Name: Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Poznaj metodę izolacji jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej przy użyciu homogenizacji, gradientowej ultrawirówki i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości próbek do dalszych badań molekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Marcelo Toro za pomoc przy analizie cytometrii przepływowej. Badanie to było wspierane przez Szwedzką Fundację Serca i Płuc (Swedish Heart- and Lung Foundation), program Komisji Europejskiej FP7 „CardioCell”, Szwedzką Radę Badawczą (Swedish Research Council), AFA insurances oraz ALF. O.B. otrzymał wsparcie z Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Izolacja jąder komórkowych serca
<ol>
 <li>Pokryj probówki do ultrawirówki (Beckman Centrifuge Tubes #363664) 10 ml roztworu pokrywającego 1%BSA/PBS. Zakręć probówki i pozostaw je do rotacji przez 30 min w rotatorze do probówek. Usuń roztwór pokrywający i pozostaw probówki do wyschnięcia na powietrzu (do analizy pojedynczych serc mysich wymagana jest jedna probówka na jedno serce mysie; alternatywnie w jednej probówce można przetworzyć do 5 serc mysich lub 1 g tkanki serca innego gatunku (np. ludzkiego)).</li>
 <li>Wszystkie kolejne kroki należy przeprowadzać na lodzie. Wypreparuj lewą komorę ze świeżego lub błyskawicznie zamrożonego serca mysiego za pomocą skalpela. Uwaga: niniejszy protokół jest zoptymalizowany dla serca mysiego, ale może zostać dostosowany również do serca szczura lub człowieka. Alternatywnie użyj do 1 g tkanki serca innego gatunku.</li>
 <li>Pokrój preparat skalpelem na małe kostki.</li>
 <li>Przenieś fragmenty tkanki do probówki Falcon 50 ml wypełnionej 15 ml buforu lizującego.</li>
 <li>Zhomogenizuj tkankę serca za pomocą homogenizatora z głowicą T-25 Ultra-Turrax (IKA) przy 24 000 rpm przez 10 sek.</li>
 <li>Rozcieńcz homogenat równą objętością buforu lizującego do 30 ml.</li>
 <li>Użyj szklanego douncera (40 ml), aby dalej zhomogenizować tkankę i uwolnić jądra komórkowe. Wykonaj osiem pociągnięć tłokiem o dużym prześwicie.</li>
 <li>Przepuść surowy izolat jąder przez nylonowe sitka komórkowe (BD Biosciences) o oczkach 100 μm i 70 μm, kolejno.</li>
 <li>Odwiruj surowy izolat jąder w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min.</li>
 <li>Ostrożnie usuń naddatek, odwracając probówki, i wytrzyj wnętrze probówki ręcznikiem papierowym. Zachowaj ostrożność, aby nie naruszyć osadu jąder.</li>
 <li>Rozpuść surowy izolat jąder w 5 ml buforu sacharozowego, pipetując roztwór kilkakrotnie w górę i w dół. Dodaj kolejne 25 ml buforu sacharozowego do rozpuszczonego osadu.</li>
 <li>Dodaj 10 ml świeżo przygotowanego buforu sacharozowego do pokrytej probówki do ultrawirówki (patrz krok 1.1).</li>
 <li>Ostrożnie nałóż resuspenderowany osad jąder rozpuszczony w buforze sacharozowym z kroku 1.9 na dodane 10 ml buforu sacharozowego.</li>
 <li>Zrównoważ probówki do wirowania przed umieszczeniem ich w rotorze wolnoobrotowym JS13.1, a następnie umieść rotor w wirówce wysokoprędkościowej (Beckman Avanti S-25).</li>
 <li>Wiruj próbkę jąder przy 13 000 x g w temperaturze 4 °C przez 60 min.</li>
 <li>Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki z rotora i usuń naddatek, odwracając probówki i wycierając pozostałe zanieczyszczenia z wnętrza probówek ręcznikiem papierowym.</li>
 <li>Rozpuść osad jąder w 1 ml buforu do przechowywania jąder (bufor NSB plus). Uwaga: NSB plus zawiera 1,5 mM sperminy jako stabilizatora DNA.</li>
 <li>Przejdź do kroku 2.1: immunobarwienia jąder kardiomiocytów.</li>
</ol>
2. Immunobarwienie do cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Przygotować kontrolę negatywną do immunobarwienia. Odpipować 20 μl próbki jąder komórkowych i dodać 980 μl buforu NSB plus.</li>
 <li>Do próbki jąder komórkowych dodać przeciwciało anty-materiał pericentriolarny 1 (rabbit anti-PCM-1, Atlas Antibodies) w rozcieńczeniu 1:500 w celu immunoznakowania jąder kardiomiocytów. Do kontroli negatywnej, przygotowanej w kroku 2.1, dodać przeciwciało izotypowe w tym samym rozcieńczeniu co przeciwciało anty-PCM-1.</li>
 <li>Inkubować kontrolę negatywną oraz próbkę w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
 <li>Przepłukać kontrolę negatywną i próbkę co najmniej raz buforem NSB plus (wirować probówki w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i zawiesić osad jąder w 1 ml buforu NSB plus).</li>
 <li>Do kontroli negatywnej oraz próbki dodać fluorescencyjne przeciwciało wtórne anty-królicze (FITC lub APC) w rozcieńczeniu 1:1000.</li>
