termiczną z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowej. Technika ta umożliwia badanie agregacji białek w kontekście choroby Alzheimera.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) za cDNA APP. Praca ta była finansowana z grantów NIH R21AG031948 (D.B., J.M.B.), F30AG030878 (E.S.S.), R01DK073394 (AFO), Funduszu Upamiętniającego Johna Sealy’ego na rzecz Badań Biomedycznych (AFO) oraz Funduszu Badań Neurologicznych Jean C. i William D. Willis (E.S.S.). J.M.B. jest stypendystą w programie Translational Research Scholar Program oraz członkiem Centrum Niezależności Starszych Amerykanów Claude E. Pepper przy University Of Texas Medical Branch (wspieranego odpowiednio przez granty NIH UL1RR029876 i P30-AG-024832).

1. Ekspresja rekombinowanej domeny wewnątrzkomórkowej białka APP (AICD)
<ol>
 <li>Przeprowadź transformację szczepu E. coli BL21 ludzkim AICD (pozostałości 649-695 APP, numeracja izoformy neuronalnej) sklonowanego do wektora pGEX-4T-1 (GE Healthcare). Wektor ten spowoduje ekspresję AICD jako części C-końcowej białka fuzyjnego z transferazą S-glutationową (GST). Wektor ten koduje również sekwencję cięcia trombiną, aby ułatwić usunięcie części GST. Szczegóły klonowania AICD do pGEX-4T-1 znajdują się w naszej poprzedniej publikacji4.</li>
 <li>Z pojedynczej kolonii zaszczep 10 ml bulionu LB z ampicyliną (100 μg/ml) i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu.</li>
 <li>Następnego ranka zaszczep 400 ml LB/ampicyliny w kolbie o pojemności jednego litra za pomocą 5 ml kultury nocnej.</li>
 <li>Inkubuj w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0,4 do 0,6. Zazwyczaj zajmuje to od 2 do 2,5 hr.</li>
</ol>
Na tym etapie warto pobrać małą próbkę (~10 μl), aby monitorować proces oczyszczania za pomocą SDS-PAGE (patrz Rysunek 1A,B). Z każdego kolejnego etapu oczyszczania należy również pobrać małą alikwot do analizy metodą SDS-PAGE.
<ol start="5">
 <li>Indukować ekspresję GST-AICD poprzez dodanie 0,4 mM izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozydu (IPTG). Inkubować w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu przez 5 hr.</li>
 <li>Wirować komórki z prędkością 6,000 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C. Na tym etapie procedury osad komórkowy można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie GST-AICD
<ol>
 <li>Przygotować 50 ml buforu do lizy w następujący sposób: 1 mM ditiotreitol, 1mM kwas etylenoaminotetraoctowy (EDTA), 0,1% Triton-X100, 1 mM fluorurek fenylometylosulfonylowy (PMSF), Complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science) oraz bufor fosforanowo-solny (PBS). Schłodzić na lodzie.</li>
 <li>Odmrozić osad bakteryjny (jeśli był wcześniej zamrożony) na lodzie.</li>
</ol>
Na tym etapie kluczowe jest, aby wszystkie kroki były wykonywane w temperaturze 4 °C w celu ograniczenia proteolizy. Wszystkie probówki, bufory i pozostałe odczynniki powinny być schłodzone. W przypadku użycia prasy francuskiej lub emulsyfikatora do lizy, urządzenia te również powinny być uprzednio schłodzone.
<ol start="3">
 <li>Dokładnie resuspenduj osad bakteryjny w 20 ml buforu do lizy. Połączenie mieszania w wirówce typu vortex oraz trituracji pipetą 10 ml na lodzie zapewni całkowitą resuspensję osadu.</li>
 <li>Przepuść resuspendowane komórki bakteryjne przez emulsyfikator (np. Avestin EmulsiFlex-C3) lub prasę francuską, schłodzone wcześniej do 4 °C, przy ciśnieniu 30,000 psi. Przepuść lizat przez emulsyfikator po raz drugi. Zbierz lizat do schłodzonej wcześniej probówki 50 ml.</li>
</ol>
Główną zaletą tych dwóch instrumentów jest to, że minimalizują one nagrzewanie próbki. Powszechnie stosowana technika sonikacji generuje znaczną ilość ciepła na końcówce sondy sonikacyjnej, co może prowadzić do agregacji białek rekombinowanych.
<ol start="5">
 <li>Odwiruj lizat z prędkością 15,000 x g przez 30 min. Oddziel i przelej nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml.</li>
 <li>Dodaj 500 μl 50% zawiesiny agarozy z glutationem (Sigma-Aldrich). Inkubuj w rotatorze przez 30 min w temperaturze 4 °C. Podczas rotacji próbki przygotuj świeży bufor elucyjny: 50 mM Tris 7.8, 0.1% Triton-X100, 0.5 mM ditiotreitol, 10 mM zredukowany glutation.</li>
</ol>
