Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej. Jest to osiągane poprzez wstępną homogenizację tkanki za pomocą homogenizatora homogenizatora z głowicą i tłuczka szklanego, a następnie przeprowadzenie kilku etapów filtracji. Drugim krokiem jest wyizolowanie frakcji jądrowej z pozostałych frakcji komórkowych poprzez wirowanie z sedymentacją gęstościową.

Następnie jądra kardiomiocytów są znakowane immunologicznie przeciwciałem przeciwko PCM1. Ostatnim krokiem jest izolacja znakowanych jąder kardiomiocytów za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Ostatecznie, bezpośrednio przed dalszymi manipulacjami, czystość jąder kardiomiocytów jest potwierdzana poprzez ponowną analizę posortowanych frakcji jądrowych.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość równie skutecznej analizy jąder kardiomiocytów z tkanki świeżej, jak i zmrożonej z archiwum, w sposób wysokoprzepustowy. Badania oparte na DNA w kardiomiocytach są szczególnie wymagające z kilku powodów. Po pierwsze, kardiomiocyty stanowią jedynie około 20–30% komórek w sercu.

Ponadto w znacznym stopniu posiadają one jądra komórkowe. Co więcej, kardiomiocyty w znacznym stopniu są poliploidalne. Opisana tutaj metoda pozwala pokonać wszystkie te przeszkody.

Przed rozpoczęciem procedury pokryj probówki do ultrawirówki 10 mililitrami roztworu powlekającego składającego się z 1% BSA i PBS. Po rotowaniu probówek przez 30 minut usuń roztwór powlekający i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.

Procedurę izolacji jąder komórkowych z serca należy rozpocząć od wycięcia skalpelem lewej komory z gwałtownie zamrożonego serca myszy. Wypreparowany preparat należy podzielić na małe fragmenty, a następnie przenieść kawałki tkanki do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 15 ml buforu lizującego. Następnie tkankę serca należy zhomogenizować za pomocą homogenizatora z głowicą przy 24 000 RPM przez 10 sekund, a następnie rozcieńczyć homogenizat równą objętością buforu lizującego do uzyskania 30 ml. Homogenizat należy przenieść do homogenizatora szklanego i wykonać osiem pociągnięć tłuczkiem o dużym prześwicie, aby uwolnić jądra.

Następnie przefiltruj surowe jądra komórkowe. Izoluj je najpierw przez sitko do komórek o oczkach 100 µm, a następnie przez sitko do komórek o oczkach 70 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Teraz odwiruj izolat surowych jąder przez 10 minut przy 700 ×g i temperaturze 4 °C.

Odwrócić probówkę, aby ostrożnie usunąć nadsącz, a następnie wytrzeć wnętrze probówki ręcznikiem papierowym, uważając, by nie naruszyć pelletu jąder komórkowych. Kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby resuspender surowe jądra komórkowe.

Wyizolować w pięciu mililitrach buforu sacharozowego, a następnie dodać kolejne 25 mililitrów buforu sacharozowego do zawiesiny jąder. Następnie dodać 10 mililitrów świeżo przygotowanego buforu sacharozowego do jednej z wcześniej przygotowanych powlekanych probówek do ultrawirówki. Po czym ostrożnie nanieść na bufor roztwór resuspendowanego osadu jąder.

Po zrównoważeniu probówki w wolnoobrotowym rotorze typu swing-out, umieść rotor w wirówce do wysokich prędkości i wirowuj próbkę jąder przez 60 minut przy 13 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki z rotora i ponownie je odwróć. Aby usunąć nadsącz, przetrzyj pozostałe zanieczyszczenia z wnętrza probówki ręcznikiem papierowym, tak jak poprzednio, a następnie resuspenduj pellet jąder w jednym mililitrze buforu do przechowywania jąder.

Przed rozpoczęciem procedury barwienia immunocytochemicznego przenieś 20 µL porcji próbki jąder komórkowych do probówki typu Eppendorf. Do porcji dodaj 980 µL buforu do przechowywania jąder i opisz probówkę jako kontrola negatywna. Następnie dodaj przeciwciało anty-PCM1 do próbki jąder oraz do probówki z kontrolą negatywną w rozcieńczeniu 1:500.

