Name: Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Poznaj metodę izolacji protoplastów z liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Technika umożliwia analizę ekspresji genów specyficznych dla typów komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prace prowadzone w laboratorium Buchanan-Wollaston nad profilowaniem specyficznym dla typu komórek i stadium rozwoju są wspierane przez projekt AGRON-OMICS (grant nr LSHG-CT-2006-037704) w ramach 6th Framework Progamme Komisji Europejskiej. Prace prowadzone w laboratorium Gifford nad profilowaniem specyficznym dla typu komórek są wspierane przez grant BBSRC New Investigator (BB/H019502/1).
Linie Arabidopsis KC274 i KC464 otrzymano od A.A.R. Webba (University of Cambridge).

1. Generowanie protoplastów
<ol>
 <li>Zebrać materiał liściowy i pociąć go na paski o szerokości 1 mm (Rycina 1) za pomocą żyletki. W przypadku próbek zawierających więcej niż jeden liść, przed cięciem można łatwo ułożyć w stos do 15 liści.</li>
 <li>Bezzwłocznie przenieść paski liści do okrągłej szalki Petriego o średnicy 9 cm zawierającej 20 ml roztworu A (400 mM mannitolu, 20 mM uwodnionego MES, 20 mM KCl, 10 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA i 2,5 mM β-merkaptoetanolu, pH 5,7) z dodatkiem enzymów do protoplastowania (1,2% celulozy R-10, 0,6% celulozy RS i 0,4% macerozymu R-10) oraz inhibitorów RNazy i transkrypcji (1×ProtectRNA i 10 μg/ml aktynomycyny D); delikatnie rozdzielić paski liści i poddać infiltracji próżniowej przez 2 × 5 min.</li>
 <li>Umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 90 rpm w temperaturze pokojowej i inkubować w celu uzyskania protoplastów przez 3-4 h.
 <ol>
 <li>W czasie inkubacji paski liści należy rozdzielać od siebie za pomocą płaskich pęset w odstępach półgodzinnych.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Umieścić sitko komórkowe 70 μm (Fisher Scientific) w probówce o pojemności 50 ml i delikatnie przefiltrować przez nie roztwór do protoplastowania. Pozwoli to na usunięcie pasków liści, które zostaną zatrzymane przez sito, podczas gdy protoplasty przejdą przez nie.</li>
 <li>Przepłukać paski liści 4 ml roztworu A i delikatnie przefiltrować przez to samo sito.</li>
 <li>Przenieść protoplasty do probówek o okrągłym dnie i odwirować roztwór protoplastów przy 300 x g przez 5 min, aby uzyskać osad z protoplastów.</li>
 <li>Delikatnie odessać jak największą ilość supernatantu, nie naruszając osadu protoplastów.</li>
 <li>Przepłukać protoplasty 5 ml roztworu A i wirować przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant.</li>
 <li>Resuspendować protoplasty w odpowiedniej objętości roztworu A, używając pipety Pasteura lub uciętego końcówki pipety P1000.</li>
</ol>
2. FACS protoplastów liściowych
<ol>
 <li>Bezpośrednio przed sortowaniem resuspenduj protoplasty, używając (nieuciętej) końcówki P1000, aby uniknąć ich zlepiania się.</li>
 <li>Przenieś protoplasty do probówki do sortowania przez filtr filcon 50 μm (BD Biosciences) i rozcieńcz w odpowiedni sposób, aby uniknąć zapchania dyszy sortera komórkowego. Protoplasty są sortowane przy użyciu dyszy 100 μm pod ciśnieniem 20 psi (osłona) i 21-21,5 psi (próbka), przy częstotliwości 39,2 kHz i tempie zdarzeń &lt;4000 (ustawienia te są optymalne dla sortera komórkowego BD Influx (BD Biosciences). Optymalizacja na innych maszynach do sortowania komórek może wymagać korekty tych parametrów).</li>
 <li>Protoplasty pozytywne pod kątem GFP są identyfikowane przy użyciu lasera argonowego 488 nm i poprzez wykreślenie sygnału z filtra pasmowo-przepustowego 580/30 (pomarańczowy) względem filtra pasmowo-przepustowego 530/40 (zielony). Protoplasty GFP-dodatnie znajdą się w populacji high 530/low 580, protoplasty GFP-ujemne w populacji low 530/low 580, a martwe/obumierające protoplasty oraz debris w populacji high 580 (Rysunek 2).
