Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach znakowanych GFP w podwzgórzowych wycinkach mózgu myszy

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie odpowiedzi wapniowych wywołanych bodźcem, zarówno w neuronach znakowanych GFP, przestrzennie, jak i czasowo w wycinkach mózgu przy użyciu niezielonego fluorescencyjnego barwnika wskaźnikowego wapnia. Osiąga się to poprzez ekstrakcję mózgu transgenicznej myszy wykazującej ekspresję GFP w określonych komórkach. Drugim krokiem jest przygotowanie plastrów tkanek za pomocą mikrotomu.

Następnie roztwór obciążający barwnik wskaźnikowy wapnia jest pipetowany na plastry, aby umożliwić wchłonięcie barwnika przez komórki mózgowe. Ostatnim krokiem jest wykonanie zapisu znacznika czasu komórek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ostatecznie odpowiedzi wapnia w neuronach znakowanych GFP wykazano za pomocą wielokolorowej analizy obrazowania wapnia.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami mikroskopii konfokalnej jest to, że możemy obrazować wapń w zielonych fluorescencyjnych neuronach technologii GFP za pomocą przesuniętej ku czerwieni fluorescencyjnej matrycy wskaźnika wapnia. Ogromne przesunięcie skoku mniejszej liczby czerwieni pozwala nam na przeprowadzenie wielokolorowej analizy czerwonej fluorescencji w połączeniu z zielonym GFP przy użyciu jednej długości fali wzbudzenia. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy stanęliśmy przed problemem monitorowania sygnałów wapniowych w neuronach, które mogliśmy zidentyfikować tylko za pomocą genetycznej technologii fluorescencyjnej, którą było białko zielonej fluorescencji.

Przedstawię teraz różne kluczowe etapy tej procedury. Procedurę należy rozpocząć od przelania podgrzanego roztworu agaru na kwadratową szalkę Petriego na wysokość jednego centymetra, po schłodzeniu i stwardnieniu 4% żelu agarowego kroi się na bloki o długości jednego centymetra sześciennego i umieszcza w butelce do przechowywania. Po ścięciu głowy mysz nacięła skórę głowy żyletką o pojedynczej krawędzi w centralnym kierunku strzałkowym od kości czołowej do zewnętrznej wypukłości potylicznej.

Następnie dalej otwórz ciętą skórę głowy najpierw w kierunku bocznym rostralnym. Następnie w kierunku brzusznym. Następnie wykonaj dwa cięcia boczne i jedno rostralne.

W otworze wielkim małymi sprężynowymi nożyczkami ostrożnie odetnij czaszkę. W tym momencie należy odłączyć kości potyliczne międzyciemieniowe i ciemieniowe. Jeśli opona twarda jest nadal obecna, ostrożnie usuń ją kleszczami, aby zapobiec uszkodzeniu mózgu.

Następnie usuń kość płaskonabłonkową, przedni otwór sitowy i przedni. Teraz mózg można łatwo usunąć za pomocą odwróconej szpatułki z mikro łyżką, a nerwy czaszkowe mogą zostać przecięte. Mózg powinien wylądować na brzusznej stronie na powierzchni odpornej na przecięcie z brzuszną powierzchnią mózgu skierowaną w dół.

Użyj żyletki z pojedynczą krawędzią, aby usunąć móżdżek. Ta prosto ścięta powierzchnia będzie podstawą do zamontowania mózgu na płycie, aby umożliwić cięcie koronalnych odcinków mózgu. Następnie przyklej mózg z wyciętą powierzchnią na płycie podstawy mikrotomu za pomocą niewielkiej ilości szybkoutwardzalnego, wysokowydajnego kleju cyjanoakrylowego super glue.

Następnie przyklej blok żelu agarowego o długości jednego centymetra sześciennego po brzusznej stronie mózgu do płytki podstawy mikrotomu, aby podeprzeć i umocować mózg podczas krojenia. Po wyschnięciu wiązania włóż płytkę do kąpieli mikrotomu zawierającego natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy o temperaturze sześciu stopni Celsjusza. Następnie pokrój mózg na plasterki o grubości 300 mikronów z małą prędkością krojenia, plasterki mózgu koronalnego są zbierane, aż cały mózg zostanie podzielony na sekcje.