 <li>Inkubować kontrolę negatywną oraz próbkę w temperaturze 4 °C przez 1 h.</li>
 <li>Przepłukać kontrolę negatywną i próbkę co najmniej raz buforem NSB plus (wirować probówki w wirówce chłodzącej (4 °C) przy 700 x g przez 10 min. Odlać nadsącz i zawiesić osad jąder w 1 ml buforu NSB plus).</li>
 <li>Przejść do analizy i sortowania metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
3. Cytometria przepływowa
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem sortowania metodą cytometrii przepływowej pokryć probówki do zbierania jąder (Falcon 15 ml) 1% roztworem BSA/PBS, zgodnie z opisem w kroku 1.1.</li>
 <li>Przefiltrować próbkę oraz kontrolę negatywną przez sito komórkowe o oczkach 30 μm, a następnie w pierwszej kolejności załadować kontrolę negatywną do cytometru przepływowego (BD Influx). Wyznaczyć pierwszą i drugą bramkę w celu odseparowania jąder i singletów (pojedynczych jąder), w oparciu o rozproszenie przednie (FSC), szerokość impulsu rozproszenia przedniego (FS pulse width) oraz rozproszenie boczne (SSC) (Ryc. 2a i b). Dodanie barwnika DNA (DRAQ5 (1:500)) do próbki może pomóc w wstępnej identyfikacji populacji jąder.</li>
 <li>Załadować próbkę immunoznakowaną i wyznaczyć trzecią bramkę, aby odizolować jądra kardiomiocytów (PCM-1-dodatnie) od jąder niekardiomiocytów (PCM-1-ujemnych). Rozpocząć sortowanie (Ryc. 2c i d).</li>
</ol>
Opcjonalnie: W celu analizy zawartości DNA jądrowego (ploidalności) oraz przeprowadzenia analizy cyklu komórkowego należy dodać do jąder odpowiedni barwnik DNA (np. Hoechst 33342 lub DRAQ5) (Rys. 2e).
<ol start="4">
 <li>Po sortowaniu metodą cytometrii przepływowej umieść jądra na lodzie i przeprowadź ponowną analizę w celu określenia czystości sortowania (Ryc. 3a i b).</li>
 <li>Odwiruj posortowane jądra w probówkach kolekcjonerskich z prędkością 1500 x g w wirówce chłodzącej przez 15 min.</li>
 <li>Rozpuść osad z jąder w buforze odpowiednim dla zastosowania w dalszych etapach analizy.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Morfologię i integralność jąder można ocenić za pomocą barwników DNA i zwizualizować pod mikroskopem (Rys. 1). Poprawność znakowania PCM-1 można ocenić za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej (Rys. 1 oraz Rys. 2c i d). Populacje PCM-1-dodatnie i PCM-1-ujemne powinny być wyraźnie od siebie oddzielone (Rys. 2c i d). W lewej komorze serca myszy około 30% wszystkich jąder powinno stanowić jądra kardiomiocytów (Rys. 2d). Czystość sortowania można ocenić poprzez ponowną analizę posortowanych jąder (Rys. 3a i b). Obie populacje jąder powinny charakteryzować się czystością sortowania przekraczającą 95%.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, analiza ekspresji białek; jądra komórkowe, markery PCM-1, Nkx2.5, badanie komórkowe." src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. PCM-1 identyfikuje jądra kardiomiocytów. Jądra kardiomiocytów (a) barwiono przeciwciałami przeciwko PCM-1 (b) oraz Nkx2.5 (c) w sercu dorosłej myszy. (d) Jądra znakowane PCM-1 są otoczone cytoplazmą kardiomiocytów (ciężkie łańcuchy miozyny (MHC)) i wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego Nkx2.5, co potwierdza dokładną identyfikację jąder kardiomiocytów za pomocą barwienia PCM-1 (paski skali 20 μm i 10 μm (d, wstawka)). (e) Izolowane jądra komórek serca wizualizowane przy użyciu barwnika DNA DRAQ5. (f i g) Jądra kardiomiocytów znakowane przeciwciałami przeciwko PCM-1 (pasek skali 10 μm). Zwróć uwagę na epinuklearny wzorzec barwienia PCM-1 w jądrach miocytów w przekroju tkankowym oraz w izolowanych jądrach (strzałki).
<img alt="Analiza cytometryczna; wykresy rozrzutu ilustrujące populacje komórek; histogram zawartości DNA." src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Sortowanie cytometryczne jąder kardiomiocytów. (a) Jądra komórek serca są identyfikowane na podstawie rozproszenia światła w przodzie (FSC) i rozproszenia bocznego (SSC). (b) Drugi bramka identyfikuje pojedyncze jądra na podstawie FSC i szerokości impulsu FS5. (c, d) Bramkowanie fluorescencyjne umożliwia oddzielenie jąder kardiomiocytów (PCM-1-dodatnich) od jąder niebędących kardiomiocytami (PCM-1-ujemnych) z tkanki serca. (e) Kardiomiocyty mysie są w większości (&gt;80%) diploidalne (2n), tylko niewielka podgrupa jest tetraploidalna (4n)6. Należy zauważyć, że kardiomiocyty ludzkie zawierają wyższą częstotliwość jąder poliploidalnych (&gt;2n)7,8.