 <ol>
 <li>Podczas sortowania protoplastów, z których będzie ekstrahowane RNA, powinny być one sortowane bezpośrednio do co najmniej 4 objętości buforu lizującego zawierającego czynnik redukujący (np. β-merkaptoetanol). Ponadto czas sortowania pojedynczej próbki powinien być ograniczony do 20-30 min, a w jednym czasie przetwarzane powinny być maksymalnie dwie do trzech próbek.</li>
 <li>W celu wizualizacji posortowanych protoplastów powinny być one sortowane bezpośrednio do co najmniej 8 objętości roztworu A, a następnie zebrane za pomocą wirowania w celu ich zagęszczenia.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół opisuje metodę otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis, które są wykorzystywane do fluorescencyjnego sortowania komórek (Rycina 1). Generowanie protoplastów w obecności RNazy oraz inhibitorów transkrypcji zapobiega uruchomieniu odpowiedzi transkrypcyjnej w komórkach. Skutkuje to jednak powstaniem wielu martwych i obumierających protoplastów, które wykazują znaczny poziom autofluorescencji. Podczas sortowania protoplastów przygotowanych tą metodą bardzo często obserwuje się kilka odrębnych populacji na wykresach fluorescencji 580 nm względem 530 nm wykorzystywanej do sortowania. Przykłady tego zjawiska wraz z bramkami sortowania zastosowanymi w tym protokole przedstawiono na Rycynie 3.
Protoplasty można rozdzielić do 8 objętości roztworu A i zebrać w celu wizualizacji w celu weryfikacji wzbogacenia. Rysunek 2G przedstawia przykład tej procedury z wykorzystaniem linii TP382, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach szparkowych.
Przykłady wydajności uzyskanych za pomocą tej metody, zarówno przed, jak i po amplifikacji, przedstawiono w Tabeli 1. Uzyskane ilości są wystarczające do amplifikacji przy użyciu systemu Ovation Pico WTA (500 pg-50 ng), a tym samym do późniejszej analizy za pomocą qPCR (Rysunek 4), sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy.
<img alt="Schemat procesu hodowli komórek roślinnych; mikroskopia, chromatografia, elektroforeza, analiza danych." src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Ogólny schemat przebiegu eksperymentu. 1) Zbiór wybranych liści z linii Arabidopsis wykazującej ekspresję GFP. 2) Szybkie pocięcie na paski o szerokości ok. 1 mm i natychmiastowe przeniesienie ich do roztworu do protoplastyki oraz poddanie infiltracji próżniowej. 3) Inkubacja przez 3-4 hr. 4) Delikatna filtracja roztworu z protoplastami przez sito 70 μm, przeniesienie do probówek z okrągłym dnem i wytrącenie protoplastów poprzez wirowanie. 5) Bezpośrednio przed sortowaniem resuspensja protoplastów i przeniesienie do probówki do sortowania przez filtr 50 μm. 6) Sortowanie żywych protoplastów GFP-dodatnich i GFP-ujemnych. 7) Protoplasty mogą teraz zostać poddane analizie wizualnej lub z wykorzystaniem technik takich jak qPCR, sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) lub mikromacierze.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna przekrojów tkanek; czerwone i zielone markery podkreślają struktury komórkowe." src="/files/ftp_upload/4214/4214fig2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 2"> 
 Rysunek 2. Linie KC464, KC274 i TP382 wykorzystane w niniejszym badaniu. A) Przekrój poprzeczny liścia KC464 wykazujący ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej. B) Protoplasty pochodzące z liści KC464. C) Przekrój poprzeczny liścia KC274 wykazujący ekspresję GFP w układzie przewodzącym. D) Protoplasty pochodzące z liści KC274. E) Liść TP382 wykazujący ekspresję GFP w komórkach szparkowych. F) Protoplasty pochodzące z liści TP382. G) Przykład wzbogacenia uzyskanego za pomocą FACS dla komórek szparkowych wykazujących ekspresję GFP w złożonym tle komórek liścia, pokazujący protoplasty zawierające GFP z populacji protoplastów o wysokiej fluorescencji 530/niskiej fluorescencji 580 pochodzących z liści TP382. A-F: Obrazy z mikroskopu konfokalnego; G: Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego. Paski skali na obrazach wynoszą 50 μm.