Jedynym krokiem protokołu wykonywanym w temperaturze pokojowej jest etap elucji. W związku z tym bufor do elucji przechowuje się w temperaturze pokojowej. Bufor do elucji należy przygotować bezpośrednio przed użyciem.
<ol start="7">
 <li>Przelej lizat i zawiesinę do jednorazowej 5-calowej polistyrenowej kolumny chromatograficznej z grubymi filtrami (90-130 μm) (Evergreen Scientific). Przemyj kolumnę 5 razy 3 ml fosforanowego buforu solnego (PBS).</li>
 <li>Zamknij dół kolumny i dodaj 500 μl buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Zamknij górę kolumny i obracaj przez 5 min w temperaturze pokojowej. Zbierz eluat do schłodzonej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Powtórz elucję jeszcze dwa razy (łącznie 1,5 ml eluatu).</li>
 <li>Przeprowadź dializę eluatu za pomocą membrany dializacyjnej z progiem odcięcia 10 000 Da (np. kasety dializacyjne Thermo Scientific Slide-A-Lyzer) w 4 litrach fosforanowego buforu solnego przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia przeprowadź dializę przeciwko kolejnym 4 litrom fosforanowego buforu solnego w temperaturze 4 °C przez 1 h.</li>
 <li>Przenieś białko z kasety dializacyjnej i wykonaj test ilościowy białka, aby określić wydajność GST-AICD. Typowe oczyszczanie z 400 ml hodowli daje wydajność &gt;20 mg oczyszczonego białka przy stężeniach 10-20 mg/ml. Rozdziel białko na aliquoty po 200 μl i zamroź w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Rozszczepienie GST-AICD przez trombinę i oczyszczanie AICD
<ol>
 <li>Odmrozić 200 μl oczyszczonego GST-AICD i dodać 20 μl trombiny o stężeniu 1 U/μl. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
Jakość i czystość trombiny znacznie różnią się w zależności od producenta i mogą stanowić istotne źródło zanieczyszczeń. Stosujemy trombinę firmy GE Healthcare (patrz tabela odczynników). Po inkubacji przez noc, &gt;95% białka fuzyjnego powinno zostać odcięte (Rysunek 1B).
<ol start="2">
 <li>Po całonocnym cięciu trombiną prawdopodobne jest, że część uwolnionego AICD uległa agregacji, przez co roztwór może być mętny. Usuń zagregowany materiał poprzez wirowanie przy 20,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Przenieś nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki do mikrowirówki.</li>
 <li>Dodaj 50 μl 50% zawiesiny glutation-agarozy oraz 50 μl 50% zawiesiny p-aminobenzamidyną-agarozy, aby usunąć odpowiednio GST i trombinę. Inkubuj w rotacji przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Wiruj krótko, aby osadzić kuleczki agarozy, a następnie przenieś nadsącz do nowej probówki. Usuń GST za pomocą glutation-agarozy jeszcze czterokrotnie. Pojedyncza ekstrakcja p-aminobenzamidyną-agarozą jest wystarczająca do usunięcia 20 U trombiny.</li>
 <li>Wykonaj oznaczanie ilości białka na 5 μl oczyszczonego AICD. Typowe wydajności z 400 ml hodowli wynoszą 50-100 μg przy stężeniu od 0,2 do 0,5 mg/ml. Wyższe wydajności można uzyskać poprzez cięcie większych objętości GST-AICD.</li>
</ol>
Oczyszczony AICD należy przygotować bezpośrednio przed charakterystyką biochemiczną/biofizyczną. Niewykorzystany materiał należy zutylizować. Możliwe jest również zagęszczenie AICD poprzez liofilizację próbki i ponowne zawieszenie w mniejszej objętości buforu6. Jeśli wykrywanie AICD wymaga transferu (np. po metodzie filter trap lub w teście dot blot), należy przeprowadzić regenerację antygenu na membranie zgodnie z opisem Pimplikara i Suryanarayany12.
4. Agregacja AICD do mikroskopii sił atomowych (AFM)
<ol>
 <li>Świeżo przygotowany AICD rozcieńczyć w roztworze soli fizjologicznej z buforem fosforanowym do stężenia 0,1 mg/ml w końcowej objętości 15 μl. Na tym etapie można dodać różne związki i/lub białka, aby sprawdzić, czy hamują one agregację AICD. Przykładowo, wykazaliśmy w tym teście, że ekvimolarne stężenia ubiquilin-1 zapobiegają agregacji AICD4.</li>
</ol>
Możliwe jest również gromadzenie większych objętości reakcyjnych dla eksperymentów biochemicznych, takich jak testy z pułapką filtrową oraz rozpraszanie światła4. Pomyślnie przeprowadziliśmy testy z pułapką filtrową na mieszaninach reakcyjnych o objętości do 400 μl przy rozcieńczeniu AICD do stężeń tak niskich jak 1 μM.
<ol start="2">
 <li>Wywołaj agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 °C przy mieszaniu z prędkością 800 rpm w mikserze termicznym Eppendorf Thermomixer przez 48 hr. Temperaturę tę wybrano na podstawie testów chaperonowych badających agregację termiczną modelowego substratu chaperonowego, jakim jest syntaza cytrynianowa4,13.</li>