<img alt="Porównanie wykresów rozproszenia cytometrii przepływowej; PCM-1 vs SSC; schemat analizy populacji komórkowych." src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Analiza czystości wyselekcjonowanych jąder kardiomiocytów i jąder niebędących kardiomiocytami. Ponowna analiza wyselekcjonowanych jąder niebędących kardiomiocytami (a) oraz jąder kardiomiocytów (b). Obie populacje wykazują czystość sortowania przekraczającą 99%.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Dokładna identyfikacja jąder kardiomiocytów jest kluczowa dla analizy procesów regeneracyjnych w mięśniu sercowym2,3. Konwencjonalne techniki izolacji kardiomiocytów z tkanki świeżej opierają się głównie na enzymatycznym trawieniu białek macierzy zewnątrzkomórkowej i późniejszym oczyszczaniu z komórek śródmiąższowych za pomocą wirowania przy niskich prędkościach. Dalsze oczyszczanie żywych kardiomiocytów z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) można przeprowadzić poprzez immunoznakowanie markerami powierzc...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Bufor lizujący&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.32 M sacharozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM octanu magnezu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.0 mM EDTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 mM EGTA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. Bufor sacharozowy&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 M sacharozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 8)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mM octanu magnezu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mM DTT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Bufor do przechowywania jąder (NSB plus)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Nazwa odczynnika&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.44 M sacharozy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mM sperminy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królicze IgG izotypowe - klasy ChIP, #ab37415</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało przeciwko PCM-1, #HPA023374</td><td>Atlas Antibodies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osiołkowe przeciwciało wtórne, przeciwkrólicze Alexa 488 Fluor, #A-21206 lub równoważne fluorescencyjne przeciwciało wtórne</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biostatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sitka do komórek 30 &amp;mu;m, 70 &amp;mu;m i 100 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szklany homogenizator typu douncer (40 ml) i tłuczek &quot;L&quot;</td><td>VWR (Wheaton Industries Inc.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator T-25 Ultra-Turrax</td><td>IKA Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Narzędzie dyspergujące S25 N-18 G</td><td>IKA Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Beckman Avanti</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 15 ml i 50 ml</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówki Beckman #363664</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotor wolnoobrotowy JS13.1</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy Influx</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotator do probówek</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identyfikacja jąder kardiomiocytów w skrawkach tkanek stanowiła dotąd wyzwanie, ponieważ większość strategii opiera się wyłącznie na białkach markerowych cytoplazmy1. Rzadkie zdarzenia w miocytach serca, takie jak proliferacja i apoptoza, wymagają dokładnej identyfikacji jąder miocytów serca w celu analizy odnowy komórkowej w stanie homeostazy oraz w warunkach patologicznych2. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę izolacji jąder kardiomiocytów z tkanek pobranych po śmierci za pomocą sedymentacji gęstościowej i immunoznakowania przeciwciałami przeciwko białku materiału pericentryjolarnego 1 (PCM-1), a następnie sortowania metodą cytometrii przepływowej. Strategia ta umożliwia wysokoprzepustową analizę i izolację, z zaletą polegającą na równiej skuteczności w przypadku tkanek świeżych oraz zamrożonego materiału archiwalnego. Pozwala to na badanie materiałów zgromadzonych już w biobankach. Technika ta jest stosowalna i została przetestowana u szerokiego spektrum gatunków oraz nadaje się do wielu zastosowań w dalszych etapach analiz, takich jak datowanie węglem-143, analiza cyklu komórkowego4, wizualizacja analogów tymidyny (np. BrdU i IdU)4, a także analiza transkryptomiczna i epigenetyczna.

Jądra komórek serca są izolowane metodą sedymentacji gęstościowej i znakowane immunologicznie przeciwciałami przeciwko materiałowi pericentriolarnemu 1 (PCM-1) w celu identyfikacji i sortowania jąder kardiomiocytów za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Identyfikacja jąder kardiomiocytów w przekrojach tkankowych stanowiła wyzwanie, ponieważ większość strategii opiera się wyłącznie na cytoplazmatycznych białkach markerowych1. Rzadkie zdarzenia ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej. Jest to osiągane poprzez wstępną homogenizację tkanki za pomocą homogenizatora homogenizatora z głowicą i tłuczka szklanego, a następnie przeprowadzenie kilku etapów filtracji. Drugim krokiem jest wyizolowanie frakcji jądrowej z pozostałych frakcji komórkowych poprzez wirowanie z sedymentacją gęstościową.Następnie jądra kardiomiocytów są znakowane immunologicznie przeciwciałem przeciwko PCM1. Ostatnim krokiem jest izolacja znakowanych jąder kardiomiocytów za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS). Ostatecznie, bezpośrednio przed dalszymi manipulacjami, czystość jąder kardiomiocytów jest potwierdzana poprzez ponowną analizę posortowanych frakcji jądrowych.Główną zaletą tej techniki jest możliwość równie skutecznej analizy jąder kardiomiocytów z tkanki świeżej, jak i zmrożonej z archiwum, w sposób wysokoprzepustowy. Badania oparte na DNA w kardiomiocytach są szczególnie wymagające z kilku powodów. Po pierwsze, kardiomiocyty stanowią jedynie około 20–30% komórek w sercu.Ponadto w znacznym stopniu posiadają one jądra komórkowe. Co więcej, kardiomiocyty w znacznym stopniu są poliploidalne. Opisana tutaj metoda pozwala pokonać wszystkie te przeszkody.Przed rozpoczęciem procedury pokryj probówki do ultrawirówki 10 mililitrami roztworu powlekającego składającego się z 1% BSA i PBS. Po rotowaniu probówek przez 30 minut usuń roztwór powlekający i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu.Procedurę izolacji jąder komórkowych z serca należy rozpocząć od wycięcia skalpelem lewej komory z gwałtownie zamrożonego serca myszy. Wypreparowany preparat należy podzielić na małe fragmenty, a następnie przenieść kawałki tkanki do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 15 ml buforu lizującego. Następnie tkankę serca należy zhomogenizować za pomocą homogenizatora z głowicą przy 24 000 RPM przez 10 sekund, a następnie rozcieńczyć homogenizat równą objętością buforu lizującego do uzyskania 30 ml. Homogenizat należy przenieść do homogenizatora szklanego i wykonać osiem pociągnięć tłuczkiem o dużym prześwicie, aby uwolnić jądra.Następnie przefiltruj surowe jądra komórkowe. Izoluj je najpierw przez sitko do komórek o oczkach 100 µm, a następnie przez sitko do komórek o oczkach 70 µm do nowej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Teraz odwiruj izolat surowych jąder przez 10 minut przy 700 ×g i temperaturze 4 °C.Odwrócić probówkę, aby ostrożnie usunąć nadsącz, a następnie wytrzeć wnętrze probówki ręcznikiem papierowym, uważając, by nie naruszyć pelletu jąder komórkowych. Kilkakrotnie pipetować roztwór w górę i w dół, aby resuspender surowe jądra komórkowe.Wyizolować w pięciu mililitrach buforu sacharozowego, a następnie dodać kolejne 25 mililitrów buforu sacharozowego do zawiesiny jąder. Następnie dodać 10 mililitrów świeżo przygotowanego buforu sacharozowego do jednej z wcześniej przygotowanych powlekanych probówek do ultrawirówki. Po czym ostrożnie nanieść na bufor roztwór resuspendowanego osadu jąder.Po zrównoważeniu probówki w wolnoobrotowym rotorze typu swing-out, umieść rotor w wirówce do wysokich prędkości i wirowuj próbkę jąder przez 60 minut przy 13 000 ×g i temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania ostrożnie wyjmij probówki z rotora i ponownie je odwróć. Aby usunąć nadsącz, przetrzyj pozostałe zanieczyszczenia z wnętrza probówki ręcznikiem papierowym, tak jak poprzednio, a następnie resuspenduj pellet jąder w jednym mililitrze buforu do przechowywania jąder.Przed rozpoczęciem procedury barwienia immunocytochemicznego przenieś 20 µL porcji próbki jąder komórkowych do probówki typu Eppendorf. Do porcji dodaj 980 µL buforu do