Analiza specyficzna dla komórek liści Arabidopsis przy użyciu sortowania komórek aktywowanego fluorescencją

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie populacji protoplastów specyficznych dla typu komórki z liścia. Osiąga się to poprzez pierwszą uprawę roślin, które wykazują ekspresję GFP w określonych typach komórek w liściu. Drugim krokiem jest zebranie liści i wytworzenie protoplastów za pomocą trawienia enzymatycznego.

Następnie protoplasty są filtrowane i sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją lub faktów. Ostatnim krokiem jest potwierdzenie dokładności sortowania za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Ostatecznie posortowane protoplasty można wykorzystać do analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, analizy proteomicznej lub profilowania metabolicznego.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją było wcześniej z powodzeniem stosowane w przypadku korzeni, ale jest używane do izolowania komórek liści. Znakowanie GFP przed tą metodą było ograniczone ze względu na interferencję fluorescencji chlorofilu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ jest szybka, ale staranne przygotowanie próbki ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania rozległych zmian fizjologicznych, które mogą wystąpić podczas sortowania komórek.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały problemy, ponieważ nie będą świadome, jak skonfigurować sortownik komórek lub jak potwierdzić dokładne sortowanie. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii systemów roślinnych. Problem z identyfikacją sieci regulacji genów w złożonych narządach wielokomórkowych, takich jak liść, polega na tym, że różne typy komórek wyrażają różne grupy genów.

Ta informacja genetyczna jest tracona podczas analizy zbioru całego liścia, demonstrując procedurę. Obok mnie będą Ellison As i Sanjeev, którzy zapewniają wsparcie techniczne dla tej pracy w naszym laboratorium. Najpierw napełnij dziewięciocentymetrową okrągłą szalkę Petriego 20 mililitrami roztworu A zawierającego enzymy protoposiekowe oraz inhibitory transkrypcji i RNA.

Następnie zbierz żądany materiał liści w przypadku próbek zawierających więcej niż jeden liść, takich jak próbka pokazana tutaj. Ułóż liście w stosie do 15 liści. Następnie za pomocą żyletki pokrój liście w paski o szerokości jednego milimetra.

Natychmiast przenieś paski liści na szalkę Petriego za pomocą płaskiej pęsety, delikatnie oddziel paski, a następnie naciekaj próżniowo próbki dwa razy przez pięć minut za każdym razem. Następnie umieść szalkę Petriego na wytrząsarce orbitalnej ustawionej na 90 obr./min w temperaturze pokojowej i proto tynku próbki przez trzy do czterech godzin. Podczas inkubacji za pomocą pęsety oddzielaj paski liści od siebie w odstępach półgodzinnych.

Po roztrawieniu delikatnie przefiltruj roztwór protoplastów przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów do probówki o pojemności 50 mililitrów. Aby usunąć paski liści, paski zostaną zachowane. Protoplasty zostaną przefiltrowane.

Teraz użyj czterech mililitrów roztworu A, aby delikatnie spłukać paski liści, zbierając pranie w 50-mililitrowej tubce. Następnie przenieść zawiesinę protoplastów do probówek z okrągłym dnem i odwirować protoplasty przez pięć minut w temperaturze 300 razy G i temperaturze pokojowej. Uważając, aby nie naruszyć osadu, delikatnie odessać jak najwięcej natantu na wznak, a następnie przemyć protoplasty pięcioma mililitrami roztworu A w tych samych warunkach wirówki.

Na koniec, po usunięciu natantu leżącego na wznak, należy użyć końcówki odcinającej P 1000, aby ponownie zawiesić PROTOPLASTY w odpowiedniej objętości roztworu A do sortowania bezpośrednio przed sortowaniem. Użyj nieobciętej końcówki P 1000, aby zdezagregować wszelkie grudki w roztworze protoplastów. Dalej dysocjuj komórki, filtrując protoplasty do rurki zasilającej przez filtr fillon o średnicy 50 mikronów.

Następnie odpowiednio rozcieńczyć roztwór komórkowy, aby uniknąć zatkania dyszy doprowadzającej komórki. Po określeniu optymalnych warunków pozyskiwania komórek, zidentyfikuj dodatni GFP Proto plus za pomocą lasera Argonne 488 nm, zwiększając moc wyjściową z filtra pasmowego 580 30 w porównaniu z filtrem pasmowym 530 40. Należy zauważyć, że protoplasty GFP dodatnie pojawią się w populacji o wysokiej wartości 530 i niskiej populacji 580.