</ol>
Agregacja termiczna jest powszechnie stosowaną metodą indukowania przejścia strukturalnego białka ze stanu natywnego w strukturę nienatywną (zazwyczaj bogatą w harmonijki beta), co prowadzi do tworzenia się agregatów międzycząsteczkowych. Agregację termiczną wykorzystuje się również do badania funkcji chaperonów molekularnych, które osłaniają segmenty hydrofobowe, zapobiegając tworzeniu nieprawidłowych oddziaływań międzycząsteczkowych (a tym samym opóźniając lub zapobiegając agregacji termicznej).
<ol start="3">
 <li>Próbkę rozcieńczyć 20-krotnie w wodzie dejonizowanej i nanieść 2 μl na świeżo łupaną mikę. Próbkę suszyć w eksyكاتهorze przez noc. Konieczne będzie empiryczne określenie optymalnego rozcieńczenia do obrazowania, dlatego zasadne byłoby przygotowanie kilku rozcieńczeń w zakresie od 10- do 100-krotnego.</li>
 <li>Zaggregated AICD zwizualizować za pomocą AFM pracującego w trybie tapping mode14. Wykorzystane dźwigary to mikroostre dźwigary azotkowe pokryte złotem (MSNL, Bruker) o nominalnym promieniu wierzchołka 2 nm. Typowe amplitudy drgań podczas obrazowania wynoszą 10-20 nm przy częstotliwości rezonansowej dźwigarów (30-50 kHz).</li>
</ol>
Stwierdzono, że jakość obrazu i kontrast różnych agregatów białkowych zależały od przyłożonej siły oraz czasu trwania eksperymentu. Aby zminimalizować zaburzenia próbki powodowane przez sondę, utrzymywano stosunkowo niską siłę przyłożoną, zachowując stosunek set-point powyżej 95% i ograniczając skanowanie każdej próbki do 5-10 min. Przetwarzanie obrazów przeprowadzono za pomocą oprogramowania WSxM (Nanotec). Standardowe przetwarzanie obrazu obejmowało odejmowanie płaszczyzny i wyrównywanie (flattening). Nasze laboratoria wykorzystują własnej konstrukcji AFM15 zintegrowany z komercyjnym systemem sterowania mikroskopem sondowym (Nanotec).
5. Reprezentatywne wyniki
Ekspresja i względne wzbogacenie GST-AICD przedstawione są na Rysunku 1A. Po lizie większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej, w związku z czym ekstrakcja z ciałek inkluzyjnych nie jest wymagana. Materiał eluowany z kolumny z agarozą glutationową jest czysty w &gt;95%. W preparacie pokazanym na Rysunku 1 stężenie białka eluowanego z kolumny wynosiło 14,5 mg/ml, a wydajność wyniosła 22 mg (z kultury początkowej o objętości 400 ml). Nocne trawienie 200 μl tego preparatu przy użyciu 20 U trombiny doprowadziło do niemal 100% rozszczepienia białka fuzyjnego (Rysunek 1B). Ilość użytej trombiny jest na tyle niska, że nie jest ona wykrywalna w barwieniu błękitem Coomassie (patrz ścieżka „Cleaved”, Rysunek 1B). Usunięcie trombiny i GST spowodowało pewną utratę materiału, jednak był on czysty w &gt;90%, a wydajność w tym preparacie wyniosła 70 μg AICD przy stężeniu 0,35 mg/ml. Rysunek 1C przedstawia schemat agregacji AICD i późniejszej analizy. Agregaty AICD obrazowane za pomocą AFM mają zazwyczaj kształt sferoidalny/amorficzny, a ich rozmiar mieści się w przedziale od 50 do 100 nm (Rysunek 1D,F). Materiał zagregowany nie jest wykrywalny, gdy do reakcji agregacji dodano ekimolarną ilość chaperonu ubikwiliny-1 (Rysunek 1E)4.
<img alt="Wyniki SDS-PAGE, schemat oczyszczania białka, dane z mikroskopii sił atomowych (AFM), histogram średnic." src="/files/ftp_upload/4204/4204fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Oczyszczanie i agregacja AICD. A) Barwienie Coomassie blue próbek pobranych na każdym etapie procesu oczyszczania. W przypadku próbek nieindukowanych i indukowanych na żelu naniesiono 20 μl całkowitej masy bakterii. Dla frakcji nadsączu na żelu naniesiono 5 μl lizatu (z całkowitej objętości 20 ml). W przypadku frakcji osadu, osad zawieszono ponownie w 20 ml buforu do lizy, a 5 μl tego materiału poddano sonikacji w kąpieli ultradźwiękowej przez 30 min w 4 °C przed naniesieniem na żel. Dla frakcji przepływowej na żelu naniesiono 5 μl. Wskazano ilości eluatu naniesione na żel. B) Żel barwiony Coomassie blue dla nieciętego i ciętego GST-AICD (2 μl) oraz 1 i 5 μl oczyszczonego AICD. C) Schemat blokowy oczyszczania, agregacji i analizy AICD. D, E) Reprezentatywny obraz AFM termicznie zagregowanego AICD wobec braku (D) i obecności (E) chaperonu molekularnego ubikwiliny-1. F) Histogram rozkładu wielkości agregatów AICD.