<img alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej; analiza danych, rozkład populacji komórek; wykres intensywności fluorescencji." src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 3"> 
 Rysunek 3. Typowe wykresy kropkowe z akwizycji FACS dla sygnałów z filtrów pasmowych 580/30 nm (pomarańczowy) vs. 530/40 nm (zielony) (sorter komórek BD Influx). Przedstawione bramki sortowania są tymi, które są typowo stosowane podczas sortowania. A) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści Col-4, uzyskanych bez użycia inhibitorów, wykazujący pojedynczą populację low 530/low 580. B) Wykres kropkowy protoplastów wyizolowanych z liści wt Col-4, uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujący przesunięcie fluorescencji 580 spowodowane stresem i barwieniem przez inhibitory. C-E) Wykresy kropkowe protoplastów wyizolowanych z liści odpowiednio linii KC74, KC464 i TP382, uzyskanych w obecności inhibitorów, wykazujące populacje zawierające GFP w populacjach high 530/low 580. Podano wartości procentowe zdarzeń w populacjach GFP (high 530/low 580). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Wykres względnej ekspresji genów z wykresem punktowym; analiza danych dla eksperymentu znakowania GFP." src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Ekspresja GFP w reprezentatywnych frakcjach populacji wyodrębnionych za pomocą bramkowania, zgodnie z Rysunkiem 3. Dla każdego typu frakcji uzyskano dwie powtórzenia biologiczne, które powielono przy użyciu systemu Ovation Pico WTA, a następnie przeprowadzono qPCR z użyciem starterów specyficznych dla GFP (Tabela 2). Przedstawione wartości to najwyższe (czerwone), najniższe (zielone) oraz średnie wartości względne. Populacja high 580 została w tym przypadku podzielona na dwie: low 530/low 580 oraz high 530/low 580, dla których zastosowano pojedyncze powtórzenie biologiczne, dlatego przedstawiono tylko pojedynczą wartość. ACT2 (At3g18780) służył jako standard dla wszystkich próbek. Leaf: cały liść. Unsorted: nieposortowane protoplasty. GFP1: high 530/low 580 i Rest1: low 530/low 580, GFP2: high 530/high 580 i Rest2: low 530/high 580, zgodnie z opisem na Rysunku 3 i w wstawce. Wyniki stanowią weryfikację ocen optycznych zawartości GFP w komórkach w posortowanych frakcjach (np. Rysunek 2G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Próbka</td>
 <td>Liczba liści </td>
 <td>Liczba komórek</td>
 <td>Wydajność RNA 
 (ng)</td>
 <td>Wydajność RNA 
 (amplifikowany; ng)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cały liść A 
 Cały liść B</td>
 <td>1 
 1</td>
 <td>- 
 -</td>
 <td>8001 
 10525</td>
 <td>4623*** 
 4572***</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nieposortowane protoplasty A 
 Niesortowane protoplasty B</td>
 <td>5 
 5</td>
 <td>- 
 -</td>
 <td>2433 
 2625</td>
 <td>1152*** 
 3321***</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GFP1 A 
 Rest1 A</td>
 <td>15</td>
 <td>6039 (0.39%*) 
 55389 (6.40%*)</td>
 <td>-** 
 -**</td>
 <td>861 
 489</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GFP1 B 
 Rest1 B</td>
 <td>15</td>
 <td>10783 (0.63%*) 
 57040 (7.49%*)</td>
 <td>-** 
 -**</td>
 <td>537 
 420</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GFP2 
 Odpoczynek 2</td>
 <td>15</td>
 <td>18337 (1.49%*) 
 62405 (73.49%*)</td>
 <td>-** 
 -**</td>
 <td>360 