W przypadku protoplastów niebędących GFP w populacji o niskiej 530, niskiej populacji 580, martwe umierające protoplasty i szczątki pojawiają się w populacji o wysokiej populacji 580 w celu wizualizacji posortowanych protoplastów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, posortuj protoplasty bezpośrednio do co najmniej ośmiu objętości roztworu A po sortowaniu koncentratu, protoplasty przez odwirowanie protoplastów można posortować do ośmiu objętości roztworu A i zebrać do wizualizacji pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu sprawdzenia wzbogacenia. Ten pierwszy obraz pokazuje przykład wzbogacenia linii komórkowej TP 382, która ulega ekspresji GFP w komórkach ochronnych. Przykłady plonów uzyskanych przy użyciu tej metody zarówno przed, jak i po amplifikacji podsumowano w tej tabeli.

Ilości uzyskane w zakresie od 500 pikogramów do 50 nanogramów są wystarczające do amplifikacji za pomocą systemu ovation PICO WTA, a następnie analizy za pomocą ilościowego PCR, sekwencjonowania nowej generacji lub mikromacierzy. Następna seria zdjęć pokazuje różne linie komórkowe protoplastów wyizolowane i posortowane za pomocą właśnie opisanej metody. Te pierwsze protoplasty pochodziły z KC 2 74, pozostawiają poprzeczny przekrój KC 2 74.

Liść pokazuje, że GFP ulega ekspresji w układzie naczyniowym. Protoplasty te wyizolowano z liści KC 4 64, a przekrój poprzeczny liścia KC 4 64 pokazuje, że ekspresja GFP znajduje się w naskórku A dal. Ostatecznie te protoplasty pochodziły z liści TP 3 82 w liściach TP 3 82.

GFP ulega ekspresji w komórkach ochronnych w tym miejscu. Pokazano typowe wykresy punktowe akwizycji faksu ilustrujące dane wyjściowe z filtrów pasmowych 5 80 30 nanometrów w porównaniu z filtrami pasmowymi 5 30 40 nanometrów. Pokazane bramki sortujące to te, które są zwykle używane podczas sortowania.

Ten pierwszy wykres zatrzymania protoplastów pochodzących z czterech liści węgla, otynkowanych pod nieobecność inhibitorów, pokazuje pojedynczą populację o niskiej wartości 530, niskiej populacji 580. Natomiast ten wykres punktowy z węgla dzikiego, protoplasty pochodzące z czterech liści, otynkowane w obecności inhibitorów, pokazują przesunięcie fluorescencji 580, które występuje z powodu stresu i zabarwienia spowodowanego przez inhibitory. Te wykresy kropkowe przedstawiają protoplasty pochodzące z liści odpowiednio z linii KC siedem cztery, KC 4 64 i TP 3 82.

Próbki te zostały również profesjonalnie otynkowane w obecności inhibitorów wykazujących, że GFP jest zawarta w populacjach o wysokiej wartości 530 i niskich 580. W tym przypadku reprezentatywnie najpierw uzyskano ilościowe próbki eksperymentalne PCR dla każdego typu frakcji. Próbki zostały następnie amplifikowane za pomocą systemu ovation PICO WTA i ilościowego PCR.

Wykonano stosowanie starterów specyficznych dla GFP. Pokazane wartości są najwyższe w kolorze czerwonym i najniższe w kolorze zielonym, średnie lub pojedyncze wartości wykorzystujące aktynę drugą jako gen odniesienia są oznaczone poziomymi żółtymi paskami. Wyniki są wynikiem ponownej weryfikacji optycznych ocen zawartości komórek GFP w posortowanych frakcjach.

Populacja o wysokim poziomie 530 i niskim 580 wykazywała najwyższe mierzalne poziomy ekspresji GFP. Podczas gdy populacja o wysokim poziomie 530 i 580 wykazywała około 1000 razy niższą ekspresję GFP, populacje o niskiej wartości 530, 580 i 530 o wysokiej 580 wykazywały niskie poziomy ekspresji GFP, które były porównywalne z populacjami kontrolnych całych liści i niesortowanych protoplastów Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu czterech do pięciu godzin od rośliny do posortowanej populacji komórek, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o stałym monitorowaniu sortownika komórek i w razie potrzeby jego ponownej kalibracji w celu utrzymania dokładności sortowania.

Znaleziono tę procedurę. Inne metody, takie jak analiza mikrorentgenowska, mogą być wykonywane w celu porównania i kontrastowania poziomów ekspresji genów w różnych typach komórek. Teraz, gdy ta technika została opracowana, analizujemy ekspresję genów w określonych typach komórek liści na różnych etapach rozwoju i porównamy to z danymi z całego liścia, które zostały wygenerowane w ramach projektu agronomicznego.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować pojedyncze typy komórek liści za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.