Name: Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach znakowanych GFP w podwzgórzowych wycinkach mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi wapniowych w neuronach znakowanych GFP w podwzgórzu myszy przy użyciu czerwonego wskaźnika fluorescencyjnego. Technika umożliwia analizę przestrzenną i czasową sygnałów wapniowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy naszym współpracownikom, którzy uczestniczyli w pracy podsumowanej w niniejszym opracowaniu. Praca ta była wspierana przez granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), DFG Schwerpunktprogramm 1392 „Integrative analysis of olfaction” oraz Fundacji Volkswagena (TLZ). TLZ jest profesorem Lichtenberga w Fundacji Volkswagena.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Kluczowym pytaniem w neuronauce jest zrozumienie, w jaki sposób mózg przetwarza informacje społeczne. Dominującym źródłem informacji niezbędnych do rozpoznawania społecznego są sygnały węchowe lub feromonowe. Detekcja tych sygnałów przez populacje neuronalne w nosie oraz ich rozpoznawanie w mózgu, w szczególności w podwzgórzu, odgrywają kluczową rolę w wielu procesach społecznych i wpływają na hormony oraz inne czynniki neuroendokrynne13-16. Istotną przeszkodą w analizie odpowiedzi neuronalnych w obszarach móz...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Fura-red/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-3021</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfoksyd</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom z wibrującym nożem Hyrax V 50</td><td>Zeiss</td><td>9770170</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie chłodzące CU 65 do mikrotomu Hyrax V 50</td><td>Zeiss</td><td>9920120</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, CB210-UL</td><td>Binder</td><td>0019389</td><td></td></tr><tr><td>Super glue, Loctite 406TM</td><td>Henckel</td><td>142580</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułki podwójne, w kształcie łyżeczki</td><td>Bochem</td><td>3182</td><td></td></tr><tr><td>Mikroszpatułki, w kształcie łyżeczki</td><td>Bochem</td><td>3344</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, Moria-Vannas-Wolff – ostrza 7 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15370-52</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe, Vannas – ostrza 3 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Wagnera</td><td>Fine Science Tools</td><td>14071-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta medyczna, Dumont 7b</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Duża prostokątna otwarta komora kąpieli (RC-27)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0238</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny BioRad Radiance 2100</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą gfp w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Mimo ogromnego wzrostu naszej wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw kodowania informacji w mózgu, wciąż pozostaje centralne pytanie dotyczące precyzyjnych etapów molekularnych, a także aktywności specyficznych neuronów w wielofunkcyjnych jądrach obszarów mózgu, takich jak podwzgórze. Problem ten obejmuje identyfikację komponentów molekularnych zaangażowanych w regulację różnych kaskad transdukcji sygnałów neurohormonalnych. Wzrosty wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ odgrywają istotną rolę w regulowaniu wrażliwości neuronów, zarówno na poziomie transdukcji sygnału, jak i w miejscach synaptycznych.
Powstały nowe narzędzia pomagające w identyfikacji neuronów w niezliczonej liczbie komórek mózgowych poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą konkretnego promotora. Aby monitorować odpowiedzi Ca2+ indukowane bodźcem w neuronach znakowanych GFP, zarówno w wymiarze przestrzennym, jak i czasowym, konieczne jest zastosowanie wskaźnika Ca2+ o fluorescencji innej niż zielona. Ponadto mikroskopia konfokalna jest preferowaną metodą obrazowania pojedynczych neuronów w skrawkach tkanki ze względu na możliwość wizualizacji neuronów w odrębnych płaszczyznach głębokości wewnątrz tkanki oraz ograniczanie fluorescencji poza ogniskową. Ratiometryczny wskaźnik Ca2+ fura-2 był stosowany w połączeniu z neuronami znakowanymi GFP1. Jednak barwnik ten jest wzbudzany światłem ultrafioletowym (UV). Koszt lasera oraz ograniczona głębokość penetracji optycznej światła UV utrudniały jego stosowanie w wielu laboratoriach. Co więcej, fluorescencja GFP może zakłócać sygnały fura-22. Dlatego zdecydowaliśmy się zastosować czerwony fluorescencyjny wskaźnik Ca2+. Duży przesunięcie Stokesa w przypadku fura-red umożliwia wielokolorową analizę czerwonej fluorescencji w połączeniu z GFP przy użyciu pojedynczej długości fali wzbudzenia. Wcześniej uzyskaliśmy dobre wyniki, stosując fura-red w połączeniu z neuronami węchowymi znakowanymi GFP3. Protokoły dla skrawków tkanki węchowej wydawały się działać równie dobrze w neuronach podwzgórza4. Obrazowanie Ca2+ oparte na fura-red zostało również z sukcesem połączone z komórkami β trzustki znakowanymi GFP oraz receptorami znakowanymi GFP eksprymowanymi w komórkach HEK5,6. Specyficzną cechą fura-red jest to, że intensywność jego fluorescencji przy 650 nm maleje po związaniu wapnia przez wskaźnik7. W związku z tym fluorescencja neuronów w stanie spoczynku, z niskim stężeniem Ca2+, ma stosunkowo wysoką intensywność. Należy zauważyć, że istnieją lub są obecnie opracowywane inne czerwone barwniki wskaźnikowe Ca2+, które mogą dawać lepsze lub ulepszone wyniki w różnych neuronach i obszarach mózgu.

