Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Ogólnym celem niniejszej procedury jest monitorowanie odpowiedzi wapniowych indukowanych bodźcem, zarówno przestrzennie, jak i czasowo, w neuronach oznakowanych GFP w skrawkach mózgu, przy użyciu niezielonego fluorescencyjnego wskaźnika wapnia. Cel ten osiąga się poprzez najpierw wyizolowanie mózgu myszy transgenicznej wykazującej ekspresję GFP w określonych komórkach. Drugim krokiem jest przygotowanie skrawków tkanki za pomocą mikrotomu.

Następnie na skrawki nanosi się pipetą roztwór ładujący z barwnikiem wskaźnikiem wapnia, aby umożliwić jego wchłanianie przez komórki mózgu. Ostatnim krokiem jest przeprowadzenie rejestracji czasowej fluorescencyjnych komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej. W końcowej fazie odpowiedzi wapniowe w neuronach znakowanych GFP są prezentowane za pomocą wielokolorowej analizy obrazowania wapnia.

Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod mikroskopii konfokalnej jest możliwość obrazowania wapnia w neuronach z zieloną fluorescencją GFP przy użyciu przesuniętego w stronę czerwieni fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego dla wapnia. Ogromne przesunięcie Stokesa barwnika czerwonego pozwala na wielokolorową analizę fluorescencji czerwonej w połączeniu z zielonym GFP przy użyciu pojedynczej długości fali wzbudzenia. Pomysł zastosowania tej metody pojawił się, gdy napotkaliśmy problem z monitorowaniem sygnałów wapniowych w neuronach, które mogliśmy zidentyfikować wyłącznie za pomocą genetycznego markera fluorescencyjnego, jakim było zielone białko fluorescencyjne.

W tej części zaprezentuję kilka kluczowych etapów tej procedury. Procedurę rozpoczynamy od wlania podgrzanego roztworu agaru do kwadratowej szalki Petriego do wysokości jednego centymetra; po ochłodzeniu i stwardnieniu żel agarowy o stężeniu 4% jest cięty na kostki o objętości jednego centymetra sześciennego i umieszczany w butelce do przechowywania. Po odcięciu głowy myszy należy naciąć skórę głowy jednorazową żyletką wzdłuż linii pośrodka, w kierunku strzałkowym, od kości czołowej do występu zewnętrznego potylicy.

Następnie należy dodatkowo rozciąć skórę głowy, najpierw w kierunku rostralno-bocznym, a potem w kierunku brzusznym. Następnie wykonuje się dwa cięcia boczne i jedno cięcie rostralne.

W miejscu otworu wielkiego (foramen magnum) ostrożnie oddziel czaszkę za pomocą małych nożyczek sprężynowych. Na tym etapie kości potyliczna, międzypłacowy oraz ciemieniowe powinny zostać oddzielone. Jeśli opona twarda nadal jest obecna, ostrożnie usuń ją za pomocą pęsety, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu.

Następnie usuń kość łuskową, otwory sitowe przednie oraz otwór czołowy. Teraz mózg można łatwo wyjąć za pomocą odwróconej szpatułki mikro łyżeczkowej, przecinając nerwy czaszkowe. Mózg powinien zostać ułożony stroną brzuszną na powierzchni odpornej na przecięcia, tak aby powierzchnia brzuszna mózgu była skierowana w dół.

Użyj jednokrawędziowego ostrza do usuwania móżdżku. Ta prosta powierzchnia cięcia będzie podstawą do zamocowania mózgu na płytce, co umożliwi wycinanie koronalnych przekrojów mózgu. Następnie przyklej mózg powierzchnią cięcia do płytki bazowej mikrotomu, używając niewielkiej ilości szybko utwardzanego, wysokowydajnego kleju cyjanoakrylowego.

Następnie przyklej sześcian agaru o objętości jednego centymetra sześciennego do strony brzusznej mózgu, a następnie do płytki podstawowej mikrotomu, aby wesprzeć i unieruchomić mózg podczas krojenia. Po wyschnięciu spoiwa umieść płytkę w kąpieli mikrotomu zawierającej natleniony roztwór pozakomórkowy w temperaturze 6 °C. Następnie przetnij mózg na plastry o grubości 300 µm przy niskiej prędkości krojenia; koronalne plastry mózgu zbieraj do momentu pocięcia całego organu.