<ol><li>De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+secretases%3A+enzymes+with+therapeutic+potential+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neurology%22%5BJournal%5D)">The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).</li>
<li>Chang, K. A., Suh, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+roles+of+amyloid+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+reports%22%5BJournal%5D)">Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein.</a> BMB reports. 43, 656-663 (2010).</li>
<li>McLoughlin, D. M., Miller, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FE65+proteins+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">The FE65 proteins and Alzheimer's disease.</a> J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).</li>
<li>Stieren, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquilin-1+is+a+molecular+chaperone+for+the+amyloid+precursor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein.</a> J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).</li>
<li>Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation-induced+structural+changes+in+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+detected+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR.</a> J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).</li>
<li>Ramelot, T. A., Gentile, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+structure+of+the+amyloid+precursor+protein+cytoplasmic+tail+indicates+preordering+of+structure+for+binding+to+cytosolic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors.</a> Biochem. 39, 2714-2725 (2000).</li>
<li>Radzimanowski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+intracellular+domain+of+the+amyloid+precursor+protein+in+complex+with+Fe65-PTB2%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2.</a> EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).</li>
<li>Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+alters+gene+expression+and+induces+neuron-specific+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis.</a> Gene. 475, 1-9 (2011).</li>
<li>von Rotz, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+APP+intracellular+domain+forms+nuclear+multiprotein+complexes+and+regulates+the+transcription+of+its+own+precursor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor.</a> J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).</li>
<li>Hamid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+modulates+cellular+calcium+homeostasis+and+ATP+content%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content.</a> J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).</li>
<li>Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APP+intracellular+domain+impairs+adult+neurogenesis+in+transgenic+mice+by+inducing+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation.</a> PLoS ONE. 5, e11866(2010).</li>
<li>Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+APP+intracellular+domain+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Molecul.+Biol%22%5BJournal%5D)">Detection of APP intracellular domain in brain tissue.</a> Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).</li>
<li>Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+chaperone+function+using+citrate+synthase+as+nonnative+substrate+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Met.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein.</a> Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).</li>
<li>Hansma, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+atomic+force+microscopy+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Recent advances in atomic force microscopy of DNA.</a> Scanning. 15, 296-299 (1993).</li>
<li>Valbuena, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quasi-simultaneous+imaging%2Fpulling+analysis+of+single+polyprotein+molecules+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy.</a> Rev. Sci. Instrum. 78, 113707(2007).</li>
<li>Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overproduction%2C+purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+human+Fe65-PTB2+in+complex+with+the+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+Sect.+F+Struct.+Biol.+Cryst.+Commun%22%5BJournal%5D)">Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain.</a> Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).</li>
<li>Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intracellular+domain+of+amyloid+precursor+protein+interacts+with+flotillin-1%2C+a+lipid+raft+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).</li>
<li>Kim, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Notch1+signaling+by+the+APP+intracellular+domain+facilitates+degradation+of+the+Notch1+intracellular+domain+and+RBP-Jk%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk.</a> J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).</li>
<li>Lazarov, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport%2C+amyloid+precursor+protein%2C+kinesin-1%2C+and+the+processing+apparatus%3A+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited.</a> J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).</li>
<li>Kakuda, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equimolar+production+of+amyloid+beta-protein+and+amyloid+precursor+protein+intracellular+domain+from+beta-carboxyl-terminal+fragment+by+gamma-secretase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase.</a> J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).</li>
<li>Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+under+the+atomic+force+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Pept.+Lett%22%5BJournal%5D)">Amyloid under the atomic force microscope.</a> Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