Teraz przygotuj 20% onic F1 27 w roztworze DMSO, dodając roztwór DMSO do proszku onic F1 27. Następnie rozpuść go, bezpośrednio sonizując roztwór przez dwie minuty. Następnie dodaj pięć mikrolitrów 20% roztworu F1 27 do probówki z 50 mikrogramami przepuszczalnego dla komórek futra am.

Wymieszać roztwór za pomocą pipety. Następnie dodaj 45 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego do mieszaniny i wymieszaj ją. Krótko dodając dodatkowe 325 mikrolitrów roztworu zewnątrzkomórkowego i sonikować probówkę przez kolejne trzy minuty.

Po sonikacji dodać 1,156 mililitra natlenionego roztworu zewnątrzkomórkowego, aby uzyskać końcowy roztwór ładujący wskaźnik wapnia D. Przenieś koronalne wycinki mózgu na sześciodołkową płytkę do hodowli komórkowej wypełnioną natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym do sześciu wycinków na dołek. Następnie odessaj natleniony roztwór zewnątrzkomórkowy z komór, uważając, aby nie uszkodzić wycinków mózgu.

Następnie odpipetować 750 mikrolitrów roztworu ładującego wskaźnik wapnia D bezpośrednio do każdego. Otóż wycinki mózgu powinny być pokryte roztworem zawierającym rore am. Następnie inkubuj plastry w inkubatorze do hodowli komórkowych z dwutlenkiem węgla przez 45 do 60 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji zastąp roztwór ładujący DI wskaźnika wapnia świeżym natlenionym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby zapobiec przeciążeniu komórek. Aby monitorować wywołane bodźcem zmiany w sygnale fluorescencyjnym, przenieś jeden z czerwonych wycinków mózgu do komory rejestracyjnej i ustaw go zgodnie z życzeniem. Po zamontowaniu komory na mikroskopie konfokalnym, perfunduj plasterek przez 10 minut natleniznym roztworem zewnątrzkomórkowym, aby usunąć nadmiar zewnątrzkomórkowego barwnika wskaźnikowego wapnia.

Po wyjściu z komory nagraniowej, PERFUSE ósemka jest zbierana do butelki próżniowej. Następnie spójrz na przekrój przez mikroskop w małym powiększeniu. Zanotuj orientację wycinka i znajdź obszar zainteresowania w wycinku, w naszym przypadku obszar podwzgórza w mózgu.

Następnie zmień na duże powiększenie. Znajdź interesującą Cię komórkę w wycinku, zbierając obrazy GFP i jednocześnie sprawdzając intensywność fluorescencji czerwonego sygnału URA. Dostosuj moc lasera do wartości, która umożliwia pomiary w zmianie intensywności czerwonej fluorescencji URA i zapobiega bieleniu dwóch fluoroforów.

Następnie zacznij rejestrować obrazy z częstotliwością od 0,5 do dwóch herców, aby zebrać sygnały fure i GFP. Ten rysunek przedstawia konfokalny obraz neuronów GN, RHR Tau GFP w koronalnym wycinku mózgu. Jest to względnie jednorodny sygnał fluorescencyjny obserwowany po załadowaniu wycinka mózgu fure am i jest to połączony obraz przedstawiający neurony obciążone barwnikiem wskaźnikowym wapnia.

Oto przykłady wywołanych bodźcem somatycznym odpowiedzi wapniowych z pojedynczych neuronów oznaczonych GFP w różnych obszarach mózgu podwzgórza. Wyraźne sygnały wapniowe między neuronami wyrażającymi GN RHR różnych jąder podwzgórza można porównać, wykorzystując obszar pod krzywą jako oszacowanie całkowitej zmiany wapnia w danej komórce w tym samym okresie po opanowaniu. Technikę tę można wykonać w czasie krótszym niż 90 minut, wliczając w to przygotowanie barwnika wskaźnikowego wapnia, ładowanie i inkubację plastrów, jeśli jest wykonywana prawidłowo.