Następnie inkubuj obie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder i odlaniu nadsączu, resuspenduj osady jąder w kolejnym mililitrze buforu do przechowywania jąder.

Następnie dodaj fluorescencyjne przeciwciało wtórne anty-królicze do próbek komórek w rozcieńczeniu 1:100 i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder, zawieś osady w 1 mL buforu do przechowywania jąder w celu sortowania i analizy cytometrycznej; po pokryciu probówek do zbierania jąder BSA i PBS, analogicznie jak na początku filmu, zacznij od przefiltrowania próbki oraz kontroli negatywnej przez oddzielne sitka komórkowe 30 µm. Bezpośrednio przed załadowaniem dodaj barwnik DNA.

Wykonaj rozcieńczenie w stosunku 1:500 w celu identyfikacji populacji jąder. Załaduj kontrolę negatywną do cytometru przepływowego. Wykorzystaj parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter), aby ustawić pierwszą bramkę definiującą jądra komórek serca, analogicznie do przedstawionego tutaj wykresu kropkowego (DOT plot).

Następnie należy wykorzystać parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz szerokości impulsu rozproszenia w przód (forward scatter pulse width), aby stworzyć drugą bramkę wokół pojedynczych jąder komórkowych, podobnie jak na przedstawionym tutaj wykresie DOT. Teraz należy wczytać próbkę znakowaną immunochemicznie i ustawić trzecią bramkę w celu odróżnienia jąder kardiomiocytów pozytywnych pod kątem PCM1 od jąder komórek niebędących kardiomiocytami, które są negatywne pod kątem PCM1. Wykorzystaj barwienie DNA jądrowego do analizy zawartości DNA oraz do przeprowadzenia analizy cyklu komórkowego, analogicznie do analizy zilustrowanej na tym histogramie.

Po posortowaniu jąder na podstawie pozytywności dla białka PCM1, umieść posortowane jądra na lodzie i ponownie przeanalizuj alikwot każdej posortowanej próbki, aby określić czystość sortowania. Na koniec odwirowuj posortowane jądra w probówkach kolekcjonujących przez 15 minut przy 1500 ×g i temperaturze 4 °C. Po odrzuceniu naddeników resuspenduj osady z jąder w buforze kompatybilnym z planowaną aplikacją analityczną.

Na tej pierwszej rycinie serce dorosłej myszy zostało zabarwione barwnikiem jądrowym oraz przeciwciałami przeciwko PCM1, czynnikowi transkrypcyjnemu serca NKX2.5 oraz ciężkiemu łańcuchowi miozyny, czyli MHC. Przedstawiono tutaj powiększenie nałożenia obrazów z poprzedniej ryciny. Zwróć uwagę, jak jądra znakowane PCM1 na biało wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego NKX2.5 na czerwono i są otoczone przez cytoplazmę kardiomiocytów na zielono.

Dane te wspólnie demonstrują dokładność, z jaką barwienie na PCM one identyfikuje jądra kardiomiocytów. Wstawka podkreśla epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w jądrach miocytów, na co wskazują również strzałki w eksperymencie przedstawionym na trzech następnych rysunkach; izolowane jądra sercowe zostały zabarwione barwnikiem DNA DRAC five oraz przeciwciałami przeciwko PCM one. Tutaj, na nałożeniu dwóch poprzednich rysunków, strzałki ponownie wskazują epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w izolowanych jądrach kardiomiocytów.

Ten wykres punktowy wykazuje, że około 30% jąder wyizolowanych tą metodą to jądra kardiomiocytów, co potwierdza ich znakowanie PCM one. Wreszcie, jak ilustrują te histogramy, jądra kardiomiocytów myszy są głównie diploidalne, na co wskazuje piki dwa N, a jedynie niewielka podgrupa jest tetraploidalna, co wskazuje mniejszy piki cztery N. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość jej łatwego dostosowania do innych gatunków.

Podobnie jak u ludzi.