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Pomimo ogromnego wzrostu naszej wiedzy na temat mechanizmów leżących u podstaw kodowania informacji w mózgu, centralne pytanie dotyczące...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie odpowiedzi wapniowych indukowanych bodźcem, zarówno przestrzennie, jak i czasowo, w neuronach oznakowanych GFP w skrawkach mózgu, przy użyciu niezielonego fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyizolowanie mózgu myszy transgenicznej wykazującej ekspresję GFP w określonych komórkach. Drugim krokiem jest przygotowanie skrawków tkanki za pomocą mikrotomu.Następnie na skrawki nanosi się pipetą roztwór ładujący z barwnikiem wskaźnikiem wapnia, aby umożliwić jego wchłanianie przez komórki mózgu. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie rejestracji czasowej fluorescencyjnych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej. W końcowej fazie odpowiedzi wapniowe w neuronach znakowanych GFP są prezentowane za pomocą wielokolorowej analizy obrazowania wapnia.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod mikroskopii konfokalnej jest możliwość obrazowania wapnia w neuronach z zieloną fluorescencją GFP przy użyciu przesuniętego w stronę czerwieni fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego dla wapnia. Ogromne przesunięcie Stokesa barwnika czerwonego pozwala na wielokolorową analizę fluorescencji czerwonej w połączeniu z zielonym GFP przy użyciu pojedynczej długości fali wzbudzenia. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy napotkaliśmy problem z monitorowaniem sygnałów wapniowych w neuronach, które mogliśmy zidentyfikować wyłącznie za pomocą genetycznego markera fluorescencyjnego, jakim było zielone białko fluorescencyjne.W tej części zaprezentuję kilka kluczowych etapów tej procedury. Procedurę rozpoczynamy od wlania podgrzanego roztworu agaru do kwadratowej szalki Petriego do wysokości jednego centymetra; po ochłodzeniu i stwardnieniu żel agarowy o stężeniu 4% jest cięty na kostki o objętości jednego centymetra sześciennego i umieszczany w butelce do przechowywania. Po odcięciu głowy myszy należy naciąć skórę głowy jednorazową żyletką wzdłuż linii pośrodka, w kierunku strzałkowym, od kości czołowej do występu zewnętrznego potylicy.Następnie należy dodatkowo rozciąć skórę głowy, najpierw w kierunku rostralno-bocznym, a potem w kierunku brzusznym. Następnie wykonuje się dwa cięcia boczne i jedno cięcie rostralne.W miejscu otworu wielkiego (foramen magnum) ostrożnie oddziel czaszkę za pomocą małych nożyczek sprężynowych. Na tym etapie kości potyliczna, międzypłacowy oraz ciemieniowe powinny zostać oddzielone. Jeśli opona twarda nadal jest obecna, ostrożnie usuń ją za pomocą pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu.Następnie usuń kość łuskową, otwory sitowe przednie oraz otwór czołowy. Teraz mózg można łatwo wyjąć za pomocą odwróconej szpatułki mikro łyżeczkowej, przecinając nerwy czaszkowe. Mózg powinien zostać ułożony stroną brzuszną na powierzchni odpornej na przecięcia, tak aby powierzchnia brzuszna mózgu była skierowana w dół.Użyj jednokrawędziowego ostrza do usuwania móżdżku. Ta prosta powierzchnia cięcia będzie podstawą do zamocowania mózgu na płytce, co umożliwi wycinanie koronalnych przekrojów mózgu. Następnie przyklej mózg powierzchnią cięcia do płytki bazowej mikrotomu, używając niewielkiej ilości szybko utwardzanego, wysokowydajnego kleju cyjanoakrylowego.Następnie przyklej sześcian agaru o objętości jednego centymetra sześciennego do strony brzusznej mózgu, a następnie do płytki podstawowej mikrotomu, aby wesprzeć i unieruchomić mózg podczas krojenia. Po wyschnięciu spoiwa umieść płytkę w kąpieli mikrotomu zawierającej natleniony roztwór pozakomórkowy w temperaturze 6 °C. Następnie przetnij mózg na plastry o grubości 300 µm przy niskiej prędkości krojenia; koronalne plastry mózgu zbieraj do momentu pocięcia całego organu.Następnie przygotuj 20% roztwór onic F1 27 w DMSO, dodając DMSO do proszku onic F1 27. Następnie rozpuść go, poddając roztwór bezpośredniej sonikacji przez dwie minuty. Po tym czasie dodaj pięć mikrolitrów 20% roztworu onic F1 27 do probówki zawierającej 50 mikrogramów przenikalnego przez błony komórkowe furred am.Wymieszać roztwór za pomocą pipety. Następnie dodać do mieszaniny 45 µl roztworu zewnątrzkomórkowego i wymieszać na wirówce typu vortex. Następnie dodać kolejne 325 µL roztworu zewnątrzkomórkowego i poddać probówkę sonikacji przez kolejne trzy minuty.Po sonikacji dodaj 1,156 mililitrów natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego, aby otrzymać końcowy roztwór ładujący wskaźnik wapnia D. Przenieś koronalne skrawki mózgu do sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, umieszczając do sześciu skrawków w jednym dołku. Następnie odessaj natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z komór, uważając, aby nie uszkodzić skrawków mózgu.Następnie pipetuj 750 µL roztworu ładującego wskaźnik wapnia D bezpośrednio do każdego dołka. Przekroje mózgu powinny być całkowicie przykryte roztworem zawierającym rore am. Po tym czasie inkubuj przekroje w inkubatorze do hodowli komórkowych z dostępem do tlenu i dwutlenku węgla przez 45 do 60 minut w temperaturze 37 °C.Po zakończeniu inkubacji należy zastąpić roztwór ładujący wskaźnik wapnia DI świeżym natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu komórek. W celu monitorowania zmian sygnału fluorescencyjnego wywołanych bodźcem, należy przenieść jeden z naładowanych fure red skrawków mózgu do komory rejestracyjnej i ustawić go w pożądanej pozycji. Po zamontowaniu komory w układzie mikroskopu konfokalnego, skrawka należy perfundować przez 10 minut natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby usunąć nadmiar zewnątrzkomórkowego barwnika wskaźnika wapnia.Po opuszczeniu komory rejestracyjnej preparat PERFUSE eight zbiera się do butelki próżniowej. Następnie należy obejrzeć skibkę pod mikroskopem przy małym powiększeniu. Należy odnotować orientację skibki i zlokalizować w niej obszar zainteresowania, którym w naszym przypadku jest obszar podwzgórza w mózgu.Następnie przełącz na duże powiększenie. Znajdź interesującą komórkę w przekroju, wykonując obrazowanie GFP i jednocześnie kontrolując intensywność fluorescencji sygnału URA czerwonego. Dostosuj moc lasera do wartości, która umożliwi pomiary zmian intensywności fluorescencji URA czerwonego i zapobiegnie wybielaniu obu fluoroforów.Następnie należy rozpocząć akwizycję obrazów z częstotliwością od 0,5 do 2 Hz w celu zarejestrowania sygnałów fure i GFP. Na tej figurze przedstawiono obraz konfokalny neuronów GN, RHR Tau GFP w koronalnym przekroju mózgu. Jest to stosunkowo jednorodny sygnał fluorescencyjny obserwowany po załadowaniu przekroju mózgu barwnikiem fure am, a tutaj znajduje się obraz scalony, pokazujący neurony załadowane wskaźnikiem wapnia.Poniżej przedstawiono przykłady odpowiedzi wapniowych indukowanych stymulacją somatyczną w pojedynczych neuronach z markerem GFP w różnych obszarach podwzgórza. Wyraźne sygnały wapniowe pomiędzy neuronami GN RHR wykazującymi ekspresję w różnych jądrach podwzgórza można porównać, stosując pole pod krzywą jako szacunek całkowitej zmiany poziomu wapnia w danej komórce w tym samym przedziale czasowym. Po opanowaniu tej techniki, cały proces można przeprowadzić w czasie krótszym niż 90 minut, wliczając przygotowanie barwnika wskaźnika wapnia, obciążenie oraz inkubację skrawków, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.

imaging-calcium-responses-gfp-tagged-neurons-hypothalamic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach oznaczonych GFP w krohach mózgu mysiego podwzgórza

Narząd jamistnokaczkowy (VNO) wykrywa wewnątrzgatunkowe sygnały chemiczne, które przekazują informacje społeczne i rozrodcze. Przeprowadziliśmy eksperymenty obrazowania Ca2+ z wykorzystaniem myszy transgenicznych wykazujących ekspresję G-CaMP2 w tkance VNO. Podejście to pozwala nam analizować złożone wzorce odpowiedzi neuronów jamistnokaczkowych na liczne bodźce feromonowe.

Obrazowanie odpowiedzi neuronalnych w preparatach skrawków narządu jamistego wyrażających genetycznie kodowany czujnik wapnia

Źródło: Bancroft, E. A., et al. Kwantyfikacja spontanicznych strumieni ca2+{ i ich dalsze efekty w pierwotnych neuronach śródmózgowia myszy. J. Vis. Exp. (2020) {{TAG_ 46}}Ten film pokazuje wizualizację w czasie rzeczywistym napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy. Wykorzystując wektor wirusowy do ekspresji wskaźnika wapnia, neurony są obrazowane pod mikroskopem konfokalnym w celu śledzenia zmian intensywności fluorescencji podczas spontanicznej i...

Wizualizacja napływu wapnia do neuronów brzusznego śródmózgowia pochodzących z zarodków myszy

Opisujemy eksperymentalną procedurę pomiaru aktywności neuronalnej za pomocą podwójnych okien optycznych nad obustronnymi głównymi korami somatosensorycznymi (S1) u transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s przy użyciu mikroskopii 2-fotonowej (2P) in vivo.

Obrazowanie aktywności neuronalnej w pierwotnej korze somatosensorycznej przy użyciu transgenicznych myszy Thy1-GCaMP6s

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Tutaj prezentujemy, jak odsłonić kolankowaty ganglion żywej, znieczulonej myszy laboratoryjnej i jak wykorzystać obrazowanie wapnia do pomiaru reakcji zespołów tych neuronów na bodźce smakowe, co pozwala na wielokrotne próby z różnymi stymulantami. Pozwala to na dogłębne porównania, które neurony reagują na które degustacje.

Obrazowanie wapnia in vivo reakcji neuronów zwojowych układu nerwowego myszy na bodźce smakowe

Przedstawiamy protokół odsłaniania pnia mózgu dorosłej myszy od strony brzusznej. Dzięki zastosowaniu soczewki o indeksie gradientowo-refrakcyjnym z miniaturowym mikroskopem, obrazowanie wapnia można wykorzystać do zbadania aktywności somatów nerwowych dolnych oliwek in vivo.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapnia u myszy z oliwek dolnych

Ten protokół opisuje chirurgiczną ekspozycję zwoju korzenia grzbietowego (DRG), a następnie GCaMP3 (genetycznie kodowany wskaźnik Ca2+; Białko zielonej fluorescencji-białko kalmoduliny-M13 3) Ca2 + obrazowanie zespołów neuronalnych przy użyciu myszy Pirt-GCaMP3 przy jednoczesnym stosowaniu różnych bodźców do ipsilateralnej tylnej łapy.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach korzenia grzbietowego

Ten protokół szczegółowo opisuje procedurę obrazowania reakcji wapnia w górnym wzgórku (SC) obudzonych myszy, w tym obrazowanie aktywności pojedynczego neuronu za pomocą mikroskopii dwufotonowej przy jednoczesnym pozostawieniu nienaruszonej kory mózgowej u myszy typu dzikiego, oraz obrazowanie całego SC za pomocą mikroskopii szerokiego pola u myszy z mutacją częściowej kory  mózgowej.

Obrazowanie wapnia u myszy Superior Colliculus

Obecny protokół opisuje obrazowanie wapnia in vivo do pomiaru odpowiedzi zespołów neuronów DRG lędźwiowych-6 na bodźce somatyczne i trzewne. Można dokonać dokładnych porównań między neuronami reagującymi na różne bodźce. Protokół ten jest cenny w badaniu mechanizmów bólu trzewnego i stymulacji somatycznej, takich jak akupunktura.

In vivo (in vivo) Obrazowanie wapniowe reakcji neuronów zwojów korzenia grzbietowego na bodźce somatyczne i trzewne

Zakręt zębaty hipokampa pełni podstawowe i odrębne funkcje w uczeniu się i pamięci. Protokół ten opisuje zestaw solidnych i skutecznych procedur obrazowania in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym u swobodnie poruszających się myszy.

Obrazowanie in vivo wapnia komórek ziarnistych w zakręcie zębatym hipokampa u myszy

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Poznaj metodę obrazowania odpowiedzi wapniowych w neuronach znakowanych GFP w podwzgórzu myszy przy użyciu czerwonego wskaźnika fluorescencyjnego. Technika umożliwia analizę przestrzenną i czasową sygnałów wapniowych.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Przeglądaj więcej filmów