 411</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Próbki pobrane za pomocą FACS i przeanalizowane metodą qPCR w celu ustalenia, która frakcja zawiera żywe protoplasty wykazujące ekspresję GFP. W tabeli uwzględniono również całkowitą wydajność RNA w ng przed i po amplifikacji z użyciem systemu Ovation Pico WTA (NuGen). Frakcje GFP1, GFP2, Rest1 i Rest2 są przedstawione na wstawce na Rysunku 4. *Procent komórek w stosunku do całkowitego przebiegu sortowania komórek podano w nawiasach obok liczby komórek w frakcji. Procenty te nie są ze sobą skorelowane dla każdej próbki, ponieważ przebiegi sortowania FACS dla frakcji „Rest” zostały przerwane wcześniej niż dla frakcji GFP ze względu na znacznie większą liczbę zebranych komórek Rest. **50 ng użyte jako materiał wejściowy do reakcji amplifikacji, zgodnie z protokołem producenta.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Starter</td>
 <td>Sekwencja</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mGFP5-ER.fw</td>
 <td>GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>mGFP5-ER.rv</td>
 <td>TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACT2.fw</td>
 <td>GCCATCCAAGCTGTTCTCTC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ACT2.rv</td>
 <td>GCCATCCAAGCTGTTCTCTC</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Startery do qPCR.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisaliśmy metodę pozwalającą na wykorzystanie roślin Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach do generowania protoplastów i późniejszego sortowania komórek za pomocą FACS. Metoda ta pozwala na uzyskanie ilości RNA wystarczającej do amplifikacji, a w konsekwencji do dalszej analizy za pomocą qPCR lub mikromacierzy. Frakcje poddane sortowaniu są silnie wzbogacone w komórki zawierające GFP, co wykazano za pomocą qPCR (Ryc. 2).
Aby uzyskać wysoką wydajność żywych protoplastów, kluczowe jest szybkie działanie podczas początkowych etapów procedury, aż do momentu próżniowej infiltracji pasków liści roztworem do izolacji protoplastów zawierającym inhibitor. Ponadto, podczas przygotowywania pasków liści o szerokości 1 mm, bardzo ważne jest krojenie lub nacinanie liści zamiast ich „siekania” lub rozgniatania, ponieważ prowadzi to do nadmiernych uszkodzeń i w konsekwencji do niższej wydajności protoplastów.
Kluczową różnicą między opisaną tutaj metodą a innymi opublikowanymi metodami jest zastosowanie inhibitorów RNazy oraz inhibitorów transkrypcji. Większość metod opracowano dla korzeni Arabidopsis, z których protoplasty można generować łatwiej. Jednak w przypadku pracy z liśćmi, z wyłączeniem mezofylu, konieczne jest wydłużenie czasu generowania protoplastów. Dlatego istotne jest uwzględnienie tych inhibitorów w celu ochrony przed zmianami w ekspresji genów wynikającymi z samego procesu generowania protoplastów (dane nie zostały przedstawione). Jednak obecność inhibitorów prowadzi do niemożności wywołania odpowiedzi transkrypcyjnej, poprzez włączanie lub wyłączanie genów, co prawdopodobnie czyni protoplasty bardziej podatnymi, ponieważ prowadzi to do utraty plastyczności niezbędnej do przeciwdziałania stresom towarzyszącym procedurze protoplastyzacji.
Z powodzeniem zastosowaliśmy opisaną tutaj metodę w odniesieniu do wielu linii Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP. Co istotne, wykorzystaliśmy tę metodę w liniach GFP wykazujących silną ekspresję GFP w jądrze komórkowym lub znacznie słabszą ekspresję w sposób nielokalizowany/rozproszony w cytozolu, co ma miejsce w przypadku użytych tutaj linii KC464 i KC274. Oba typy linii są kompatybilne z tą metodą i pozwalają na uzyskanie wysoce wzbogaconych frakcji protoplastów wykazujących ekspresję GFP (Rysunek 2 i 3). Metodę tę można łatwo dostosować do innych fluoroforów, przy czym fluorofor musi zostać wybrany tak, aby jego fluorescencja znacząco różniła się od autofluorescencji komórek martwych lub obumierających, aby zachować możliwość selekcji żywych komórek.

<table><tbody><tr><td>Celulaza R-10</td><td>Melford</td><td>C8001</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza RS</td><td>Melford</td><td>C8003</td><td></td></tr><tr><td>Macerozyme R-10</td><td>Melford</td><td>M8002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3912</td><td></td></tr><tr><td>ProtectRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7397</td><td></td></tr><tr><td>Aktynomicyna D</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1410</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 &amp;mu;m</td><td>Fisher</td><td>FB35181</td><td></td></tr><tr><td>Filtry filcon typu kubkowego 50 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>340630</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza specyficzna dla komórek liści arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Po inicjacji prymordium liścia akumulacja biomasy jest kontrolowana głównie przez proliferację i ekspansję komórek w liściach1. Jednak liść Arabidopsis jest złożonym organem składającym się z wielu różnych typów komórek i kilku struktur. Jednocześnie rosnący liść zawiera komórki na różnych etapach rozwoju, przy czym komórki najdalej oddalone od ogonka liściowego jako pierwsze przestają się rozszerzać i przechodzą w stan starzenia (senescencji)1. W związku z tym różne komórki w obrębie liścia w dowolnym momencie mogą się dzielić, wydłużać lub różnicować; być aktywne, objęte stresem lub martwe; oraz/lub reagować na bodźce w podzbiorach swojego typu komórkowego. Sprawia to, że badania genomowe liścia są wymagające: na przykład podczas analizy danych ekspresji z całych liści sygnały z sieci genetycznych działających w odrębnych strefach odpowiedzi komórkowej lub typach komórek zostaną pomieszane, co doprowadzi do wygenerowania niedokładnego profilu.
Aby rozwiązać ten problem, opisano kilka metod umożliwiających badanie specyficznej dla komórek ekspresji genów. Należą do nich mikrodysekcja sterowana laserem (LCM)2 lub wykorzystanie roślin wykazujących ekspresję GFP do generowania protoplastów i późniejszego sortowania komórek za pomocą cytometrii przepływowej (FACS)3,4, niedawno opisany system INTACT do precypitacji jąder komórkowych5 oraz immunoprecypitacja polizomów6.
Metoda FACS była z sukcesem wykorzystywana w wielu badaniach, w tym do wykazania, że tożsamość komórki oraz jej odległość od wierzchołka korzenia mają istotny wpływ na profile ekspresji licznej grupy genów3,7. FACS linii GFP wykorzystywano również do wykazania specyficznej dla komórek regulacji transkrypcyjnej podczas reakcji korzeni na azot i rozwoju korzeni bocznych8, stresu solnego9, dystrybucji auksyn w korzeniu10 oraz do stworzenia mapy ekspresji genów w merystemie wierzchołkowym pędu Arabidopsis11. Chociaż FACS był wcześniej stosowany do sortowania protoplastów pochodzących z liści Arabidopsis na podstawie autofluorescencji12,13, dotychczas wykorzystanie FACS w liniach Arabidopsis wykazujących ekspresję GFP w liściach było bardzo ograniczone4. W poniższym protokole opisujemy metodę otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilnych z FACS, przy jednoczesnym zminimalizowaniu wpływu procedury generowania protoplastów. Metodę tę demonstrujemy na przykładzie linii Arabidopsis KC464, która wykazuje ekspresję GFP w epidermie adaksjalnej14, linii KC274, która wykazuje ekspresję GFP w tkance przewodzącej14 oraz linii Arabidopsis TP382, która wykazuje ekspresję podwójnej konstrukcji GFP połączonej z sygnałem lokalizacji jądrowej w komórkach aparatów szparkowych (dane niepokazane; Rycina 2). Obecnie stosujemy tę metodę do badania zarówno specyficznej dla typu komórek ekspresji podczas rozwoju i stresu, jak i heterogenicznych populacji komórek na różnych etapach starzenia się.