Następnie przygotuj 20% roztwór onic F1 27 w DMSO, dodając DMSO do proszku onic F1 27. Następnie rozpuść go, poddając roztwór bezpośredniej sonikacji przez dwie minuty. Po tym czasie dodaj pięć mikrolitrów 20% roztworu onic F1 27 do probówki zawierającej 50 mikrogramów przenikalnego przez błony komórkowe furred am.

Wymieszać roztwór za pomocą pipety. Następnie dodać do mieszaniny 45 µl roztworu zewnątrzkomórkowego i wymieszać na wirówce typu vortex. Następnie dodać kolejne 325 µL roztworu zewnątrzkomórkowego i poddać probówkę sonikacji przez kolejne trzy minuty.

Po sonikacji dodaj 1,156 mililitrów natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego, aby otrzymać końcowy roztwór ładujący wskaźnik wapnia D. Przenieś koronalne skrawki mózgu do sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, umieszczając do sześciu skrawków w jednym dołku. Następnie odessaj natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z komór, uważając, aby nie uszkodzić skrawków mózgu.

Następnie pipetuj 750 µL roztworu ładującego wskaźnik wapnia D bezpośrednio do każdego dołka. Przekroje mózgu powinny być całkowicie przykryte roztworem zawierającym rore am. Po tym czasie inkubuj przekroje w inkubatorze do hodowli komórkowych z dostępem do tlenu i dwutlenku węgla przez 45 do 60 minut w temperaturze 37 °C.

Po zakończeniu inkubacji należy zastąpić roztwór ładujący wskaźnik wapnia DI świeżym natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu komórek. W celu monitorowania zmian sygnału fluorescencyjnego wywołanych bodźcem, należy przenieść jeden z naładowanych fure red skrawków mózgu do komory rejestracyjnej i ustawić go w pożądanej pozycji. Po zamontowaniu komory w układzie mikroskopu konfokalnego, skrawka należy perfundować przez 10 minut natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby usunąć nadmiar zewnątrzkomórkowego barwnika wskaźnika wapnia.

Po opuszczeniu komory rejestracyjnej preparat PERFUSE eight zbiera się do butelki próżniowej. Następnie należy obejrzeć skibkę pod mikroskopem przy małym powiększeniu. Należy odnotować orientację skibki i zlokalizować w niej obszar zainteresowania, którym w naszym przypadku jest obszar podwzgórza w mózgu.

Następnie przełącz na duże powiększenie. Znajdź interesującą komórkę w przekroju, wykonując obrazowanie GFP i jednocześnie kontrolując intensywność fluorescencji sygnału URA czerwonego. Dostosuj moc lasera do wartości, która umożliwi pomiary zmian intensywności fluorescencji URA czerwonego i zapobiegnie wybielaniu obu fluoroforów.

Następnie należy rozpocząć akwizycję obrazów z częstotliwością od 0,5 do 2 Hz w celu zarejestrowania sygnałów fure i GFP. Na tej figurze przedstawiono obraz konfokalny neuronów GN, RHR Tau GFP w koronalnym przekroju mózgu. Jest to stosunkowo jednorodny sygnał fluorescencyjny obserwowany po załadowaniu przekroju mózgu barwnikiem fure am, a tutaj znajduje się obraz scalony, pokazujący neurony załadowane wskaźnikiem wapnia.

Poniżej przedstawiono przykłady odpowiedzi wapniowych indukowanych stymulacją somatyczną w pojedynczych neuronach z markerem GFP w różnych obszarach podwzgórza. Wyraźne sygnały wapniowe pomiędzy neuronami GN RHR wykazującymi ekspresję w różnych jądrach podwzgórza można porównać, stosując pole pod krzywą jako szacunek całkowitej zmiany poziomu wapnia w danej komórce w tym samym przedziale czasowym. Po opanowaniu tej techniki, cały proces można przeprowadzić w czasie krótszym niż 90 minut, wliczając przygotowanie barwnika wskaźnika wapnia, obciążenie oraz inkubację skrawków, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury.