Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pobranej po śmierci. Jest to realizowane poprzez wstępną homogenizację tkanki za pomocą homogenizatora zgłębnikowego i szklanego tłoka, a następnie przeprowadzenie kilku etapów filtracji. Drugim krokiem jest oddzielenie frakcji jądrowej od pozostałych frakcji komórkowych za pomocą wirowania z sedymentacją gęstościową.

Następnie jądra kardiomiocytów poddaje się immunoznakowaniu przeciwciałem skierowanym przeciwko PCM1. Ostatnim krokiem jest wyizolowanie znakowanych jąder kardiomiocytów za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją. Ostatecznie, bezpośrednio przed dalszymi manipulacjami, czystość jąder kardiomiocytów potwierdza się poprzez ponowną analizę posortowanych frakcji jądrowych.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość równie skutecznej analizy jąder kardiomiocytów z tkanki świeżej, jak i mrożonej z archiwum, w sposób wysokoprzepustowy. Badania oparte na DNA w kardiomiocytach są szczególnie wymagające z kilku powodów. Po pierwsze, kardiomiocyty stanowią jedynie około 20 30% komórek w sercu.

Ponadto w znacznym stopniu są one jądrowe. Co więcej, kardiomiocyty w znacznym stopniu są poliploidalne. Opisana tutaj metoda pozwala pokonać wszystkie te przeszkody.

Przed rozpoczęciem procedury należy pokryć probówki do ultracentryfugi 10 mililitrami roztworu do blokowania składającego się z 1% BSA oraz PBS. Po rotowaniu probówek przez 30 minut należy usunąć roztwór i pozostawić je do wyschnięcia na powietrzu.

Procedurę izolacji jąder komórkowych z serca należy rozpocząć od wycięcia lewej komory ze świeżo zamrożonego serca myszy za pomocą skalpela. Wycięty materiał należy podzielić na małe fragmenty, a następnie przenieść kawałki tkanki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 15 ml buforu lizującego. Następnie tkankę serca należy homogenizować za pomocą homogenizatora z głowicą przy 24 000 RPM przez 10 sekund, a następnie rozcieńczyć homogenizat równą objętością buforu lizującego do 30 ml. Homogenizat należy przenieść do szklanego homogenizatora i wykonać osiem pociągnięć tłuczkiem o dużym prześwicie, aby uwolnić jądra.

Następnie należy przefiltrować surowe jądra komórkowe. Odizoluj je najpierw za pomocą sitka komórkowego o oczkach 100 µm, a następnie przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 mL. Teraz odwiruj izolat surowych jąder przez 10 minut przy 700 ×g i temperaturze 4 °C.

Odwróć probówkę, aby ostrożnie usunąć nadsącz, a następnie przetrzyj wnętrze probówki ręcznikiem papierowym. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu jąder. Pipetuj roztwór kilkukrotnie w górę i w dół, aby resuspender surowe jądra.

Wyizolować w 5 ml buforu sacharozowego, a następnie dodać kolejne 25 ml buforu sacharozowego do zawiesiny jąder. Następnie do jednej z wcześniej przygotowanych powlekanych probówek do ultrawirówki dodać 10 ml świeżo przygotowanego buforu sacharozowego. Potem ostrożnie nałożyć roztwór resuspensowanego osadu jąder na powierzchnię buforu.

Po zrównoważeniu probówki w rotorze z wolnoobrotowymi kątami, umieść rotor w wirówce wysokoobrotowej i wiruj próbkę jąder przez 60 minut przy 13 000 ×g i temperaturze 4 °C. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki z rotora i ponownie je odwróć. Aby usunąć nadsącz, wytrzyj pozostałe zanieczyszczenia z wnętrza probówki ręcznikiem papierowym jak wcześniej, a następnie resuspenduj osad jąder w 1 mL buforu do przechowywania jąder.

Przed rozpoczęciem procedury barwienia immunocytochemicznego przenieś 20 µL aalikwot próbki jąder do probówki typu Eppendorf. Do alikwotu dodaj 980 µL buforu do przechowywania jąder i opisz probówkę jako kontrolę negatywną. Następnie dodaj przeciwciało anty-PCM1 do próbki jąder oraz do probówki z kontrolą negatywną w rozcieńczeniu 1:500.