Metoda otrzymywania protoplastów z liści Arabidopsis kompatybilna z fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS), umożliwiająca badania specyficznych populacji komórkowych. Metoda ta jest zgodna z każdą linią Arabidopsis wykazującą ekspresję GFP w podzbiorze komórek.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Po zainicjowaniu prymordium liścia akumulacja biomasy jest kontrolowana głównie przez proliferację i ekspansję komórek w liściach1. Jednakże...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie populacji protoplastów specyficznych dla konkretnego typu komórek z liścia. Osiąga się to najpierw poprzez hodowlę roślin wykazujących ekspresję GFP w określonych typach komórek liścia. Drugim krokiem jest pobranie liści i wygenerowanie protoplastów za pomocą trawienia enzymatycznego.Następnie protoplasty są filtrowane i sortowane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek lub FACS. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie dokładności sortowania przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie posortowane protoplasty mogą zostać wykorzystane do analizy ekspresji genów specyficznej dla danego typu komórek, analizy proteomicznej lub profilowania metabolicznego.Fluorescencyjne sortowanie komórek (FACS) było wcześniej z sukcesem stosowane w przypadku korzeni, lecz w niniejszym przypadku służy ono do izolowania komórek liści. Stosowanie znakowania GFP przed tą metodą było ograniczone ze względu na zakłócenia wywołane fluorescencją chlorofilu. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ szybkie, lecz staranne przygotowanie próbek ma decydujące znaczenie dla zminimalizowania rozległych zmian fizjologicznych, które mogą wystąpić podczas sortowania komórek.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności, ponieważ nie wiedzą, jak skonfigurować sorter komórkowy ani w jaki sposób potwierdzić poprawność sortowania. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemów roślin. Problem z identyfikacją sieci regulacji genów w złożonych organach wielokomórkowych, takich jak liść, polega na tym, że różne typy komórek wykazują ekspresję różnych grup genów.Informacje genetyczne te są tracone podczas analizy zbiorów całego liścia, co demonstruje ta procedura. Towarzyszyć mi będą Ellison As i Sanjeev Kuma, którzy zapewniają wsparcie techniczne dla tych prac w naszym laboratorium. Najpierw należy napełnić dziewięciocentymetrową okrągłą płytkę Petri 20 ml roztworu A zawierającego enzymy do przygotowania płytek oraz inhibitory transkrypcji i RNA.Następnie pobierz odpowiedni materiał z liści dla próbek zawierających więcej niż jeden liść, tak jak w przykładzie pokazanym tutaj. Ułóż liście w stosie składającym się z maksymalnie 15 liści. Następnie za pomocą żyletki potnij liście na paski o szerokości jednego milimetra.Natychmiast przenieś paski liści do szalki Petriego za pomocą płaskich pęset, delikatnie je rozdziel, a następnie poddaj próbki dwukrotnej infiltracji próżniowej, po pięć minut za każdym razem. Następnie umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 90 RPM w temperaturze pokojowej i inkubuj próbki protoplastów przez trzy do czterech godzin. W czasie inkubacji co pół godziny rozdziel paski liści od siebie za pomocą pęsety.Po trawieniu delikatnie przefiltruj roztwór protoplastów przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 µm do probówki o pojemności 50 mL. W ten sposób paski liści zostaną zatrzymane, a protoplasty przejdą przez sito.Następnie należy użyć czterech mililitrów roztworu A, aby delikatnie wypłukać paski liści, zbierając płuczyny do probówki o pojemności 50 mililitrów. Potem zawiesinę protoplastów przenosi się do probówek z okrągłym dnem i odwirowuje protoplasty przez pięć minut przy 300 ×g w temperaturze pokojowej. Uważając, aby nie naruszyć osadu, należy delikatnie odprowadzić za pomocą pipety jak najwięcej nadnadziele, a następnie przemyć protoplasty pięcioma mililitrami roztworu A w tych samych warunkach wirowania.Na koniec, po usunięciu pływającego znad osadu nadpływu, należy użyć obciętej końcówki P 1000, aby resuspenderować PROTOPLASTY w odpowiedniej objętości roztworu A bezpośrednio przed sortowaniem. Aby rozbić grudki w roztworze protoplastów, należy użyć nieobciętej końcówki P 1000. Następnie należy przeprowadzić dalszą dysocjację komórek, filtrując protoplasty do probówki sorteryjnej przez filtr fillon o wielkości oczek 50 micron.Następnie odpowiednio rozcieńczyć zawiesinę komórkową, aby zapobiec zapychaniu dyszy pobierającej komórki. Po ustaleniu optymalnych warunków pobierania komórek, zidentyfikować protoplasty GFP-dodatnie, wykorzystując laser Argonowy o długości fali 488 