W niniejszym protokole przedstawiliśmy procedurę otrzymywania AICD o wysokiej czystości do analiz strukturalnych, biofizycznych i biochemicznych. Procedura ta nie wymaga zaawansowanego sprzętu chromatograficznego, dzięki czemu jest dostępna dla większości laboratoriów. Inne grupy oczyszczały AICD5-7,16, w tym GST-AICD17-19, na potrzeby analiz biochemicznych i strukturalnych. Wadami poprzednich protokołów były słaba rozpuszczalność AICD16, nieidealna czystość17 oraz konieczność ...

<table><tbody><tr><td>pGEX-4T-1</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9545-49</td><td></td></tr><tr><td>Trombina</td><td>GE Healthcare</td><td>27-0846-01</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik do oznaczania białek metodą Bradforda</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0002</td><td></td></tr><tr><td>Błękit Coomassie</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0786</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozyd)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z glutationem</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza z p-aminobenzamidyną</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7155</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Kasety do dializy Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66380</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny chromatograficzne</td><td>Evergreen Scientific</td><td>208-3367-050</td><td></td></tr><tr><td>Emulgator</td><td>Avestin, Inc</td><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Wysoce zalecany</td></tr><tr><td>Eppendorf Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>022670107</td><td></td></tr><tr><td>Dyski mikowe</td><td>Ted Pella</td><td>50-12</td><td></td></tr><tr><td>Zanurzenia AFM</td><td>Bruker</td><td>MSNL-10</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie WSxM</td><td>Nanotec</td><td>N/A</td><td>Bezpłatne pobieranie</td></tr></tbody></table>

oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Purification and Aggregation of the Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain

Białko prekursor amyloidu (APP) jest białkiem transbłonowym typu I powiązanym z patogenezą choroby Alzheimera (AD). APP charakteryzuje się dużą domeną zewnątrzkomórkową i krótką domeną cytozolową, zwaną wewnątrzkomórkową domeną APP (AICD). Podczas dojrzewania w szlaku wydzielniczym APP może być cięte przez proteazy zwane α-, β- i γ-sekretazami1. Sekwencyjne cięcie proteolityczne APP przez β- i γ-sekretazy prowadzi do powstania małego peptydu proteolitycznego, zwanego Aβ, który jest amyloidogenny i stanowi główny składnik blaszek starczych. AICD jest również uwalniana z błony po procesowaniu przez sekretazy i poprzez oddziaływania z Fe65 oraz Tip60 może translokować do jądra komórkowego, aby uczestniczyć w regulacji transkrypcji wielu genów docelowych2,3. Oddziaływania białko-białko z udziałem AICD mogą wpływać na transport, procesowanie i funkcje komórkowe holo-APP oraz jego fragmentów C-końcowych. Wykazaliśmy niedawno, że AICD może agregować in vitro, a proces ten jest hamowany przez zaangażowaną w AD molekularną chaperoninę ubiquilin-14. Zgodnie z tymi odkryciami, AICD posiada odsłonięte domeny hydrofobowe i jest białkiem wewnętrznie nieuporządkowanym in vitro5,6, jednak uzyskuje stabilną strukturę drugorzędową po związaniu z Fe657. Zasugerowaliśmy, że ubiquilin-1 zapobiega niewłaściwym oddziaływaniom między- i wewnątrzmolekularnym AICD, zapobiegając agregacji in vitro oraz w nienaruszonych komórkach4. Podczas gdy większość badań koncentruje się na roli APP w patogenezie AD, rola AICD w tym procesie nie jest jasna. Wykazano, że ekspresja AICD indukuje apoptozę8, moduluje szlaki sygnalizacyjne9 i reguluje sygnalizację wapniową10. Nadekspresja AICD i Fe65 w transgenicznym modelu mysim indukuje patologię przypominającą chorobę Alzheimera11, a niedawno AICD została wykryta w lizatach mózgu metodą western blotting przy zastosowaniu odpowiednich technik odzyskiwania antygenu12. Aby ułatwić badania strukturalne, biochemiczne i biofizyczne AICD, opracowaliśmy procedurę rekombinacyjnej produkcji dużych ilości wysokiej czystości białka AICD. Ponadto opisujemy metodę indukcji termicznej agregacji AICD in vitro oraz analizę przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Opisane metody są przydatne do charakterystyki biochemicznej, biofizycznej i strukturalnej AICD oraz badania wpływu molekularnych chaperonin na agregację AICD.

Opisano metodę wielkoskalowego oczyszczania wewnątrzkomórkowej domeny białka APP (AICD). Opisano również metodologię indukcji agregacji AICD in vitro oraz jej wizualizację za pomocą mikroskopii sił atomowych. Przedstawione metody są przydatne do biochemicznej i strukturalnej charakterystyki AICD oraz badania wpływu chaperonów molekularnych na jej agregację.

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Białko prekursor amyloidowy (APP) jest białkiem transbłonowym typu I powiązanym z patogenezą choroby Alzheimera (AD). APP charakteryzuje się...

Celem niniejszej procedury jest oczyszczenie wewnątrzkomórkowej domeny białka prekursorowego amyloidu, znanej również jako A ICD, oraz przedstawienie protokołu agregacji termicznej i charakterystyki A ICD przy użyciu mikroskopii sił atomowych. Jest to realizowane poprzez najpierw ekspresję białka fuzyjnego A GST z A ICD w bakteriach. Następnie białko G-S-T-A-I-C-D jest oczyszczane i cięte trombiną w celu oddzielenia GST od A ICD, po czym GST jest usuwane.Następnie indukuje się agregację termiczną A ICD. Na koniec agregaty A ICD są obrazowane za pomocą mikroskopii sił atomowych. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące, że A ICD można oczyścić do poziomu homogeniczności w ilości wystarczającej do analiz biochemicznych i biofizycznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, które wymagają złożonych etapów chromatografii, jest to, że wysokiej czystości i rozpuszczalna ICD można wyizolować w warunkach laboratoryjnych przy użyciu standardowych odczynników i sprzętu. ICD otrzymana zgodnie z tym protokołem nadaje się do dalszej charakterystyki biochemicznej i biofizycznej.Procedurę zademonstruje Amina ti. Były stażysta podoktorski w moim laboratorium, dr Andres Oberer, zaprezentuje sposób wykonywania obrazowania za pomocą mikroskopii sił atomowych A ICD. Aby wyrazić rekombinowany wewnątrzkomórkowy domena A PP lub A ICD, należy rozpocząć od komórek BL 21 przekształconych wektorem pgx 41, zawierającym ludzkie A ICD połączone z końcem C GST; pojedynczą kolonią należy zaszczepić 10 mililitrów bulionu LB z ampicyliną i inkubować przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy intensywnym wytrząsaniu następnego ranka.Inkubować 400 ml pożywki LB z ampicyliną w kolbie o pojemności jednego litra z dodatkiem 5 ml hodowli nocnej. Inkubować w temperaturze 37 °C przy intensywnym wytrząsaniu, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnie wartość od 0.4 do 0.6. Zazwyczaj zajmuje to od 2 do 2.5 godziny; następnie indukowć ekspresję G-S-T-A-I-C-D.Dodajemy 0,4 mM IPTG i inkubujemy w temperaturze 37 °C przy intensywnym wstrząsaniu przez pięć godzin. Komórki wirować przy 6 000 ×g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a osad przechowywać w temperaturze -80 °C. Po przygotowaniu buforu do lizy i schłodzeniu bakterii na lodzie, dodać do osadu 20 mL buforu i dokładnie wymieszać, łącząc wortexowanie z pipetowaniem na lodzie.Resuspend pellet bakteryjny, a następnie przepuść resuspenderowany lizat bakteryjny przez schłodzony emulsyfikator lub prasę francuską. Przy ciśnieniu 30 000 PSI przepuść lizat przez emulsyfikator po raz drugi i zbierz go do schłodzonej probówki o pojemności 50 ml. Odwiruj lizat z prędkością 15 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.Oddzielić i przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 50 ml. Dodać 500 µl 50% zawiesiny agarosek z glutationem. Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C podczas rotacji próbki.Po inkubacji należy przygotować świeży bufor elucyjny. Przenieść lizat i zawiesinę do jednorazowej, pięciocalowej polistyrenowej kolumny chromatograficznej z grubymi filtrami. Przemyć kolumnę pięciokrotnie, używając 3 mL PBS.Zakryj dół kolumny i dodaj 500 µL buforu elucyjnego o temperaturze pokojowej. Zakryj górę kolumny i obracaj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zbierz wczesny eluat do schłodzonej probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml.Powtórz elucję jeszcze dwa razy. Eluat dializuj przez noc w temperaturze 4 °C w czterech litrach PBS, używając membrany dializacyjnej o progu odcięcia 10 000 Da. Następnego dnia przeprowadź dializę przeciwko kolejnym czterem litrom PBS w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę.Usunąć białko z kasety do dializy i przeprowadzić analizę ilościową białka, aby określić wydajność G-S-T-A-I-C-D. Typowa puryfikacja z 400 milliliters kultury pozwoli na uzyskanie ponad 20 milligrams oczyszczonego białka przy stężeniach od 10 do 20 milligrams per milliliter. Rozdzielić białko na aliquoty po 200 microliter i zamrozić w temperaturze minus 80 degrees Celsius.Aby uwolnić A ICD z fuzji GST, należy wziąć 200 µL oczyszczonego G-S-T-A-I-C-D i dodać 20 µL trombiny o stężeniu 1 U/µL, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia usunąć zagregowany materiał poprzez wirowanie z prędkością 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść nadsącz do schłodzonej wcześniej mikroprobówki w celu usunięcia GST i trombiny. Dodać odpowiednio 50 µL 50% zawiesiny glutationu i 50 µL 50% zawiesiny p and wino zaine.Inkubować z rotacją przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Krótko odwirować, aby osadzić kuleczki agro, a nadsącz przenieść do nowej probówki. Przeprowadzić ekstrakcję GST jeszcze cztery razy przy użyciu glutationu.Należy przeprowadzić oznaczanie ilości białka w 5 µL oczyszczonego A ICD. Typowe wydajności z 400 mL hodowli wynoszą od 50 do 100 µg przy stężeniu od 0,2 do 0,5 mg/mL. Po rozcieńczeniu świeżo przygotowanego A ICD w PBS do stężenia 0,1 mg/mL, indukowano agregację termiczną poprzez inkubację próbek w temperaturze 43 °C przy 800 RPM w inkubatorze z wytrząsaniem przez 48 godzin.Rozcieńcz próbkę 20-krotnie w wodzie dejonizowanej i nanieś dwie µL na świeżo rozłupaną mikę. Próbkę susz w eksyكاته przez noc, aby zwizualizować agregaty Aβ. Do obrazowania użyj mikroskopii sił atomowych (AFM) w trybie stukowym (tapping mode) z kanti限りami z azotku cyrkonu pokrytymi złotem o nominalnym promieniu wierzchołka wynoszącym 2 nm.Typowe amplitudy stuknięć podczas obrazowania wynoszą od 10 do 20 nanometrów przy częstotliwości rezonansowej wsporników. Przedstawiono tutaj ekspresję i względne wzbogacenie G-S-T-A-I-C-D. Po lizie większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej, w związku z czym ekstrakcja z ciałek inkluzyjnych nie jest wymagana.Materiał eluowany z kolumny z glutationem charakteryzował się czystością przekraczającą 95%. W preparacie przedstawionym w tej procedurze stężenie białka eluowanego z kolumny wynosiło 14,5 mg/ml, a wydajność wyniosła 22 mg. Inkubacja 200 µL tego preparatu przez noc z 20 jednostkami trombiny doprowadziła do niemal 100% rozszczepienia białka fuzyjnego.Ilość użytej trombiny jest na tyle niska, że nie jest wykrywalna metodą barwienia Kumasi. Barwienie niebieskie oraz usuwanie trombiny i GST spowodowały pewną utratę materiału. Niemniej jednak czystość przekroczyła 90%, a wydajność w tej preparatyce wyniosła 70 µg A ICD przy stężeniu 0,35 mg/ml.Agregaty ICD obrazowane za pomocą AFM są zazwyczaj amorficznymi strukturami steroidowymi o rozmiarach od 50 do 100 nanometrów. Materiał zagregowany nie jest wykrywalny, gdy do reakcji agregacji dodano ekimolarną ilość chaperony UBI Quillin one. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak oczyszczać EICD, indukować jego agregację oraz obrazować agregaty metodą AFM EICD.Próbki oczyszczone tą techniką mogą zostać wykorzystane w innych metodach, takich jak rozpraszanie światła i testy pułapki filtracyjnej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące wpływu chaperonów molekularnych na agregację EACD.