przechowywania jąder i opisz probówkę jako kontrola negatywna. Następnie dodaj przeciwciało anty-PCM1 do próbki jąder oraz do probówki z kontrolą negatywną w rozcieńczeniu 1:500.Następnie inkubuj obie probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia, po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder i odlaniu nadsączu, resuspenduj osady jąder w kolejnym mililitrze buforu do przechowywania jąder.Następnie dodaj fluorescencyjne przeciwciało wtórne anty-królicze do próbek komórek w rozcieńczeniu 1:100 i inkubuj je w temperaturze 4 °C przez jedną godzinę. Po przemyciu probówek buforem do przechowywania jąder, zawieś osady w 1 mL buforu do przechowywania jąder w celu sortowania i analizy cytometrycznej; po pokryciu probówek do zbierania jąder BSA i PBS, analogicznie jak na początku filmu, zacznij od przefiltrowania próbki oraz kontroli negatywnej przez oddzielne sitka komórkowe 30 µm. Bezpośrednio przed załadowaniem dodaj barwnik DNA.Wykonaj rozcieńczenie w stosunku 1:500 w celu identyfikacji populacji jąder. Załaduj kontrolę negatywną do cytometru przepływowego. Wykorzystaj parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) i pod kątem (side scatter), aby ustawić pierwszą bramkę definiującą jądra komórek serca, analogicznie do przedstawionego tutaj wykresu kropkowego (DOT plot).Następnie należy wykorzystać parametry rozproszenia światła w przód (forward scatter) oraz szerokości impulsu rozproszenia w przód (forward scatter pulse width), aby stworzyć drugą bramkę wokół pojedynczych jąder komórkowych, podobnie jak na przedstawionym tutaj wykresie DOT. Teraz należy wczytać próbkę znakowaną immunochemicznie i ustawić trzecią bramkę w celu odróżnienia jąder kardiomiocytów pozytywnych pod kątem PCM1 od jąder komórek niebędących kardiomiocytami, które są negatywne pod kątem PCM1. Wykorzystaj barwienie DNA jądrowego do analizy zawartości DNA oraz do przeprowadzenia analizy cyklu komórkowego, analogicznie do analizy zilustrowanej na tym histogramie.Po posortowaniu jąder na podstawie pozytywności dla białka PCM1, umieść posortowane jądra na lodzie i ponownie przeanalizuj alikwot każdej posortowanej próbki, aby określić czystość sortowania. Na koniec odwirowuj posortowane jądra w probówkach kolekcjonujących przez 15 minut przy 1500 ×g i temperaturze 4 °C. Po odrzuceniu naddeników resuspenduj osady z jąder w buforze kompatybilnym z planowaną aplikacją analityczną.Na tej pierwszej rycinie serce dorosłej myszy zostało zabarwione barwnikiem jądrowym oraz przeciwciałami przeciwko PCM1, czynnikowi transkrypcyjnemu serca NKX2.5 oraz ciężkiemu łańcuchowi miozyny, czyli MHC. Przedstawiono tutaj powiększenie nałożenia obrazów z poprzedniej ryciny. Zwróć uwagę, jak jądra znakowane PCM1 na biało wykazują ekspresję czynnika transkrypcyjnego NKX2.5 na czerwono i są otoczone przez cytoplazmę kardiomiocytów na zielono.Dane te wspólnie demonstrują dokładność, z jaką barwienie na PCM one identyfikuje jądra kardiomiocytów. Wstawka podkreśla epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w jądrach miocytów, na co wskazują również strzałki w eksperymencie przedstawionym na trzech następnych rysunkach; izolowane jądra sercowe zostały zabarwione barwnikiem DNA DRAC five oraz przeciwciałami przeciwko PCM one. Tutaj, na nałożeniu dwóch poprzednich rysunków, strzałki ponownie wskazują epinuklearny wzorzec barwienia PCM one w izolowanych jądrach kardiomiocytów.Ten wykres punktowy wykazuje, że około 30% jąder wyizolowanych tą metodą to jądra kardiomiocytów, co potwierdza ich znakowanie PCM one. Wreszcie, jak ilustrują te histogramy, jądra kardiomiocytów myszy są głównie diploidalne, na co wskazuje piki dwa N, a jedynie niewielka podgrupa jest tetraploidalna, co wskazuje mniejszy piki cztery N. Jedną z zalet tej techniki jest możliwość jej łatwego dostosowania do innych gatunków.Podobnie jak u ludzi.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Kwantyfikacja obrotu kardiomiocytów jest wyzwaniem. Opisany tutaj protokół w istotny sposób przyczynia się do rozwiązania tego wyzwania, umożliwiając dokładne i czułe określenie ilościowe wytwarzania jąder neokardiomiocytów i ploidalności jąder.