nm, analizując sygnał z filtra pasmowo-przepustowego 580/30 w zestawieniu z filtrem pasmowo-przepustowym 530/40. Należy pamiętać, że protoplasty GFP-dodatnie będą widoczne w populacji o wysokim sygnale 530 i niskim sygnale 580.W populacji protoplastów niewykazujących fluorescencji GFP o niskich wartościach 530 i 580, martwe i obumierające protoplasty oraz debris pojawiają się w populacji o wysokich wartościach 580. W celu wizualizacji posortowanych protoplastów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, należy sortować protoplasty bezpośrednio do co najmniej ośmiokrotnej objętości roztworu A. Po sortowaniu protoplasty należy skoncentrować poprzez wirowanie. Protoplasty mogą być sortowane do ośmiu objętości roztworu A i zbierane do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu weryfikacji wzbogacenia. Pierwszy obraz przedstawia przykład wzbogacenia linii komórkowej TP 382, która wykazuje ekspresję GFP w komórkach szparkowych. Przykłady uzyskowych wydajności z zastosowaniem tej metody, zarówno przed, jak i po amplifikacji, podsumowano w poniższej tabeli.Ilości od 500 picogramów do 50 nanogramów są wystarczające do amplifikacji za pomocą systemu ovation PICO WTA i późniejszej analizy za pomocą ilościowego PCR, sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy. Kolejna seria obrazów przedstawia różne linie komórkowe protoplastów wyizolowane i posortowane opisaną przed chwilą metodą. Pierwsze protoplasty pochodzą z KC 2 74, liście, przekrój poprzeczny KC 2 74.Liść wykazuje, że GFP jest ekspresyjne w układzie naczyniowym. Protoplasty te wyizolowano z liści KC 4 64, a przekrój poprzeczny liścia KC 4 64 pokazuje, że ekspresja GFP występuje w epidermie A dal. Ostatecznie protoplasty te pochodziły z liści TP 3 82 w liściach TP 3 82.GFP ulega tutaj ekspresji w komórkach szparkowych. Przedstawiono typowe wykresy kropkowe z akwizycji danych, ilustrujące sygnał z filtrów pasmowych 580±30 nm oraz 530±40 nm. Wyznaczone bramki sortowania to te, które są zazwyczaj stosowane podczas procesu sortowania.Ten pierwszy wykres kropkowy protoplastów pochodzących z liści linii col-4, poddanych protoplastyzacji w obecności inhibitorów, pokazuje pojedynczą populację o niskiej fluorescencji 530 i niskiej fluorescencji 580. Natomiast ten wykres kropkowy protoplastów pochodzących z liści linii col-4 typu dzikiego, poddanych protoplastyzacji w obecności inhibitorów, wykazuje przesunięcie w fluorescencji 580, które występuje w wyniku stresu i barwienia wywołanego przez inhibitory. Przedstawione wykresy kropkowe dotyczą protoplastów z liści odpowiednio linii KC 74, KC 464 i TP 382.Próbki te poddano również analizie w obecności inhibitorów, co wykazało, że GFP znajduje się w populacjach o wysokim sygnale 530 i niskim 580. W tym reprezentatywnym eksperymencie ilościowego PCR najpierw pozyskano próbki dla każdego rodzaju frakcji. Następnie próbki powielono przy użyciu systemu ovation PICO WTA oraz ilościowego PCR.Przeprowadzono analizę z wykorzystaniem specyficznych starterów do GFP. Przedstawione wartości to najwyższe (zaznaczone na czerwono) i najniższe (zaznaczone na zielono) wartości średnie lub pojedyncze; poziomy z wykorzystaniem aktyny 2 jako genu referencyjnego zaznaczono poziomymi żółtymi paskami. Wyniki stanowią weryfikację optycznych ocen zawartości GFP w posortowanych frakcjach komórkowych.Populacja high 530 low 580 wykazywała najwyższe mierzalne poziomy ekspresji GFP. Podczas gdy populacja high 530 high 580 wykazywała ekspresję GFP około 1000 razy niższą, populacje low 530 low 580 oraz low 530 high 580 wykazywały niskie poziomy ekspresji GFP, które były porównywalne z poziomami w kontrolnych populacjach całych liści oraz niesortowanych protoplastów. Po opanowaniu techniki tej, proces od rośliny do posortowanej populacji komórek może zająć od czterech do pięciu godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby stale monitorować sorter komórkowy i w razie potrzeby go rekalibrować w celu zachowania dokładności sortowania.Znaleziono tę procedurę. W celu porównania i zestawienia poziomów ekspresji genów w różnych typach komórek można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza microray. Dzięki opracowaniu tej techniki analizujemy obecnie ekspresję genów w określonych typach komórek liściowych na różnych etapach rozwoju, a następnie porównamy te wyniki z danymi z całego liścia, które zostały wygenerowane w ramach projektu agrotechnicznego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pojedyncze typy komórek liści za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza specyficzna dla komórek Arabidopsis liści za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie

Przedstawiono metodę izolacji specyficznych typów komórek z materiału roślinnego. Technika ta wykorzystuje transgeniczne linie markerowe wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych w określonych typach komórek, dysocjację komórkową oraz sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS). Dodatkowo opracowano układ hodowlany, który umożliwia poddanie siewek Arabidopsis thaliana obróbce przed sortowaniem komórek.

Sortowanie komórek protoplastów roślinnych metodą fluorescencyjnej aktywacji (FACS)

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Opisujemy zastosowanie perfluorodekaliny jako infiltracyjnego medium montażowego. Jest to prosta metoda poprawiająca głębokość obrazowania w tkance liścia Arabidopsis thaliana przy minimalnym wpływie fizjologicznym.

Prosta metoda obrazowania liści Arabidopsis z wykorzystaniem perfluorodekaliny jako infiltrującego medium obrazującego

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Fundamentalnym celem biologii komórki jest zdefiniowanie mechanizmów leżących u podstaw tożsamości organelli tworzących komórki eukariotyczne. W niniejszej pracy proponujemy metodę identyfikacji genów odpowiedzialnych za integralność morfologiczną i funkcjonalną organelli roślinnych, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną oraz narzędzia sekwencjonowania następnej generacji.

Przesiew mikroskopii fluorescencyjnej i sekwencjonowanie następnej generacji: użyteczne narzędzia do identyfikacji genów zaangażowanych w integralność organelli

Zapewniamy tutaj skuteczny i niezawodny protokół barwienia immunologicznego, fluorescencji hybrydyzacji in situ, barwienia DNA, a następnie ilościowego obrazowania w wysokiej rozdzielczości w zalążkach Arabidopsis thaliana. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej.

Skuteczna metoda ilościowej, jednokomórkowej analizy modyfikacji chromatyny i architektury jądrowej w zalążkach z całą górą u Arabidopsis

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Obrazowanie konfokalne na żywo dostarcza biologom potężnego narzędzia do badania rozwoju. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół obrazowania konfokalnego na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika.

Obrazowanie konfokalne na żywo rozwijających się kwiatów rzodkiewnika

Tutaj prezentujemy protokół do badania zachowań związanych ze wzrostem roślin, a zwłaszcza fenotypów w powtarzalny sposób. Pokazujemy, jak zapewnić zmienne, a jednocześnie stabilne warunki oświetleniowe. Prawidłowe analizy zależą od wystarczającej liczby prób i prawidłowych ocen statystycznych.

Analiza zachowania wzrostu Arabidopsis thaliana w różnych jakościach światła

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Poznaj metodę izolacji protoplastów z liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Technika umożliwia analizę ekspresji genów specyficznych dla typów komórkowych.

Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis z wykorzystaniem sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Przeglądaj więcej filmów