purification-aggregation-amyloid-precursor-protein-intracellular

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursora amyloidu

SDD-AGE jest użyteczną techniką wykrywania i charakteryzacji polimerów amyloidopodobnych w komórkach. Przedstawiamy tutaj adaptację, która sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań na szeroką skalę.

Przesiewowe badanie agregacji amyloidu metodą półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym z detergentem

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Podczas gdy transport białek na powierzchni komórki jest stosunkowo łatwy do zbadania, wizualizacja transportu białek wewnątrzkomórkowych jest znacznie trudniejsza. Tutaj używamy konstruktów zawierających fotoaktywowany GFP i demonstrujemy metodę dokładnego śledzenia białka prekursorowego amyloidu z aparatu Golgiego do dalszych przedziałów i śledzenia jego klirensu.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowego transportu APP za pomocą fotoaktywowalnego GFP

Opisana jest dwuetapowa metoda chromatograficzna oczyszczania rekombinowanego białka Shadoo wyrażonego jako ciała inkluzyjne w Escherichia coli, a także protokół migotania oczyszczonego Shadoo do struktur amyloidowych.

Oczyszczanie i ponowne fałdowanie do włókienek amyloidowych rekombinowanego białka Shadoo znakowanego znakowanym 6 ekspresji jako ciała inkluzyjne w E. coli

Niniejszym opisujemy dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który daje peptydy amyloidu beta 42 (Aβ42) o wysokiej czystości i amyloidu beta 40 (Aβ40), zdolne do tworzenia oligomerów. Amyloid beta jest wysoce podatnym na agregację, hydrofobowym peptydem związanym z chorobą Alzheimera. Amyloidogenny charakter peptydu sprawia, że jego oczyszczanie jest wyzwaniem.

Dostosowany protokół oczyszczania HPLC, który pozwala uzyskać peptydy amyloidu beta 42 i beta-amyloidu beta 40 o wysokiej czystości, zdolne do tworzenia oligomerów

Tutaj używamy dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym, aby potwierdzić obecność włókien podobnych do amyloidu o niejednorodnej wielkości i wykluczyć możliwość, że niejednorodność wielkości jest spowodowana dysocjacją włókien amyloidowych podczas procesu działania żelu.

Zastosowanie dwuwymiarowej półdenaturującej elektroforezy w żelu agarozowym detergentu w celu potwierdzenia niejednorodności wielkości włókien amyloidowych lub amyloidopodobnych

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Dostępny jest tutaj protokół do badania interakcji między natywnymi formami, prefibrylarnymi i dojrzałymi fibrylami amyloidowymi różnych peptydów i białek z mitochondriami izolowanymi z różnych tkanek i różnych obszarów mózgu.

Interakcje i przenikanie błony mitochondriów mózgowych przez fibryle amyloidowe

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Poznaj metodę oczyszczania domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu (AICD) oraz jej agregację termiczną z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowej. Technika ta umożliwia badanie agregacji białek w kontekście choroby Alzheimera.

Oczyszczanie i agregacja domeny wewnątrzkomórkowej białka prekursorowego amyloidu

Przeglądaj więcej filmów