Jednoczesna ocena syntezy i ploidalności DNA kardiomiocytów: metoda wspomagająca ilościowe określanie regeneracji i obrotu kardiomiocytów

Aby odróżnić podział komórek od zmian cyklu komórkowego w kardiomiocytach, prezentujemy protokoły wykorzystujące dwie transgeniczne linie myszy: myszy transgeniczne Myh6-H2B-mCh, do jednoznacznej identyfikacji jąder kardiomiocytów, oraz myszy CAG-eGFP-anilin, do odróżniania podziału komórek od zmian cyklu komórkowego.

Wizualizacja zmian cyklu komórkowego i oznaczanie zarodkowania w kardiomiocytach postnatalnych

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Tutaj opisujemy protokół izolowania wystarczającej ilości pojedynczych niekardiomiocytów o wysokiej żywotności z serca myszy po zawale mięśnia sercowego (MI). Można to wykorzystać do późniejszego sekwencjonowania pojedynczych komórek, analizy cytometrii przepływowej i pierwotnej hodowli komórek.

Przygotowanie zawiesiny komórek innych niż kardiomiocyty do sekwencjonowania jednokomórkowego RNA z serca dorosłej myszy po zawale mięśnia sercowego

Tutaj prezentujemy protokół opisujący przygotowanie jąder komórkowych. Po mikrodysekcji i enzymatycznej dysocjacji tkanki serca na pojedyncze komórki, komórki progenitorowe zamrożono, a następnie wyizolowano czyste żywe komórki, które wykorzystano do sekwencjonowania RNA pojedynczego jądra i testu pojedynczego jądra dla chromatyny dostępnej dla transpozazy z wysokoprzepustowymi analizami sekwencjonowania.

Izolacja jąder z komórek progenitorowych serca myszy w celu profilowania epigenomu i ekspresji genów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Próbki tkanek po endarterektomii wieńcowej zostały przetworzone w celu wyizolowania pojedynczych jąder przy użyciu zoptymalizowanego protokołu dysocjacji. Integralność izolowanych jąder została zweryfikowana za pomocą trzech uzupełniających się podejść: barwienia trypanowym wykluczającym do oceny integralności błony, mikroskopii konfokalnej opartej na DAPI do potwierdzenia morfologii jądrowej oraz cytometrii przepływowej do ilościowej oceny wydajności i czystości jądrowej.

Izolacja pojedynczego jądra od tkanki po endarterektomii wieńcowej pacjentów poddanych przeszczepowi tętnic wieńcowych

Poznaj metodę izolacji jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej przy użyciu homogenizacji, gradientowej ultrawirówki i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia uzyskanie wysokiej czystości próbek do dalszych badań molekularnych.

Izolacja jąder kardiomiocytów z tkanki pośmiertnej

Przeglądaj więcej filmów