Następnie obie probówki należy inkubować w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder i odlaniu nadsączu, osady jąder należy zawiesić w kolejnym mililitrze buforu do przechowywania jąder.

Następnie do próbek komórek należy dodać antykrólicze fluorescencyjne przeciwciało wtórne w rozcieńczeniu 1:100 i inkubować je w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder, osady należy ponownie zawiesić w 1 mL buforu do przechowywania jąder w celu sortowania i analizy cytometrycznej. Po pokryciu probówek do zbierania jąder BSA i PBS, tak jak na początku filmu, należy rozpocząć od przefiltrowania próbki oraz kontroli negatywnej przez oddzielne sita komórkowe o rozmiarze oczek 30 µm. Bezpośrednio przed załadowaniem należy dodać barwnik DNA.

Wykonaj rozcieńczenie 1:500 w celu identyfikacji populacji jąder. Załaduj kontrolę negatywną do cytometru przepływowego. Wykorzystaj parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) i z boku (side scatter), aby ustawić pierwszą bramkę określającą jądra kardiomiocytów, analogicznie do przedstawionego tutaj wykresu kropkowego (DOT plot).

Następnie należy wykorzystać parametry rozproszenia w przód (forward scatter) oraz szerokość impulsu rozproszenia w przód (forward scatter pulse width) do utworzenia drugiej bramki wokół singletów jąder, analogicznie do przedstawionego tutaj wykresu DOT. Teraz należy załadować próbkę znakowaną immunologicznie i ustawić trzecią bramkę w celu odróżnienia jąder kardiomiocytów PCM1-dodatnich od jąder niekardiomiocytów PCM1-ujemnych. Użyj barwnika do DNA jądrowego, aby przeanalizować zawartość DNA i przeprowadzić analizę cyklu komórkowego, podobnie jak w analizie zilustrowanej przez ten histogram.

Po posortowaniu jąder na podstawie pozytywności dla PCM1, umieść posortowane jądra w lodzie i ponownie przeanalizuj alikwot każdej posortowanej próbki, aby określić czystość sortowania. Na koniec odwiruj posortowane jądra w probówkach zbiorczych przez 15 minut przy 1500 ×g i 4 °C. Po odlaniu nadsączów, resuspenduj osady jąder w buforze kompatybilnym z planowaną dalszą aplikacją.

Na pierwszej ilustracji serce dorosłej myszy zostało zabarwione barwnikiem jądrowym oraz przeciwciałami przeciwko PCM1, czynnikowi transkrypcyjnemu serca NKX2.5 oraz ciężkiemu łańcuchowi miozyny (MHC). Przedstawiono tutaj powiększenie nałożonych obrazów z poprzedniej ilustracji. Należy zwrócić uwagę, że jądra oznakowane PCM1 na biało wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego NKX2.5 na czerwono i są otoczone cytoplazmą kardiomiocytów na zielono.

Dane te wspólnie demonstrują dokładność, z jaką barwienie PCM one identyfikuje jądra kardiomiocytów. Wstawka podkreśla epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w jądrach miocytów, co zostało dodatkowo wskazane strzałkami w eksperymencie przedstawionym na trzech kolejnych rysunkach; izolowane jądra serca zostały zabarwione barwnikiem DNA DRAC five oraz przeciwciałami przeciwko PCM one. Tutaj, na nałożeniu dwóch poprzednich rysunków, strzałki ponownie wskazują epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w izolowanych jądrach kardiomiocytów.

Ten wykres kropkowy wykazuje, że około 30% jąder wyizolowanych tą metodą to jądra kardiomiocytów, co potwierdza ich znakowanie PCM one. Wreszcie, jak ilustrują te histogramy, jądra kardiomiocytów myszy są głównie diploidalne, o czym świadczy piki dwa N, a jedynie niewielka część jest tetraploidalna, co wskazuje mniejszy piki cztery N. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość jej łatwego dostosowania do innych gatunków.

Podobnie jak u ludzi.